一、包涵体的纯化和复性总结（二）
二、[ 2008-2-25 14:25:00 | By: 飞鸿 ]
三、关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂
一、菌体的裂解
1、怎样裂解细菌？
细胞的破碎方法
1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等
细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:
裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml 溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用)
但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘.
protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体.
如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了.
但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间.
沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的.
"取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法
到底能不能溶解细菌中的包涵体? "
而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.
2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？
在表达重组蛋白时，诱导以后跑SDS-PAGE发现表达都很好，但是在裂解细胞时遇到问题。总是不能彻底裂解细胞。
首先我采用超声裂解，可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。
我的超声条件如下：宁波新芝超声细胞破碎仪，功率400W，超5秒，间隔5秒，重复99次。然后显微镜观察，不彻底时再重复99次。菌体来自200 ml培养液，用20 ml PBS重悬。
然后我又尝试加溶菌酶，首先加至终浓度100 ug/ml，4C半小时菌液不变粘，加大浓度至1 mg/ml，半小时后仍无明显变化。因为我用的PBS是pH7.4，我怀疑是pH不合适，换用pH8.0 TE buffer，1 mg/ml溶菌酶，4C半小时仍无明显变粘。因为这次使用的溶菌酶是前一天配好的，担心溶菌酶失效，重新称取冻干粉末，直接加入菌液，仍然没有明显变化。
真是郁闷。到底出了什么事？请高手解答，并介绍优化的方案。
同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法，以及如何确定最佳条件。
溶菌酶在pH7.4时是否没有活性了？可否配成浓缩液保存溶菌酶，如果可以，应如何保存？加入溶菌酶以后，如果细胞壁已破坏，菌液应该变粘吧，因为核酸被释放出来。
而超声破碎细胞，我觉得菌液是不会变粘的，因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。我判断细胞破碎不完全是因为，在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDS-PAGE观察，发现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外，还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。
据此可以判断细胞只是部分破碎。
不知我的分析是否正确，请版主和各位高手指教。
如果溶菌酶效果还可以，我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞，然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好。因为超声有可能使蛋白变性，但单用溶菌酶不能确定是否完全破碎，还要再加核酸酶降低粘度。这种两步法策略应该还可以减少破碎条件优化的时间。
我用的溶菌酶放置时间比较长了，有可能失活了。我刚从生工又定了一支，不过得后天到货，但愿它有用。
如何观察溶菌酶是否已裂解细胞，通过观察粘度变化是否可以？
只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞？
溶菌酶只有在pH值大于8.0的条件下才能发挥溶菌作用，请务必保持PBS的pH＞8.0，同时溶菌酶的量一定要足！
在加入溶菌酶后，最好放于磁力搅拌器上搅拌30分钟，再进行超声破菌，我的超声条件是：功率400W，工作2秒，间隔2秒，重复199次。菌体来自500 ml培养物，用30 ml PBS重悬，超声效率还是可以的。
哪儿的溶菌酶好用？
我用生工的溶菌酶，称取干粉20mg。200ml菌液用18 ml NaCl重悬，加入2 ml 25mM Tris-HCl(pH8.0)，将溶菌酶干粉加入体系，混匀，测pH降低到5－6，加20 ul 2M Tris碱，体系pH升到～8。4C放置1小时，菌液上层变澄清，摇动发现体系没有变粘。测pH仍在8左右。再37C保温1小时，还没有变化，我简直不知如何才好了。
另一瓶200ml培养物，溶菌酶处理1小时后超声。条件：300W，超5秒停5秒，重复99次。菌液有变化，但很不明显。继续超声400次，从外观来看没有太大区别。我简直要说tmd了。
见鬼了。
我的操作有什么地方不妥当，请各位指正。
溶菌酶的厂商要求是否很重要？
我的诱导物来自1：20过夜培养物接种，37C生长3小时后30C诱导2小时（0.8mM IPTG）。
是否菌液太浓，Pharmacia的说明书200 ml培养物用10 ml重悬，我用20 ml，仍然不够稀？有人告诉我菌液应该稀一些，200 ml用30－40 ml重悬。但实际操作也不够理想。
SDS-PAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。超声那么多次，蛋白都要被超碎变性了。
3、酵母的破碎
酵母是一类单细胞真菌的总称，其成员分别属于不同的真菌纲，细胞壁成分是否会有较大差别，这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。我归纳了一下，做破碎酵母的几种方法：
1 机械的方法：一般的PROTOCOL都是用glass beads：如 sigma G-8772，加玻璃珠后超声，蛋白活性保持较好。
2 化学裂解的方法：10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状（希望高手点评）
3 尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH 值8.0）高压匀浆。（这个好象也该在方法2中）
4 液氮冻融并研磨酵母破壁，我认为这种可能在小试中比较合适。
5 温和的酶法，可能不会会破坏酵母原生质体
