3. 培养基
3.1 一级种子：胰蛋白胨10 g/Ｌ
LB培养基酵母提取物5 g/Ｌ
氯化纳10 g/Ｌ
PH 7.3 加水至1L
3.2 二级种子：胰蛋白胨16 g/Ｌ
２×ＹＴ培养基酵母提取物10g/Ｌ
氯化纳 5 g/L
PH 7.3 加水至1L
LK：LB＋卡纳霉素（50mg/L）
3.3 罐料培养基：胰蛋白胨102g
酵母提取物64g
葡萄糖 6.4g
氯化钠 1.6g
磷酸氢二钠48g
磷酸二氢钾9.6g
氯化铵 3.2g
氯化钙0.035g
硫酸镁 3.2g
维生素B1 0.1g
PH 7.2 加水至3.2L
3.4 补料培养基：酵母提取物200g
胰蛋白胨20g
甘油200ml
葡萄糖10g
硫酸铵5g
硫酸镁5g
维生素B1 0.1g
原始PH，加水至0.8-1.0L
以上培养基中均加卡纳霉素，加量50mg/L
胰蛋白胨、酵母提取物为OXOID公司产品，卡那霉素为Genview公司产品，IPTG为Japan 产品，其余试剂为国产分析纯。发酵罐：NBS5LBioflo3000，扫描仪(GE公司U9909-H7L0),Unico7200分光光度计。
4. 实验方法与过程
发酵工艺路线：保藏菌种单菌落一级种子（F1）二级种子(F2) 发酵离心收集菌体。
4.1 菌种活化与扩大培养
将保藏在-20℃工作种子液解冻,取10μl，梯度稀释，10-5、10-6、10-7涂LB平板37℃培养16-18小时左右生产单菌落。
F１发酵菌种：挑取LK平板单一菌落，接入50ml/250ml三角瓶LB培养基中（含卡纳霉素）37℃，200rpm培养箱8～10小时，至O.D600×10达0.25～0.35。F２发酵菌种：将F１按0.5%接种量接到200ml/1000ml三角瓶，2×YT培养基中（含卡纳霉素）37℃,200rpm摇荡培养，培养7～8小时至O.D600×10达0.3～0.5。
4.2 发酵罐发酵培养
将生长好的F2，400ml种子液接入发酵罐，37℃培养至O.D600×100达40-50，加IPTG诱导，加量0.1～0.2mmol/L，诱导3.5～4小时，压缩空气做气源，保持通气量1vvm ，溶氧控制30－45%，发酵2.5小时左右开始通氧，发酵过程控制pH7.0－7.2，每隔１小时取样一次，测O.D600至最大，不再增长。补料速率在培养阶段控制在补料泵10%－40%，随发酵时间以10%增长，诱导阶段，补料速率控制在补料泵20%－40%，在诱导阶段第一小时内补料速度最大,放罐前半小时停止补料。
检测
4.3.1测O.D600 ：使用“7200”分光光度计,波长600nm；
对照:蒸馏水；
样品:发酵液用蒸馏水稀释至合适倍数。
发酵工艺流程图 打开备料泵，进料基质→开备料阀→备料100T，关备料阀→开搅拌器，设转速为200r/min→开排气阀，设参数→开通风阀，设参数→加菌种→开补糖阀→开硫铵阀→开前体罐的进料泵，设频率(0~100k/z) →开前体阀→开消泡补罐的进料泵，设频率→加消泡剂。 在发酵流程图里打开备料泵，在发酵罐操作里打开备料阀，备料开搅拌器，过程跟上述流程图一样，需要注意的是： 1.发酵过程中时时补糖，保持残糖浓度为5kg/m3. 2.发酵过程中时时补硫铵，保持硫铵浓度为0.25kg/m3 3.开冷却水，维持发酵温度在25℃ 4.控制PH在6.8左右，不可高于7.3或低于6.0 5.控制通风阀及排气阀开度，保持发酵罐压力为0.07Mpa 6.前体浓度不应超过1kg/m3，但也不能太低 7.保证发酵罐中的溶氧浓度不低于百分之30 8.泡沫高度不应超过35cm 9.不要满罐，超负荷生产 发酵后期处理与提纯 预处理： 开发酵液开关，加发酵液→开预处理罐搅拌器→加黄血盐，
去除铁离子至浓度为0→加磷酸盐，去除镁离子至浓度为0→加絮凝剂，去除蛋白质至浓度为0→打开转筒真空过滤器及其后阀门→待发酵液经过过滤排主混合罐B101后，关阀门，关泵，关真空过滤器。 一次BA提取： 开罐B101搅拌器→开阀，加BA（硝酸丁脂），质量为发宵夜的三分之一，关阀→开阀，加稀硫酸调PH至2.8-3.0，关阀→开阀，加破乳剂100kg，关阀→打开阀泵，向分离机注液→开分离机→开阀，开萃取回收阀，萃取→关阀，关泵→关B101搅拌器→关分离机 一次反提取： 开罐B102搅拌器→开阀，加碳酸氢钙溶液，质量为青霉素溶液的25倍，并调PH至6.8-7.2，关阀→开阀，开泵，向分离机注液→开分离机，开阀，开萃取相回X阀→关阀，关泵→关B102搅拌器→关分离机，及阀 脱色： 打开活性炭进料阀，进料25kg→关闭进料阀→开脱色罐搅拌器，设定时间10min→开泵，开阀，将青霉素溶液经过过滤器到结晶罐→关泵，关阀→关脱色罐搅拌器 结晶： 开结晶罐搅拌器→开阀，加硝酸钠一乙醇溶液，至青霉素浓度为0，关阀→开冷却水阀，控制结晶温度为5℃→开泵，
