广东药学院
硕士学位论文
陈皮总黄酮、橙皮苷和挥发油的动态分析研究
姓名：林林
申请学位级别：硕士
专业：药物化学
指导教师：黄庆华
20080501
摘要
陈皮是芸香科植物橘Citri Reticulata ‘Blanco’及其栽培变种的干燥成熟果皮。具有理气健脾、燥湿化痰的功效。药材分为“陈皮”（为福橘、大红袍和温洲密柑等的干燥成熟果皮，产于福建、四川、浙江等）和“广陈皮”（为茶枝柑和行柑的干燥成熟果皮，产于广东新会）。其中以“广陈皮”的质量为优，“广陈皮”中又以新会陈皮为道地药材。陈皮主要含有挥发油和黄酮两大类成分。挥发油主要成分为D-柠檬烯。陈皮还含有黄酮类化合物，其中橙皮苷含量最高。陈皮自古就有“今天下多以广中者来胜”及“陈久者良”之说。贮存时间越久的陈皮，药用与调味效果不同，市场售价也高，所以出现了以外地陈皮冒充新会陈皮、以茶水染色的新皮充当陈皮的假冒伪劣产品。陈皮“道地性”和“陈久者良”表现在什么地方？其物质基础有何依据？正因为如此，迫切需要对新会陈皮和非新会陈皮，不同贮存年份和不同采收期新会陈皮的有效物质成分进行系统的研究，为进一步开发利用陈皮资源提供依据。
本文研究了陈皮有效物质成分总黄酮的提取和测定方法,并对陈皮挥发油的主要成分作了初步对比分析，主要研究有：
（1）陈皮中总黄酮含量的分析方法考察采用紫外分光光度法,在283波长下,以橙皮苷为标准品，直接测定提取液中总黄酮的含量。在4.548~22.74μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。回归方程为：A=0.033C+0.013，相关系数r=0.9993。加样回收率在98.77~101.6范围内。本法用于陈皮中总黄酮含量的测定,方法准确、可靠、结果令人满意。
(2) 优化新会陈皮总黄酮的提取条件在单因素试验的基础上，采用正交试验方法，以总黄酮含量为考察指标，确定陈皮总黄酮最优提取条件。重点考察提取时间、水浴温度、液固比三个因素。综合上面的因素考虑，最佳提取条件为：60％乙醇，70℃，液固比1：25，提取3小时，提取一次。
(3) 不同产地、不同贮存年份和采收期陈皮总黄酮的含量测定不同贮存年份新会陈皮的贮存期越长，总黄酮含量越高；不同采收期新会陈皮总黄酮含量相差并不大，青黄皮为高，黄皮次之，红皮最低。从总黄酮含量来看，新会陈皮与外地陈皮比较并不优越，道地药材物质基础有待进一步研究。
(4)不同贮存年份和采收期新会陈皮橙皮苷的含量测定不同贮存年份新会陈皮的贮存期越长，橙皮苷含量越高，这和不同贮存年份新会陈皮总黄酮的变化规律是一致的;不同采收期新会陈皮橙皮苷含量规律：青黄皮为高，黄皮次之，红皮最低。
(5)新会陈皮挥发油的提取及气-质联用分析选取挥发油的其中12个主要的成分，对不同贮存年限和采收期陈皮样品进行动态分析。结果显示：不同贮存年份的陈皮样品，挥发油沸点较低的成分变化缓慢，主要成分变化明显，新会陈皮特有成分2-甲氨基-苯甲酸甲酯的含量变化不大，沸点较高的成分变化也很缓慢。不同采收期和不同贮存年份的陈皮挥发油变化规律类似，而青黄皮和红皮挥发油的成分差异较大，黄皮和红皮差异较小。
关键词：陈皮,；总黄酮；橙皮苷；挥发油；动态分析
Study on dynamic state Analysis of The tatal flavone、The
hesperidin and The volatile oil for Pericarpium Citri
Reticulatae
Lin Lin（Pharmaceutical chemistry）
Supervisor: prof. Huang Qing-hua
Abstract
Pericarpium Citri Reticulatae, which is the desiccational and maturational fruit coats of Citri Reticulata Blanco togeter with its cultivated variety, has the effect managing gas tonifying spleen and the eliminating dampness reducing phlegm. The materia medica is divided into Pericarpium Citri Reticulatae ( the fruit coats of Citri Reticulatae ‘Tangerina’, Citri Reticulatae ‘Dahongpao’ and Citri Reticulatae ‘Unshiu’ which from Fujian, Chongqing and Zhejiang) and Guang Pericarpium Citri Reticulatae(the fruit coat of Citri Reticulata ‘Chachi’ which from Xinhui and sihui in Guangdong).The mass expanding Guang pericarpium citri reticulatae among them is excellent ,which takes Xinhui pericarpium citri reticulatae as genuine medicinal materials.Pericarpium Citri Reticulatae main contain two species chemical composition(total flavone and volatile oil).D-limonene is the essential component of the volatile oil and the hesperidin is the essential component of the total flavone .Pericarpium citri reticulatae has the statements of "Guang goods"and "the longer the better",because if the reserve time increasingly long, the medical effect of Pericarpium citri reticulatae is different, market price is also high, at the same times, some others had appeared to pretend to be Xinhui Pericarpium citri reticulatae , through dyeing skin with tea. What is show the "genuine" and "the older the better".Which is the material foundation.therefore,it's Urgent need to study on effective constituent for pericarpium citri reticulatae from xinhui and different place, different years and different collection period. to supply evidence to utilize pericarpium citri reticulatae deeply.
