发酵工艺优化
前言：发酵工艺的优化在发酵行业起到很大的作用,尤其是在发酵生产中,它是提高发酵指标的一项非常,有用的技术手段.同时也是搞发酵行业的人的必备知识要求之一,借此我想通过和大家交流共同提高发酵方面的知识水平.
一、发酵工艺优化方法与思路:发酵工艺优化的方法有很多,它们之间不是孤立的,而是相互联系的。在一种发酵中,往往是多种优化方法的结合,其目的就是发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。
同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率,在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH 值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。
注意:大家可以从以下各个方面进行交流.尽量能够分类进行叙述,
我总结了以下几累,也不是很全,当然从其他的方面进行交流也可以,但是希望你注明附加说明!
二. 好氧发酵
1. PH工艺的优化
2. 溶氧工艺的优化
3.原材料工艺的优化
4.消毒(灭菌)工艺的优化
5.菌种制备工艺的优化
6.小试到中试,中试到生产等扩大实验的工艺优化
7.成本工艺优化
8.种子罐工艺的优化
9.发酵罐工艺参数控制的优化
10.仪表控制的工艺优化
11.环境的工艺优化
12.染菌处理的工艺优化
13.紧急情况处理的工艺优化(停电\停水\停气\停汽等)
14.补料工艺的优化
15.倒种工艺的优化
16发酵设备的工艺优化
17.其他的工艺优化
三. 厌氧工艺的优化
四.固体发酵的工艺优化
五.其他
1. PH工艺的优化
A.配料中的PH 很重要,其中有配前PH,配后PH,消前PH,消后PH,接种前PH,工艺控制PH等,配前PH,配后PH,可以用来检测厡材料的质量,初步估计配料的情况,如果出了错误,有时候可以从PH中的变化看出来,能够减少错误的发生.
B.另外,每次有新的配方我们总是要用PH方法检测其中的每种厡材料是否会和其他的发生反应,可以互相两两混合,检测PH的变化,
也可以用来作为配微量元素的检测.
C.消前PH可以用来减少消毒过程对培养基的破坏,因为培养基在消毒中会有PH的变化,在不同的PH条件下对培养基破坏也不一样,因此可以在消毒的时候选择合适的PH,消毒完后可以调节过来,这样一来可以对PH敏感的一些原材料减少破坏,这种方法在生产中已经取得了初步的成绩,提高了指标.
D.工艺控制的PH,在发酵的产抗期间,通过在不同的发酵时间调整不同的PH,可以减少杂质的产生,同时还可以缓解溶氧,比如在头孢发酵中,通过在后期调整PH可以减少DCPC的含量,给提取工序带来很大的好处,
E.补料罐通过PH的调节可以更好的通过流加物料而不影响发酵. (部分发酵在不同时期的PH有所不同,所以通过补料罐的调整可以对发酵指标有所提高)
F.发酵过程中的PH调节可以通过各种方法,不一定要添加氨水和氢氧化钠,可以添加玉米桨等其他的物料来进行调节.
G.控制放罐时的PH可以对后面的过滤有所影响,所以一定要控制好放罐前的PH
H.绘制种子瓶和种子罐以及发酵罐等整个发酵过程的PH生长曲线,可以用来参考控制工艺,检测无菌情况的发生.
六、A. 华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化的有关现象,研究细胞代谢物质流与生物反应器物料流变化的相关性，高度重视细胞的生长变化，尽可能多地从生长变化中做出有实际价值的分析，进一步建立细胞生长变量与生物反应器的操作变量及环境变量三者之间的关系，以便有效控制细胞的代谢流，实现发酵过程的优化。
B. 补料分批发酵技术该技术可以有效地减少发酵过程中培养基黏度升高引起的传质效率降低、降解物的阻遏和底物的反馈抑制的现象，很好地控制代谢方向，延长产物合成期和增加代谢物的积累。所需营养物限量的补加，常用来控制营养缺陷型突变菌种，
使代谢产物积累到最大。氨基酸发酵中采用这种补料分批技术最普遍，实现了准确的代谢调控。
C. 超声波的应用:超声波有很强的生物学效应。可应用于发酵过程的上、中、下游三个阶段。其在发酵工艺上的应用，可增加细胞膜的通透性和选择性，促进酶的变性或分泌，增强细胞代谢过程，从而缩短发酵时间，改善生物反应条件,高生物产品的质量和产量. 超声波的作用机制分为热作用、空化作用和机械传质作用。热作用是超声波在介质内传播过程中，能量不断被介质吸收而使介质的温度升高的一种现象，可用于杀菌或使酶失活。空化作用是超声波在介质中传播时，液体中分子的平均距离随着分子的振动而变化。当其超过保持液体作用的临界分子间距，就形成空化（空泡）。空泡内可产生瞬间高温高压并伴有强大的冲击波或射线流等，这足以改变细胞的壁膜结构，使细胞内外发生物质交换。机械传质作用是超声波在介质中传播时，可使介质质点进入振动状态，加速发酵液的质量传递，提高发酵过程的反应速度。超声波可广泛应用于生物发酵工程。不同频率和强度的超声波对发酵过程的作用是不同的，使用时应视具体的发酵工艺和使用条件进行选择。增加前体物的合成增加目的产物的前体物的合成或是直接添加前体物，均有利于目的产物的大量积累。如：在氨基酸的发酵中，通常在微生物的培养中加入前体，生产氨基酸；在花生四烯酸的发酵中，通过增加前体物或是加强糖代谢的途径，增加其前体物的合成，均有助于提高花生四烯酸的产量。去除代谢终产物改变细胞膜的通透性，把属于反馈控制因子的终产物迅速不断地排出细胞外，不使终产物积累到可引起反馈调节的浓度，即可以预防反馈控制。
七、、发酵工程的优化不是很全,、其主要是在两个方面进行优化:营养条件与环境条件的优化.目前做发酵优化没有什么前途,发不了高水平的文章,应该说发酵工程优化是Technology,而不是science.其主要着眼点在于实现发酵过程的高产量\高产率\高生产强度的相对统一.从以下几个方面实现优化技术:
1 基于微生物反应原理的培养环境优化技术;
2 基于微生物代谢特性的分阶段培养技术
3 基于反应动力学和人工智能的优化和控制技术
4 基于代谢通量分析的过程优化技术
5 基于系统观点的生物反应系统优化技术
6 基于胁迫条件下微生物生理应答特性的发酵过程优化技术
八、发酵工程包括不少内容，工艺的优化也有很多值得研究的地方。但是很多的理论是和生产实践相脱节的，也可以说对某些生产项目而言是没必要做过多的研究的（比如绝大多数的基因工程菌），说白了，就是看菌种好坏。
另外，个人认为，发酵工艺条件的优化，还是要结合具体的代谢产物和微生物来针对性研究。希望从理论和整体的角度做研究，对优化而言是没有效率的。
这里只是从实用性角度来说的，我并不怀疑发酵工艺的价值。
发酵工程优化是Technology,而不是science。但是有些事情可能不是你想象的那样，毕竟现在国内的公司和厂家主要以Technology 为主，学校和科研单位以基础理论为主，现在的大体情况是科研和实际的生产应用有些脱钩，搞科研的大部分对搞生产的知识和应用有所缺陷，相反搞生产的觉得搞科研用处不大，尤其是现在的国内大的公司很少有出钱搞科研（基础理论研究）的，他们宁愿把大部分的钱用于工艺上的改进，而不愿意投资搞新产品的开发。其他方面我不是很清楚，但是在生物制药方面中国的新产品开发和应用成功的现在几乎占不到国外的千分之一。根据调查（刚刚进行的在北京进行的国际首届生物高级经济论坛报告）指出，现在中国的公司和科研脱钩严重，搞科研的只关心发高水平文章，不关心应用，更不关心生产。他们并不了解公司真正需要什么技术，现在公司和科研单位（包括学校）真正联手搞发展的很少，走形式的很多。像国外大的公司自己出钱搞科研开发的几乎没有，因为大部分的公司宁愿花钱去买现成的工艺和技术。九、至于公司和学校等科研单位合作很难的原因有很多，什么保
密、付款、应用等等，我们关心的是我们毕业早晚要参加工作，如果搞理论和科研也好，但是大部分的人员是要参加公司工作的，所以多了解这方面的知识，尤其是理论和实践结合的知识对我们很有用处。因为我们公司近几年招徕的新学生（包括研究生和博士）对公司的生产和科研很不适应，他们往往只是从事某方面的工作，而且基础的东西占有很大的比例。为了更好的毕业后融入工作人员的大家庭，出于这个目的，所以我才开这个交流，希望对将要毕业从事工作的人有所帮助，也对刚刚参加工作的人有所启示。大家共同学习，提高，当然在更多的方面进行交流更好，我们可以学习更多的知识。
我再根据自己的经验谈谈：不足之处，敬请大家给与补充改正！
十、溶氧工艺的优化
A.影响溶氧的条件有：温度、通气量、发酵液性质、物料的性质、补料的情况、压力、搅拌的形式、设备的各种参数、菌丝本身的情况、染菌等等