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】 实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 1．实验目的 （1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。 （2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。 2．实验原理 重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。 工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。 补料的流加方式直接影响着发酵的效果。分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。 高密度发酵是工程菌剧烈生长繁殖的过程，这期间对氧气的需求量也大大提高，这就需要及时调整通风量和搅拌速度，一般的高密度发酵通风速度达18L/min（20L发酵罐），搅拌速度达500r/min以上，需保持60%以上的溶氧饱和度。此外，还需要考虑通风速度和搅
发酵工艺标准操作流程 (SOP) 一生产前准备 每次生产前按品种配方将所需原料称重准备齐全,并确认生产原料库存量,保证原料库存量足够下次生产所需、 二生产前检查 1检查蒸汽、压缩空气、冷却水进出的管路就是否畅通,所有阀门就是否良好,并关闭所有阀门、 2检查电路、控制柜、开关的状态,确保控制柜运行正常、 3检查空压机油表油表及轴承、三角带、气缸等就是否正常,确保空压机运行正常、 4检查发酵罐搅拌减速机的油量及密封轴降温水就是否正常、 三总过滤器灭菌 当蒸汽总管路上的压力为0、2-0、25MPa时,打开总过滤器进气阀输入蒸汽,同时打开出气阀的跑分阀、排气阀、排污阀,当三个阀均排出蒸汽时,调整进气阀、排污阀,稳定总过滤器压力0、15-0、2MPa,此时打开压力表下跑分,计时灭菌2-2、5小时、灭菌结束后启动空压机,当空气输入管道压力大于总过滤器压力时,关闭蒸汽阀,打开空气阀,将空气出入总过滤器,然后调整进气阀与排污阀,稳定总过滤器压力在0、15-0、2MPa,保持通气在15-20小时,当出气阀跑分与排污阀放出的空气为干燥空气时,完成灭菌、 四分过滤器灭菌 1当蒸汽管路压力为0、2-0、25MPa时,打开蒸汽过滤器的进气阀与排污阀,当蒸汽管路中无蒸汽凝结液后,再将蒸汽输入空气管路,然后打开分过滤器的进气阀、排污阀及出气阀上的跑分,当所有阀门均有蒸汽排出后,调整进气与排污阀,就是压力稳定在0、11-0、15MPa,计时灭菌30-35分钟、灭菌结束后,关闭蒸汽过滤器进出气阀、排污阀,并立即将空气输入预过滤器,使空气通过预过滤器进入到分过滤器,再调整分过滤器排污阀使压力稳定在0、11-0、15MPa,备用、
实验一单细胞蛋白（SCP）的生产 一、实验目的 1．了解单细胞蛋白的开发优势及技术现状。 2．掌握单细胞蛋白的液体深层培养法及工艺控制规律。 3．了解发酵过程中菌体浓度及生物量的一般检测方法。 二、实验原理 所谓SCP（SingleCellProtein）就是指那些工厂化大规模培养、作为人类食品和动物饲料的蛋白质来源的酵母、细菌、放线菌、霉菌、藻类和高等真菌等微生物的干细胞。SCP工业，主要是饲料酵母工业。酵母是一种单细胞微生物，生长繁殖快，菌体营养丰富。饲料酵母是一种营养价值很高的蛋白饲料，成品呈微黄色粉末状，具有酵母特殊香味。酵母蛋白质含量一般都在70%左右，比大豆高1倍。与肉蛋白、鸡蛋蛋白、大豆蛋白相比，单细胞蛋白所含的氨基酸组分齐全，有18-20种氨基酸，尤其是谷物中所缺乏赖氨酸含量较高。此外，维生素含量也十分丰富。每千克酵母类单细胞可使奶牛的产奶量增加6-7㎏，用含有10%单细胞蛋白饲料养鸡，产蛋提高21%-35%。1吨单细胞蛋白可节约5-7吨饲料粮，可产1.5吨鸡肉或3万枚鸡蛋。我国单细胞蛋白（酵母）年产量近3万吨，多用于医药、面包生产和饲料。用于生产饲料酵母的原料来源广泛，有矿物资源（如石油、甲烷、泥炭等）、纤维资源（如秸杆、木屑等）、糖类资源（如糖蜜、红薯等）、石油二次制品、废弃资源（包括有机废水、废渣、动物粪便等）。从我国目前的情况出发，生产饲料酵母等单细胞蛋白值得优先开发的原料有废糖蜜、薯干、纸浆废液，豆制品厂、味精厂、淀粉加工厂的废液等，用这些原料生产饲料酵母，首先是产品无毒性，另外也有利于解决工厂和城市的污染问题。 酵母细胞的发酵特点：目前，最广泛用于生产作为蛋白资源的酵母是假丝酵母，该酵母生长繁殖速度快，每2-4小时可繁殖一代，培养10小时左右就能繁殖到种子菌体量的15倍。发酵过程中，要保证罐内的液体混合良好和较适当地提供氧气，还要控制好温度和pH。采用流加间歇发酵可以保证糖被具有良好活性的酵母呼吸消耗，以达到最适产量。底物浓度过高，即使在有氧条件下，酵母也会发酵产生碳水化合物。如果酵母生长速率过快，底物也会发酵。因此，在培养过程中，底物浓度应维持在一定较低的水平，并维持一定的通风量。 酵母生物量的检测方法及分离：最普遍的检测方法是细胞干重法、显微镜记数法和光密度法。菌体的分离常采用过滤法和离心分离法。 三、实验仪器与材料 （一）仪器 10L发酵罐、恒温培养箱、超净工作台、显微镜、大容量冷冻离心机、高压灭 （二）材料