The extraction and analysis methods of total flavones in pericarpium citri reticulatae, were discussed in this thesis.The volatile oil was extracted from pericarpium citri reticulatae,and analysed by GC-MS. The main contents and conclusions were prvided as follows.
(1) Assaying of total flavones .The contents of total flavones in pericarpium citri reticulatae,were determined by UV spectrophotometry. The optimum conditions for this
experiment were found:Wavelength:283nm; The data of this content and absorbance formed a standard curve,namely A=0.033C+0.013,regress coefficient r=0.9993;The recovery of samples was 98.77%~101.6%.The operation was easy,accurate and reliable,and it can be used to determine total flavones in pericarpium citri reticulatae.
(2) In order to optimize the extraction condition, base on simplex agent, design was applied for orthogonal experiment method. Emphasis tested the density of solvent; the ratio of material and the extract time were.The optimum condition parameter is 60% alcohol as solvent; the ratio of material andsolvent 1:25; extracting times with 2h for one time.
(3) To determin the total flavone contents for pericarpium citri reticulatae from different place, different years and different harvest times in XinHui . Result is the contents of the total flavone in XinHui dried tangerine peel is low than the other place. genuine medicinal materials foundation will is research deeply; times is longer the content of the total Flavonen is higher; The content of green tangerine orange peel is highest, with reddish lower, and bright red lowest.
(4) To determin the hesperidin contents for different different years and different harvest times in XinHui dried tangerine peel. Result is times is longer the content of the hesperidin is higher; The content of green tangerine orange peel is highest, with reddish lower, and bright red lowest.
(5) The extraction and analysis of volatile oil from pericarpium citri reticulatae.choice 12 essential component and analysis for different years and different harvest times in XinHui dried tangerine peel. Result is low boiling point component slow-moving; The essential component changed obviously; Citri Reticulata ‘Chachi’ particular component don’t changed mainly; High boiling point component is also slow-moving. And the content of naphtha of different harvest times is the same with the storage.
KeyWords: pericarpium citri reticulatae; total flavone; hesperidin; volatile oil; dynamic state analysis
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前言
1、陈皮概述
1.1 陈皮的别名、性状和分类
陈皮是芸香科植物橘Citri Reticulata‘Blanco’及其栽培变种的干燥成熟果皮。栽培变种主要有茶枝柑Citrus reticulata‘Chachi’（广陈皮）、大红袍Citrus
reticulata‘Dahongpao’ 、温州蜜柑Citrus reticulata‘Unshiu’、福橘 Citrus