b. 控制好的溶氧要从各个方面分析入手，比如说，在不同的周期要调整各种影响溶氧的条件顺序就不一样，前期可以调整通气量，罐压然后温度，经搅拌等对生产指标影响不大，但是在发酵后期则要注意：如果你的军种和产物的生产对温度敏感的话，则需要最后调整温度，如果对压力或者二氧化碳敏感的话则最后再调整压力。其他的情况一样。也可以通过顺序调整来节省成本。
c. 搅拌的形式很多，我们试过很多的形式，根据设备的不同选型有所不同，但是必须要根据你的发酵液的性质和电机的功率等进行选择。这方面在发酵设备这本书上有详细的描述。注意一点是：搅拌的选择要注意它的接口和缝隙，避免染菌。
d. 空气分布器可以根据设备的情况进行设计，保证它和物料的混合度达到最大当然最好。不过一定要考虑它对染菌的影响。以及对其进行清洗的方便和消毒的方便，不易杜塞等。
e. 通过补料可以缓解溶氧，尤其是你的部料成分对发酵后其有很大影响的时候，通过合适的补料时间和补料量的控制可达到提高
发酵指标的效果。具体问题具体分析了！
f. 通气量的控制可以根据菌丝的ph 的变化和溶氧计的测量进行控制，同时可以根据补料量的多少进行控制，这些均可以作为调整溶氧的参考依据。
十一、做发酵优化一定要有针对性,在你做一个新品种时,一定要忘记你原来品种的所有特性,把注意力集中到你所从事的具体微生物的培养上来!就象人才培养一样要因才施教,要有感情的去对待它,微生物也是生物,在某方面同人一样,这是我做发酵几年的体会,对于发酵是TECHNOLOGY还是SCIENCE,以及前途如何均不重要,重要的是要把自己所做的事情做好,做精,做细,就能实现TECHNOLOGY与SCIENCE之间的转化,它们表象不同,本质一样!无论工作和试验都是一样的，需要你尽心尽力去认真的对待，只有踏踏实实认认真真的努力去把试验和工作做好,做精,做细，我觉得任何人都会有很多的收获的。我做了好几年的生物制药工作，深感到做好一件工作并不是一件容易的事情，在发酵工艺改进这方面的工作也做了很多，有一点身有感触，就是其实我们做微生物试验不妨把自己的位置和微生物换个角度考虑，就会得到很多的启事。
举个例子来说吧！曾经有位博导说过，我们自己在培养微生物，用微生物进行试验，但是我们总是把他们当作微生物看待，当自己试验品，我们不妨换个角度，如果我们和微生物一样的话，即我们在微生物角度那么我们应该怎样进行试验呢！我们所用的大多数高产菌株几乎大部分是缺陷型菌株，也就是说是病态菌株，所以我们如果能够向对待病人一样对待他，知道他需要什么，病症在那里，如何维持我们所需要的状态等，就会理所当然的得到他的配合，也就是能够更多的得到我们所需要的产物。
从中我得到了很多的启事，当然我们不是微生物，但是我们可以从其他的角度去考虑问题，或许能够得到意想不到的效果！！呵呵！
十二、从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处
1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑
2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。
3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。
4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。
5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。
6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。
7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。
8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。
9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。
10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等。
十三、补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点：
(1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。
(2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。
(3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。
(4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。
(5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。
十四、连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。
目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统
十五、消毒(灭菌)工艺的优化
1、消毒又叫灭菌，但是又很多的区别在里面（可以上网搜索资料参考，很多的），我们在公司一般把它称为消毒。消毒其实又很多的学问在里面，一个好的消毒工可以达到一年内千分之一的染菌率，非常的厉害！！
2、发酵液经过消毒会遭到很大的破坏，所以首先需要控制消毒前的PH，而后控制消毒时的温度和时间（非常重要，有时候对发酵指标又很大的影响），在VB12发酵中，消毒的质量可以直
接影响发酵的水平，从消后的指标就几乎能得出放罐时的指标。所以必须控制消毒的温度和时间。
3、消毒的方式的不同对发酵影响也很大，公司一般分实消（间断消毒）和连消两种，连消的发酵液质量较好，但是对设备仪器要求恨严格。实消操作简单，但是控制也不容易，对发酵噎破坏较大，因为它的升降温时间很长。对设备破坏较大，（震动和蛇罐等）。
4、现在出现一种是螺旋板换热器连续消毒，很方便也很经济。它的原理和连消鞳相似，只是它靠板式换热，不和蒸汽直接接触，而且它的消毒蒸汽冷凝水可以回流到原培养基进口处加热培养基，可以节约成本。而且可以控制培养基的体积。但是对设备的要求很严格（为了保证无菌要求），很少的设备公司能够做好这样的设备。
5、发酵的补料消毒可以通过调节好PH的几种料一起进行消毒，节约成本，如果部分的发酵中对几种物料的利用安比例进行，而且这些物料不发生任何反映，这样消毒既可以调节浓度控制蒸发量，又可以节约能源，一举两得。
6、部分得补料可以加入某种不容物质，消毒后再分开。保证设备的干净和无菌等，例如油里面可以加入其他的易溶于水的物质等，消毒后分水时可以把它分开。
7、消毒在保证无菌的前体下，还要考虑经济、对培养基破坏情况、操作方便（节省维修时间人员等）、工艺改进等等。
十六、剪切力的计算可以参考（发酵设备），一般的说剪切力一般以搅拌叶的线速度测量，如果没有摇瓶没有搅拌可以参考摇瓶中最大的线速度，
计算公式为：转速*3.14*摇瓶中最大的半径的平方。
不过我觉得影响你发酵可能是胞外次级代谢物或者其他的物质。摇瓶中的剪切力对菌种的影响很小，不过你的菌种我不是很熟悉，不过凭我的经验我觉得他不是主要的因素。
我考虑的可能是氧气对你的影响较大，可能你搅拌时破坏了菌
种的生长环境，导致他的代谢途径改变，产生了其他的物质（可能是有害物质）导致了菌种的生长环境改变影响了它的代谢。
还有一点是：你的培养基条件不是很适合菌种的生长，菌种在前期创造了自己生长条件，结果搅拌遭到破坏所以没有长好。
十七、浅谈在发酵工艺优化中统计手段的重要性。