课程设计说明书 课程名称：发酵工程 设计题目：大肠杆菌的高密度发酵 院系：生物与食品工程学院 学生姓名：****** 学号：201006030051 专业班级：10生物工程（2）班 指导教师：*****
课程设计任务书设计题目大肠杆菌的高密度发酵 学生姓名所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班10生物工程 设计要求： 1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。 2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。 3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、设计标准要求规范、实用、切合实际。 5、设计应严格按有关设计规范进行。 6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。 学生应完成的工作： 1、明确设计标准适用的范围，给出产品以清晰明确的定义。 2、确定引用标准和技术要求，确定特定的理化指标及标准。 3、确定理化指标所采用的测定方法，一般首选国标或公认经典方法。新方法需经多试验或单一实 验法验证。 4、给出检验规则。 5、对产品的外观、流通保藏过程中操作给出规范。 参考文献阅读：[1] Fuchs C, Koste D, Wiebusch S, et al. Scale-up of dialysis fermentation for high cell densityCultivation of Escherichian coji[J]。Biotechnol, 2002, 93: B. 2002, 93: 243~251 [2] 刘子宇，李平兰，郑海涛等.微生物高密度培养的研究进展[J].中国乳业，2005，12:47~51 [3] Riesenberg D. High cell-density cultivation of Escherichian coli. Curr. Opin. Biotechnol.1991，2: 380~384 工作计划： 2013.5.27----2013.5.30 接受设计任务，查阅相关文献。 2013.5.30----2013.6.3 整理文献资料，进行产品标准的应用设计。 2013.6.3— 2013.6.9 整理设计内容，完成课程设计报告。 任务下达日期：2013年5月27日 任务完成日期：2013年6月9日 指导教师（签名）：学生（签名）：
发酵工艺标准操作流程(SOP) 生产前准备 每次生产前按品种配方将所需原料称重准备齐全,并确认生产原料库存量,保证原料库存量 足够下次生产所需. 二生产前检查 1检查蒸汽、压缩空气、冷却水进出的管路是否畅通, 所有阀门是否良好,并关闭所有阀门2检查电路、控制柜、开关的状态, 确保控制柜运行正常. 3检查空压机油表油表及轴承、三角带、气缸等是否正常,确保空压机运行正常. 4检查发酵罐搅拌减速机的油量及密封轴降温水是否正常. 三总过滤器灭菌 当蒸汽总管路上的压力为0.2-0.25MPa 时,打开总过滤器进气阀输入蒸汽,同时打开出气阀的跑分阀、排气阀、排污阀,当三个阀均排出蒸汽时,调整进气阀、排污阀,稳定总过滤器压力0.15-0.2MPa,此时打开压力表下跑分，计时灭菌2-2.5小时?灭菌结束后启动空压机，当空气输入管道压力大于总过滤器压力时,关闭蒸汽阀,打开空气阀,将空气出入总过滤器,然后调整进气阀与排污阀,稳定总过滤器压力在0.15-0.2MPa, 保持通气在15-20 小时,当出气阀跑分和排污阀放出的空气为干燥空气时,完成灭菌. 四分过滤器灭菌 1 当蒸汽管路压力为0.2-0.25MPa 时,打开蒸汽过滤器的进气阀和排污阀,当蒸汽管路中无蒸汽凝结液后,再将蒸汽输入空气管路,然后打开分过滤器的进气阀、排污阀及出气阀上的跑分,当所有阀门均有蒸汽排出后,调整进气与排污阀,是压力稳定在0.11-0.15MPa, 计时灭菌30-35 分钟.灭菌结束后,关闭蒸汽过滤器进出气阀、排污阀,并立即将空气输入预过滤器,使空气通过预过滤器进入到分过滤器，再调整分过滤器排污阀使压力稳定在0.11-0.15MPa,备用.