reticulata‘Tangerina’。别名橘皮、贵老、红皮、黄橘皮、广橘皮、新会皮、柑皮、广陈皮。中药陈皮分陈皮和广陈皮。陈皮来源于福橘，朱橘，大红袍、温州密柑等多种柑桔值物，广陈皮主要来源新会柑（茶枝柑）。橘为常绿小乔木或灌木，栽培于丘陵、低山地带、江河湖泊沿岸或平原。分布于长江以南各地区；茶枝柑主要分布于新会银洲湖两岸冲积平原为核心的潭江两岸冲积平原带和南部滨海沉积平原区为适宜产区，要求地下水位深度0.7米以上、能利用潭江水灌溉的水田或坡地，现在广东其他地区和广西一些地方也有种植。10至12月果实成熟时，摘下果实，剥取果皮，阴干或通风干燥。由于地区的气候和土壤条件不同，在外观性状上有明显的区别。
陈皮果皮常剥成数瓣，基部相连，有的呈不规则的片状，厚1～4mm 。外表面橙红色或红棕色，有细皱纹及凹下的点状油室；内表面浅黄白色，粗糙，附黄白色或黄棕色筋络状维管束。质稍硬而脆。气香，味辛、苦。
广陈皮果皮多剖成3至4瓣，基部相连，形状整齐有序，厚度约1毫米。点状油室较大，对光照视透明清晰，质较柔软。均以片大、色鲜、油润、质软、香气浓、味甜苦辛者为佳。
图1 陈皮图2 广陈皮
按采收加工时间和质量可分为：柑青皮（青黄皮）、微红皮（黄皮）和大红皮（红皮）。
柑青皮（青黄皮）
指果皮未着色，生理未成熟时（通常指农历立秋至寒露）采收果实所加工的皮。外表色泽青褐色至青黑色，有无数微凹入的油室点，不显皱缩。内表紧密光洁，雪白、淡黄白至棕红色。质硬、皮薄，味辛苦、气芳香。
微红皮(黄皮)
指果皮开始着色，但未完全着色，生理仍未充分成熟时（通常指农历寒露至小雪）采收果实所加工的皮，外表色泽褐黄色至棕黄褐，有无数大而凹入的油室，皱缩较明显。内表雪白、淡黄白至棕红色，海绵浮松状不明显。质较硬，皮较厚，味辛带苦略甜。
大红皮（红皮）
指果皮已基本着色，生理已基本成熟时（通常指农历小雪至小寒）采收果实所加工的皮，外表色泽棕红色至红黑色，有无数大而凹入的油室，皱缩十分明显。内表雪白、淡黄白至棕红色，海绵浮松状明显。质软、皮厚，味辛带甜香。
图3 青黄皮(10月）图4 黄皮（11月）图5 红皮（12月）
1.2 陈皮的文献记载及考证
《神农本草经》[1]载：“橘柚，一名橘皮。生川谷。味辛温。主胸中瘕热逆气，利水谷。久服，去臭。”
《新修本草》[2]、《证类本草》[3]载：“橘柚，味辛，温，无毒。” “久服去臭，下气通神，轻身长年。生南山川谷及江南，十月采。” “陶隐居云：此是说其皮功尔，以东橘为好，西江亦有而不如。北人亦用之，以陈者为良。”
《本草纲目》[4]载：“橘皮，苦能泄能燥，辛能散，温能和。其治百病，总是取其
理气燥湿之功。同补药则补，同开药则开，同降药则降。” “今天下多以广中来者为胜，江西者次之，然亦多以柑皮杂之。”
各家杂谈。宋代.韩彦直《橘录》[5]曰“若欲取皮，用充药饵，不若广中者，皮薄辛香，愈陈则愈善也。” 南宋陶弘景云：“橘皮疗气大胜。以东橘为好，西江亦有而不如。北人亦用之，并以陈者为良。” 元代王好古曰：“橘皮以色红日久者为佳，故曰红皮、陈皮。” 明代.刘文泰《本草品汇精要》[6]载：“道地：广东。” 明.倪朱《本草汇言》[7]:"沈则施曰：它药贵新，惟橘皮贵陈。” 近代著名医家张寿颐曰：“新会皮，橘皮也，以陈年者辛辣之气稍和为佳，故曰陈皮。市肆中有多种，以广东化州产者为最佳，其通用者则新会所产，故通称曰新会皮，味和而辛不甚烈，其福州及浙衢之产，味苦而气亦浊，且辛辣更烈，非佳品矣。” 中华民国.陈仁山《药物出产辨》[8]云：“产广东新会为最”。
至现代药学辞典、药材学中已经记载陈皮为芸香科植物橘及其栽培变种的成熟果皮，而进一步将其划分为陈皮和广陈皮，如《现代中药材鉴别手册》[9]中载：“陈皮：果皮常剥皮数瓣，基部相连或呈不规则片状，厚0.1~0.4cm，外表面橙红色或红棕色，具细皱纹及凹下的小油点。内表面浅黄色，粗糙，常附有黄白色或黄棕色筋络，质稍硬而脆。气香味辛、苦。广陈皮：3~4瓣相连，形状整齐，裂瓣多向外反卷，厚薄均匀，油点较大，对光照视透明清晰，质柔润。均以片大，香气浓者为佳。” 《中药材产销》[10]认为广陈皮气香浓郁，质量、功效均优于陈皮。广东及出口仍以广陈皮为主要品种。
陈皮收载于《中国药典》[11]（2005版，一部），为芸香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培变种的干燥成熟果皮。药材分为“陈皮”和“广陈皮”。
1.3 广陈皮的特点
新会陈皮与非新会陈皮质量特色明显，主要由于品种、水土、气候、工艺等特殊原因造成。新会陈皮具有明显的地域性，传统上是指以新会的银洲湖为核心的潭江两岸冲积平原生产区域。由新会陈皮协会提供的数据，今年新会柑年产量近2万吨，年加工陈皮量达1千吨以上。新会陈皮还很讲究种植技术，种植新会柑品种，应用圈枝或嫁接苗木、水田健园、利用老果树生产、多施基肥、水旱轮作等技术才能生产好的柑皮原料。还讲究采收时间，不同采收期加工出不同货式，因为不同货用途也不尽相同。最重要的还要讲究陈化条件，陈化条件对新会陈皮后品质形成至关重
要，在新会，一直以来都是采用自然晒制和自然界贮存法加工新会陈皮，所以新会质量对产区自然条件依赖非常高。还有加工方法，拣扁身薄皮的果；采用“对称二刀“正三刀”法开皮；稍失水软反皮；冬至前晒皮；自然条件大仓存放；新皮通风常晒，适时防烧、防霉、防虫和防潮，旧皮定装定仓，适时返晒。只有在这些条件都具备的条件下，才能算是道地的新会陈皮。
1.4 陈皮现代研究
1.4.1 陈皮的化学物质基础
陈皮主要含有挥发油和黄酮两大类成分。
陈皮挥含挥发油2～4％，油中主要成分为右旋柠檬烯（d-Limonene）。
陈皮还含有黄酮类化合物，如橙皮苷(Hesperidin)、橘皮素(Tangeretin)、新橙皮苷(Neohesperidin)、川陈皮素(Neobiletin)、二氢川陈皮素(Citromitin)等。此外，尚含肌醇，维生素Ｂ1，胡萝卜素，对羟基福林等。
现代分析利用气-质联用等技术，已可以清楚地将挥发油成分分离、鉴定和定量。清华大学孙素琴教授、广东药学院黄庆华教授等[12]利用现代红外光谱傅立叶转换技术全面分析陈皮，发现随着陈皮贮放时间越久，挥发性成分减少，而酯类成分增加；并区分鉴定陈皮与广陈皮，发现陈皮挥发性成分较高，而广陈皮酯类成分较高，为陈皮“越陈越好”；广陈皮“味和而辛不甚烈”，陈皮“味苦而气亦浊，且辛辣更烈”拿出依据。
谢培山教授等人[13]采用GC/MS和HPLC/DAD联用技术,对不同年份陈皮和“老化”模拟实验新会陈皮样品的挥发油和黄酮类成分进行分析.结果发现陈皮挥发油低沸点成分随陈放时间延长均有下降,而较高沸点成分下降缓慢;黄酮类物质无明显变化.并认为高含量的柠檬烯使新鲜果皮气味不佳, 随着陈放时间延长则柠檬烯逐渐减少,气味随之香醇.为陈皮“陈久者良”的说法找到了一定根据.
