乙肝病毒和原核生物的基因组结构特点
1.病毒基因组所含核酸类型不同
2.不同病毒基因组大小相差较大
3.病毒基因组可以是连续的也可以是不连续的
4.病毒基因组的编码序列大
5.基因可以是连续的也可以是间断的
6.病毒基因组都是单倍体和单拷贝
7.基因重叠
8.病毒基因组功能单位或转录单位
9.病毒基因组含有不规则结构基因
（1）几个结构基因的编码区无间隔
（2）结构基因本身没有翻译起始序列
（3） mRNA没有5’端的帽结构
原核生物基因组结构特点：
1.细菌等原核生物的基因组是一条双链闭环的DNA分子
2.具有操纵子结构
3.原核基因组中只有1个复制起点
4.结构基因无重叠现象
5.基因序列是连续的，无内含子，因此转录后不需要剪切
6.编码区在基因组中所占的比例远远大于真核基因组，但又远远小于病毒基因
组。非编码区主要是一些调控序列
7.基因组中重复序列很少
8.具有编码同工酶的基因
9.细菌基因组中存在着可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子
10.在DNA分子中具有多种功能的识别区域，如复制起始区、复制终止区、转录
启动区和终止区等。这些区域往往具有特殊的序列，并且含有反向重复序列
真核生物基因组结构特点：
1）真核基因组远远大于原核生物的基因组。
2）真核基因具有许多复制起点，每个复制子大小不一。每一种真核生物都有一定的染色体数目，除了配子为单倍体外，体细胞一般为双倍体，即含两份同源的基因组。
3）真核基因都出一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物的单顺反子，即一分子mRNA只能翻译成一种蛋白质。
4）真核生物基因组中含有大量重复顺序。
5）真核生物基因组内非编码的顺序（NCS）占90%以上。编码序列占5%。6）真核基因产断列基因，即编码序列被非编码序列分隔开来，基因与基因内非编码序列为间隔DNA，基因内非编码序列为内含子，被内含子隔开的编码序列则为外显子。
7）真核生物基因组功能相关的基因构成各种基因家族，它们可串联在一起，亦可相距很远，但即使串联在一起成族的基因也是分别转录的。
8）真核生物基因组中也存在一些可移动的遗传因素，这些DNA顺序并无明显
生物学功能，似科为自己的目的而级织，故有自私DNA之称，其移动多被RNA介导，也有被DNA介导的。
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细菌和病毒一样同属原核生物，因而细菌基因组的结构特点在许多方面与病毒的基因组特点相似，而在另一些方面又有其独特的结构和功能。本节首先介绍细菌染色体基因组的一般结构特点，然后再具体介绍大肠杆菌染色体基因组的结构和功能。 ?细菌染色体基因组结构的一般特点 ?大肠杆菌染色体基因组的结构和功能 细菌染色体基因组结构的一般特点 （1）细菌的染色体基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成细菌的染 色体相对聚集在一起，形成一个较为致密的区域，称为类核（nucleoid）。 类核无核膜与胞浆分开，类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成，外围是双 链闭环的DNA超螺旋。染色体DNA通常与细胞膜相连，连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异。 在DNA链上与DNA复制、转录有关的信号区域与细胞膜优先结合，如大肠杆菌染色体DNA的复制起点（OriC）、复制终点（TerC）等。细胞膜在这里的作用可能是对染色体起固定作用，另外，在细胞分裂时将复制后的染色体均匀地分配到两个子代细菌中去。有关类核结构的详细情况目前尚不清楚。 （2）具有操纵子结构（有关操纵子结构详见基因表达的调控一章）其中的结构基因为多顺反子，即数个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节。数个操纵子还可以由一个共同的调节基因 （regulatorygene）即调节子（regulon）所调控。 （3）在大多数情况下，结构基因在细菌染色体基因组中都是单拷贝但是编码rRNA的基因rrn往往是多拷贝的,这样可能有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。 （4）和病毒的基因组相似，不编码的DNA部份所占比例比真核细胞基因组少得多。 （5）具有编码同工酶的同基因（isogene）例如，在大肠杆菌基因组中有两个编码分支酸（chorismicacid）变位酶的基因，两个编码乙酰乳酸（acetolactate）合成酶的基因。 （6）和病毒基因组不同的是，在细菌基因组中编码顺序一般不会重叠，即不会 出现基因重叠现象。 （7）在DNA分子中具有各种功能的识别区域如复制起始区OriC，复制终止区 TerC,转录启动区和终止区等。这些区域往往具有特殊的顺序，并且含有反向重复顺 序。 （8）在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA 聚合酶从DNA链上脱落。例如大肠杆菌色氨酸操纵子后尾含有40bp的GC丰富区，其后紧跟AT丰富区，这就是转录终止子的结构。终止子有强、弱之分，强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT 结构，这样的终止子无需终止蛋白参与即可以使转录终止。而弱终止子尽管也有反向重复序列，但无polyT 结构，需要有终止蛋白参与才能使转录终止。 大肠杆菌染色体基因组的结构和功能 大肠杆菌染色体基因组是研究最清楚的基因组。估计大肠杆菌基因组含有3500个基因，已被定位的有900个左右。在这900个基因中，有260个基因已查明具有操纵子结构，定位于75个操纵子中。在已知的基因中