酶法裂解主要用两种酶：1。蜗牛酶，可以直接从蜗牛的胃液中获得；2。lyticase，可以从sigma定购。这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用，尤其是glass beads方法，效果很好。
我用过化学裂解的方法，10g酵母加1ml的乙酸乙酯，充分搅拌至液体状。此法的裂解效果
不错的，不妨试一下。
一篇文章是加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0），据说效果可以
酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠，就象microbe 和rongjunli所说的那样，效率很高的，而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。
4、超声破碎的条件选择
超声破碎的条件不能一概而论，要看你的实验要求，有的是细菌破碎，有的是对组织细胞进行破碎，要掌握好功率和每次超声时间，功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，必要时在冰浴条件下进行超声破碎。至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题，这与你超声的量明显有关。
5、如何鉴定细菌超声破碎的程度
最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察
切记：只用结晶紫染色，别忘了染色后再用水稍冲洗一下
6、细菌裂解的DNaseI
不同纯度的酶换算标准不同，所以你最好查查是哪个公司的酶？仔细看说明书，可能会有换算说明。
另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的，到该公司的主页也可能有收获。
我用过华美和TAKARA的DNA酶，华美的是用mg/ml。华美也有RNase free的DNA酶，定量
用活性单位。TAKARA的两种酶都是用活性单位定量的。
我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶，一般用超声液加不同量的酶做一个预实验，选取符合你需要的酶量。
其实根据目的和方法的不同，所需要的酶量也是可调节的，比如酶切温度（16度或37度）。
7、超声裂解细菌是否完全？
最简单的方法：涂片--革兰氏结晶紫溶液染色0.5分钟---显微镜观察
切记：只用结晶紫染色
二、包涵体的洗涤
1、包涵体的洗涤问题
通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体
对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：
尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。
8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实验际温度要比设定温度低至少4度（呵呵，不好意思！）。不过我接着往下进行SDS-PAGE、层析等发现没有什么不良影响。所以，你不用担心也许你的蛋白也只是和你开了个玩笑呢！
三、关于包涵体的溶解：
1、请教GST包涵体溶解
直接用8M的脲或 6M胍融解，取上清，测浓度。直接稀释后包被检测相应抗体。（由于快速稀释相当于复性过程，产物用于检测没有问题的）
我所用的包涵体提取方法：
1．PBS或生理盐水洗涤诱导后菌体，Buffer A重悬菌体，超声波破碎至清亮
２．４度，１００００rpm离心１０分钟，弃上清
３．用ＰＢＳ或生理盐水洗涤沉淀２－３次
４．往沉淀中加１９．７ml Buffer A及０．３ml ２０％的ＳＫＬ（十二烷基肌氨酸钠）贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温静置３０分钟至２小时
５．４度，１００００rpm离心１０分钟，取上清
６．加２０％ＰＥＧ４０００２１０ul至终浓度为０．２％，加５０mM的氧化型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为１mM,加100mM的还原型谷胱甘肽４２０ul至终浓度为２mM,静置３０分钟至２小时（亦可４度复性过夜）
７以ＰＢＳ（pH8.0)或ＴＥ（pH8.0)透析，取出－２０度保存备用
！Buffer A配方：
Tris-base 50mM
EDTA 0.5mM
NaCl 50mM
甘油5%
DTT 5mM
2、包涵体的溶解
十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时，可不可以互相代替？可以替换，调pH不久没什么区别了吗；两者的功能团相同，pH不同，前者钠盐便于保存罢了
3、有关包涵体的溶解问题
强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等是去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。
4、8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?
我在4度放了半个月，目前没出什么问题
5、8M尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题?
BI溶液在室温放置48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，因而早些处理BI溶液比较好。具体有什么影响我也不是很清楚。
6、GST融合蛋白形成包含体不溶，咋办？
GST融合蛋白应该不能用尿素等作用太强的变性剂，否则GST融合蛋白是不能与beads相结合的
GST的Beads是应用酶与底物结合的原理，所以要去除处理因素后才好结合，不知你的温和的去污剂是什么？
做完裂解之后加Triton X－100轻摇３０min，蛋白溶解的会多些！
四、包涵体的复性
1、包涵体如何复性
包涵体的复性主要有两种方式：
1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释
2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂
其中透析很适合实验室应用，但是时间长。另外，如果蛋白质右两个以上的2硫键，很可能错误形成配对，应用还原剂。还有，复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定！
另外，你用多大体积的透析缓冲液？可能不够，要更换几次
你家了多少蛋白呀？蛋白量过大也会使复性困难。
你用的透析代是否是新的，处理过没有？新代有化学杂质！
最后，有些复性过程就是还有沉淀（透析方法的缺点）看看溶液中蛋白含量，说不定已经够
用了~~
包涵体的复性还要注意以下几点：
1.首先要获得较高纯度的包涵体。
2.包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施。
3.透析前后均要离心
4.透析不能太快.
5.纯化的最佳条件要摸索。
小技巧：
1）包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100.