1.4.2 陈皮的药理作用
在历史上就早已有对陈皮的药用记载，清代吴仪络、黄宫秀言：“陈则烈气消，无燥散之患，故曰陈皮”；明代李时珍谓“其治百病，总是取其理气燥湿之功，同补药则补，同泻药则泻，同升药则升，同降药则降。脾乃元气之母，肺乃摄气之龠，故橘皮为二经气分之药，但随所配而补泻升降也。”由于陈皮丰富的化学组成，现代研究中大量的药理实验亦证明，其在多方面都有着显著疗效，表现如下：
（一）对消化系统的作用
抗胃溃疡作用，对大鼠结扎幽门形成胃溃疡模型,于实验前或实验中皮下注射甲基橙皮甙能明显抑制溃疡的发生,并能抗病理性胃液分泌增多,如合并维生素C 及维生素K4 ,可使作用加强[14]；对消化液分泌作用，陈皮挥发油能促进大鼠正常胃液的分泌,有助于消化，陈皮水煎液体外实验证明,能使人唾液淀粉酶活性增高[15]；利胆作用，给麻醉大鼠皮下注射甲基橙皮甙,可增加胆汁及胆汁内固体物的排泄量。合并用维生素C 及维生素K4可增强利胆效果。另外从鲜橘皮中提取的桔皮油具有较强的溶解胆固醇结石的作用[16]。
（二）对心血管系统的作用
陈皮能增强心肌收缩力、增加心输出量、扩张冠脉;能升高血压、提高机体应激能力;显著降低高脂家兔主动脉弓粥样硬化斑块面积,显著减轻细胞的脂化程度;抑制胆甾醇过多,显著降低胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯和脂质总量,增加高密度脂蛋白水平[17]。有明显的降脂、预防动脉硬化及抗血液高凝状态的作用,药效优于安妥明。降脂机理是: ①抑制胆汁酸的重吸收,阻断胆汁酸的肝肠循环,促进体内胆固醇大量转化为胆汁酸; ②直接干扰脂肪和胆固醇的吸收。③抑制胰脂酶活性,增加甘油三酯从粪便中排出而降低血浆中甘油三酯水平。同时还具有抗血栓作用，Robbins 等采用引起血栓的饲料饲喂大鼠,发现用橘皮苷处理能使大鼠的存活期延长16～71 天,说明橘皮苷具有极强的抗血栓能力。人体血小板实验表明,0108mg/ ml 的桔皮苷即能有效抑制肾上腺素和ADP 诱导的血小板凝聚,还能阻止白细胞和红细胞聚合。橘皮苷还能抑制透明质酸酶活性,从而降低毛细血管透性和毛细血管壁的脆性，降低毛细血管透性，可用于多种渗出性疾病如:水肿、出血、高血压、糖尿病、慢性静脉机能不全、痔疮、坏血病、各种溃疡和血管挫伤等。研究还证实:给患有胸膜炎、肺结核、革雷夫斯氏病(Grave’sdisease)和脚气病的病人每日补充30mg的桔皮苷能降低毛细血管透性,缓解症状。
（三）祛痰、平喘作用
陈皮所含挥发油有刺激性祛痰作用,其有效成分为柠檬烯。鲜橘皮煎剂用于家兔气管灌流,可使支气管扩张,灌流速度加快。陈皮的醇提物可对抗组织胺所致豚鼠离体气管痉挛性收缩[18]。川陈皮素在豚鼠离体气管实验和麻醉猫静注时都能扩张支气管,但强度比氨茶碱弱。如用肌注或胃肠道给药,此作用则不明显,川陈皮素可显著对抗用
蛋清致敏的豚鼠离体支气管过敏性收缩,甲基橙皮甙对离体气管的解痉作用不明显。唐发娣等研究发现葛缕酮对豚鼠药物性哮喘有保护作用,直接松弛离体气管,并抗氧甲酰胆碱,抑制豚鼠肺组织SRS-A的释放,拮抗SRS-A收缩回肠,抑制致敏离体气管的Schultz-Dale反应。
（四）其它作用
橙皮甙与甲基橙皮甙均有维生素P 样作用,可降低毛细血管通透性,防止微血管出血。可以拮抗组胺、溶血卵磷脂或蝮蛇毒素引起的小鼠血管通透性增加及制止蝮蛇毒素所致小鼠皮下出血。橙皮甙皮下注射对小鼠巴豆油性肉芽囊肿的炎症反应有抑制作用,使囊内渗出液明显减少。磷酰橙皮甙尚有抑制透明质酸酶的作用。此外,橙皮甙给家兔口服,能减轻氯乙烷造成的耳部冻伤。大量的研究亦表明:陈皮提取物有明显的清除氧自由基、羟自由基和抗脂质过氧化作用,对自由基引起的细胞膜氧化损伤有保护作用[19~20]。并能抗衰老,增强生命活力。苏丹等人用人参皂苷为阳性对照,研究发现:陈皮不但能延长果蝇的平均寿命,还能延长果蝇的最高寿命,且对雌蝇的延寿作用优于人参皂苷。单味陈皮、单味人参及人参配伍陈皮均能显著延长小鼠游泳时间,并使小鼠运动后50分钟血乳酸明显降低,表现出抗疲劳作用[21]。但陈皮组的作用更为明显,其次为单味人参组。甚至，陈皮提取物(多氧甲基黄酮类) 对人肺癌细胞、直肠癌细胞、肾癌细胞有显著性的抑制作用[22]。这一特性已引起美国、日本等国家的普遍关注,认为是一种有开发前景的抗肿瘤中药提取物。陈皮不仅无致突变性,还能拮抗呋喃氟脲嘧啶、噻替哌、环磷酰胺等多种化疗药物的致突变毒性。并能显著拮抗环磷酰胺所致的雄性小鼠生殖细胞损伤(P<0.101),以药前使用为佳,故可用于癌症的预防。另外，桔皮苷能防止紫外线引起皮肤细胞脂质的过氧化而导致的红斑和皮肤癌[23]。这意味着它可作为防晒化妆品的理想原料。