1. 协同效应与关键因素：优化发酵工艺实质是考察各个变量对优化目标的效应以获得各因素（变量）对目标值的影响关系，进而以此为基础确定最优操作条件。同其他学科一样，在发酵优化时如果能建立各因素对目标的数学表达函数是最为理想的。但由于发酵中微生物性质的复杂性（微生物内部的代谢机理，调控机制等）及发酵环境多样的传递特性（热，质量、动量），使得要建立一个准确的机理模型十分困难。因此目前常见的发酵模型多为黑箱模型，即拟合模型（虽然随着对微生物代谢途调控机制的了解及生化反应动力学的发展，不少成功的机理模型也被建立并用于发酵的优化和调控——可参见诸多生化反应动力学教程及研究文献）。同时，更简单的单因素试验或稍复杂的正交试验也在发酵工艺优化中得到普遍应用。虽然针对不同的优化要求，优化手段当然可以也应该尽量简单，但目前很多国内学术研究文献还频频采用正交试验的确让人感觉很惋惜，特别是对试验数据的统计处理不够重视，相关的检验欠缺。因为在发酵时，涉及微生物性质（种类、种龄、活力，接种量），生长条件（pH、温度），培养基组成，传递条件（溶氧量或转速、搅拌速度）等多个变量，所以不仅要考察每个因素的效应，还应考察是否存在不同因素的协同效应。一般而言，存在如此多的因素，协同效应在所难免。而要高效判别协同效应，统计手段就不可不重视。此外，要高效的进行优化时，也应该借助统计手段确定各个因素的效应大小，选择重要的因素进行重点考察，即抓住主要矛盾把好钢（精力）用在刀刃（关键因素）上。因此，在优化发酵工艺时，一定要有意识的应用统计手段，首先确定关键因素（包括产生重要协同效应的因素），而后再集中精力优化关键因素。值得一提的
是，要事半功倍地实现优化目标，就应该时刻牢记要抓住主要矛盾。
2. 用统计手段建立数学模型：前点已提及要建立数学模型，但为什么要用统计手段建立数模了？我们都知道盲人摸象的故事，其实优化发酵工艺也与此类似。试想，如果我们能准确地定量了解各个因素是如何影响发酵目标的，那要进行优化就是个简单地求最值的问题。之所以进行单因素试验或者正交试验，目的就是通过考察输入－输出关系建立变量－响应间的关系。我们如果仅仅通过考察几个孤立的点就想得到一个系统的全局的关系实在有盲人摸象的危险：获得一个局部的关系，得到一个局部的极值而非全局最值；或者获得失真的关系，得到连极值都不是的结果。而如果借助统计手段，我们可以有意识的选取一些有代表性的点，以获得全局的正确关系。比如，如果确定一个正方体的考察空间，那可以选择八个顶点＋一个中心点，还可以补充考察六个面上的中心点。如此一来，不仅对全局做到了有效考察，而且最少只用9个点就可以达到目标，胜于无目的地考察正方体的其他点。
3. 如何事半功倍确定有效因素：如果有12个因素需要考察，那考虑到因素间的两两协同效应，则要另增加12×11＝132个因素。如果采用单因素试验或正交试验，试验将非比寻常。如果借助适当的统计手段，则可大大减少试验次数。如Plackett－Burman（拼写可能有误）试验，n次试验可以考察n-1个因素，即进行12次试验可以考察11个因素。虽然PB有一定的缺陷，但一般而言的确是高效而又实用的。类似的非平衡或平衡块统计手段还有许多，我们可以根据需要选择合适的手段进行试验以达到目的。
4.应用统计优化的其他好处：在建立数学模型是，选择合适的方法也对优化过程和结果大有裨益。借助最陡爬坡试验、中心点试验，相应面方法，均匀设计等方法能让你准确、高效的完成试验。借助SAS，SPAA，Statistics等统计手段，你可以快速完成数据的分析、模型构建及假设检验。而且这些统计软件还特供了强
大的绘图能力，你可以看到所建模型的三维图像，得到直观影响，轻松进行最优求解得到优化条件。另外，最优算法发展比较快，象基因算法，神经元网络算法也广为应用。
发酵工艺优化方法与思路
发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。
为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。
发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率。
在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH 值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。
基于此，华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化的有关现象，研究细胞代谢物质流与生物反应器物料流变化的相关性，高度重视细胞的生长变化，尽可能多地从生长变化中做出有实际价值的分析，进一步建立细胞生长变量与生物反应器的操作变量及环境变量三者之间的关系，以便有效控制细胞的代谢流，实现发酵过程的优化。
补料分批发酵技术该技术可以有效地减少发酵过程中培养基黏度升高引起的传质效率降低、降解物的阻遏和底物的反馈抑制的现象，很好地控制代谢方向，延长产物合成期和增加代谢物的积累。
所需营养物限量的补加，常用来控制营养缺陷型突变菌种，使代谢产物积累到最大。氨基酸发酵中采用这种补料分批技术最普遍，实现了准确的代谢调控。
超声波的应用超声波有很强的生物学效应。可应用于发酵过程的上、中、下游三个阶段。其在发酵工艺上的应用，可增加细胞膜的通透性和选择性，促进酶的变性或分泌，增强细胞代谢过程，从而缩短发酵时间，改善生物反应条件，提高生物产品的质量和产量。
超声波的作用机制分为热作用、空化作用和机械传质作用。热作用是超声波在介质内传播过程中，能量不断被介质吸收而使介质的温度升高的一种现象，可用于杀菌或使酶失活。空化作用是超声波在介质中传播时，液体中分子的平均距离随着分子的振动而变化。当其超过保持液体作用的临界分子间距，就形成空化（空泡）。空泡内可产生瞬间高温高压并伴有强大的冲击波或射线流等，这足以改变细胞的壁膜结构，使细胞内外发生物质交换。机械传质作用是超声波在介质中传播时，可使介质质点进入振动状态，加速发酵液的质量传递，提高发酵过程的反应速度。 超声波可广泛应用于生物发酵工程。不同频率和强度的超声波对发酵过程的作用是不同的，使用时应视具体的发酵工艺和使
用条件进行选择。
增加前体物的合成增加目的产物的前体物的合成或是直接添加前体物，均有利于目的产物的大量积累。如：在氨基酸的发酵中，通常在微生物的培养中加入前体，生产氨基酸；在花生四烯酸的发酵中，通过增加前体物或是加强糖代谢的途径，增加其前体物的合成，均有助于提高花生四烯酸的产量。
去除代谢终产物改变细胞膜的通透性，把属于反馈控制因子的终产物迅速不断地排出细胞外，不使终产物积累到可引起反馈调节的浓度，即可以预防反馈控制。
发酵工艺优化的方法有很多，它们之间不是孤立的，而是相互联系的。在一种发酵中，往往是多种优化方法的结合，其目的就是要控制发酵，按照自己的设计，生产出更多、更好的产品。
基因工程菌高密度发酵工艺研究进展
摘 要 阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。
关键词:高密度发酵; 分批补料; 生长抑制因子
重组ＤＮＡ技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。分
批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平[1,2]。
大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认
清[3]。产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。
1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素
1.1宿主菌的选择
不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。现在普遍应用的大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)ｐｌｙｓＳ因其带有编码Ｔ7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋白的表达,但不影响ＩＰＴＧ诱导目的蛋白的表达水平,从而成为近年来最为常用的宿主菌[4]。表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径:第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白质是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性[5]。因此,不同宿主菌的选择对表达产物的积累以及下游分离纯化都有至关重要的作用。
1.2质粒载体
重组大肠杆菌中构建的质粒载体对外源基因的表达也产生了很大影响。常用的基因表达载体有ｐＥＴ、ｐＳＣ、ｐＰＢＢ、ｐＵＣ系列以及由它们衍生的一系列优化载体。
质粒载体的拷贝数和稳定性不仅受宿主菌生理状况及生长环境的影响,而且还取决于自身的遗传特性。质粒载体的拷贝数并不是越高越好,因为有些克隆的编码基因,当用高拷贝数质粒作载体时,其产物含量过高会严重地扰乱寄主细胞正常的新陈代谢活动。质粒不稳定性通常有以下
