scFv 包涵体蛋白表达纯化操作流程 Day1 一、 配制溶液 1、 LB 2L 2、 裂解缓冲液 500ml 50mM Tris 50mM Nacl 5%甘油 3、 含 2M 尿素裂解缓冲液 250ml 50mM Tris 50mM Nacl 5%甘油 2M 尿素 4、 含 1% Triton X-100 裂解缓冲液 250ml 50mM Tris 50mM Nacl 5%甘油 1% Triton X-100 5、 Binding Buffer (PH8.0) 500ml 0.1M NaH2PO4 0.01M Tris-Cl 8M 尿素 6、 Wash Buffer (PH6.3) 250ml 0.1M NaH2PO4 0.01M Tris-Cl 8M 尿素 7、 Elution Buffer (PH4.5) 250ml 0.1M NaH2PO4 0.01M Tris-Cl 8M 尿素 8、 透析袋处理液 (PH8.0) 1L 2% NaHCO3 1mM EDTA 9、 透析缓冲液（PH7.2）各 500ml 4M /2M/1M/0.5M 尿素 20mM PB（PH7.4） 10、 0.2M PB (PH7.4) 1L 19ml 0.2M NaH2PO4 81ml 0.2M Na2HPO4 11、 10mM PBS (PH7.2) 1L 50ml 0.2M PB NaCl 8.5~9g 加水至 1L 二、 scFv 蛋白诱导表达
1、 挑 scFv 蛋白表达单克隆 37℃摇~8h 2、 1:50 转接至 40ml LB(Amp) 中 37℃摇过夜 Day2 3、 1:50 转接至 2L LB(Amp)中，37℃摇 2h，加 IPTG 至终浓度 1mM，37℃继续培养 4h 4、 取样 取 1ml 全菌离心后， 100ul 水重悬沉淀， 100ul 2×上样 SDS Buffer 95℃煮沸 5min， 用 加 标记全菌沉淀和全菌上清上样 三、 表达产物处理 1、 菌液 8000rpm 4℃离心 10min 2、 菌体沉淀按 10:1（菌重 1L~5g，2L 加~50ml）裂解缓冲液，冰上超声至清亮（250W，超 声 5s，间歇 5s，功率 35%） 3、 取样 取 100ul 超声菌液并离心，标记超声上清，超声沉淀 4、 12000g 4℃离心 15min，上清备用，标记超声上清 5、 超声沉淀用含 2M 尿素的裂解缓冲液，以 20:1 比例重悬，继续超声 5min 6、 12000g 4℃离心 20min， 7、 超声沉淀用含 1% Triton X-100 的裂解缓冲液重悬，4℃放置 10min 8、 12000g 4℃离心 15min，获得包涵体 9、 获得包涵体用 Binding Bufer 重悬，4℃放置过夜 Day3 四、 scFv 包涵体的纯化 1、 放置过夜包涵体 4℃高速离心，收集上清备用 2、 取样 取离心上清，标记柱前 3、 使用 Ni-NTA 基质进行纯化，用 Binding Buffer 平衡 Ni 柱，柱子平衡后低流速上样，整个 上样过程使样品处于冰上，上样后用 3~5 个柱体积的 Wash Buffer 进行漂洗，最后用 Elution Buffer 洗脱，收集 280 吸收峰处的目的蛋白 4、 取样 取柱后，标记柱后 五、 scFv 包涵体复性 1、 透析袋处理方法： 把透析袋简称适当长度 （10~20cm） 小段， 在大体积的 2% （W/V） NaHCO3 和 1mM EDTA (PH8.0)中将透析袋煮沸 10min。用蒸馏水彻底清洗透析袋。放在 1mM EDTA(PH8.0)中将之煮沸 10min。 冷却后存放于 4℃， 必须确保透析袋始终浸没在溶液内。 从此时起取用透析袋时必须戴手套保持清洁，用前在透析袋内装满水然后排出，将之清 洗干净 2、 复性采用梯度透析法，纯化后包涵体用含 4M 尿素的透析缓冲液稀释蛋白浓度至约 100ug/ml，从 4M、2M、2M、0.5M 依次降低透析液中尿素浓度，每个浓度均
4℃透析，4~6h 换新鲜透析液一次，高速离心去除沉淀。最后用 PBS(PH7.2) 4℃透析过夜。高速离心去除沉 淀，超滤浓缩