2、黄酮类化合物简介
2.1 概述
黄酮类化合物广泛存在于自然界,是一类重要的天然有机化合物，其不同的颜色为天然色素家族添加了更多的色彩。这类含有氧杂环的化合物多存在于高等植物及羊齿类植物中。黄酮类化合物的存在形式既有与糖结合成盐的,也有游离体。黄酮类化合物如此广泛分布于植物界中,而且生理活性多种多样,引起了国内外的广泛重视,研究进展很快。仅截至到1974年为止,国内外已发表的黄酮类化合物共1674个(主要是天然黄酮类,也有少部分为合成品,其中苷元902个,苷722个,并以黄酮醇类最为常见,约占总数的1/3,其次为黄酮类,占总数的1/4以上,其余则较少见。至于双黄酮类多局限分布于裸子植物,尤其松柏纲、银杏纲和凤尾纲等植物中。截止到1994年统计,黄酮类化合物总数己超过4000个。
2.2 黄酮类化合物的基本骨架
黄酮类化合物原主要指基本母核为一苯基色原酮类化合物,现在则是泛指
两个具有酚羟基的苯环（A与B环）通过中央三碳原子相互连结而成的一系列化
合物[24]。
O O O O
O
色原酮 2一苯基色原酮 C
6-C
3
-C
6
2.3 黄酮类化合物的分类
天然黄酮类化合物母核上常含有羟基、甲氧基、烃氧基、异戊烯氧基等取代基。由于这些助色团的存在,使该类化合物多显黄色。又由于分子中一吡酮环上的氧原子能与强酸成盐而表现为弱碱性,因此曾称为黄碱素类化合物。根据三碳键结构的氧化程度和环的连接位置等特点,黄酮类化合物可分为下列几类：黄酮和黄酮醇；黄烷酮（又称二氢黄酮）和黄烷酮醇（又称二氢黄酮醇）；异黄酮；异黄烷酮（又称
二氢异黄酮）；查耳酮；二氢查耳酮；橙酮；黄烷和黄烷醇；黄烷-3,4-二醇（又称白花色苷元）；花色素（又称2-苯基苯并吡喃）。根据环与环中间三碳链的氧化程度位是否有,位是否有羰基,与是否为双键等,环连接位置或位以及环是否构成环状结构等特点,可将黄酮类化合物分很多小类[25]。
2.4 黄酮类化合物理化性质
2.4.1物理性质
性状：黄酮类化合物多为结晶固体,少数黄酮如黄酮昔类为无定形粉末。
颜色：一般说来,黄酮、黄酮醇及其苷类多呈灰黄色至黄色,查耳酮为黄至橙黄色,而二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类,因在分子结构中不存在交叉共轭体系,故不呈黄色,几乎为无色。如果在黄酮、黄酮醇分子中,尤其在7-位或4，位引入-OH及-OCH
3
等供电子基团后,产生一共轭,促进电子重排,使共轭系统延长,化合物颜色加深。但-OH和
-OCH
3引入分子结构中其他位置,则对颜色影响较小。如果C
2
和C
3
间的双键被氢化,则
交叉共轭体系和加合关系中断,故二氢黄酮和二氢黄酮醇几乎无色。异黄酮共轭键很少,仅显微黄色。花色素所显示的颜色,随不同PH而改变,一般PH<7显红色,PH=8.5显紫色,PH>8.5显蓝色,PH不同可能促进结构产生可逆变化。
2.4.2 酸碱性
黄酮类化合物因分子中具有酚羟基,故显酸性,可溶于碱性水溶液、吡啶中。其酸性强弱与酚羟基数目的多少和位置有关。例如黄酮的酚羟基酸性由强到弱顺序是：7，4，-OH>7-或4，-OH>一般酚羟基>5-OH, 7，4，-位有酚羟基者,在共扼效应的影响下,使酸性增强而溶于碳酸氢钠水溶液。7-或4，-位上有酚羟基者,只溶于碳酸钠水溶液,不溶于碳酸氢钠水溶液。具有一般酚羟基者只溶于氢氧化钠水溶液。仅有5-位酚羟基者,因可与C
4
位上的羰基形成分子内氢键,故酸性最弱,因此,可用梯度法来分离黄酮类化合物。
2.4.3 溶解性
黄酮类化合物的溶解度因结构不同而有很大差异。一般黄酮苷元难溶或不溶于水,易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。其中黄酮、黄酮醇、查耳酮等为平面型分子,因堆砌紧密,分子间引力较大,故难溶于水。而二氢黄酮及二氢黄酮醇等,因系非平面型分子,故排列不紧密,分子间引力降低,有利于水分子进入,因而在水中溶解度稍大。
2.4.4 还原反应
盐酸一镁粉反应：一般黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇类成分在乙醇或甲醇溶液中可被还原成红色至紫红色,个别的显蓝色或绿色(如7、3，、4，三-OH二氢黄酮）,而异黄酮不显色。此反应可用于鉴识黄酮类化合物,也可检识某提取物或提取液中是否含有上述黄酮类成分。具体做法药材粉末少量置试管中,加乙醇数毫升,温热浸出,过滤,滤液加镁粉与数滴浓盐酸,溶液变橙或红色。这是由于黄酮类被还原生成花色苷元与其二聚物而致。分子中羟基或甲氧基数目多时,色较深,位上无羟基的黄酮反应不明显。