乳酸菌高密度规模发酵工艺优化 随着人们对抗生素滥用的重视,益生菌越来越广泛地应用于饲料、食品和医药行业,乳酸菌作为一种微生物资源因此受到越来越多的关注。乳酸菌高密度规模发酵是为提高菌体的发酵密度而使用的技术手段和特殊的培养装置,使菌体密度相较于普通培养方式能有显著的提高,最终提高菌细胞的产出率的一种扩大培养方式。 在实际生产过程中,乳酸菌菌体密度是乳酸菌发酵产品的重要指标。本试验以嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌为研究对象,筛选适合其增殖的培养基,研究适合乳酸菌的培养条件,优化乳酸菌中试高密度发酵工艺以及冷冻干燥保护剂组成。 本文的研究结果如下:(1)两株乳酸菌的形态学特征乳酸乳球菌在MRS培养基上可以形成明显的白色菌落,直径在1mm左右,圆形边缘整齐,不透明,表面光滑无皱褶。在添加碳酸钙的固体培养基中,菌落周围由于产酸形成透明的水解圈。 显微镜下观察,细菌成球形,不形成链状。嗜酸乳杆菌在MRS培养基上可以形成明显的菌落。 菌落圆形、白色、凸起,表面光滑、边缘较光滑,直径在1mm左右。在添加碳酸钙的固体培养基中,菌落周围形成透明水解圈。 在显微镜下观察,细菌成短杆状。两株乳酸菌通过革兰氏染色均为紫色,是革兰氏阳性菌。 (2)乳酸菌培养条件前期发酵条件优化前期实验室工作通过对两株乳酸菌的条件优化摸索,确定了以乳清粉为中试培养基,并确定乳酸乳球菌的最适培养温度在37℃C左右、初始培养基pH值在6.5、接种量在2%-7%之间,而接种量对最大活菌数的影响并不显著。培养28h可获最多的活菌,最大活菌数为 1.92±0.15
×108CFU/mL;嗜酸乳杆菌的最适培养温度在37℃C左右、初始培养基pH值在 6-6.5、接种量在5%-7%之间。 嗜酸乳杆菌在乳清粉培养基中培养32h可获得最大活菌数为1.53±0.15 × 1 08 CFU/mL。(3)高密度规模化发酵工艺优化随着乳清粉含量的增加,通过离心获得的乳酸菌干重是不断增加的。 当乳清粉含量增加至60%时,细胞干重(DCW/L)增加至13.21 g/L。通过乳清粉的添加,可以显著提高发酵罐中乳酸菌的细胞干重。 而从菌粉获得率计算,当乳清粉含量增加至60%时,嗜酸乳杆菌获得率增加 至23.42%。(4)冷冻干燥保护剂优化通过对离心获得的菌体添加10%的脱脂奶粉和10%的葡萄糖,或添加10%脱脂奶粉和10%海藻糖能够达到较高的复苏率。 通过进一步筛选得到四种具有显著保护性能的保护剂,并通过对乳酸乳球菌冷冻干燥保护剂的四因素三水平正交实验,结果得出这四种因素对于冷冻干燥后复苏率的影响,从大到小的顺序依此是葡萄糖>硫酸锰>脱脂奶粉>海藻糖。这四个因素对于冷冻干燥后的复苏率的影响都是极显著的,是影响该实验结果的主要因子。 通过正交实验,确定了一种冻干保护性较强的冻干保护剂组合,这种冻干保 护剂配比为每公斤菌体添加葡萄糖90g、海藻糖90g、硫酸锰60g、脱脂奶粉30g。冷冻干燥后的菌粉在储藏时应保持低温的环境,本次实验制备的两种菌粉在-20℃C环境下密封保存4周后,存活率仍能超过50%。 (5)乳酸菌耐受实验两株冻干菌粉对于人工消化液均有一定的耐受能力,乳 酸乳球菌在人工胃液中模拟消化3h存活率9.3%。在人工肠液中,经过4h的模拟消化过程,乳酸乳球菌的存活率为8.6%。
大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代谢副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。 预防乙酸产生的措施： 1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生： 比生长速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度，控制补料等方法来降低比生长速率。 2、透析培养： 在大肠杆菌的培养过程中可以用透析技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实现重组菌的高密度发酵和产物的表达。 3、控制葡萄糖的浓度： 葡萄糖是大肠杆菌发酵过程中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个较低的水平上，以减少乙酸的产生。 常用的控制方法主要有： 恒pH法：大肠杆菌会代谢葡萄等产生乙酸，使pH 值下降。因此可通过pH值的高低作为控制葡萄糖的指标，该法的缺点是pH 的变化不完全是由葡萄糖代谢的结果，容易造成补料体系出错。 恒溶氧法：菌体代谢时会消耗氧，使溶氧下降，当葡萄糖浓度低到一定程度时菌体代谢下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根据溶氧曲线补加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在一定的水平。 二、温度
发酵工艺标准操作流程 (SOP) 一生产前准备 每次生产前按品种配方将所需原料称重准备齐全,并确认生产原料库存量,保证原料库存量足够下次生产所需. 二生产前检查 1检查蒸汽、压缩空气、冷却水进出的管路是否畅通,所有阀门是否良好,并关闭所有阀门. 2检查电路、控制柜、开关的状态,确保控制柜运行正常. 3检查空压机油表油表及轴承、三角带、气缸等是否正常,确保空压机运行正常. 4检查发酵罐搅拌减速机的油量及密封轴降温水是否正常. 三总过滤器灭菌 当蒸汽总管路上的压力为0.2-0.25MPa时,打开总过滤器进气阀输入蒸汽,同时打开出气阀的跑分阀、排气阀、排污阀,当三个阀均排出蒸汽时,调整进气阀、排污阀,稳定总过滤器压力0.15-0.2MPa,此时打开压力表下跑分,计时灭菌2-2.5小时.灭菌结束后启动空压机,当空气输入管道压力大于总过滤器压力时,关闭蒸汽阀,打开空气阀,将空气出入总过滤器,然后调整进气阀与排污阀,稳定总过滤器压力在0.15-0.2MPa,保持通气在15-20小时,当出气阀跑分和排污阀放出的空气为干燥空气时,完成灭菌. 四分过滤器灭菌 1当蒸汽管路压力为0.2-0.25MPa时,打开蒸汽过滤器的进气阀和排污阀,当蒸汽管路中无蒸汽凝结液后,再将蒸汽输入空气管路,然后打开分过滤器的进气阀、排污阀及出气阀上的跑分,当所有阀门均有蒸汽排出后,调整进气与排污阀,是压力稳定在0.11-0.15MPa,计时灭菌30-35分钟.灭菌结束后,关闭蒸汽过滤器进出气阀、排污阀,并立即将空气输入预过滤器,使空气通过预过滤器进入到分过滤器,再调整分过滤器排污阀使压力稳定在0.11-0.15MPa,备用.