2) 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性
3）复性液的组成很有讲究，本人使用 Oxidised Glutathione/ Reduced Glutathione 还加入一定的L-Arginine-Hydrochloride 12-24h
4) 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h
5) 复性率的测定据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定（望有经验的战友能更详细地讲解）
6）TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。好像SDS 最后残留量不能大于0.5%吧，忘了。
我用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。因为色谱柱的纯化条件比较难optimize。
这段文字可以参考：
用Novagen公司《pET System Manual》提供的方法，分别进行细菌渗透休克，超声波裂解，研究融合蛋白在细胞周质，细胞质和包涵体中的分布。
渗透休克用1.2.3方法诱导细菌（10ml体积），测菌液OD600，10000 r/min离心0.5 min 去上清，加入渗透休克溶液1（V1= OD 600×V2/5，V1为渗透休克溶液1，V2为培养新鲜菌液），冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，去上清。加V1体积渗透休克溶液2重悬，摇动冰浴10 min，10000 r/min离心0.5 min，保存上清、细菌沉淀。作如下处理：上清用三氯乙酸(TCA Trichloroacetic acid) 沉淀，加1/10体积100% TCA (w/v)，涡漩15 sec.，冰浴10 min，13000 r/min离心5 min，100 ul丙酮洗涤沉淀，干燥1 h，加V1/2体积1× PBS（pH 10）溶解，-20℃保存，取10 ul加入等体积2×SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，UNIUER SAL HooD-S.N. 75s 成像系统照相。
超声波裂解细菌渗透休克细菌沉淀加1/10培养体积20 mM Tris-HCl（pH 7.5，0℃）重悬，冰浴，超声波裂解，20%工作选择，脉冲粉碎1 min，然后13000 r/min离心5 min，-20℃保存上清、细菌沉淀。上清进行TCA沉淀，处理同上。沉淀用Protein Extraction Reagent （Ni-NTAHi Bind Purification Kit BugBuster. 提供）按 Novagen公司《pET System Manual》提供方法反复处理，洗涤包涵体。包涵体按培养菌100×OD600/3 ul体积加1% SDS 溶解，加等体积2×SB，进行12% SDS-PAGE电泳分析，进行蛋白条带灰度扫描，计算融合蛋白Trx-PrPC27-30占细菌总蛋白的相对含量。
1.2.7重组融合蛋白的纯化
PrP-pET-32a（+）转化表达菌E.coli BL21（DE3），TB培养基中，25℃，AMP 200 ug/ml，摇床（250 r／min）培养至OD600约为1.5，更换等体积新鲜TB培养基，加入IPTG至终浓度1 mM，AMP 200 ug/ml，25℃，4 h，4000 g离心收集菌体。按 Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明溶解包涵体，纯化融合蛋白。
或使用笔者改进方法，将Ni-NTA HiBind Purification Kit使用说明中Buffer D改成Wash-Buffer，Buffer-E改成Elute-Buffer，最后用Buffer-E重生Ni-NTA HiBind Rasin，Binding- Buffer平衡以后加50%酒精保存，以免长菌。
洗脱所得蛋白用TCA沉淀，处理同上，得融合蛋白Trx-PrPC27-30，冻干保存。然后12% SDS-PAGE凝胶电泳分析。
3、包涵体复性2
精氨酸可助溶，但精氨酸是代谢产物高浓度对人可能不好。
另外甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以试一试。
对于疏水蛋白的可溶表达，可以降低诱导温度（可以试试4度诱导过夜）和IPTG的量，降低蛋白的表达速度，从而减少包涵体形成的速度，增加正确折叠蛋白的量。或者换成GST融合表达载体，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表达。我的蛋白包涵体在经变性纯化后透析复性过程中，在透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。我想对于你的情况，由于含有二硫键，还要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成正确的二硫键。复性是一个很难捉摸的过程，不同蛋白的复性条件也各不相同。
5、包涵体复性问题
包含体复性三大原则：
1。低浓度
2。平缓梯度
3。低温
有蛋白析出最大的可能型是：蛋白浓度太高，建议你稀释以后再作透析。
此外，透析的盐浓度（比如ura）要平缓降低：8m-6m-4m-2m-pbs-H2O。
6、包涵体复性形成聚集物
关键是蛋白在复性过程中凝聚了以后，调节PH可以使其溶解，但是这样复性好的蛋白有没有活性还是问题，虽然样品溶解了，但活性不高或没有也不行呀！
7、复性中蛋白析出！
出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据你包含体的溶液成分，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M；
另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油；一些拙见。8、包涵体复性液配方
对于包涵体复性，一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。TRIS系统和PBS系统都没有明确的规定，这些需要你在实验过程中不断试验，确定合适的缓冲系统；不过复性过程主要是注意以下几个问题：
1）最适pH值范围为8.0-9.0之间；
2) 温度适宜选择4℃；
3）复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL；
4) 复性时间一般为24-36小时；
5) 低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复
性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解；
6) 氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.。
还有就是你的蛋白质的特性
9、什么叫复性成功
复性效果的检测：