两种情况1)分离不稳定性;(2)结构不稳定性。另外环境条件也会影响质粒的拷贝数,如葡萄糖、ＮＨ4+等因子的限量供应以及ｐＨ的变化都会引起质粒拷贝数的下降。已有报道通过正交实验考察了Ｅ.ｃｏｌｉＨＢ101(ｐＢ
Ｒ322)高密度培养过程中,不同培养条件对质粒的稳定性影响,结果表明当温度在33～39℃、ｐＨ为6.4～7.2、ＤＯ为40%～80%时质粒没有丢失现象[6]。
2 培养条件
2.1营养源
高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物,需投入几倍于生物量的基质以满足细菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需要[7]。一般使用的培养基为半合成培养基,培养基各组分的浓度和比例要恰当,过量的营养物质反而会抑制菌体的生长,特别是碳源和氮源的比例。葡萄糖(Ｇｌｕ)因细菌利用快且价廉易得,已被广泛用作重组菌高密度发酵的限制性基质。一般Ｇｌｕ浓度控制在10ｇ/Ｌ左右,如果超过20ｇ/Ｌ将会抑制细胞的生长。同时已有人用甘油代替Ｇｌｕ作为细菌生长的碳源,以减少代谢抑制物质———乙酸的积累,更易达到重组菌的高密度和外源蛋白的高表达。ＮＯ3-、胰蛋白胨(Ｔｒ)、酵母提取物(Ｙｅ)作为氮源有利于细胞的生长。比如,在硅藻类(Ｎｉｔｚｓｃｈｉａｌａｅｖｉｓ)高密度培养过程中提高十二碳五烯酸ＥＰＡ的产量时,ＮＯ3-∶Ｔｒ∶Ｙｅ的最佳比例为1∶2.6∶1.3,Ｇｌｕ∶ＮＯ3-的最佳比例为32∶1[1]。有些营养物质在高密度培养过程中可以控制细胞的死亡率,曾有报道在非洲绿猴肾成纤维细胞系(ＶＥＲＯｃｅｌｌ)培养过程中,加入半乳糖和谷胱甘肽可以阻止细胞程序性死亡[8]。
另外还有实验数据表明,在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提高。比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽(ＧＳＨ)时,在发酵开始和进行12ｈ后,各添加2.0ｇ/Ｌ腺苷三磷酸(ＡＴ
Ｐ)和9ｍｍｏｌ/Ｌ前体氨基酸,可以使细胞浓度和ＧＳＨ的产量分别比不添加这两种物质提高24%和1.4
倍[9]。2.2 控制条件
2.2.1 接种量 接种量大小的控制对很多细胞培养和代谢物积累都起到重要作用[10]。接种量对基因表达的影响不大,但对菌体生长影响较明显。接种量小(0.5%
～4%)时,比生长速率大,对数生长期持续时间长;接种量大(>8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续生长时间短,自溶也较快,所以接种量一般选择在4%以下[11]。
2.2.2 溶氧浓度 溶氧浓度是高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素之一。大肠杆菌的生长代谢过程需要氧气的参与,溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大,溶解氧的浓度过高或过低都会影响细菌的代谢。在高密度发酵过程中,由于菌体密度高,发酵液的摄氧量大,一般通过增大搅拌转速和增加空气流量以增加溶氧量。随着发酵时间的延长,菌体密度迅速增加,溶氧浓度随之下降。因此在高密度发酵的后期,需要维持较高水平的溶氧浓度。 目前,提高溶氧量的方法主要有:通入纯氧来提高氧的传递水平,但可能导致局部混合不匀,易使微生物氧中毒;在菌体中克隆具有提高氧传递能力的透明颤藻蛋白(ＶＨＢ)[12];培养基中添加Ｈ2Ｏ2,利用宿主菌的过氧化氢酶分解产生Ｏ2;提高氧的分压[13]。
2.2.3 ｐＨ值 稳定的ｐＨ值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。由于外界的ｐＨ值变化会改变菌体细胞内的ｐＨ值,从而影响细菌的代谢反应,进而影响细胞的生物量和基因产物的表达。Ｅ.ｃｏｌｉ发酵时产生的有机酸(主要是乙酸)可导致发酵液的ｐＨ值降低,细胞释放的ＣＯ2溶解于发酵液内与Ｈ2Ｏ作用生成的碳酸也会导致发酵液ｐＨ值的降低。在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。必须及时调节ｐＨ值使之处于适宜的ｐＨ值范围内,避免ｐＨ值激烈变化对细胞生长和代谢造成的不利影响。 菌体生长
和产物合成过程中,常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠杆菌的生长。
2.2.4 温度 培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。较高的温度有利于细菌的高密度发酵,低温培养能提高重组产物的表达量,而且在不同培养阶段采用不同的培养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量,并可缩短培养周期。但细胞生长的温度突然升高细胞内就会生成某些热激蛋白,以适应变化的环境,外源蛋白相对量降低,给后续的纯化造成困难。如果温度升高的范围不太大,热激蛋白合成的速度会很快下降,恢复正常蛋白的合成。对于采用温度调控基因表达或质粒复制的重组菌,发酵过程一般分为生长和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重组蛋白量。
2.2.5 诱导剂及诱导时间控制 乳糖基因(ｌａｃ)及其衍生的启动子被广泛地应用于重组蛋白在大肠杆菌表达系统中进行表达生产。这类启动子通常都用异丙基βＤ硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)作为诱导剂进行外源蛋白的表达,但它成本高,污染环境,因而不适于工业生产。已有人用乳糖代替异丙基β Ｄ硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)做为诱导剂[14]或者以一定比例混合[15],诱导外源蛋白的表达。 诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时,外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影响菌体代谢及蛋白表达水平。 诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。
2.2.6 补料控制 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键在于补料策略,即采用合理的营养流加方式。常用的流
加模式[5]:非反馈补料,反馈补料,其主要工作原理见下表。
除了补料技术的影响外,补料培养基成分及补料时间的选择对外源基因的表达也是至关重要的。如在大肠杆菌表达重组绵羊生长激素(ｒ-ｏＧＨ)时,补料培养基的成分就包含有Ｇｌｕ和Ｙｅ,并在培养16ｈ后进行补料[16]。
3 生长抑制因子
3.1 乙酸的积累 以Ｇｌｕ为碳源的大肠杆菌的生长,常伴随着乙酸的分泌,进而影响细胞生长和蛋白表达。乙酸的分泌可以通过维持较低浓度的Ｇｌｕ或补充Ｙｅ等来减少合成代谢。当残留的Ｇｌｕ浓度<1ｇ/Ｌ和乙酸浓度<2ｇ/Ｌ时,不存在大肠杆菌细胞生长的抑制因
子[17]。 乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。目前国外已有研究希望通过代谢工程改变重组大肠杆菌的代谢途径,从而降低乙酸的生成。
3.2 ＣＯ2的积累 高密度发酵过程中,细菌代谢产物ＣＯ2的积累也会抑制外源蛋白的表达[18]。因为ＣＯ2对菌体具有直接的毒害作用,而且溶解于发酵液中也会导致ｐＨ值的下降。有报道多变鱼腥藻(Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ)[19]可以利用ＣＯ2为碳源,进行高密度培养,这样可以消除ＣＯ的抑制作用。
4 发展与展望 随着发酵控制手段的进一步发展,临控技术的掌握,发酵装置在线检测或控制物理化学参数、化学测量、生物学和生化测量,并提供反映环境变化和细胞生长的许多重要信息,作为控制发酵过程的依据。生物反应器也有了巨大的发展,比如膜反应器就可以透析除去发酵液中有害物质,从而实现工程菌的高密度发酵。 基因工程菌高密度发酵技术是基因工程技术生产应用的基础,其产品在化工、食品、环保、医药等方面都存在极大的潜在能力。但能否实现高密度培养及高目标产物浓度,是工程菌能否以较低成本实现规模生产的决定性因素。因此,必须结合高密度发酵的各个工艺条件,简化操作