原核生物基因组和真核生物基因组的区别： 1、真核生物基因组指一个物种的单倍体染色体组(1n)所含有的一整套基因。还包括叶绿体、线粒体的基因组。 原核生物一般只有一个环状的DNA分子，其上所含有的基因为一个基因组。 2、原核生物的染色体分子量较小，基因组含有大量单一顺序 （unique-sequences），DNA仅有少量的重复顺序和基因。 真核生物基因组存在大量的非编码序列。包括： .内含子和外显子、.基因家族和假基因、重复DNA序列。真核生物的基因组的重复顺序不但大量，而且存在复杂谱系。 3、原核生物的细胞中除了主染色体以外，还含有各种质粒和转座因子。质粒常为双链环状DNA，可独立复制，有的既可以游离于细胞质中，也可以整合到染色体上。转座因子一般都是整合在基因组中。 真核生物除了核染色体以外，还存在细胞器DNA，如线粒体和叶绿体的DNA，为双链环状，可自主复制。有的真核细胞中也存在质粒，如酵母和植物。 4、原核生物的DNA位于细胞的中央，称为类核（nucleoid）。 真核生物有细胞核，DNA序列压缩为染色体存在于细胞核中。 5、真核基因组都是由DNA序列组成，原核基因组还有可能由RNA组成，如RNA病毒。 原核生物和真核生物区别（从细胞结构、基因组结构和遗传过程分析）主要差别 由真核细胞构成的生物。包括原生生物界、真菌界、植物界和动物界。真核细胞与原核细胞的主要区别是：
【从细胞结构】 1.真核细胞具有由染色体、核仁、核液、双层核膜等构成的细胞核；原核细胞无核膜、核仁，故无真正的细胞核，仅有由核酸集中组成的拟核 2.真核细胞有内质网、高尔基体、溶酶体、液泡等细胞器，原核细胞没有。 真核细胞有发达的微管系统，其鞭毛（纤毛）、中心粒、纺锤体等都与微管有关，原核生物则否。 3.真核细胞有由肌动、肌球蛋白等构成的微纤维系统，后者与胞质环流、吞噬作用等密切相关；而原核生物却没有这种系统，因而也没有胞质环流和吞噬作用。 真核细胞的核糖体为80S型，原核生物的为70S型，两者在化学组成和形态结构上都有明显的区别。 4.原核细胞功能上与线粒体相当的结构是质膜和由质膜内褶形成的结构，但后者既没有自己特有的基因组，也没有自己特有的合成系统。真核生物的植物含有叶绿体，它们亦为双层膜所包裹，也有自己特有的基因组和合成系统。与光合磷 酸化相关的电子传递系统位于由叶绿体的内膜内褶形成的片层上。原核生物中的蓝细菌和光合细菌，虽然也具有进行光合作用的膜结构，称之为类囊体，散布于细胞质中，未被双层膜包裹，不形成叶绿体。 【从基因组结构】 1.真核生物中除某些低等类群（如甲藻等）的细胞以外，染色体上都有5种或4种组蛋白与DNA结合，形成核小体；而在原核生物则无。 2.真核生物中除某些低等类群（如甲藻等）的细胞以外，染色体上都有5种或4种组蛋白与DNA结合，形成核小体；而在原核生物则无。 3.真核细胞含有的线粒体，为双层被膜所包裹，有自己特有的基因组、核酸合成系统与蛋白质合成系统，其内膜上有与氧化磷酸化相关的电子传递链
乙型肝炎病毒基因型检测的临床意义 乙型肝炎病毒（HBV）基因型分为A～H八个型，不同基因型与病情的严重程度、预后、抗毒治疗效果等方面都可能有一定的相关性[1-3]。本文对上海市165例乙肝患者的HBV基因型布及与病情严重程度的关系，进行了初步的研究。另外，HBV的前C区变异会影响抗病毒药物选择及治疗的效果，本文就HBV基因型与这些变异及病毒的复制能力是否相关，进行了探讨。材料与方法 1. 研究对象：165份血清标本来自上海市传染病医院的住院和门诊乙肝患者包括114例慢性乙型肝炎（CHB），26例慢性重型乙型肝炎（CHG），22例肝硬化（LC），2例性乙型肝炎（AHB），1例肝癌（HCC）。疾病的诊断依据2000年全国病毒性肝炎和肝病会议拟的方案。并从上述收集的部分标本进行HBV血清学标志物、前C区1896位变异及HBV DNA定检测。 2. 方法：HBV基因型检测：以特异性引物套式PCR法检测不同的HBV基因型[4]取部分不同基因型的扩增产物进行测序分析，证实二种分型方法的结果一致。前C 变异检测：以特异性引物PCR法进行检测，部分结果也经测序证实。 HBV DNA载测定：以TaqMan探针实时荧光PCR法定量检测。 3. 统计学处理：用卡方检验分析所得数据。结果 1. HBV感染者的基因型分析结果：从表1可以看出，A型1例（0.6%），型55例（33.3%），C型105例（63.6%），D型2例（1.2%）A/B和B/C混合型各1例（0.6% 0.6%），没有发现E、F、G、H型及其混合型。基因型在不同临床型患者中的分布情况其总体成比中，LC与CHB患者的基因型分布有统计学差异，C型在CHB和LC患者中所占百分比明高于B型，分别为61.4%比36.8%（P<0.01）和90.9%比9.1%（P<0.001）。CHG患者的基型分布无显著差异。因HCC 、AHB患者病例数少难以进行统计学分析。仅有的2例AHB患者为D型。 2. 乙肝患者的HBV基因型与血清标志物分析结果：在CHB中，B与C基因型比较，HBeA 抗HBe的检出率间的差异在统计学上无显著性，而HBeAg/抗HBe双阳性的检出率B型高于C基型，分别为9.5%和4.3%（P<0.05）。在CHG患者中，B与C基因型相比，HBeAg、抗HBe和HBeA 抗HBe双阳性检出率的差异在统计学上有显著性，前者以C基因型为主，后两者以B型为主。患者在B型中病例数太少，没有统计意义，结果见表2。
乙型肝炎现状如何？ 乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的一种疾病，主要存在于肝细胞内，可引起肝细胞炎症、坏死和纤维化。 乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球约有3.6亿感染者，每年约有100万人死于与HBV相关的肝脏疾病。我国属于感染的高发区，现有的慢性HBV感染者约9300万例。 乙型肝炎病毒（HBV）基因分型的临床意义 HBV根据DNA差异可分为A、B、C、D、E、F、G、H八种类型，不同型别在流行特征，致病性，对药物治疗反应等方面存在差异，其中，我国以B型和C型为主，感染HBV基因型B的患者发生肝纤维化及肝细胞癌的平均年龄要比感染HBV基因型C的患者的年龄大。 通过分型检测，可判断病毒复制活跃程度及突变发生率情况。研究表明，与HBV-B型相比，C型复制较活跃，不易发生HBeAg血清转换；HBV-B型易产生前C区突变，C型核心启动子区变异发生率更高，与重型肝炎发病机制密切相关，可作为肝癌高危指标之一。同时，HBV-B、C型患者易产生拉米夫定耐药突变，通过分型检测，可指导临床治疗方案制定，有针对性进行临床治疗，更大程度上提高患者的生活质量。 乙肝的治疗方式有哪些？ HBV感染主要的治疗方法是抗病毒治疗，国内外普遍使用的药物有干扰素和核苷（酸）类。