3. 培养基 3.1 一级种子：胰蛋白胨10 g/Ｌ LB培养基酵母提取物5 g/Ｌ 氯化纳10 g/Ｌ PH 7.3 加水至1L 3.2 二级种子：胰蛋白胨16 g/Ｌ ２×ＹＴ培养基酵母提取物10g/Ｌ 氯化纳 5 g/L PH 7.3 加水至1L LK：LB＋卡纳霉素（50mg/L） 3.3 罐料培养基：胰蛋白胨102g 酵母提取物64g 葡萄糖 6.4g 氯化钠 1.6g 磷酸氢二钠48g 磷酸二氢钾9.6g 氯化铵 3.2g 氯化钙0.035g 硫酸镁 3.2g 维生素B1 0.1g PH 7.2 加水至3.2L 3.4 补料培养基：酵母提取物200g 胰蛋白胨20g 甘油200ml 葡萄糖10g 硫酸铵5g 硫酸镁5g 维生素B1 0.1g 原始PH，加水至0.8-1.0L
以上培养基中均加卡纳霉素，加量50mg/L 胰蛋白胨、酵母提取物为OXOID公司产品，卡那霉素为Genview公司产品，IPTG为Japan 产品，其余试剂为国产分析纯。发酵罐：NBS5LBioflo3000，扫描仪(GE公司U9909-H7L0),Unico7200分光光度计。 4. 实验方法与过程 发酵工艺路线：保藏菌种单菌落一级种子（F1）二级种子(F2) 发酵离心收集菌体。 4.1 菌种活化与扩大培养 将保藏在-20℃工作种子液解冻,取10μl，梯度稀释，10-5、10-6、10-7涂LB平板37℃培养16-18小时左右生产单菌落。 F１发酵菌种：挑取LK平板单一菌落，接入50ml/250ml三角瓶LB培养基中（含卡纳霉素）37℃，200rpm培养箱8～10小时，至O.D600×10达0.25～0.35。F２发酵菌种：将F１按0.5%接种量接到200ml/1000ml三角瓶，2×YT培养基中（含卡纳霉素）37℃,200rpm摇荡培养，培养7～8小时至O.D600×10达0.3～0.5。 4.2 发酵罐发酵培养 将生长好的F2，400ml种子液接入发酵罐，37℃培养至O.D600×100达40-50，加IPTG诱导，加量0.1～0.2mmol/L，诱导3.5～4小时，压缩空气做气源，保持通气量1vvm ，溶氧控制30－45%，发酵2.5小时左右开始通氧，发酵过程控制pH7.0－7.2，每隔１小时取样一次，测O.D600至最大，不再增长。补料速率在培养阶段控制在补料泵10%－40%，随发酵时间以10%增长，诱导阶段，补料速率控制在补料泵20%－40%，在诱导阶段第一小时内补料速度最大,放罐前半小时停止补料。 检测 4.3.1测O.D600 ：使用“7200”分光光度计,波长600nm； 对照:蒸馏水； 样品:发酵液用蒸馏水稀释至合适倍数。
文章编号:1000-9973(2004)05-0017-05 乳酸菌发酵剂高密度培养的研究 熊晓辉,于修 ,熊强,陆利霞 (南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京 210009) 摘要:研究了乳酸菌生长繁殖的环境条件(温度、接种量、起始pH 等)和培养基组成(氮源、碳源、缓冲盐等),优化确定了乳酸菌发酵剂的适宜培养条件为:起始pH 值为6.5,培养温度为37 ,培养基配比为麦芽糖 乳糖(1 1)2%、牛肉膏1.0%、缓冲盐A0.5%、NaCl0.25%、M gSO 40.1%,接种量4%,进一步探索了半连续法进行高密度培养,结合优化的培养条件,可使乳酸菌的液体发酵活菌密度至1.1 1012CFU/mL 。 关键词:乳酸菌;发酵剂;高密度培养中图分类号:TS201.5 文献标识码:A High cell density culture of lactic acid bacteria starter XIONG Xiao hui,Y U Xiu jian,XIO NG Qiang,LU Li Xia (College of Life Science and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 210009,China) Abstract:This paper studied on the high cell density culture of L actobacillus sp p .,and discussed the effects of cultural condition (temperature,inoculation capacity and initial pH)and media composition.The optimal culturing conditions were developed ,follow ing:1%maltose,1%lactose,1.0%beef ex tract,0.5%buffer salt A,0.25%sodium chloride,0.1%m agnesium sulfate,pH6.5,4%inoculation capacity.T hen high cell density culture w as explored w ith one semi-continuous w ay and obtained the cells population over 1.1 1012CFU/mL for 16hours based on the optimal condition.Key words:Lactic acid bacteria;starter;hig h cell density culture 乳酸菌是生产发酵乳制品、泡菜、干酪、发酵香肠等传统发酵食品,赋予其特殊质地、风味和口感的重要微生物菌群,而这些传统食品的专用发酵剂的生产和研制将对实现其工业化生产、缩短产品成熟期、使产品特征标准化和安全化起重要作用,也是传统食品的发展方向[1,2]。