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/de7996913.html, 微生物发酵工艺优化研究进展 作者：张锐 来源：《海外文摘·学术》2017年第03期 摘要：近些年，在有关技术领域中微生物的发酵技术已得到了非常广泛的应用，特别在医药行业内应用此种技术十分普遍。微生物科技发展非常快，因此，人们也有不断深入的研究微生物的发酵工艺。为此，本文对影响微生物发酵的培养条件和培养基进行了分析，又对优化微生物发酵工艺的办法进行了讨论研究，为微生物工程的发展提供参考价值。 关键词：发酵工艺；微生物；培养条件；工艺优化；培养基 中图分类号：TQ920.6 文献标识码：A 文章编号：1003-2177（2017）03-0058-02 1 微生物发酵受培养基的影响 微生物在进行生长、代谢时，培养基能供给微生物发酵所需要的能量与营养物质，对合成发酵产物的效率和产品的质量保障来讲有着重要意义。在进行微生物发酵时，因其发酵条件与菌种的差异和不同的发酵阶段，需要培养基的成分也不同。一般情况下，微生物生长需要的营养要素有生长因子，碳源，无机盐和氮源四类。 1.1 选择氮源与碳源作发酵的培养基 氮源为微生物提供含氮的有机物与蛋白质，并且，还是合成含氮产物的参与者。氮源主要是有机氮源与无机氮源两种，如豆粉，氨盐，蛋白胨与硝酸盐等。碳源能够为微生物提供能量来源，形成产物和构建细胞。碳源的形式有油脂，多糖，单糖，天然复合物，双糖等，如豆油，葡萄糖，淀粉与蔗糖等。选择发酵的培养基中要有均衡的碳源与氮源比，确保其菌体能够正常生长，而且还有利于合成产物的速率。 1.2 无机盐对发酵培养基的影响 微生物的生长和生成的代谢产物都与无机盐有关重要关系。微生物在进行生长代谢时，构成的辅酶中有磷的参与，它是构成微生物生长，代谢的重要因素。有些菌种的发酵产物中包含磷酸根，因此在进行培养基发酵时，添加很多的磷酸盐，这利于产物快速合成。在微生物发酵中钙离子对细胞的生理状况起到了调节作用，例如，使细胞膜的通透性降低，维持细胞状态等。很多酶都用镁来作催化剂。微生物生长所需微量元素有很多，如，钴，铁，锌，锰等。经研究证明，枯草芽孢杆菌的生长中需要锰离子的参与，在发酵培养基中添加适量的氯化锰，可以提升枯草芽孢杆菌生成的发酵物中抑菌物质的活性。 2 微生物发酵受培养条件的影响
工业发酵进展
微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。
3.正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步： （1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表； （2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验； （3）根据正交表给出的实验方案，进行实验； （4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因 次 报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法 部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法
发酵工艺流程图 打开备料泵，进料基质→开备料阀→备料100T，关备料阀→开搅拌器，设转速为200r/min→开排气阀，设参数→开通风阀，设参数→加菌种→开补糖阀→开硫铵阀→开前体罐的进料泵，设频率(0~100k/z) →开前体阀→开消泡补罐的进料泵，设频率→加消泡剂。 在发酵流程图里打开备料泵，在发酵罐操作里打开备料阀，备料开搅拌器，过程跟上述流程图一样，需要注意的是： 1.发酵过程中时时补糖，保持残糖浓度为5kg/m3. 2.发酵过程中时时补硫铵，保持硫铵浓度为0.25kg/m3 3.开冷却水，维持发酵温度在25℃ 4.控制PH在6.8左右，不可高于7.3或低于6.0 5.控制通风阀及排气阀开度，保持发酵罐压力为0.07Mpa 6.前体浓度不应超过1kg/m3，但也不能太低 7.保证发酵罐中的溶氧浓度不低于百分之30 8.泡沫高度不应超过35cm 9.不要满罐，超负荷生产 发酵后期处理与提纯 预处理： 开发酵液开关，加发酵液→开预处理罐搅拌器→加黄血盐，
去除铁离子至浓度为0→加磷酸盐，去除镁离子至浓度为0→加絮凝剂，去除蛋白质至浓度为0→打开转筒真空过滤器及其后阀门→待发酵液经过过滤排主混合罐B101后，关阀门，关泵，关真空过滤器。 一次BA提取： 开罐B101搅拌器→开阀，加BA（硝酸丁脂），质量为发宵夜的三分之一，关阀→开阀，加稀硫酸调PH至2.8-3.0，关阀→开阀，加破乳剂100kg，关阀→打开阀泵，向分离机注液→开分离机→开阀，开萃取回收阀，萃取→关阀，关泵→关B101搅拌器→关分离机 一次反提取： 开罐B102搅拌器→开阀，加碳酸氢钙溶液，质量为青霉素溶液的25倍，并调PH至6.8-7.2，关阀→开阀，开泵，向分离机注液→开分离机，开阀，开萃取相回X阀→关阀，关泵→关B102搅拌器→关分离机，及阀 脱色： 打开活性炭进料阀，进料25kg→关闭进料阀→开脱色罐搅拌器，设定时间10min→开泵，开阀，将青霉素溶液经过过滤器到结晶罐→关泵，关阀→关脱色罐搅拌器 结晶： 开结晶罐搅拌器→开阀，加硝酸钠一乙醇溶液，至青霉素浓度为0，关阀→开冷却水阀，控制结晶温度为5℃→开泵，
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 创建人：时间：2013-04-17 【点击数： 482】 实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术 1．实验目的 （1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。 （2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。 2．实验原理 重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。 工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。 补料的流加方式直接影响着发酵的效果。分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。 高密度发酵是工程菌剧烈生长繁殖的过程，这期间对氧气的需求量也大大提高，这就需要及时调整通风量和搅拌速度，一般的高密度发酵通风速度达18L/min（20L发酵罐），搅拌速度达500r/min以上，需保持60%以上的溶氧饱和度。此外，还需要考虑通风速度和搅
绵阳师范学院 本科生毕业论文（设计） 题目脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化专业生物技术 院部生命科学与技术学院 学号0811420218 姓名杜长蔓 指导教师李俊刚 答辩时间2012年5月 论文工作时间：2011 年7 月至2012 年5 月
脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化 学生：杜长蔓 指导老师：李俊刚 摘要：本文对绵阳师范学院微生物实验室筛选和鉴定的产脂肪酶细菌 M-6-2的生长动力学和产酶动力学进行了研究；通过单因素实验和正交试验，对脂肪酶产生菌M-6-2 摇床发酵产脂肪酶的培养基组成和培养条件进行优化，得出较佳的产酶培养基组成配方为：1.5%淀粉+0.5%酵母膏为碳源、4.5%豆饼粉 +1.5%硝酸铵为最佳的氮源、0.05%磷酸氢二钠和0.15%硫酸镁；最优的发酵条件为：初始pH7.5，接种量1.5 %，装液量20ml/250ml，发酵温度35℃，在转速180r/min 下，培养16h，经过优化后发酵液脂肪酶酶活力最高可达到15.60 U/ml,较优化前提高了49.57%。脂肪酶产生菌M-6-2与国内文献报道的产脂肪酶细菌相比产酶活力高。对该菌株发酵条件进行优化后，为生产性试验打下了基础。 关键词：脂肪酶产生菌M-6-2；脂肪酶；发酵条件；优化；正交试验；