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1，凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2，光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3，色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，
4，生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。5，黏度和浊度测a定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6，免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。
在正常的生理条件下，组成蛋白质的多肽链都能以独特的方式进行折叠，形成自己特有的空间结构，以执行某一些生命活动。当外界环境改变时，可能造成基因突变和蛋白质序列改变，错误剪接和运输，错误折叠和异常聚积，形成对机体有害的反应，引起构象病的发生和无生物活性、不可溶的包涵体形成。目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚，
许多已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的，且没有普遍性，但从这许许多多的个例中发现了一些规律：如聚集的发生是由链间的疏水相互作用介导、聚集具有相对特异性、折叠中间体可能具有不同的作用等等，并利用这些知识建立了一些重组蛋白质高效复兴性的方法。相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相关新技术和新设备的发展和完善，在不久的将来，预测和设计最佳复性方案将成为可能。
10、怎样鉴定融合蛋白复性是否成功
问：最近在做GST融合蛋白的纯化，由于目的蛋白主要存在于包涵体中，所以在变性条件下将包涵体溶解，经复性，透析后用GSH sepharose 4B纯化，结果得到了比较纯的融合蛋白，这是否说明GST的活性已得到恢复（因为能与GSH结合），请问这种情况下，是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢复？由于我的目的蛋白只是一个蛋白的某一段，不具有酶活性，也不是什么受体之类的，所以不知如何鉴定它的活性。
如果我得到的是变性的融合蛋白，那么用于制备多抗或者单抗会有影响吗？
如果我的融合蛋白是可溶性的，那么用GSH sepharose 4B纯化得到的融合蛋白可以直接用于制备多抗吗？溶液中的GSH，Tis等成分对免疫动物有影响吗？是否需要透析除取这些成分才能去免疫动物呢？
答：1）。不可以。GST 具体多大忘记了，但做为TAG 使用的蛋白一般是很小的一段AA，可以用相对应的抗体做PULL DOWN，亲和纯化等。但蛋白的活性是需要构象存在的，一小段TAG 空间结构几乎没有，就算是没有恢复活性的蛋白也可以与这小段AA 对应的抗体结合。
2）。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
3）。免疫动物要求抗原体种尽量小。在这种小体积的情况下，缓冲液里的小分子成分只要没毒影响就不大，可以不用考虑。
4） GST为26kd,你得到的蛋白活性应通过目的蛋白功能分析才能验证是否复性。GST融合蛋白可以免疫动物，但抗体纯化须用GSH-sepharose 4B 和蛋白A或G进一步纯化，去掉抗GST抗体，如果你的目的蛋白很大，可以凝血酶切割除去ＧＳＴ，再免疫动物.GSH,Tris 是小分子，没影响。
5）既然目的蛋白没有活性，何来得活性鉴定，复性是否成功，就主要是看是否恢复到原来特有的三级结构，这就要看你目的蛋白的特异性，和天然的目的蛋白片断进行比较，看其复性是否彻底，这必须有个对照，才能知道复性是否完全。不知道你得到目的蛋白有什么用处，如果是用来做抗原，就没有必要进行活性鉴定了。
变性的融合蛋白做抗原是没有影响的，gst的分子量是26kda，当然，如果将融合伴侣除去，抗体的特异性会要更好一些，如果不除，影响也不会很大。最好进行透析，除去溶液中的杂物质，但是Tris没有什么关系，其就如同PBS一样，本身是缓冲体系，不会对免疫造成太大影响。
6）做抗原的话，变性了没关系的；纯化后可以直接免疫动物，我们这就有人做，不过他是用的His融合表达；挂着GST挺好的，不切也行，蛋白大些岂不是抗原性更强些
另外，你看没看过菌液上清里的蛋白量？那里可能有许多的有活性的蛋白呀
五、包涵体的纯化
复性以后的蛋白质的纯化策略与可溶性蛋白质相似，这里不再赘述。（注：当然也可以先纯化然后再复性———一般多采用凝胶柱，或者纯化与复性同步进行———比如柱上复性。）
六、综述以及其他
1、蛋白复性和纯化在线资料
1. 包涵体表达的蛋白的复性 https://www.doczj.com/doc/0914859693.html,/method/ecoli.htm#1
2. 重组蛋白纯化方法
组织细胞的破碎 https://www.doczj.com/doc/0914859693.html,/method/sansheng/dissociation.htm
目标蛋白的粗提 https://www.doczj.com/doc/0914859693.html,/method/sansheng/extracting.htm
蛋白质沉淀方法 https://www.doczj.com/doc/0914859693.html,/method/sansheng/precipitation.htm
色谱分离 https://www.doczj.com/doc/0914859693.html,/method/sansheng/chromatogram.htm
2、综述
蛋白的复性是一个世界性的难题，没有通用的方法，甚至没有靠得住的规律，只能试。
可以参考以下文章。该文出处已经忘了，如果有人知道原创作者或网上出处，请补充。
包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性
包涵体：
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
包涵体的组成与特性：
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA 等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。
包涵体表达的有利因素：