浓缩发酵剂[1,3,4](特别是冻 干发酵剂)具有活力高、体积小、携带使用方便的特点,可直接用于发酵制品生产,省去扩大培养的复杂操作过程,从而简化产品生产工艺,有利于保持产品质量的稳定,防止菌种的退化和污染。 乳酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现对其进行高活性、高密度的培养[1,4]。高密 收稿日期:2004-02-25 基金项目:国家862自然科学基金资助项目(2002AA8041) 第5期2004年5月 中国调味品 CHINA CONDIMENT No.5M ay.2004
56 2019, V ol.40, No.08食品科学※生物工程 布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化 刘开放，席志文，黄林娜，惠丰立* （南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳 473061） 摘?要：为实现布拉酵母高密度培养，对其高密度发酵培养基和发酵工艺进行优化。采用Plackett-Burman试验筛选培养基中的显著因素，并进行中心组合设计。通过人工神经网络（artificial neural network，ANN）和响应面试验建立菌体布拉酵母产量与培养基之间的关系模型，利用遗传算法（genetic algorithm，GA）进行全局寻优。结果表明，ANN模型有较好的数据拟合能力和预测能力，更适合处理复杂的非线性问题。GA优化获得最佳培养基组合：葡萄糖40.52 g/L、蛋白胨36.8 g/L、玉米浆17.32 g/L、硝酸钾14 g/L、酵母营养盐1.5 g/L、磷酸二氢钾0.6 g/L、硫酸镁0.8 g/L。利用该培养基进行摇瓶培养，菌体布拉酵母产量可达到8.21 g/L，比优化前提高1.39 倍。在此基础上利用1 L发酵罐培养确定最佳发酵工艺：温度30 ℃、接种量10%、pH 5.0、溶氧40%。利用50 L发酵罐进行扩大培养，流加葡萄糖和蛋白胨控制发酵液中葡萄糖3 g/L、氨氮0.06 g/L，菌体布拉酵母产量达到51.21 g/L。 关键词：布拉酵母；神经网络；遗传算法；增殖培养基；高密度培养 Optimization of High Cell Density Fermentation of Saccharomyces boulardii for Enhanced Biomass Production LIU Kaifang, XI Zhiwen, HUANG Linna, HUI Fengli* (College of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China) Abstract: For high cell density cultivation of Saccharomyces boulardii, we attempted to optimize medium composition and culture conditions. Plackett-Burman design was used to recognize the signi?cant medium components. Subsequently, response surface methodology and arti?cial neural network (ANN) based on central composite design (CCD) were applied to model the relationship between dry biomass production and medium composition. The optimization of medium composition was carried out using genetic algorithm (GA). The results showed that the ANN model, more suitable for complex and nonlinear modeling, had better goodness of ?t and prediction performance. The optimal medium composition was obtained as follows (g/L): glucose 40.52, peptone 36.8, corn steep liquor 17.32, KNO3 14, yeast nutrients 1.5, KH2PO4 0.6 and MgSO4 0.8 shake ?ask cultivation using the optimized medium gave a dry biomass yield of 8.21 g/L, which was 2.39 folds higher than that obtained from the original medium. Based on