Lipase to produce bacteria M-6-2 Optimization of fermentation conditions Undergraduate: Du Changman Supervisor: Li Jun Gang Abstract: In this paper, Laboratory screening and identification of lipase production by bacteria in the M-6-2 growth kinetics and enzyme production kinetics were studied; through single factor experiments and orthogonal test, the lipase to produce bacteria M-6-2 shaker fermentation lipase medium composition and culture conditions were optimized to come to a better enzyme production medium composition formula: 1.5% starch and 0.5% yeast extract as carbon source, 4.5% of the soybean powder and 1.5% ammonium nitrate for the best source of nitrogen, 0.05% disodium hydrogen phosphate and 0.15% magnesium sulfate. Optimal fermentation conditions were: initial pH 7.5, 1.5% of the inoculum size, liquid volume 20ml/250ml, fermentation temperature 35 ° C, in the speed 180r/min next, cultured 16h After optimization of the fermentation broth lipase activity can reach 49.57% to 15.60 U / ml, compared to before optimization. Lipase to produce bacteria M-6-2 and reported in China in the production of lipase bacteria compared to the high activity of enzyme production. Of the strain fermentation conditions optimized, laid the foundation for the production of test. Key words: Lipase producing strain M-6-2；lipase ；fermentation conditions； optimization ；orthogonal test
发酵工艺标准操作流程 (SOP) 一生产前准备 每次生产前按品种配方将所需原料称重准备齐全,并确认生产原料库存量,保证原料库存量足够下次生产所需、 二生产前检查 1检查蒸汽、压缩空气、冷却水进出的管路就是否畅通,所有阀门就是否良好,并关闭所有阀门、 2检查电路、控制柜、开关的状态,确保控制柜运行正常、 3检查空压机油表油表及轴承、三角带、气缸等就是否正常,确保空压机运行正常、 4检查发酵罐搅拌减速机的油量及密封轴降温水就是否正常、 三总过滤器灭菌 当蒸汽总管路上的压力为0、2-0、25MPa时,打开总过滤器进气阀输入蒸汽,同时打开出气阀的跑分阀、排气阀、排污阀,当三个阀均排出蒸汽时,调整进气阀、排污阀,稳定总过滤器压力0、15-0、2MPa,此时打开压力表下跑分,计时灭菌2-2、5小时、灭菌结束后启动空压机,当空气输入管道压力大于总过滤器压力时,关闭蒸汽阀,打开空气阀,将空气出入总过滤器,然后调整进气阀与排污阀,稳定总过滤器压力在0、15-0、2MPa,保持通气在15-20小时,当出气阀跑分与排污阀放出的空气为干燥空气时,完成灭菌、 四分过滤器灭菌 1当蒸汽管路压力为0、2-0、25MPa时,打开蒸汽过滤器的进气阀与排污阀,当蒸汽管路中无蒸汽凝结液后,再将蒸汽输入空气管路,然后打开分过滤器的进气阀、排污阀及出气阀上的跑分,当所有阀门均有蒸汽排出后,调整进气与排污阀,就是压力稳定在0、11-0、15MPa,计时灭菌30-35分钟、灭菌结束后,关闭蒸汽过滤器进出气阀、排污阀,并立即将空气输入预过滤器,使空气通过预过滤器进入到分过滤器,再调整分过滤器排污阀使压力稳定在0、11-0、15MPa,备用、
发酵工艺优化 从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等 发酵工艺中补料的作用 补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统 至于装液量的问题，应该从以下几个方面考虑： 1、保持在你所需要的转速培养情况下（尤其是在后期，菌丝很多时，转速很高时），不能让发酵液把你的塞子湿掉，容易造成染菌。 2、装液量的体积在消毒过程中，不能因为沸腾把塞子湿掉，或者跑出三角瓶，装液量太多会出现这样的情况。很容易染菌。 3、根据你的菌种的情况和发酵液的粘度，需要的混匀程度等等方面也要考虑。 4、建议你做一个梯度试验（40－50－60－70－80等）就可以找到你所需要的装液量。 关于剩余空气的排除在灭菌完毕后（100度左右），立刻用盖子或者其他的用品把你的培养摇瓶盖好，有时候这么点空气根本对兼性厌氧发酵没有什么影响，如果你的菌种要求很严的话，最好用干冰加入已经灭菌的空摇瓶后，立刻用其他的样品培养基分装即可。当然也可以用氮气。最好是二氧化碳。 你可以再查查看是否有其他的方法，我说的也不完全。！！
发酵工艺优化 发酵工艺优化 从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等 发酵工艺中补料的作用 补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统
发酵工艺优化---现代发酵工业调控策略 发布日期：2010-04-10 来源：[标签:来源] 作者：[标签:作者] 浏览次数：716 发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在 发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH 值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率。在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。基于此，华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化的有关现象，研究细胞代谢物质流与生物
发酵工艺条件的优化集团档案编码：[YTTR-YTPT28-YTNTL98-UYTYNN08]
发酵工艺条件的优化 发酵优化对于搞发酵的工作者而言是非常必需的，下面结合其他战友的一些经验之谈引出此专题，希望大家踊跃讨论，以其提高发酵水平和解决实际问题。 发酵工艺的优化在发酵行业起到很大的作用,尤其是在发酵生产中,它是提高发酵指标的一项非常,有用的技术手段.同时也是搞发酵行业的人的必备知识要求之一,借此我想通过和大家交流共同提高发酵方面的知识水平.发酵工艺优化方法与思路:发酵工艺优化的方法有很多,它们之间不是孤立的,而是相互联系的。在一种发酵中,往往是多种优化方法的结合,其目的就是发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率,在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。 注意:大家可以从以下各个方面进行交流.尽量能够分类进行叙述,我总结了以下几累,也不是很全,当然从其他的方面进行交流也可以,但是希望你注明附加说明!!!谢谢大家的参与!!!!!!!!!一. 好氧发酵1. PH 工艺的优化2. 溶氧工艺的优化3.原材料工艺的优化4.消毒(灭菌)工艺的优化5.菌种制备工艺的优化6.小试到中试,中试到生产等扩大实验的工艺优化7.成本工艺优化8.种子罐工艺的优化9.发酵罐工艺参数控制的优化10.仪表控制的工艺优化11.环境的工艺优化12.染菌处理的工艺优化13.