第二部分：蛋白的纯化 如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？ 破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。 根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。 对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。 沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。 取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。 无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。 包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。 电泳检测的话，可以用SDS-PAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。 包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体； 建议： 还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。
包涵体得形成以及处理方法 1包涵体形成得原因 (1)表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体L２]。原因可能就是合成速度太快,以至于没有足够得时间进行折叠,二硫键不能正确配对,过多蛋白间得非特异性结合,蛋白质无法达到足够得溶解度等。(2)重组蛋白就是大肠杆菌得异源蛋白,真核糖蛋白无法糖基化使中问体溶解度下降,导致不溶解包涵体形成］。(3)重组蛋白分泌序列得存在阻碍折叠,导致错误折叠分子得产生。(４)重组蛋白得氨基酸组成,一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。(５)包涵体形成动力学研究表明,包涵体就是由部分变性得中阃体聚合而成。因此,任何影响中间体稳定得因素,如pH值(ｐＨ接近蛋白得等电点时容易形成包涵体)离子强度与温度都可以引起蛋白聚合反应。(6)在细菌分泌得某个阶段,蛋白质分子间得离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体得形成、(７)有报道认为,丰富得培养基有利于活性蛋白质得表达,当培养条件不佳时,容易形成包涵体？。 包涵体得处理 包涵体得形成具有有利得一面,也有不利得一面、有利得一面就是包涵体得形成去除了几乎全部得细胞内可溶性蛋白质。同时,因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物得降解而大大提高产率,通常其表达量可占菌体总蛋白得１0％～30％,甚至高达５0％。不利得一面就是溶解包涵体进行复性折叠得过程中需要加变性剂与去垢剂,而引起蛋白质得不可逆修饰以及性质改变,这些试剂价格昂贵,且复性得操作过程不好控制;另一方面复性过程常伴有蛋白质水解与沉淀,有些还形成异构体【s] ５。因此复性就是蛋白质工程中最关键、最复杂得问题。
包涵体得处理一般有如下几个步聚。 破碎细菌细胞 提取包涵体时,首先要裂解细菌,为了防止在裂解细菌得过程中目得蛋白质变性,常常采取一些保护措施:合适得缓冲体系,如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液;加 入保护剂,如还原剂DTT(２一巯基苏糖醇)、２一巯基乙醇;加防止水解酶作用得试剂,如酶得抑制剂、EDTA(乙二胺四乙酸)。破菌得方法很多,主要包括以下几种:(１)渗透破碎法: 这种方法就是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。(2)冷热交替法:把待碎样品投人90℃左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内,可使大部分细胞破碎、可用于提取蛋白质与核酸。 (3)反复冻融法:把待碎样品冷却到一2Ｏ℃,冻固后取出,缓慢解冻,如此反复操作,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破导致部分细胞及胞内得颗粒破碎,但也可使生物活性物质失活。这种方法虽简单方便,但对温度变化敏感得蛋白质却不宜采用。(4)超声波法:使用超声波仪使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎、根据不同待碎样品采用不同频率,不同时间;另外,超声波处理时溶液温度升高会使不耐热得物质失活,因此使用时为防止温度升高,除间歇开机外,还需人工降温、避免溶液内存在气泡,这样会使蛋白质变性【６】。(5)溶菌酶处理法:多用于破坏大肠杆菌等微生物得细胞壁、在每毫升含2亿个细胞得悬液中加1０0 g至1 mg溶菌酶,37℃保温１0 min,或者室温作用30 ｍｉｎ,细胞就破坏了、 洗涤包涵体 洗涤包涵体前先8000 r/rａin,412离心15 ｒaｉn,可使大多数包涵体沉淀,
教学过程六个基本环节 通常意义上，一节完整的思维型教学的课堂需要包含六个基本环节：创设情境—提出问题—自主探究—合作交流—总结反思—应用迁移。 每个环节都至关重要，各个环节的优劣直接关乎学生学习行为的发生、思维能力的培养以及素养的形成。 那么，教师该如何有效落实这六个环节，分别要注意些什么？ 一、创设情境 一个好的情境创设需要具备一些标准：
1、情境能够融入情感，激发学生的内在动机； 2、鼓励学生大胆质疑，便于学生积极参与和主动学习； 3、能够产生高认知的问题，并具有目的性、适应性和新颖性。情境和问题； 4、能够使学生产生认知冲突，激发学生积极思维。情境与问题是密不可分的，在情境中会产生疑难，而疑难便会引发问题。问题是在情境中自然而然产生的； 5、要基于生活实际，接近真实情境。情境唯有和学生的生活紧密相连，学生才能真正理解知识，才能产生真实感受； 6、要紧扣教学内容，突出教学重点。情境的创设要与教学内容紧密结合，是为了激发学生的思维而产生的，并非为了创设情境而创设情境；
7、要适合学生的知识经验和认知水平，符合最近发展区的要求。 以上这些是一个好的情境需要具备的要求。那么，创设情境的方法有哪些呢？主要可以分为四种： 1、观察与实验。比如教师想让学生认识鼓，就可以让学生观察各种不同的鼓，最后抽象概括出鼓的概念；
2、模拟事物。现在虚拟现实技术可以模拟一些观察不到的场景，比如宇宙景观以及分子结构等等； 3、唤起学生已有的知识和经验。学生在日常生活中积累了很多经验，可以唤起他们的这些经验。或者，在上节课上已经解决了某一个问题，教师可以根据这一结果提出一个新的问题。
包涵体的纯化和复性总结（二） 关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-1 00, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的load ing buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. "取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? " 而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.