由于干扰素需要反复注射，且副作用较多，近年来，核苷(酸)类似物(NA)已成为抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒复制能力强、使用方便、耐受性好且疗效确切，适用于不同阶段的肝病患者，是长期治疗的合理选择。但随着治疗时间的延长，往往会出现病毒耐药株，从而需要监测乙型肝炎病毒耐药基因型，指导临床用药。 乙肝病毒产生耐药的机理是什么？ HBV对某种药物的耐药性一般是指由HBV基因组上某些位点的变异导致这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用。通常分为以下几种： （1）原发性耐药变异：指药物作用靶位的基因及其编码的氨基酸发生变异，导致变异病毒株对治疗药物的敏感度下降； （2）继发性耐药变异(又称补偿性耐药变异)：指由于原发性耐药变异病毒株复制能力下降，在原发性耐药变异的基础上，病毒株也可在其他位点发生变异，这些变异可部分恢复变异病毒的复制能力或可导致变异病毒对药物敏感度的进一步下降； （3）基因型耐药：指检测到已在体外的表型分析研究中被证实与抗病毒药物耐药相关的HBV变异；（4）表型耐药：通过体外复制系统证实检测到的HBV变异会降低其对抗病毒药物的敏感度。 HBV属于嗜肝DNA病毒科，基因组长约3.2kb，是部分双链环状DNA结构。HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框(open reading frame，ORF)，分别为S基因区、C基因区、P基因区和x基因区。产物为含末端蛋白、间隔区、逆转录酶区和RNA酶H区4部分的HBV聚合酶。 HBV虽然属于DNA病毒，但其复制过程并非DNA—DNA的直接复制过程，而是经过前基因组RNA的中间过程，即DNA—RNA—DNA的复制过程。在前基因组RNA逆转录为负链DNA的过程中，HBV逆转录酶由于缺乏严格的校正机制，导致HBV复制过程中核苷酸错配率较高，发生变异的频率为每年(1.4～3.2)X105核苷酸替换／位点。HBV复制的这种过程和特点，决定了同一患者体内不同的HBV株基因序列之间也存在差别。 核苷（酸）类药物主要通过抑制HBV聚合酶的逆转录酶区活性，阻止HBV复制过程中以HBV的前基因组RNA为模板逆转录生成新的病毒DNA，从而发挥抑制病毒复制的作用，HBV前基因组RNA是以HBV 的cccDNA为模板合成的，即NA的药效靶点在cccDNA的下游，所以NA不能直接清除已经存在的cccDNA。
乙型肝炎病毒基因分型方法简述 邵 玲 张 男 【摘要】乙型肝炎病毒是一种嗜肝脱氧核糖核酸病毒,属于一种复合体DNA病毒。乙型肝炎病毒可按两种方法分型:血清型和基因型。随着分子生物学的发展以及对乙型肝炎病毒研究的深入,乙型肝炎病毒血清分型法已不能适应对该病毒感染研究的需要,而出现的基因分型法则引起广泛的重视。 【关键词】乙型肝炎病毒;基因分型方法 H epatitis B virus gene minute method summ ary S HA O L in Z HA N G N an 【Abstract】The hepatitis B virus is one kind is addicted to the liver deoxyribonucleic acid virus,belongs to one kind of complex DNA virus.The hepatitis B virus may according to two method minutes:Blood serum and genotype.Along with molecular biology’s development as well as to hepatitis B virus research’s thorough,a hepatitis B virus blood serum minute law has not been able to adapt to this virus infection research need,but appears a gene minute principle brings to the widespread attention. 【K ey w ords】Hepatitis B virus;Gene minute method 乙型肝炎病毒是一种嗜肝脱氧核糖核酸病毒,属于一种复合体DNA病毒。乙型肝炎病毒可按两种方法分型:血清型和基因型。随着分子生物学的发展以及对乙型肝炎病毒研究的深入,乙型肝炎病毒血清分型法已不能适应对该病毒感染研究的需要,而出现的基因分型法则引起广泛的重视。1988年Ok2 mamoto[1]对18株不同亚型的HBV基因序列两两进行比较后,根据核苷酸序列异源性>8%的原则,将18株HBV DNA序列分为A～D4个基因型,提出了HBV基因型的概念。1992年Norder[2]发现ayw4和adw4q-两旧亚型之间及基因型A～D 之间S基因差异>4%,提出了两种新的基因型E,F,1994年Norder通过全基因序列P3测定加以证实。2000年Stuyver[3],在研究来自法国和美国的慢性乙肝病人血清样本时,发现有13株病毒无法归入A～F型,命名为G型。随后,日本和德国也相继发现了G基因型。2002年Arauz～Ruiz[4]对10株HBV进行基因型研究,发现其中3株虽与F型相近,但与F型又有明显的不同,进而命名为H型。截止现今,HBV基因型可分为A～H八型。 目前,国内外对HBV进行基因分型主要有“基因序列测定法、聚合酶链反应———限制性片段长度多态性分析法、基因型特异性表位单克隆抗体的EL ISA、基因型特异性线形探针检测法、基因型特异性引物PCR法和基因芯片技术”。 1 基因分型原理 1.1 全基因序列测定。全基因序列测定是根据HBV所有病毒核苷酸异源性>8%进行分型的。Okamoto对从日本及印度尼西亚adw2慢性携带者中分离出的3株HBV进行全序列测序及比较,其核苷酸的异质性为3.9%～5.6%,而与美国2株相同血清亚型HBV序列比较,异质性达8.3%～9.3%,达到甚至超过不同血清亚型HBV的异质性,从而说明血清学分型不能真正反映HBV基因变异。再经对18株HBV DNA进行两两比较分析,根据同源性<92%、异质性>8%,将其分为A, B,C及D4个基因型,初步建立了基因分型体系。