紧急情况处理的工艺优化(停电\停水\停气\停汽等)14.补料工艺的优化15.倒种工艺的优化16发酵设备的工艺优化17.其他的工艺优化 二. 厌氧工艺的优化三.固体发酵的工艺优化四.其他1. PH工艺的优化A.配料中的PH 很重要,其中有配前PH,配后PH,消前PH,消后PH,接种前PH,工艺控制PH等,配前PH,配后PH,可以用来检测厡材料的质量,初步估计配料的情况,如果出了错误,有时候可以从PH中的变化看出来,能够减少错误的发生.B.另外,每次有新的配方我们总是要用PH方法检测其中的每种厡材料是否会和其他的发生反应,可以互相两两混合,检测PH的变化,也可以用来作为配微量元素的检测.C.消前PH可以用来减少消毒过程对培养基的破坏,因为培养基在消毒中会有PH的变化,在不同的PH条件下对培养基破坏也不一样,因此可以在消毒的时候选择合适的PH,消毒完后可以调节过来,这样一来可以对PH敏感的一些原材料减少破坏,这种方法在生产中已经取得了初步的成绩,提高了指标.D.工艺控制的PH,在发酵的产抗期间,通过在不同的发酵时间调整不同的P H,可以减少杂质的产生,同时还可以缓解溶氧,比如在头孢发酵中,通过在后期调整PH可以减少DCPC的含量,给提取工序带来很大的好处,E.补料罐通过PH的调节可以更好的通过流加物料而不影响发酵.(部分发酵在不同时期的PH有所不同,所以通过补料罐的调整可以对发酵指标有所提高)F.发酵过程中的PH调节可以通过各种方法,不一定要添加氨水和氢氧化钠,可以添加玉米桨等其他的物料来进行调节.G.控制放罐时的PH可以对后面的过滤有所影响,所以一定要控制好放罐前的PHH.绘制种子瓶和种子罐以及发酵罐等整个发酵过程的PH生长曲线,可以用来参考控制工艺,检测无菌情况的发生.A. 华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化
实验一单细胞蛋白（SCP）的生产 一、实验目的 1．了解单细胞蛋白的开发优势及技术现状。 2．掌握单细胞蛋白的液体深层培养法及工艺控制规律。 3．了解发酵过程中菌体浓度及生物量的一般检测方法。 二、实验原理 所谓SCP（SingleCellProtein）就是指那些工厂化大规模培养、作为人类食品和动物饲料的蛋白质来源的酵母、细菌、放线菌、霉菌、藻类和高等真菌等微生物的干细胞。SCP工业，主要是饲料酵母工业。酵母是一种单细胞微生物，生长繁殖快，菌体营养丰富。饲料酵母是一种营养价值很高的蛋白饲料，成品呈微黄色粉末状，具有酵母特殊香味。酵母蛋白质含量一般都在70%左右，比大豆高1倍。与肉蛋白、鸡蛋蛋白、大豆蛋白相比，单细胞蛋白所含的氨基酸组分齐全，有18-20种氨基酸，尤其是谷物中所缺乏赖氨酸含量较高。此外，维生素含量也十分丰富。每千克酵母类单细胞可使奶牛的产奶量增加6-7㎏，用含有10%单细胞蛋白饲料养鸡，产蛋提高21%-35%。1吨单细胞蛋白可节约5-7吨饲料粮，可产1.5吨鸡肉或3万枚鸡蛋。我国单细胞蛋白（酵母）年产量近3万吨，多用于医药、面包生产和饲料。用于生产饲料酵母的原料来源广泛，有矿物资源（如石油、甲烷、泥炭等）、纤维资源（如秸杆、木屑等）、糖类资源（如糖蜜、红薯等）、石油二次制品、废弃资源（包括有机废水、废渣、动物粪便等）。从我国目前的情况出发，生产饲料酵母等单细胞蛋白值得优先开发的原料有废糖蜜、薯干、纸浆废液，豆制品厂、味精厂、淀粉加工厂的废液等，用这些原料生产饲料酵母，首先是产品无毒性，另外也有利于解决工厂和城市的污染问题。 酵母细胞的发酵特点：目前，最广泛用于生产作为蛋白资源的酵母是假丝酵母，该酵母生长繁殖速度快，每2-4小时可繁殖一代，培养10小时左右就能繁殖到种子菌体量的15倍。发酵过程中，要保证罐内的液体混合良好和较适当地提供氧气，还要控制好温度和pH。采用流加间歇发酵可以保证糖被具有良好活性的酵母呼吸消耗，以达到最适产量。底物浓度过高，即使在有氧条件下，酵母也会发酵产生碳水化合物。如果酵母生长速率过快，底物也会发酵。因此，在培养过程中，底物浓度应维持在一定较低的水平，并维持一定的通风量。 酵母生物量的检测方法及分离：最普遍的检测方法是细胞干重法、显微镜记数法和光密度法。菌体的分离常采用过滤法和离心分离法。 三、实验仪器与材料 （一）仪器 10L发酵罐、恒温培养箱、超净工作台、显微镜、大容量冷冻离心机、高压灭 （二）材料
课程设计说明书 课程名称：发酵工程 设计题目：大肠杆菌的高密度发酵 院系：生物与食品工程学院 学生姓名：****** 学号：201006030051 专业班级：10生物工程（2）班 指导教师：*****
课程设计任务书设计题目大肠杆菌的高密度发酵 学生姓名所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班10生物工程 设计要求： 1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。 2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。 3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、设计标准要求规范、实用、切合实际。 5、设计应严格按有关设计规范进行。 6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。 学生应完成的工作： 1、明确设计标准适用的范围，给出产品以清晰明确的定义。 2、确定引用标准和技术要求，确定特定的理化指标及标准。 3、确定理化指标所采用的测定方法，一般首选国标或公认经典方法。新方法需经多试验或单一实 验法验证。 4、给出检验规则。 5、对产品的外观、流通保藏过程中操作给出规范。 参考文献阅读：[1] Fuchs C, Koste D, Wiebusch S, et al. Scale-up of dialysis fermentation for high cell densityCultivation of Escherichian coji[J]。Biotechnol, 2002, 93: B. 2002, 93: 243~251 [2] 刘子宇，李平兰，郑海涛等.微生物高密度培养的研究进展[J].中国乳业，2005，12:47~51 [3] Riesenberg D. High cell-density cultivation of Escherichian coli. Curr. Opin. Biotechnol.1991，2: 380~384 工作计划： 2013.5.27----2013.5.30 接受设计任务，查阅相关文献。 2013.5.30----2013.6.3 整理文献资料，进行产品标准的应用设计。 2013.6.3— 2013.6.9 整理设计内容，完成课程设计报告。 任务下达日期：2013年5月27日 任务完成日期：2013年6月9日 指导教师（签名）：学生（签名）：
发酵工艺标准操作流程(SOP) 生产前准备 每次生产前按品种配方将所需原料称重准备齐全,并确认生产原料库存量,保证原料库存量 足够下次生产所需. 二生产前检查 1检查蒸汽、压缩空气、冷却水进出的管路是否畅通, 所有阀门是否良好,并关闭所有阀门2检查电路、控制柜、开关的状态, 确保控制柜运行正常. 3检查空压机油表油表及轴承、三角带、气缸等是否正常,确保空压机运行正常. 4检查发酵罐搅拌减速机的油量及密封轴降温水是否正常. 三总过滤器灭菌 当蒸汽总管路上的压力为0.2-0.25MPa 时,打开总过滤器进气阀输入蒸汽,同时打开出气阀的跑分阀、排气阀、排污阀,当三个阀均排出蒸汽时,调整进气阀、排污阀,稳定总过滤器压力0.15-0.2MPa,此时打开压力表下跑分，计时灭菌2-2.5小时?灭菌结束后启动空压机，当空气输入管道压力大于总过滤器压力时,关闭蒸汽阀,打开空气阀,将空气出入总过滤器,然后调整进气阀与排污阀,稳定总过滤器压力在0.15-0.2MPa, 保持通气在15-20 小时,当出气阀跑分和排污阀放出的空气为干燥空气时,完成灭菌. 四分过滤器灭菌 1 当蒸汽管路压力为0.2-0.25MPa 时,打开蒸汽过滤器的进气阀和排污阀,当蒸汽管路中无蒸汽凝结液后,再将蒸汽输入空气管路,然后打开分过滤器的进气阀、排污阀及出气阀上的跑分,当所有阀门均有蒸汽排出后,调整进气与排污阀,是压力稳定在0.11-0.15MPa, 计时灭菌30-35 分钟.灭菌结束后,关闭蒸汽过滤器进出气阀、排污阀,并立即将空气输入预过滤器,使空气通过预过滤器进入到分过滤器，再调整分过滤器排污阀使压力稳定在0.11-0.15MPa,备用.