these results, we determined the optimal high cell density culture conditions for S. boulardii cultivated in a 1-L fermentor as follows: temperature 30 ℃, 10% inoculum, pH 5.0 and 40% dissolved oxygen. Furthermore, we scaled up the culture process in a 50-L fermentor with the addition of glucose and peptone to maintain the glucose concentration at 3 g/L and the ammonia nitrogen concentration at 0.06 g/L. The dry biomass yield of S. boulardii reached 51.21 g/L in the large scale experiment. Keywords: Saccharomyces boulardii; neural network; genetic algorithm; enrichment medium; high cell density fermentation DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180424-323 中图分类号：Q815 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2019）08-0056-07引文格式： 刘开放, 席志文, 黄林娜, 等. 布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化[J]. 食品科学, 2019, 40(8): 56-62. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180424-323. https://www.doczj.com/doc/f915112268.html, LIU Kaifang, XI Zhiwen, HUANG Linna, et al. Optimization of high cell density fermentation of Saccharomyces boulardii for enhanced biomass production[J]. Food Science, 2019, 40(8): 56-62. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-20180424-323. https://www.doczj.com/doc/f915112268.html, 收稿日期：2018-04-24 基金项目：国家自然科学基金面上项目（31570021） 第一作者简介：刘开放（1993—）（ORCID: 0000-0002-2575-893X），男，硕士，研究方向为发酵工程。 E-mail: liukaifang126@https://www.doczj.com/doc/f915112268.html, *通信作者简介：惠丰立（1965—）（ORCID: 0000-0001-6542-1525），男，教授，硕士，研究方向为食品微生物与发酵工程。 E-mail: hui?@https://www.doczj.com/doc/f915112268.html,
第一章绪论 第一节概述 工业发酵是利用微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的一门现代工业，而现代发酵工程则是指直接把微生物(或动植物细胞)应用于工业生产的一种技术体系，是在化学工程中结合了微生物特点的一门学科。因而发酵工程有时也称作微生物工程。在本章中，我们将对发酵的基本概念，工业上常用的微生物及其生长代谢特性，以及发酵工程原理作—简单介绍。 一、基本概念 1，发酵一词的来源 发酵现象早巳被人们所认识，但了解它的本质却是近200年来的事。英语中发酵一词fermentation是从拉丁语fervere派生而来的，原意为“翻腾”，它描述酵母作用于果汁或麦芽浸出液时的现象。沸腾现象是由浸出液中的糖在缺氧条件下降解而产生的二氧化碳所引起的。在生物化学中把酵母的无氧呼吸过程称作发酵。我们现在所指的发酵早已赋予了不同的含义。发酵是生命体所进行的化学反应和生理变化，是多种多样的生物化学反应根据生命体本身所具有的遗传信息去不断分解合成，以取得能量来维持生命活动的过程。发酵产物是指在反应过程当中或反应到达终点时所产生的能够调节代谢使之达到平衡的物质。实际上，发酵也是呼吸作用的一种，只不过呼吸作用最终生成CO2和水，而发酵最终是获得各种不同的代谢产物。因而，现代对发酵的定义应该是：通过微生物（或动植物细胞）的生长培养和化学变化，大量产生和积累专门的代谢产物的反应过程。 2，发酵的定义 （1）狭义“发酵”的定义 在生物化学或生理学上发酵是指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出二氧化碳。同时获得能量，丙酮酸被还原为乳酸而获得能量等等。 （2）广义“发酵”的定义 工业上所称的发酵是泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程，它包括厌氧培养的生产过程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等的生产。产品即有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。 