包涵体： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 包涵体的组成与特性： 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF 和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。 包涵体表达的有利因素： 1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。 破菌： 1、机械破碎 2、超声破碎 3、化学方法破碎 分离： 1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 2、过滤或萃取方法： 洗涤： 由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。 溶解：
第四节教学过程的基本环节及要求 教学是学校的中心工作，学校的一切工作必须服从和服务于教学这一中心，体现这一中心的两个主要方面是认真抓好出常规管理和深入开展教学研究。 教学基本环节： 一、备课 教师课前的准备，是教师对教学道德策划工作。备课是教师教学工作的起始环节，是上好课的先决条件。 （一）钻研理解教材 1.钻研理解教材的方法 （1）整体把握法 （2）单元教学法 （3）单篇钻研法 （4）教例收集法 （5）专题比较法 （6）立体展现法 2.钻研教材的具体操作 （1）抓重点，抓关键 （2）突破难点 （3）找出规律 （4）关注习题 第一，明确习题的目的功能 第二，明确习题的解答要求 第三，确定习题的解答方式。解答方式一般有口答、板演、书面作业、思考、讨论等。 第四，安排恰当的习题份量和难度。 此外，教师还要善于参阅有关资料，根据需要自编、自选、改编一些补充习题，保证教学、训练有效进行。 （二）分析研究学生
1、分析研究学生的内容 教师研究所教学生的内容丰富多彩，主要包括三方面的内容：一是学生个体已有的知识性结构，也就是学生基础知识水平；二是学生个体已有的能力性结构，主要是学习能力，包括解决问题的能力、班集体中共同讨论学习的能力、创新能力等；三是学生的非智力因素，主要包括兴趣、情感、信心、毅力、意志、习惯、品质等。具体如下： （1）研究所教学生的群体特点规律 （2）研究学生的家庭背景 （3）研究学生的学习经历 2、分析研究学生的方法 常用的了解研究学生的方法主要有： （1）观察法 全局观察法、细微观察法、比较观察法、多角度观察法、追踪观察法、实验观察法（2）问卷法 问卷法一般用于教师为新学生上课的情况，面对新学生，教师要根据所教学科的特点，设计若干问题，让学生作答，通过这些问题的答案了解学生已有的学科知识基础和多方面的学习习惯，为自己制定正确的教学策略提供第一手资料。 问卷形式主要有以下三种（选择） 1封闭型或结构型问卷 是否型、选择型、评判型、封闭型 2开放型或非结构型问卷 3综合型问卷 （3）谈话法 谈话的方式有：1渐进式谈话2商讨式谈话3谈心式谈话 （4）自我介绍法 （5）总结法 3分析研究学生必需的技能 （1）教师要学会与学生沟通 （2）教师要学会分析和观察 （3）教师应明确了解学生是一个双向互动的过程 4分析学生应处理好的几个关系
一、包涵体的纯化和复性总结（二） 二、[ 2008-2-25 14:25:00 | By: 飞鸿 ] 三、关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等
细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml 溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. "取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法
物理规律的教学一般要经历哪几个阶段 (一)、提出问题,创设物理环境 提出问题是整个探究的基础，因为问题是思维的动因，是探究的起点。以问题为载体引导学生展开思维进行探索和研究，寻求解决问题的途径和方法，让学生通过自己的思考和实践去主动获取知识，才能培养学生的创新精神和实践能力。这一环节尽可能鼓励或启发学生自己去发现和提出问题。 在教学中，教师引导学生提出问题的常见方法有： A．观察法 B．联想法C．比较法D．推理法E．实验法 如学生在探究牛顿第一定律教学时时，就用到：实验法—联想法—推理法 实验是发现规律的基础，先让他们作实验“阻力对运动物体的影响”，启发他们从实验中发现问题。 教师实验后可提问：“如果不受力将怎么运动，可以展开联想。如学生在实验后进行合理的推导。没有阻力运动物体将一直运动下去。 (二)、进行思维加工,建立物理规律 在中学物理教学过程中，总结规律主要运用了实验归纳法、逻辑推理法、理想实验法、图像法以及假说等方法。其中又以实验归纳法最为普遍。 实验归纳法：所谓归纳法，是从一些特殊的事实中概括出一般性结论的思维方法，是从许多同类的个别事物中找出它们共同点的过程。 (1)实验归纳法:物理学中运用归纳法的基础主要是实验，因为实验不但能够重复进行，更重要的是它可以准确地反映事物各个部分或物理过程的各个阶段的相互联系，而且运用实验最容易引起学生的兴趣，所以在中学，特别是在初中物理教学中总结物理规律应用最多的便是实验归纳法。运用实验归纳法时，常常借助于图像，即把实验所得数据在坐标系中画点、连线，从分析图线中，总结规律。例如牛顿第一定律 (2)逻辑推理法：就是在已有的定律的基础上结合一些概念，运用数学知识推证而得出结论的方法。例如，串并联电路中总电阻的计算公式，就是利用欧姆定律结合串并联电路中电流、电压的实验关系，运用简单的数学知识推得的。 有一些定性描述的规律，限于实验条件，不易做演示实验，因此可采用定性演示结合理论推导的方法而得出。
随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1 蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可 以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2.各种蛋白纯化方法及优缺点 2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。硫酸铵分馏常用做纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG 和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果， 在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。
包涵体纯化方案 缓冲液配方： 1.变性复性缓冲液 缓冲液A：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA①, 100mM NaCl②,1%Triton X-100③ 缓冲液B：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100，2M脲素④ 缓冲液C：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100 缓冲液D：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100，2M盐酸胍④ 溶解缓冲液E：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，10mM β-巯基乙醇/DTT⑤，2mM脱氧胆酸钠⑥， 8M脲素 复性缓冲液：50mM Tris-HCl (pH8.5)，100mM NaCl ，6M/4M/2M脲素,1%甘氨酸⑦，5%甘油⑧，0.2%PEG⑨，1mM氧 化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽⑩ 2.纯化缓冲液 Binding buffer：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM 咪唑，pH8.5