12年后Stuyver使用该方法,发现了一种新的3248bp的HBV基因型G 。 1.2 S基因序列测定。由于乙型肝 炎病毒基因可分为p基因、前s基因、编 码HBs4的s基因、C基因及X基因(如 图),可分别对它们进行研究,从而找出各 个基因型在各个基因之间的差异。Nor2 der[5]对32例HBV患者s基因测序结果 进行分析,并建立进化树,基因型间异质 性>4%。除证实了Okamoto的A～D分型外,还发现了2个新的基因型E和F,使HBV基因型达到6个(A～F)。在其后对28例HBV全基因组、p基因、前s基因、编码HBs4的s基因、C 基因及X基因分别比较并建立进化树,进一步证实根据s基因序列分型最接近全基因组,从而证明了单独使用S基因进行分型的可靠性。目前,此法尚在使用,主要有SSP和SSO[6],即基因型特异性引物PCR法和基因型特异性线形探针检测法。 2 基因分型方法 2.1 序列测定法。即直接测定核苷酸序列,根据差异分型。自Okamoto据HBV基因型之间的全序列异质性8%进行分型以来,测序由于方法直接、可靠而成为主要鉴定HBV基因型的方法。同全序列进化树图比较,发现S基因的序列变化同全基因序列的变化一致,可用S基因序列代替全基因序列进行分型,界限为核昔酸序列的异质性4.0%。该法虽较为可靠但操作繁琐、费用昂贵,不适于临床大量标本检测。 2.2 聚合酶链反应———限制性片段长度多态性分析法(PCR～RFL P)。目前常用的基因分型方法,通过PCR扩增出目标基因片段(通常为S基因或Pres/s基因),用特定的限制性内切酶进行酶切,根据酶切图谱进行基因分型。Mizokami[7]通过分子进化方法对已知基因型的68例HBV患者全基因、106例HBV患者s基因序列进行分析,发现并确认基因型特异性酶切位点区域。Lindh[8]对不同基因型S基因的特异酶切位点进行分析,设计使用限制性内切酶Trp509I和Hinf I使S基因PCR产物产生不同长度的酶切片段,成功地将166/180例患者HBV实现A-F基因分型。RFL P敏感性高,但酶切位点易受基因变异影响,且遇混合感染或酶切不完全,会出现复杂条带,影响分型结果判断。 2.3 基因型特异性表位单克隆抗体的酶联免疫吸附法(EL ISA)PreS2多肽有多组抗原表位。基因型不同抗原表位也不同,从而可以鉴定不同基因型。Usuda[9]等用此法制备前S2区域基因型特异性表位的单克隆抗体,并用辣根过氧化酶进行标记,对68例HBV阳性患者血清检测,分型结果与S基因测序分型完全一致。在后期实验中发现,适用于大规模的流行病学调查,使较大范围的HBV的研究成为可能。 2.4 基因型特异性线形探针检测法。该方法是设计型特异的探针,检测HBV扩增产物,以产物的不同长度或与探针的反应性来区分不同型别。Kato[10]利用G基因型的病毒在核心区有36个核苷酸的插入,设计引物用PCR的方法可以对G基因型进行特异的筛查。早在1983年Wu用酶切的方法研究血清型的酶切图谱,来区分不同的血清型。王虹[11]等采用PCR2核酸杂交/EL ISA检测,主要是联合利用PCR、核酸杂交和酶联免疫技术,设计前C和C区的探针,可以快速准确的区分HBV的基因型。另外Van G eyt[12]根据A～F基因型的保守序列设计了18种型特异性探针与HBV S (下转12页)
浅析乙肝病毒基因突变检测及治疗(一) 一、概况 由于我国人民生活水平低和卫生资源溃乏，造成乙肝泛滥。据统计：我国有乙肝病毒携带者约1.5亿、慢性迁延性肝炎约2500万、慢性活动性肝炎约1000万、重症肝炎约150万、肝硬化约100万和肝癌16～30万。肝硬化和肝癌80%以上是由乙肝病毒引起，而且80%左右来源于家族性垂直传播、与病人接触而感染机率很少。乙肝传染病已被国家疾病预防控制中心列为重点监控的疾病之一。 乙型肝炎病毒（HBV）属嗜肝病毒科，基因结构复杂，根据HBV-DNA核苷酸序列异质性≧8%为一种基因型的规定，HBV目前分为A～H8个基因型，其中A、B、C、F4个基因型存在不同的亚型，且分布呈区域性。由于其在复制过程中HBV-DNA聚合酶缺乏校正功能，导致易于变异，有报导HBV的基因型与基因型变异可能与HBV相关性肝癌的发生发展有关。HBV 变异给疾病的预防、诊断、治疗和预后带来了新问题，不同基因型的基因变异、临床表现及对抗病毒、肝移植等的治疗反应存在差异。 二、变异及区域 HBV受自然压力、个体免疫力和药物治疗作用出现变异。HBV有四个开放阅读框架（ORE）即S、C、P、X区。 1、C区变异：用基因芯片检测HBV前C区和C基因启动子（BCP）区4位点突变，发现前C 区A1896、前C区A1814、BCP区nt176 2、BCP区nt1764突变检出率分别是58.57%、12.86%、54.29%、52.86%。突变的发生依次是慢重肝、慢乙肝重度、中度、轻度，血清病毒标志是HBeAg(-)HBeAb(+)、HBV-DNA定量在104-106copy/ml之间的突变发生率最高。可以解释小三阳DNA阳性之原因：HBeAg前C区A1896位的G变异成A，密码子UGG变为终止UAG，使HBeAg不能合成，但不影响病毒复制。 2、S区变异：前S1有识别功能，前S2是介导受体进入功能。前S区的变异可能是病毒逃避宿主免疫的一种方法，前S区的变异决定不同的HBV亚型。124、131位变异或122-124间插入变异可改变S抗原决定簇的构型，致HBsAg假阴性。145、141、126、133位氨基酸的改变，用常规试剂仍可检出HBsAg，但可能削弱HBsAg的无免疫性，使高效价的乙肝免疫球蛋白或接种诱生的HBsAb难与变异株的HBsAg结合，缺乏中和特性，使HBsAg与HBsAb 同时阳性。在HBV-DNA阳性时，无论是乙肝病毒基因变异株或野毒株，前S1抗原是判断乙型肝炎病毒复制的重要指标。 3、P区变异：用微孔板核酸杂交法检测乙肝病毒P基因区变异，突变位点主要位于HBV-DNA 聚合的区域（YMDD），M1（蛋氨酸）可被VC（缬氨酸）或IC（异亮氨酸）替代。研究用拉米夫啶（LMV）治疗慢性乙肝而发生耐药的有关变异可见：LMV本身可引起HBV的变异即YMDD变异，用LMV四周后50-70%的病人出现YMDD变异。 4、X区变异：HBV-X蛋白对信号转导通路及细胞凋亡有影响，X蛋白对核转运影响和对线粒体直接作用。X区变异引起X蛋白（HBXAg）过度表达，激活体内癌基因和抑制抑癌基因，导致肝癌的发生。有报导：用聚合酶链反应检测原发性肝细胞癌（HCC）患者癌组织及癌周组织中HBV-X基因，检出率分别为68%和77%。