四氢硼钠钾反应：此反应是二氢黄酮的专属性反应,生成红一紫红色,而其它类不显色,故可用于鉴别。也可以说如一化合物与四氢硼钠试剂反应生成红一紫红色,则说明该化合物极可能是二氢黄酮类化合物。
钠汞齐还原反应：向黄酮类化合物的乙醇溶液中加入钠汞齐,放置数分钟至数小时或加热,过滤,滤液用盐酸酸化,则黄酮、二氢黄酮、异黄酮、二氢异黄酮类显红色,黄酮醇类显黄色至淡红色,二氢黄酮醇类显棕黄色。
2.5 黄酮类化合物的生物活性与应用
2.5.1 黄酮类化合物的生物活性
黄酮类化合物显著的性质之一是具有清除自由基的作用,常用来治疗和预防感染、炎症、烧伤和辐射引起的伤害[26]。黄酮类化合物还参与生物体内的氧化还原过程,是电子转移反应的有效催化剂。这些表明,黄酮类化合物本身的标准电位接近于生物化学氧化还原电对,且它得电子的能力比较低,黄酮类化合物氧化性不高,更容易失去电子。鉴于此,黄酮最重要的作用之一就是用来保护生物还原剂如抗坏血酸[27-28]。黄酮类化合物具有抑制酶的作用,包括水解酶、氧化还原酶、合成酶、聚合酶、磷酸脂酶、蛋白磷酸激酶、加氧酶和氨基酸氧化酶等[29-32]。黄酮类化合物具有诱变潜能和激素行为[33-34],影响人的感官系统,如嗅觉、神经协调和止痛效果[35-36]。黄酮类化合物能和重金属离子络合,可以作为重金属离子的解毒剂[37],黄酮类化合物对高血压、水肿、结蒂组织的放松、过敏、气喘、癌症、心血管、胃肠溃疡、老年痴呆、受伤恢复、免于系统的刺激、预防治疗后天免疫缺陷综合症、避孕等方面都有作用[38-39]。
2.5.2 黄酮类化合物的应用
黄酮类化合物可作功能性食品添加剂如天然甜味剂、天然抗氧化剂、天然风味增
强剂和天然色素等。可作生物类功能食品,市售的生物类黄酮功能食品可谓琳琅满目,涉及到功能食品的许多方面,如防衰老、防癌、提高免疫力、降脂、降压食品等,产品外观覆盖到液体、固体和半流体等多种形式。生物类黄酮除应用于食品领域,还可广泛用于医药及农药领域,用以开发具有特效功能的药品和驱虫、杀虫剂等。生物类黄酮无毒,广泛存在于植物界中,人体不能合成,而且在
体内代谢很快。人体摄取生物类黄酮主要来自于饮料、茶、咖啡、可可、果酒尤其红葡萄酒和啤酒,甚至醋都是其重要来源,占总摄入量的25%一30%。关于其日摄取量,目前尚无定性结论,美国人均摄取量达1g/d,荷兰人均对槲皮素、山奈酚、高梁黄酮、叶黄酮、杨酶黄酮的总摄取量达23mg/d,但目前的摄取水平远未达到有益的摄取量。近年来虽然分离、提取了大量的新生物类黄酮,掀起了生物类黄酮的研究热潮,但对其吸、代谢机制、活性机理、具有生理功能的活性基团、稳定性等方面仍缺乏全面的认识,因此应加强此方面的工作,弄清其生理功能从而进行有效地分离和提取,为生物类黄酮在医药、食品工业中的应用提供理论依据,加速植物资源的有效开发利用,生产出具有预防和治疗多种疾病的药品和天然保健品。
2.6 黄酮类化合物的提取和测定
2.6.1 黄酮类化合物的提取方法
天然药用植物中黄酮类化合物不但种类多,彼此间性质不同,而在植物体内存在的部位不同,其结合状态也不同,如在花果叶以苷为主要存在形式,在木质部以苷元为主要存在形式。所以黄酮类化合物的提取,主要是根据被提物的理化性质和伴生的杂质来选择适合的提取溶剂,苷类和极性较大的苷元,一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水或某些极性较大的混合物进行提取。大多数苷元宜用极性较小的溶剂,如乙醚、氯仿等有机溶剂来提取,多甲氧基黄酮类苷元,甚至可用苯来提取。
（一）有机溶剂法
乙醇和甲醇是最常用的黄酮类化合物提取溶剂,高浓度的醇（如90%一95%）适宜于提取苷元,60%左右浓度的乙醇或甲醇水溶液适宜于提取苷类物质。提取的次数一般是一次,可用加热回流法或冷浸法。在提取的过程中乙醇浓度对总黄酮的提取有较大影响,一般认为乙醇浓度增加有利于总黄酮的提取。但并不绝对,还跟黄酮类化合物的结构有关,高浓度的乙醇适用于黄酮苷元类化合物,低浓度的乙醇适用于黄酮苷类化合物[40]。
（二）超声提取法