Elution buffer：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 不同浓度梯度咪唑, pH8.5 具体实施步骤： 1.大量诱导表达的菌液7000rpm离心10min。弃上清，用1×PBS重悬，洗涤菌体细胞，7000rpm，离心10min。再用PBS重复洗一遍。离心后留菌体沉淀。 2.将菌体细胞用缓冲液A重悬，液氮中反复冻融后，超声破碎。13000rpm 离心10min，弃上清，收集包涵体沉淀。 2.分别用缓冲液B、C、D超声清洗包涵体沉淀。13000rpm离心10min 收集沉淀。 3.用缓冲液E溶解包涵体，缓慢摇动使其缓慢溶解，室温放置30min，然后13000rpm离心10min。取上清。 4.将上清稀释至0.1-1.0mg/ml，装入透析袋中，放置于梯度复性缓冲液中，4℃缓慢透析24-36h。最后在纯化binding buffer中透析，确保蛋白稳定可溶。 5.对溶解的包涵体蛋白进行亲和层析。 附注： ①EDTA防止蛋白降解 ②NaCl一定的盐离子可降低某些带电基团间的斥力 ③Triton X-100除去其他细菌成分，如膜外蛋白，质粒DNA和其他杂质 ④脲素，盐酸胍，洗掉包涵体表面的不溶性杂蛋白
教学设计的几个主要环节： 1、分析教学内容 2、学习者分析（学生） 3、教学重点、难点分析 4、教师分析 5、教学策略的分析 6、教学评价的设计 各环节的内容： （1）教学目标的设计 教学目标包括教的目标，也包括学的目标。它就是通过教师的教学和学生的学，最后达到的一种目标。它是教学设计中十分重要的内容。在进行教学设计时，一般依据《历史课程标准》，从知识与能力、过程与方法、情感态度价值观三个维度去进行教学目标的设计。 （2）教学方法的设计 在中学历史教学中，可用的方法很多。教师在备课时要对选用教学方法进行精心设计。教学方法的设计实际上就是确定教学方法的运用：什么内容用什么方法。选用的依据包括五个方面，具体内容参照第二讲中的相关内容。 注意一个课时的教学往往不止一种方法，在设计方法时最好具体到每个子目或每个知识点上。（如洋务运动一课中，洋务派与顽固派的主张可以用辩论法，也可用图表对比呈现观点；洋务企业可用图表法；洋务企业的特点可用讲解法或讨论法；评价可用讨论法） （3）教具的设计 历史教具是历史教学必要的辅助手段，包括实物类教具、图示教具、多媒体教具等。实物教具如小黑板、某种历史物件的模型或样品、有利于教学的其他具体物品；图片教具主要是一些历史图片、地图；多媒体类教具就是多媒体课件及相关的设施。备课时要精心考虑可以选用的教具以辅助教学，从而更好地实现教学目标。 （4）板书设计 板书设计是教学设计的重要组成部分，板书设计是否科学合理，直接关系到学生对相关内容的学习效果。怎样进行板书设计，将在后一节讲述。 （5）、教学思路设计 教学思路设计是教师对已确定的教学内容怎样教及推进程序的一个总体思考，其中重点是教学过程的推进顺序。一般包括以下几个方面的工作： ①设计教学过程中教师活动的时间和学生活动的时间。教师活动主要包括：讲解、提问、教具演示、板书等；学生活动主要包括：学生读书、回答问题（时间可灵活）、讨论、练习等。对于这些活动什么时候做、用多少时间做都要有计划性。 ②分配好教学过程各环节的时间。教学过程各环节的时间安排一般是这样的：组织教学1分钟、导入新课3分钟左右、讲授新课30—35分钟、小结3—5分钟；布置作业灵活处理。教学中应按这个时间安排进行。 ③设计每个知识点的用时； ④设计好子目间的过渡。 对教学思路设计的基本要求是：使整个课堂节奏紧凑，环环相扣，成为一个有机整体。教学设计是对教学的一个总体规划，是保证课堂教学有序、有效推进的前提。因此，在备课时要充分予以重视。
包涵体蛋白的分离纯化 赵玲0743085096 包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH 值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%~95%,此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。 1. 包涵体的形成 重组蛋白不论在原核细胞还是真核细胞中表达时,都可形成包涵体。通常所说的包涵体是指重组蛋白在大肠杆菌中高效表达时形成的无活性蛋白聚集体,一般含有50%以上重组蛋白,其余为核糖体组分、RNA聚合酶,外膜蛋白等杂蛋白,以及质粒DNA、RNA片断、脂质、肽聚糖、脂多糖等成分]。由于包涵体在相差显微镜下为黑色斑点, 所以也称为折射体。包涵体形成的原因主要有以下几点: ⑴蛋白合成速度太快,以致于没有足够的时间进行折叠。蛋白折叠的动力学模型表明:蛋白质天然构象形成的速率取决于肽链的合成速率、折叠速率和聚集速率几个因素。中间体正确折叠是分子内的一级反应,而中间体的聚集是发生在分子间的二级或高级反应,因此,折叠中间体的浓度对聚集反应影响非常大];⑵重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺少真核生物的翻译后修饰系统(如糖基化等) ,致使中间体大量积累,容易形成包涵体;⑶培养条件不佳和重组蛋白所处的环境也可导致包涵体形成,如发酵温度高,胞内pH 接近蛋白的等电点等;⑷二硫键在蛋白折叠中有重要作用,而大肠杆菌胞内的还原环境不利于二硫键的形成;⑸包 涵体不溶可能由于分子间无活性的β2片层含量高于天然结构或盐沉淀蛋白。包涵体蛋白虽然不具有天然
板块一、大肠杆菌 （这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。） 一、关于菌体的量 大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。 二、关于是否包涵体表达 包涵体的定义我就不讲了。我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？ 说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。
甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。 我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。 三、关于表达量 我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。我要说都是文章的作者在忽悠。不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。如用：很低、较低、中等、较高、很高等来描述。 有一个指标与表达量密切相关，那就是单位体积的菌体量。两者的乘积才是单位体积发酵液的目标蛋白产率。 与表达量相关的指标还有纯化倍数、纯化收率等，这些指标我们也常常在发表的文章中看到。同样，我也认为都是不准确的。除非你用的是活性测定的方法，用蛋白活性收率来表征。 纯化工艺的难易有时候也与表达量相关，表达量高时往往纯化也方便的多。所以，尽量提高你的目标蛋白表达量不只是基因工程上游和产量的问题，还是纯化工艺开发的问题。 四、菌体破碎
教学的过程主要分为以下几个阶段: 第一是预备阶段。 先熟悉实习班级的情况，认识班上的每个学生以及他们学习情况。然后，认真听指导老师上课。现在的听课的感觉和以前完全不一样：以前听课是为了学习知识；现在听课是学习教学方法。目的不一样，上课的注意点就不一样，现在注意的是指导老师的上课方式，上课的思想。接着，根据在大学所学的教育知识和在中学实习听课所学到的，自己在已有的基础上备课，。做足了上讲台的准备。在经过了前两天听课后，第三天我正式走上讲台，第一次感觉自己所学的知识派上用场。作为一名教师，还有一个天职就是教书，无私地把知识传播给学生。这也是我们实习的重要内容——授课。我初次体会到当老师的辛苦。上一节课，要经过“备课（写教案）——上课——批改作业——接受学生反馈的信息——评讲、巩固练习”这样一个流水线。看起来简单，可其中每个环节又有很多小细节，最主要的是“上课”。这个环节，也就是我们一直在探讨的“课堂教学”。 这些都是初三的学生，面临着中考的严峻形势。为了孩子的学习问题，学校和家长都废尽了心力.因此, 每当站在讲台上，被一双双纯净的眼睛聚精会神地望着时，作为一名教师的价值感和成就感就油然而生了,也意识到自己的责任是多么的大，我在心里暗下决心，用全力帮助孩子学习，并向家长和学校保证，会重视这份工作，尽自己的全力把工作做好。 一个老师告诉我：备课充分，能调动学生的积极性，上课效果就好。但同时又要有驾驭课堂的能力，因为学生在课堂上的一举一动都会直接影响课堂教学。因此上课一定要设法令学生投入，不让其分心，这就很讲究方法了。上课内容丰富，现实；教态自然，讲课生动，难易适中照顾全部，就自然能够吸引住学生。所以，老师每天都要有充足的精神，让学生感受到一种自然气氛。英语是一门外语，对学生而言，既生疏又困难，在这样一种大环境之下，要教好英语，就要让学生喜爱英语，让他们对英语产生兴趣。否则学生对这门学科产生畏难情绪，不愿学也无法学下去。而我教的学生在英语写作方面存在着一定的问题,所以学校和家长都提出要着重补一下英语作文方面,所以我在这方面做了很多准备。正式上课的第一天，我让学生拿出了以前做过的卷子，在很多人的卷子上字迹很潦草，由字知人，我想他们在学习上一定很随意，对自己要求不严格，很多错误都没有标出来我跟他们讲了卷面整齐的重要性，并帮他们纠正了错误。通过分析他们的语文卷子，我发现他们在回答问题上很有自己的想法，只是答题的态度不端正，有点应付的感觉。但是他们的思路很清晰，对考试存在着态度不正确的问题。但是可以看出他们是有独特想法的孩子，如果他们认真审题，仔细做答的话，我相信他们会有很不错的成绩。我把我的想法和思路都告诉他们，他们频频点头表示赞同。我也开始意识到：现在的首要任务不是讲课，而是帮助他们端正学习态度。此后，我也经常给他们上类似的课程，不时地与他们交谈学习体会。他们的听课状态比以前有了很大的改观，我也为之而感到欣喜万分。 关于作文的辅导，我虽然水平有限，但对于初中生的英语作文的应试我还是了解一些的,因为我也曾是一个初中生。我自己平时也写一些东西，我把我的文章给他们看，告诉他们我
包涵体的纯化和复性总结 二、包涵体的洗涤? 1、包涵体的洗涤问题? 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。? 包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。 此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。? 2、如何得到比较纯的包涵体? 对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。 包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3?mM。去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。? 对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。? 包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。? 8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实
教学过程六个基本环节 标签：教育分类：教学反思 六环节课堂教学模式的实质是：全过程都让学生学。 六环节课堂教学模式的教育理念是：尊重主体，面向全体，人人参与，个个展示，尝试成功，体验快乐。 “六环节”课堂教学模式的基本操作程序： 1、出示学习目标。 目的：使学生上课就开始明确学习目的，使学生学习有方向。同时，激发了学生的学习动机。 2、出示自学提纲。 目的：①.明确自学内容，具体到几页几行，明确内容和范围； ②.明确自学方法告知学生怎么自学，引导学生把主要精力放在新知向旧知转换的环节上。各学科可以有不同的方法，要具体情况具体分析，什么方法好，符合学生实际，符合学科实际，就采用什么方法。这种自学方法的指导会极大地潜移默化提高学生的自学能力;③.明确自学要求，也就是要达到的具体目标。 3、学生自学，小组交流 目的①围绕目标和自学提纲设计自学，时间适中;②学生自学时，依提纲把会的打对号，有疑问的打问号;③学生自学后带着问题，进行小组交流，体现“兵教兵”，达到人人参与。 对教师的要求：①引导学生抓住重点自学，提供有效的自学方法;②自学提纲要层次分明，让学生看了之后明确要学什么，怎么学;③学
生自学时，教师及时表扬自学速度快，效果好的学生，重点巡视学困生。 4、展示点评，师生互动 目的①根据自学提纲中问题，合理分到组主讲，师生可补充，可点评; ②学生能说的教师不说，学生能讲的教师不讲，体现“兵教兵”“兵练兵”; ③师生平等，课堂气氛民主、和谐，学生主动参与，课堂充满活力，学生学习激情高。 对教师要求：①明确教的内容。教的内容应该是学生自学点评后还不能掌握的地方;②明确教的方式，教的方式是会的学生教不会的学生，即“兵教兵”. 对学生没有点评到位的问题必须补充点评，对学生通过自学小组交流已经掌握的，坚决不教. 5、回顾目标 目的：师生共同回顾本节学习目标，对本节课重点、难点，易错易混，学生对照目标自查，掌握情况对没有掌握的地方，再次在小组内由学习伙伴帮助。 对师生要求：学困生存在问题，小组合作解决，组长督查，人人达标，体现“兵教兵”“兵练兵”. 6、当堂检测 目的:教师根据本节课学习目标，教学内容设计当堂检测，检查学生学习效果，通过巡视，了解哪些同学真正做到了“堂堂清”。 对教师要求：①课堂检测时间不少于8分钟；②检测题目要紧扣学习
蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。