两对半检查是用来判断是否感染乙肝或粗略估计病毒复制水平的初步检查， 乙肝两对半吸头 两对半对于病情严重程度的评估参考性不大。而肝功能是衡量肝脏是否有肝细胞坏死或炎症存在的重要检查，其中转氨酶是重中之重，治疗需要以肝功能为重要参考指标。HBVDNA检查是判断如何治疗的参考依据，同时也对传染性有一定的参考意义，一般DNA越高，传染性越强，也需要同肝功能一起检查。 乙肝两对半中 1（HBsAg-乙肝病毒表面抗原）为已经感染病毒的标志，并不反映病毒有无复制、复制程度、传染性强弱 2（HBsAb-乙肝病毒表面抗体）为中和性抗体标志，是否康复或是否有抵抗力的主要标志。乙肝疫苗接种者，若仅此项阳性，应视为乙肝疫苗接种后正常现象；感染乙肝病毒后依靠自身免疫力清除乙肝病毒的人体内也会产生乙肝表面抗体，这是一种好现象 3（HBeAg-乙肝病毒e抗原）为病毒复制标志。持续阳性3个月以上则有慢性化倾向 4（HBeAb-乙肝病毒e抗体）为病毒复制停止标志。病毒复制减少，传染性较弱，但并非完全没有传染性 5（HBcAb-乙肝病毒核心抗体）为曾经感染过或正在感染者都会出现的标志。核心抗体IGM是新近感染或病毒复制标志，核心抗体IgG是感染后就会产生的，对于辅助两对半检查有一定意义。 乙肝前S1抗原三病毒复制的另一个指标，人体感染乙型肝炎病毒后，最早的免疫应答就是针对前S1抗原的。由于前S1抗原的出现在HBV感染的最早期，因而可以起到早期诊断的作用。 由于核心抗原在血中不易测到，目前试剂盒也不过关，所以还剩两对半抗原抗体，这就是人们常说的“乙肝两对半”检查，或称“乙肝五项”检查。 编辑本段乙肝两对半正常值 乙肝两对半检查分为定性检查和定量检查，在定性检查和定量检查中，乙肝两对半正常值是不同的。 在乙肝两对半定性检查中，检查结果通常用“+”或“-”号来表示，“+”号表示阳性，“-”号表示阴性。乙肝两对半正常值是“-”阴性，说明血清中检测不到这项乙肝病毒标志物。 在乙肝两对半定量检查中，乙肝两对半正常值为①HBsAg：<0.5ng/ml(毫微克/毫升) ②HBsAb：<=10MIU/ml[米尤(音)/毫升] ③HBeAg<=0.5PEI U/ml ④HBeAb：当HBeAb定量<=0.2PEI U/ml ⑤HBcAb：<=0.9PEI U/ml。 编辑本段临床意义 以下是乙肝病毒血清标志物（即常说的乙肝五项或称两对半）的临床意义： 序号HBsAg HBsAb HBeAg HBeAb HBcAb临床意义 9种常见模式
两种方法检测乙型肝炎病毒五项指标的结果 对比 作者：龙青文，何建军，马家驹，何秀琳，肖金平 【关键词】酶联；血清乳胶；定性分析 ［关键词］酶联；血清乳胶；定性分析 乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗体(HBsAb)、e 抗原(HBsAg)、e抗体(HBeAb)、核心抗体(HBcAb)的检测在许多方面如诊断乙肝判断愈后、筛选献血员、乙肝的流行病学调查、判断人群对乙型肝炎的免疫水平，对食品、保育及饮水管理行业人员定期进行健康体检等起着重要的作用。故选择一种特异、敏感、稳定的实验室检测方法检测乙型肝炎病毒的五项指标显得尤为重要。现将56例检测者血清同时用酶联免疫法和血清乳胶层析法对比检测结果报告如下。 １材料与方法 1.1 标本来源56例受检者中，男29例，女27例，最大年龄72岁，最小年龄29岁，平均年龄46岁；来自健康体检人群15例，其中13例检测具有阳性结果，2例各项指标均为阴性、另41例为门诊检查结果有阳性的患者，均系血清标本。
1．2 方法酶联免疫法用乙型肝炎病毒(HBsAg，HBsAb，HBeAg、HBeAb，HBcAb)诊断试剂盒，由上海华泰生物工程实业有限公司生产，48人份，批号20040503，按说明书操作。乙肝两对半血清/血浆乳胶层析法检测试剂板由ACONLaboratories.Inc.SanDiegoCA92121USA提供，批号200407029，按说明书操作。 1.3 质量控制酶联免疫法每项检测项目均设阴、阳性对照各2孔，每空加入阴性对照(或阳性对照)各1滴，并设有空白对照1孔。乳胶层析法各项检删项目均设质控区(C)。 1.4 检测结果判定标准：酶联免疫法是根据颜色的变化，作定性分析。此法HBsAg、HBsAb、HBeAg呈黄色为阳性反应，无色为阴性反应，阳性对照为黄色，阴性对照为无色。HBeAb、HBcAb无色为阳性，黄色为阴性，阳性对照为无色，阴性对照为黄色。乳胶层析法HBsAG、HBsAb、HBeAg在测试区内(T)出现一条红色条带则是阳性结果，不出现红色条带则为阴性。HBeAb、HBcAb结果则相反，强阳性标本测试区内(T)将没有红色条带，弱阳性标本测试区内(T)将有一条非常弱的红色条带，阴性标本测试区(T)将会出现明显的红色条带。无论相应的待测物质是否存在于标本中，质控区(C)都会出现红色条带。两种检测方法结果对比分析用卡方检验两两比较进行统计学处理。
乙型肝炎病毒基因组转染H epG2细胞的microRN A表达研究 刘妍 张亮 戴久增 王琳 赵建晴 徐东平 【摘要】 目的 检测乙型肝炎病毒(HBV)全基因组转染对人肝母细胞瘤细胞系Hep G2细胞中microRNA(miRNA)表达的影响,为进一步探讨肝细胞中HBV复制的分子生物学机制提供平台。方法 分别提取Hep G212115细胞(转染HBV全基因组的Hep G2细胞,实验组)和其亲本Hep G2细胞(对照组)的总RNA并分离miRNA,采用含509条探针的哺乳动物miRNA表达谱芯片对两组之间差异表达的miRNA进行分析。用SAM软件针对差异miRNA筛选的标准为在两组之间荧光强度差异4倍以上,差异miRNA的整体假阳性率为0。选择其中2个miRNA,应用实时荧光定量RT2PCR方法对芯片结果进行验证。结果 Hep G212115细胞与Hep G2细胞间差异表达的miRNA共27个(占513%),其中7个表达上调,20个表达下调。miR2181d和miR215a的实时荧光定量RT2PCR验证结果与芯片表达结果基本一致。结论 肝细胞中存在着与HBV复制相关的miRNA,这些上调和下调表达的miRNAs 可能参与了HBV在肝细胞中的复制。 