乳酸菌高密度规模发酵工艺优化 随着人们对抗生素滥用的重视,益生菌越来越广泛地应用于饲料、食品和医药行业,乳酸菌作为一种微生物资源因此受到越来越多的关注。乳酸菌高密度规模发酵是为提高菌体的发酵密度而使用的技术手段和特殊的培养装置,使菌体密度相较于普通培养方式能有显著的提高,最终提高菌细胞的产出率的一种扩大培养方式。 在实际生产过程中,乳酸菌菌体密度是乳酸菌发酵产品的重要指标。本试验以嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌为研究对象,筛选适合其增殖的培养基,研究适合乳酸菌的培养条件,优化乳酸菌中试高密度发酵工艺以及冷冻干燥保护剂组成。 本文的研究结果如下:(1)两株乳酸菌的形态学特征乳酸乳球菌在MRS培养基上可以形成明显的白色菌落,直径在1mm左右,圆形边缘整齐,不透明,表面光滑无皱褶。在添加碳酸钙的固体培养基中,菌落周围由于产酸形成透明的水解圈。 显微镜下观察,细菌成球形,不形成链状。嗜酸乳杆菌在MRS培养基上可以形成明显的菌落。 菌落圆形、白色、凸起,表面光滑、边缘较光滑,直径在1mm左右。在添加碳酸钙的固体培养基中,菌落周围形成透明水解圈。 在显微镜下观察,细菌成短杆状。两株乳酸菌通过革兰氏染色均为紫色,是革兰氏阳性菌。 (2)乳酸菌培养条件前期发酵条件优化前期实验室工作通过对两株乳酸菌的条件优化摸索,确定了以乳清粉为中试培养基,并确定乳酸乳球菌的最适培养温度在37℃C左右、初始培养基pH值在6.5、接种量在2%-7%之间,而接种量对最大活菌数的影响并不显著。培养28h可获最多的活菌,最大活菌数为 1.92±0.15
×108CFU/mL;嗜酸乳杆菌的最适培养温度在37℃C左右、初始培养基pH值在 6-6.5、接种量在5%-7%之间。 嗜酸乳杆菌在乳清粉培养基中培养32h可获得最大活菌数为1.53±0.15 × 1 08 CFU/mL。(3)高密度规模化发酵工艺优化随着乳清粉含量的增加,通过离心获得的乳酸菌干重是不断增加的。 当乳清粉含量增加至60%时,细胞干重(DCW/L)增加至13.21 g/L。通过乳清粉的添加,可以显著提高发酵罐中乳酸菌的细胞干重。 而从菌粉获得率计算,当乳清粉含量增加至60%时,嗜酸乳杆菌获得率增加 至23.42%。(4)冷冻干燥保护剂优化通过对离心获得的菌体添加10%的脱脂奶粉和10%的葡萄糖,或添加10%脱脂奶粉和10%海藻糖能够达到较高的复苏率。 通过进一步筛选得到四种具有显著保护性能的保护剂,并通过对乳酸乳球菌冷冻干燥保护剂的四因素三水平正交实验,结果得出这四种因素对于冷冻干燥后复苏率的影响,从大到小的顺序依此是葡萄糖>硫酸锰>脱脂奶粉>海藻糖。这四个因素对于冷冻干燥后的复苏率的影响都是极显著的,是影响该实验结果的主要因子。 通过正交实验,确定了一种冻干保护性较强的冻干保护剂组合,这种冻干保 护剂配比为每公斤菌体添加葡萄糖90g、海藻糖90g、硫酸锰60g、脱脂奶粉30g。冷冻干燥后的菌粉在储藏时应保持低温的环境,本次实验制备的两种菌粉在-20℃C环境下密封保存4周后,存活率仍能超过50%。 (5)乳酸菌耐受实验两株冻干菌粉对于人工消化液均有一定的耐受能力,乳 酸乳球菌在人工胃液中模拟消化3h存活率9.3%。在人工肠液中,经过4h的模拟消化过程,乳酸乳球菌的存活率为8.6%。
发酵工艺标准操作流程 (SOP) 一生产前准备 每次生产前按品种配方将所需原料称重准备齐全,并确认生产原料库存量,保证原料库存量足够下次生产所需. 二生产前检查 1检查蒸汽、压缩空气、冷却水进出的管路是否畅通,所有阀门是否良好,并关闭所有阀门. 2检查电路、控制柜、开关的状态,确保控制柜运行正常. 3检查空压机油表油表及轴承、三角带、气缸等是否正常,确保空压机运行正常. 4检查发酵罐搅拌减速机的油量及密封轴降温水是否正常. 三总过滤器灭菌 当蒸汽总管路上的压力为0.2-0.25MPa时,打开总过滤器进气阀输入蒸汽,同时打开出气阀的跑分阀、排气阀、排污阀,当三个阀均排出蒸汽时,调整进气阀、排污阀,稳定总过滤器压力0.15-0.2MPa,此时打开压力表下跑分,计时灭菌2-2.5小时.灭菌结束后启动空压机,当空气输入管道压力大于总过滤器压力时,关闭蒸汽阀,打开空气阀,将空气出入总过滤器,然后调整进气阀与排污阀,稳定总过滤器压力在0.15-0.2MPa,保持通气在15-20小时,当出气阀跑分和排污阀放出的空气为干燥空气时,完成灭菌. 四分过滤器灭菌 1当蒸汽管路压力为0.2-0.25MPa时,打开蒸汽过滤器的进气阀和排污阀,当蒸汽管路中无蒸汽凝结液后,再将蒸汽输入空气管路,然后打开分过滤器的进气阀、排污阀及出气阀上的跑分,当所有阀门均有蒸汽排出后,调整进气与排污阀,是压力稳定在0.11-0.15MPa,计时灭菌30-35分钟.灭菌结束后,关闭蒸汽过滤器进出气阀、排污阀,并立即将空气输入预过滤器,使空气通过预过滤器进入到分过滤器,再调整分过滤器排污阀使压力稳定在0.11-0.15MPa,备用.
56 2019, V ol.40, No.08食品科学※生物工程 布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化 刘开放，席志文，黄林娜，惠丰立* （南阳师范学院生命科学与技术学院，河南南阳 473061） 摘?要：为实现布拉酵母高密度培养，对其高密度发酵培养基和发酵工艺进行优化。采用Plackett-Burman试验筛选培养基中的显著因素，并进行中心组合设计。通过人工神经网络（artificial neural network，ANN）和响应面试验建立菌体布拉酵母产量与培养基之间的关系模型，利用遗传算法（genetic algorithm，GA）进行全局寻优。结果表明，ANN模型有较好的数据拟合能力和预测能力，更适合处理复杂的非线性问题。GA优化获得最佳培养基组合：葡萄糖40.52 g/L、蛋白胨36.8 g/L、玉米浆17.32 g/L、硝酸钾14 g/L、酵母营养盐1.5 g/L、磷酸二氢钾0.6 g/L、硫酸镁0.8 g/L。利用该培养基进行摇瓶培养，菌体布拉酵母产量可达到8.21 g/L，比优化前提高1.39 倍。在此基础上利用1 L发酵罐培养确定最佳发酵工艺：温度30 ℃、接种量10%、pH 5.0、溶氧40%。利用50 L发酵罐进行扩大培养，流加葡萄糖和蛋白胨控制发酵液中葡萄糖3 g/L、氨氮0.06 g/L，菌体布拉酵母产量达到51.21 g/L。 关键词：布拉酵母；神经网络；遗传算法；增殖培养基；高密度培养 Optimization of High Cell Density Fermentation of Saccharomyces boulardii for Enhanced Biomass Production LIU Kaifang, XI Zhiwen, HUANG Linna, HUI Fengli* (College of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China) Abstract: For high cell density cultivation of Saccharomyces boulardii, we attempted to optimize medium composition and culture conditions. Plackett-Burman design was used to recognize the signi?cant medium components. Subsequently, response surface methodology and arti?cial neural network (ANN) based on central composite design (CCD) were applied to model the relationship between dry biomass production and medium composition. The optimization of medium composition was carried out using genetic algorithm (GA). The results showed that the ANN model, more suitable for complex and nonlinear modeling, had better goodness of ?t and prediction performance. The optimal medium composition was obtained as follows (g/L): glucose 40.52, peptone 36.8, corn steep liquor 17.32, KNO3 14, yeast nutrients 1.5, KH2PO4 0.6 and MgSO4 0.8 shake ?ask cultivation using the optimized medium gave a dry biomass yield of 8.21 g/L, which was 2.39 folds higher than that obtained from the original medium. Based on these results, we determined the optimal high cell density culture conditions for S. boulardii cultivated in a 1-L fermentor as follows: temperature 30 ℃, 10% inoculum, pH 5.0 and 40% dissolved oxygen. Furthermore, we scaled up the culture process in a 50-L fermentor with the addition of glucose and peptone to maintain the glucose concentration at 3 g/L and the ammonia nitrogen concentration at 0.06 g/L. The dry biomass yield of S. boulardii reached 51.21 g/L in the large scale experiment. Keywords: Saccharomyces boulardii; neural network; genetic algorithm; enrichment medium; high cell density fermentation DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180424-323 中图分类号：Q815 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2019）08-0056-07引文格式： 刘开放, 席志文, 黄林娜, 等. 布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化[J]. 食品科学, 2019, 40(8): 56-62. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180424-323. https://www.doczj.com/doc/de7996913.html, LIU Kaifang, XI Zhiwen, HUANG Linna, et al. Optimization of high cell density fermentation of Saccharomyces boulardii for enhanced biomass production[J]. Food Science, 2019, 40(8): 56-62. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-20180424-323. https://www.doczj.com/doc/de7996913.html, 收稿日期：2018-04-24 基金项目：国家自然科学基金面上项目（31570021） 第一作者简介：刘开放（1993—）（ORCID: 0000-0002-2575-893X），男，硕士，研究方向为发酵工程。 E-mail: liukaifang126@https://www.doczj.com/doc/de7996913.html, *通信作者简介：惠丰立（1965—）（ORCID: 0000-0001-6542-1525），男，教授，硕士，研究方向为食品微生物与发酵工程。 E-mail: hui?@https://www.doczj.com/doc/de7996913.html,