用超声波法提取黄酮类物质,是目前比较新的方法。它的原理是超声的空化作用对细胞膜的破坏有助于黄酮类化合物的释放与溶出,超声波使提取液不断震荡,有助于溶质扩散,同时超声波的热效应使水温基本在57℃,对原料有水溶作用。因此,超声波法大大缩短了提取时间,提高了有效成分的得率、原料的利用率。如在提取槐花中总黄酮时,用15倍于样重的乙醇,超声波提取,连续提取两次,总黄酮的浸出率可达99.8%以上,而用乙醇回流提取总黄酮的浸出率最高还不到95%,且回流提取得时间为超声处理时间的4~8倍[41]。
（三）微波提取法
微波技术在人们的生产生活中应用越来越广泛,此法[42-43]在黄酮类化合物的提取上也取得了良好效果。它在提取过程中具有反应高效性和强选择性等特点,而且操作简单,副产物少,得率高及产物易提纯等优点。浸出过程中药材细粉不凝聚不糊化,克服了热水法易凝聚易糊化的不足。例如,在刺五加中黄酮类化合物的微波辅助提取研究中,溶剂为50%乙醇,提取压力为700KPa,提取时间为10min,料液比为1:20时,得率与索氏提取法相比较,得率可提高40%[44]。刘峙嵘等[45]在提取银杏叶黄酮类化合物时比较了微波法和非微波法提取桑叶总黄酮,发现微波法提取效率比非微波法高2.2倍。
（四）酶解法
对于一些黄酮类物质被细胞壁包围不易提取的原料可以采用酶法提取。例如山楂中,由于黄酮类物质部分被以纤维素为主的细胞壁所包围,并且这些细胞壁间尚有果胶粘结,因此采用酶法要比一般方法酶提取的得率要高。将预先干燥并粉碎的山楂用蒸馏水浸泡,恒温至45℃后,加入以果胶酶和纤维素酶为主的复合酶液,用1ml/LNaOH调节PH4.5~5,在45℃恒温酶解1.5h~2.5h,然后将酶解溶液回流、提纯。采用这种方法,可使得率比目前常用的方法提高2%~3%。此提取原理是复合酶充分破坏了以纤维素为主的细胞壁结构及其细胞间相连的果胶物质,将山楂中的果胶完全分解成小分子物质,使提取物质阻力减小, 使果肉中的黄酮类物质充分地释放出来。张卫红等[46]采用复合酶解法在低温下提取茶叶中的茶多酚,得率高达98%以上,茶多酚中的活性成分儿茶素相对含量较传统沸水提取法
高出9%~10%。
（五）超临界流体萃取法
超临界流体提取法是近年来发展起来的一种新型技术,它利用超临界流体作为萃取剂从液体中提取某些高沸点成分。超临界流体萃取法具有提取效率高、无溶剂残留毒性、天然植物中活性成分和不稳定成分不易被分解破坏而保持其天然特性等优点,同时还可通过控制临界温度和压力来达到选择性提取和分离纯化的目的。但是超临界流体需要在较高的压力下操作,设备费用比较昂贵,操作较困难,难以应用于较大规模的生产[47-48]。
总之,黄酮类化合物提取的方法很多,每种方法都有各自的优缺点,要综合考虑提取物的性质、提取成本、工艺设备条件等来选择最合适的提取工艺,提高黄酮类物质的得率,增大原料的利用率。
2.6.2 黄酮类化合物的测定方法
黄酮类化合物的测定方法主要分为三大类：1.光谱分析方法;2.色谱分析方法；3.电化学分析方法。下面分别详细介绍。
2.6.2.1 光谱分析方法
这类方法由于没有对黄酮类化合物进行分离，故其测的多为总黄酮的含量。
（一）紫外分光光度法
紫外分光光度法被一些药典所采用,可大约估计总黄酮含量,不可能细致的定量测定单个黄酮类成分,但操作简单方便,是一种简易可行的测定方法,也可用于企业生产环节中初步的质量控制。巫军等[49]以槲皮素为对照品,在368nm波长处对银杏叶提取物中的主要成分黄酮类化合物的含量进行测定。陈芳群等[50]将射干、川射干、白射干样品提取液经聚酰胺柱层析后,用紫外分光光度法于266±2nm波长处测定吸光度,以射干苷为对照计算总黄酮含量。李星海等[51]用聚酰胺薄层-紫外分光光度法分别测定了秦岭地区三种金丝桃属植物药中金丝桃苷的含量。
(二) 络合分光光度法
这个方法最为采用，黄酮类化合物的络合分光光度法含量测定多采用硝酸铝显色法。其基本原理:黄酮类化合物与Al(NO3)3络合显色,以芦丁为标准溶液,在510nm波长处测定显色液的吸光度来确定黄酮类化合物的含量。邓桂春等[52]利用该法测定了银杏叶中黄酮的含量,许钢等[53]利用该法测定了竹叶提取物中黄酮的含量。但硝酸铝比色法专一性较差,测定受处理过程颜色变化的影响。为了提高硝酸铝比色法的准确度,人们对该法进行了多项改进。曾凡骏等[54]采用过滤法(即显色后过滤,测定滤液的吸
光度)对银杏黄酮紫外分光光度检测方法进行改进；尉芹等[55]发现硝酸铝比色法在测定杜仲总黄酮时的主要干扰因素是绿原酸,他们采用纸层析法将样品中的黄酮与绿原酸分离后,再用硝酸铝比色法测定黄酮含量,从而提高了测定的准确度。黄酮类化合物的测定也用三氯化铝显色法。李玉琪等[56]用此法测定赤土茯苓中总黄酮含量。方法是以芦丁为对照品,用三氯化铝醋酸钾显色,在420nm测定吸光度，测得总黄酮含量为0.4%。方法简便、快速,可用于赤土茯苓生药及其制剂总黄酮含量测定及质量控制。