【关键词】 肝炎病毒,乙型;微RNAs;基因表达 【中国图书资料分类号】 R512163 T he microRN A gene exp ression profiling in H epG2cells transfected w ith fu ll2long hep atitis B virus genom e Liu Y an,Zhang Liang,Dai Jiuzeng,et al1Viral Hepatitis Research Center,Institute of Infectious Diseases,302 Hospital of PLA,Beijing100039,China 【Abstract】 Objective MicroRNA(miRNA)has recently been suggested to play a role in certain virus infections.The present study is to investigate if miRNA is associated with hepatitis B virus(HBV)activity by detecting differential expression of miRNA between human hepatoblastoma cell line Hep G2.2.15transfected with full2long HBV genome and its parent cell line Hep G2.M ethods T otal RNA were extracted from Hep G2.2.15cells and control Hep G2cells,respectively.miRNAs were then isolated from the total RNA.Mammalian miRNA microarrays containing509miRNA genes were employed to analyze the differentially expressed miRNAs between the two groups. miRNAs were considered to be up2or down2regulated when the fluorescent intensity ratio between the two groups was over42fold and global false positive is zero using SAM program.Validation of microarray results was carried out by real2time quantitative RT2PCR(qRT2 PCR).R esu lts C ompared with those of control Hep G2cells,a total of27miRNAs were differentially expressed(5.3%of all probes),a2 m ong which7were up2regulated and20were down2regulated in Hep G2.2.15cells.qRT2PCR verified that miR2181d expression was162 fold up2regulated and miR215a was92fold down2regulated in Hep G2.2.15cells,which was in agreement with the results of the microarray analysis.C onclusion The findings suggest that there are HBV replication2associated miRNAs in HBV genome2transfected Hep G2.2.15 cells.These up2and down2regulated miRNAs may be involved in the life cycle of HBV replication.The knowledge is helpful for further study to discover new m olecular targets for anti2HBV therapy. 【K ey w ords】 hepatitis B virus;microRNAs;gene expression 核苷类似物和重组α2干扰素是目前临床上重要的抗乙型肝炎病毒(HBV)药物,但其疗效有限[1]。Mi2 croRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子,它广泛参与转录后的基因表达调控。在HCV和HIV等慢性病毒感染中,miRNA的重要作用已得到证实[2-4],但其在HBV感染中的作用尚未见报道。本研究采用哺乳动物miRNA表达谱芯片技术检测了转染HBV全基因组的人肝母细胞瘤细胞系Hep G2细胞中miRNA的表达,以探讨肝细胞中是否存在与HBV复制相关的miRNA,为进一步研究HBV在肝细胞中复制的分子生物学机制奠定基础。 1 材料与方法 111 主要实验材料 肝母细胞瘤细胞系Hep G2细胞、Hep G212115细胞(转染HBV全基因组的Hep G2细胞)由解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研 究室细胞库保存。DMEM高糖细胞培养液、胎牛血清FBS购自G ibco公司,G418购自Merck公司,总RNA 提取试剂T rizol购自Invitrogen公司,其他生化试剂购自Sigma公司。哺乳动物miRNA表达谱芯片含有509条探针,其中包括的人、大鼠、小鼠的成熟miRNA数分别为435、196和261个(数据来自2005年10月Sanger 数据库,因人、大鼠和小鼠的miRNA具有共同序列,故取三者的并集),由生物芯片北京国家工程研究中心提供。芯片实验所用共聚焦扫描仪LuxScan10K/ 【作者简介】 刘妍,医学硕士,助理研究员。主要从事病毒性肝炎分子生物学发病机制研究。已发表论文40余篇,获北京市科技进步二等奖1项,军队科技进步三等奖1项。E2mail:liuyan5360@1631com 【作者单位】 100039 北京 解放军第302医院传染病研究所病毒性肝炎研究中心(刘妍、戴久增、王琳、徐东平);生物芯片北京国家工程研究中心(张亮、赵建晴) 【通讯作者】 徐东平,E2mail:xudongpping@yahoo1com