3，发酵工程（Fermentation Engineering）的定义 应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。 二、发酵的特点 发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化学反应。其主要特点如下： 1，发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学反应，反应安全，要求条件也比较简单。 2，发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这—特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。 3，发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反应的专一性强，因而可以得到较为单—的代谢产物。 4，由于生物体本身所具有的反应机制，能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的化合物进行特定部位地氧化、还原等化学转化反应，也可以产生比较复杂的高分子化合物。 5，发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。除了必须对设备进行严格消毒处理和空气过滤外，反应必须在无菌条件下进行。如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的经济损失，要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。因而维持无菌条件是发酵成败的关键。 6，微生物菌种是进行发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分
发酵车间工艺文字流程 葡萄糖酸钠既是一种优良的食品添加剂，又是良好的水质稳定剂，还是改善建筑质量的缓凝剂和泵送剂。我公司采用食品级玉米淀粉为原料，经葡萄糖酸钠专用菌种，经一系列生化反应转化成葡萄糖酸钠。发酵车间包括制糖工段和发酵工段。 一、制糖工段 在制糖工段，玉米淀粉在调浆工序制成玉米浆，调节好各个指标，加入耐高温淀粉酶，经高压蒸汽喷射液化，经各层流罐保温，在高温酶的作用下，大分子淀粉颗粒转化成小分子糊精、低聚糖后，调节好各指标，加入复合糖化酶，进入糖化罐保温，在糖化酶的作用下，将液化液中的小分子片段分解转化成单分子的葡萄糖。当糖化各指标合格，糖化液经压滤系统过滤得到纯净的葡萄糖液，送发酵工段。 二、发酵工段 发酵工段采用使用菌种的三级发酵法和双酶发酵法。 （一）三级发酵法：一级种子扩培、二级种子扩培、发酵 1、一级种子扩培：从制糖工段来的葡萄糖液以适当的碳氮比加入一级种子罐，加以合适的微量元素，经中温中压蒸汽灭菌后，合适条件下接入菌种，保证通风溶氧温度等条件适宜，培养的菌种以合适的种龄，菌丝健壮无杂菌，各指标正常条件下在无菌条件下转入二级种子培养。这里的种子是菌种室对原始菌种进行一系列的高渗等培育筛选出的适合生产的优良菌株，在经过一系列扩培后达到的足够数量接种一级罐的菌种。 2、二级种子扩培：从制糖工段来的葡萄糖液以适当的碳氮比加以合适的微量元素，经中温中压蒸汽灭菌后，进入二级种子罐，在合适的条件下转入一级
扩培的种子。进入二级种子培养的菌丝在充足的溶氧条件下，经过短暂的调整期后会在这个新环境里迅速进入另一个对数生长期。当各项指标合格，菌丝健壮无杂菌，无菌条件下转入到发酵罐。 3、发酵罐：从制糖工段来的葡萄糖液以适当的碳氮比加以合适的微量元素，经中温中压蒸汽灭菌后，进入发酵罐。当温度溶氧等条件适宜时，转入二级种子培养物。在发酵罐中，种子经由短暂的调整期后，迅速生长，很快进入稳定期。在这个时期里，菌种代谢旺盛，在各种酶系的作用下，将葡萄糖转化成葡萄糖酸。这时加入高纯度的离子膜碱，一方面中和葡萄糖酸生成我们的目的产物葡萄糖酸钠，另一方面保证菌种代谢旺盛的最佳PH值范围。当发酵罐中的葡萄糖被转化完后，得到葡萄糖酸钠发酵液，送提取车间提纯得到合格的产品。 （二）双酶法发酵 双酶法发酵是我公司经过多次试验成功的一种新式发酵法。是和普通发酵法不同的一种发酵方法。省去菌种的扩培过程，直接利用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶转化葡萄糖成葡萄糖酸，在中和生成葡萄糖酸钠。具体操作为：从制糖工段来的葡萄糖液，经中温中压蒸汽灭菌后，进入发酵罐，在适宜条件下加入适量的双酶，保证溶氧温度等条件下，双酶迅速作用，将葡萄糖转化成葡萄糖酸，加高浓度离子膜碱中和成葡萄糖酸钠。 双酶法较发酵法发酵周期短，设备利用率高，在国内同行业数先进水平。
发酵工艺优化 前言：发酵工艺的优化在发酵行业起到很大的作用,尤其是在发酵生产中,它是提高发酵指标的一项非常,有用的技术手段.同时也是搞发酵行业的人的必备知识要求之一,借此我想通过和大家交流共同提高发酵方面的知识水平. 一、发酵工艺优化方法与思路:发酵工艺优化的方法有很多,它们之间不是孤立的,而是相互联系的。在一种发酵中,往往是多种优化方法的结合,其目的就是发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。 同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率,在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH 值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。 注意:大家可以从以下各个方面进行交流.尽量能够分类进行叙述,