（三）双波长、三波长分光光度法
单波长吸光光度法,用于植物试样测定时,由于受大量原花色素、叶绿素存在的底液干扰,方法的准确度较低,测定结果偏高,且重现性较差[57]。为此,研究者提出了双波长、三波长吸光光度法测定植物体内黄酮含量的新方法。程亚倩等[58]研究了双波长吸光光度法测定芹菜叶、银杏叶植物中黄酮含量的方法。他们以芦丁为标样,选择505和610nm为测定芹菜叶中黄酮含量；王淑杰等[59]研究采用甘草苷和甘草查尔酮为双对照品,利用甘草黄酮类化合物在220—280nm、340—390nm两段波长均出现吸收峰,采用双波长法双对照品测定甘草总黄酮的含量。张兰杰等[60]以芦丁为标样,采用
NaNO2Al(NO3)3NaOH显色体系进行显色,在测定波长510nm,参比波长584nm下测定黑玉米花粉中的总黄酮含量。
（四）荧光光度法
利用黄酮类化合物与某些金属离子的络合物在紫外线照射下可产生荧光,在一定条件下,荧光强度与该物质的浓度成正比的性质可建立黄酮类化合物的荧光光度法。廖声华等[61]利用在Tris-HCl缓冲液中,桑色素和Al3+形成二元荧光络合物,在激发波长和发射波长分别为365nm和499nm时测定该二元络合物的发射荧光强度。并且成功的运用于测定银杏叶中总黄酮的含量。张敏等[62,63]根据黄酮类化合物能与Al3+形成稳定的荧光络合物,以芦丁为标样,建立了一种测定银杏叶总黄酮的荧光分光光度法。朱炯波等[64]以芦丁为标样,采用荧光光度法测定显齿蛇葡萄中总黄酮的含量,系统研究了溶剂、pH值、表面活性剂及放置时间对荧光强度的影响。
2.6.2.2 色谱分析方法
这类方法由于先对黄酮类化合物进行分离后分析，故多为测定一种或多种黄酮类化合物含量。
（一）平面色谱法
平板色谱主要指纸色谱PC和薄层色谱TLC，PC由于选择性和重现性较差,目前已经应用不普遍,而且一般用于定性分析。王威[65]等用PC定性分析从山楂中提取黄酮类物质。TLC是50年代由经典色谱和PC发展而来,至今仍然广泛用于复杂体系如天然产物分析。朱新贵[66]等用HCl甲醇溶液提取的玫瑰茄细胞红色素中含有黄酮物质,用纸层析方法鉴别黄酮,用硅胶薄层层析测定玫瑰茄细胞色素中总黄酮含量。刘善新[67]等用薄层层析比较不同生长时间桑枝中黄酮成分,结果生长二年、一年的桑枝总黄酮的含量相近，而生长半年以内桑枝总黄酮含量较低。TLC法操作简便快速,不需要贵重的仪器设备。定量可用薄层扫描法。章崇仪等[68]用聚酰胺薄膜为固定相,乙醇-36%醋酸(1∶3)为展开剂层析后,双波长反射法锯齿扫描测定了黄芩中黄芩苷的含量。丁晨光等[69]在高效硅胶H板上,以异戊醇-正丁醇-乙酸-水(1.5∶0.5∶1∶1)为展开剂,单波长扫描测定了淫羊藿苷的含量。丁晨光等[70]还用柱分配层析法-薄层色谱法-紫外分光度法分离其中淫羊藿苷并测定了它的含量。尚晓虹等[71]选择激发波长330nm激发荧光,用薄层扫描法测定中草药葛根中的葛根素。何桂霞等[72]采用薄层扫描法测定藤茶中二氢杨梅素的含量。景仁志等[73]采用薄层扫描法测定苦荞叶中芦丁的含量。
（二）气相色谱法 GC
具有高选择性、高效能、高灵敏度、分析速度快等特点。但是多数黄酮类化合物的沸点高、对热不稳定、需将样品用衍生化试剂制成黄酮衍生物，才能用于气相色谱分离测定Pierce[74]和Collier[75]等人采用三甲基衍生用一个内标实现多种儿茶素的同时分析该法装置较贵操作繁琐应用不普遍。
（三）高效液相色谱 HPLC
HPLC法具有分离效果好、准确性好、分析速度快及仪器自动化程度高等特点，尤其适合于挥发性低热稳定性差、分子量大及离子型化合物的分析，已广泛用于天然产物的分析，成为中草药、食品化学成分或功能因子的纯度鉴定、含量测定和质量监控的常用手段。黄酮类HPLC分析通常用反相C18柱色谱柱。由于黄酮分子中存在酚羟基，流动相中加入少量的酸可改善峰形。胡芳弟等[76]以甲醇－水为流动相，梯度洗脱，在254nm检测波长下测定黄芪中黄芪甲苷和2个黄酮类化合物含量。刘斌等[77]建立了苦参汤有效部位中4种黄酮类成分的HPLC含量测定方法。此外郑莹[78]等人使用反相高效液相色谱法对三七叶中的黄酮类合物进行了含量测定。池静等[79]等人用反相高效液相色谱法测定了银杏叶中6种黄酮成分即槲皮素、异鼠李素、山萘