乙型肝炎病毒基因组序列分析 【摘要】目的分析四川省木里县1株乙型肝炎病毒基因组特征。方法从HBsAg阳性的血清标本11B18中提取病毒DNA，经多聚酶链反应和核苷酸片段测序后，用Mega4软件和Simplot软件做进化树分析和重组分析。结果S基因和C基因核苷酸序列进化树分析显示11B18分别属于D基因型和C基因型，全基因组核苷酸序列进化树分析显示此株与C1基因亚型参考株在同一进化分枝上；重组分析证实此株为C/D基因型重组株，与D基因型的重组位点大约在nt140～nt740。结论与我国西部地区的CD1和CD2两种C/D基因型重组株比较，11B18属于C1基因亚型，其与D基因型的重组位点也有差异。 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）属于嗜肝DNA病毒科，其基因组全长约3.2kb，含有4个相互重叠的开放读码框(P基因，PreC/C基因, PreS/S基因和X基因)。根据基因组或S基因核苷酸序列差异，HVB可分为A～H８个基因型[1～3]；各基因型呈一定的地理区域分布，并与一定的血清亚型相关[4]。我国HBV以B和C基因型为主，西部地区存在D 基因型及C/D重组基因型[5～8]。为了解四川省HBV的基因型，对收集到的部分HBsAg 阳性血清标本进行了核苷酸序列分析，在四川省木里县1份血清标本中检测到1株C/D基因型重组HBV，其重组位点与我国西部地区的CD1和CD2基因型重组株不同。 1. 材料与方法 1.1 血清来源血清标本编号为11B18,采自木里县1名6岁彝族儿童，血清学检测其HBsAg 和HBeAg均阳性。 1.2 HBV DNA提取使用Maxwell 16 DNA purification Kit（Promega）按厂家说明书提取病毒DNA。 1.3 多聚酶链反应（PCR）和核苷酸测序PCR在PTC-200（MJ）上进行，试剂为PCR Master Mix（Promega），所用引物见表1。PCR条件为：94℃预热3min,然后94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，共40次循环，最后72℃10min延伸。PCR产物用Wizard SV Gel and PCR Cleanup System（Promega）按厂家说明书进行纯化。纯化PCR产物用相同引物分别进行双向标记，标记试剂为Bigdye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）, 反应条件为：96℃10sec, 50℃5sec, 60℃4min,共25次循环。标记产物用BigDye XTerminator Purification Kit（Applied Biosystems）再次纯化后，在3500 xL Genetic Analyzer （Applied Biosystems）上完成测序。 1.4 基因型分析和重组分析11B18核苷酸序列与HBV A～H基因型/基因亚型参考株序列（包括我国西部地区的CD1和CD2 2种C/D基因型重组株）比对后，用MEGA4软件做进化树分析（Kimura 2 参数模型，配对删除，邻位-连接法，500次bootstrap检验）[9]，根据进化分枝聚集确定基因型。使用SimPlot软件进行重组分析。 11B18标本HBV基因组序列已在GenBank/EMBL/DDBJ数据库中登记（AB674504）。 2. 结果 2.1 核苷酸序列分析11B18基因组全长为3215bp，4个开放读码框的位置与C基因型参考株位置一致，在PreS基因上未发现缺失，且与除C基因型参考株外的其它基因型核苷酸序列差异都>8%。与各C基因亚型参考株比较，11B18与C1基因亚型参考株的核苷酸差异最小（ 3.3% ±0.5%）。根据S基因序列推导其表面抗原122位、160位和127位氨基酸分别为精氨酸、脯氨酸和赖氨酸，确定11B18的血清亚型为ayw2。 2.2 进化树分析S基因进化树分析显示11B18与CD1、CD2重组株和其它D基因型参考株聚集在一起，属于D基因型，但PreC/C基因、X基因和P基因进化树分析均显示11B18均与C基因型参考株（包括CD1和CD2）聚集一起（数据未显示）。全基因组进化树分析也证实11B18C与C1基因亚型参考株在同一进化分枝上（bootstrap值为98%）（图1）。
乙肝病毒和原核生物的基因组结构特点 1.病毒基因组所含核酸类型不同 2.不同病毒基因组大小相差较大 3.病毒基因组可以是连续的也可以是不连续的 4.病毒基因组的编码序列大 5.基因可以是连续的也可以是间断的 6.病毒基因组都是单倍体和单拷贝 7.基因重叠 8.病毒基因组功能单位或转录单位 9.病毒基因组含有不规则结构基因 （1）几个结构基因的编码区无间隔 （2）结构基因本身没有翻译起始序列 （3） mRNA没有5’端的帽结构 原核生物基因组结构特点： 1.细菌等原核生物的基因组是一条双链闭环的DNA分子 2.具有操纵子结构 3.原核基因组中只有1个复制起点 4.结构基因无重叠现象 5.基因序列是连续的，无内含子，因此转录后不需要剪切 6.编码区在基因组中所占的比例远远大于真核基因组，但又远远小于病毒基因 组。非编码区主要是一些调控序列 7.基因组中重复序列很少 8.具有编码同工酶的基因 9.细菌基因组中存在着可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子 10.在DNA分子中具有多种功能的识别区域，如复制起始区、复制终止区、转录 启动区和终止区等。这些区域往往具有特殊的序列，并且含有反向重复序列 真核生物基因组结构特点： 1）真核基因组远远大于原核生物的基因组。 2）真核基因具有许多复制起点，每个复制子大小不一。每一种真核生物都有一定的染色体数目，除了配子为单倍体外，体细胞一般为双倍体，即含两份同源的基因组。 3）真核基因都出一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物的单顺反子，即一分子mRNA只能翻译成一种蛋白质。 4）真核生物基因组中含有大量重复顺序。 5）真核生物基因组内非编码的顺序（NCS）占90%以上。编码序列占5%。6）真核基因产断列基因，即编码序列被非编码序列分隔开来，基因与基因内非编码序列为间隔DNA，基因内非编码序列为内含子，被内含子隔开的编码序列则为外显子。 7）真核生物基因组功能相关的基因构成各种基因家族，它们可串联在一起，亦可相距很远，但即使串联在一起成族的基因也是分别转录的。 8）真核生物基因组中也存在一些可移动的遗传因素，这些DNA顺序并无明显
正确理解乙肝实验室检测结果 乙型肝炎病毒(HBV)感染的实验室检测是目前国内最为常用的检验项目，也是医患纠纷产生较多的领域之一。正确理解和解释乙肝实验室检验项目的临床意义，对于这些检验项目的实际应用有重要价值。下面就几个方面重点谈一谈。 一、乙肝“两对半”检查的意义 国内人群中，二十世纪八十年代中期以前出生的，乙肝病毒的感染率超过了10%，因而时至今日，乙肝“两对半”仍是目前国内医院最常用的乙肝病毒感染检测的血清标志物，也是医生和患者经常挂在嘴上的检验项目。在很多时候，甚至是体检，都会用到这些检验项目。乙肝“两对半”顾名思义，就是有五项判断乙肝感染的乙肝病毒抗原及其抗体的检验指标，即乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗体（抗HBs）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗体（抗HBe）和乙肝核心抗体（抗HBc）等。尽管这五项指标使用得非常多，但对其真正的含义，由于认识过程的原因，仍有不少误解。 1．HBsAg HBsAg于1963年由Blumberg在澳大利亚土著人血中发现，称为澳大利亚抗原(即以前所谓的“澳抗”)，后又称为肝炎相关抗原(HAA)，1974年正式定名为乙型肝炎表面抗原(简称为HBsAg)，存在于HBV的外壳部分。HBsAg有一个特异的共同抗原决定簇“a”和至少两个亚型决定簇“d／y”和“w／r”，最常见的血清型为adw、adr和ayw。我国绝大多数地区以adr为主，adw次之(于长江以南诸省与adr混存)；新疆、西藏、内蒙古自治区的本地民族几乎全为ayw。血清中检出HBsAg是乙型肝炎的早期诊断指标之一，出现于患者血清转氨酶(ALT)升高前2—8周，至恢复期HBsAg滴度逐步降低乃至消失，抗HBs出现。但有部分患者HBsAg在血清中可持续存在，原因可能是编码HBsAg的HBV的s区段和肝细胞DNA整合。在这种情况下，即使HBV已从人体内消除，肝细胞仍能不断地复制HBsAg。 HBV感染后，大部分人没有临床表现，但在血中可检出HBsAg，这类人通常称为HBsAg携带者。在我国这类人超过1亿，其中大部分将持续携带HBsAg数年、数十年乃至终身而无临床症状；小部分人在平衡被打破后，可发展为急性或慢性乙型肝炎，甚至肝硬化、肝癌。 HBV感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg，含量在5ng～600μg/ml之间。据文献报道，到目前为止在献血员中所发现的HBsAg 携带者最低含量为0.2 ng/ml。含量高者可达2000μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg测定为阴性，如暴发性乙型肝炎、HBV的S基因发生变异等。急性重症乙型肝炎，肝细胞中以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg，从而使外周血中无HBsAg。HBV的前S/S基因编码HBsAg，构成病毒外膜，根据所带亚型决定簇的不同分为adw、adr、ayw和ayr。a决定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg 疫苗可引起抗HBs应答。如S基因145密码子变异使得其原来的甘氨酸被精氨酸替代时，可致a决定簇的抗原性发生改变，使机体产生的抗体对变异株无作用，且可引起HBV感染患者血清中同时出现HBsAg和抗HBs。同时乙肝疫苗接种也不能有效预防此类变异病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的变异有自然变异和逃避免疫变异，变异可发生在多个部位，而且几处突变可同时存在，这些变异有助于病毒携带状态的持续存在。近来，有研究表明，前S1区丢失突变（氨基酸58～118）是引起HBsAg阴性的HBV感染的重要原因，S启动子位于前S1，是合成HBsAg的调节元件，前S1的丢失突变则会影响S启动子的功能，进而影响HBsAg的合成。 HBsAg不仅存在于血液中，而且还存在于许多体液和分泌物中，如唾液、尿液、乳汁、精液等。 目前国内最常用的HBsAg免疫测定方法为酶联免疫吸附试验(ELISA)，其次是放射免疫试验(RIA)。ELISA简单、方便、快速，测定下限进口试剂盒可达0.2 ng/ml，国产试剂盒目前也能达到0.5 ng/ml。 RIA因其试剂半衰期短、废物难于处理等，使用已很受局限。血清HBsAg仅为HBV感染的标志。由于其在血液中多为不含病毒颗粒的空壳，故而不反映病毒有无复制、复制程度、传染性强弱及预后。 2．抗HBs 急性乙型肝炎病人处于恢复期后，随着HBsAg的逐步消失，血清中出现抗HBs。抗HBs是一种中和抗体，其能在体内存在相当长的时间。以HBsAg作为疫苗免疫机体产生的抗HBs，对HBV的感染具有保护性免疫作用。10mIU/m1抗HBs为对HBV具有免疫力的临界水平。低于此值，说明免疫失败。乙肝疫苗接种者，体内血循环中除了抗HBs外，不应出现其它乙肝病毒感染血清免疫学标志物，如抗HBe、抗HBc等。一旦出现除抗HBs以外的标志物，则应视为既往HBV感染。 一般情况下，血清中抗HBs和HBsAg不同时存在，若同时检出，可能为抗HBs产生的早期，或属于不同亚型的HBV感染，或由HBV的S基因变异所致。 3．HBeAg HBeAg为HBcAg的可溶性成份，两者约有75％共同的氨基酸序列，但二级结构不同，各有特异的抗原决定簇，因而在细胞水平其体液免疫应答是不同的。其在血清中的出现时间稍后于HBsAg，一般血清HBeAg阳性者，HBsAg亦为阳性。有研究表明，当乙肝病毒的前核心区发生点突变时，可使得HBeAg无法表达，表现为血清HBeAg或抗HBe测定持续为阴性，但血清HBsAg或HBV DNA可