附件1
肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用注册技术审查指导原则
本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。
本指导原则是针对肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、适用范围
本指导原则所述肿瘤相关基因检测试剂分析性能评价主要是指基于高通量测序（high-throughput sequencing）即下一代测
—1 —
序（next generation sequencing，NGS），又称为大规模平行测序（massively parallel sequencing，MPS），体外检测人体组织肿瘤细胞中的肿瘤相关基因变异。用于检测体细胞突变的NGS正在广泛用于肿瘤诊疗相关的分子检测，包括对特定基因的DNA/RNA进行测序，以寻找与肿瘤临床诊疗相关的基因变异。肿瘤基因突变类型包括点突变、插入、缺失、基因重排、拷贝数异常等广义的基因突变。
基于NGS测序原理的体外诊断（In Vitro Diagnosis，IVD）检测可能包括以下步骤：样本收集、处理和保存、核酸提取及处理、文库制备、测序和碱基识别、序列比对、变异识别和过滤、变异注释和解读以及检测报告的生成。同时，某些产品还可能会包括软件部分，但上述相关步骤并不一定被全部包括，应根据产品的具体设计流程来进行判断。对于每个检测步骤，申请人需要结合产品设计和临床意义来建立特定的可接受的质量评价指标和合格判断标准。此外，为满足产品特定预期用途，申请人需通过科学和适当的检测性能研究来确定适用的试剂、消耗品、仪器和软件。基于上述考虑因素，NGS检测产品的设计和工作流程中的任何差异均可能导致结果的不同，因此申请人需要清楚地描述相关检测性能指标。
分析性能评价的初衷在于提出产品性能有效性、安全性相关问题的假设，然后通过研究进行确认。NGS在测序通量及发现未知基因变异方面具有优势，但是在NGS技术应用需求及使用中存在包括相关临床样本收集处理、NGS检测内容、测序流程、—2 —
数据分析、结果报告等各方面的挑战。
本指导原则将重点关注实体瘤中检测具有临床意义的体细胞变异和确保高质量的检测结果。申请人应以患者的利益为中心，充分整合临床肿瘤学家对于精准诊治的观点，并充分考虑在我国推广应用的可操作性。申请人可采用多样化的靶向基因组合检测。由靶向基因产生的信息可能会被用于诊断分类，指导治疗决策，和/或为特定肿瘤提供预后评价，不同产品包含的基因数量可能存在较大差异。
本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。本指导原则不适用于全外显子检测、肿瘤全基因组测序、从头测序、游离DNA检测、RNA直接测序、病原体微生物及宏基因组学测序、胚胎植入前检测、疾病风险（含遗传风险）评估与预测、直接面向消费者测序及健康人群筛查。
二、NGS性能评价
（一）综述资料
综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容。
申请人在计划开发一个有针对性的基因检测试剂时，需确定其预期用途、待测基因数量、检测突变位点或者突变类型，包括将要检测的样本类型、适用人群以及哪些类型的检测信息将被评估和报告。还应考虑影响检测的设计、验证和质量控制的其他因素，并在试剂组成说明书中详细说明该产品包含的试剂组分及需要但未提供的试剂、设备及耗材。
—3 —
作为IVD检测一般原则，申请人应首先定义申报产品的预期用途和检测性能，产品的预期用途将直接影响检测设计和检测性能以及测序和/或报告的基因类型。申请人需要前瞻性地确定应进行的研究指标（例如准确性）以及每种研究指标应该满足的标准。在设计和开发完成之后，验证研究其是否满足预定义的性能。如果检测不符合任何预定义的性能标准，则应分析原因、重新验证或修改预定义的性能指标。通过反复的设计、开发和验证，直到检测满足设定需求。在整个过程中申请人需要记录所有研究方案、研究过程和结果以及每项研究设计的理由。建议申请人列出样本处理、文库制备、测序、生信分析等环节主要质量控制参数。如文库浓度及片段长度、碱基识别质量值（Base Call Quality scores）、过滤后有效Reads数、有效测序深度（如经过去重处理等）、符合最低测序深度和平均测序深度要求的区域（%）等。
申请人应提供整个检测流程的标准操作程序文件（Standard Operating Procedure，SOP），对NGS技术检测全过程包括的样本收集处理、文库制备、测序、数据分析、结果报告等过程进行描述。生物信息学分析方面描述和记录数据处理和分析，包括变异识别、过滤和注释的所有过程。明确所有要使用的软件，包括来源（例如：内部开发以及第三方）以及主要修改。建议以列表形式描述所有需要的软件和/或数据库名称、版本及其功能。
（二）主要原材料的研究资料
NGS检测过程主要包括样本收集处理、文库制备、测序、数据分析、结果报告等。
—4 —
1.样本收集处理（如适用）
样本收集处理过程是保证样本具有能如实反映患者体征的关键环节。申请人需提交涉及样本收集及处理相关试剂主要原材料信息，如样本前处理试剂、样本运输保存试剂、核酸提取试剂的主要组成成分等。
2.文库制备及测序
测序文库构建及测序过程中所需试剂主要包含脱氧核糖核苷三磷酸、连接酶、聚合酶、逆转录酶、限制性内切酶、引物、探针、接头等；如为申请人自行研究的主要原材料，申请人应对测序文库构建的实验过程予以详述；并提供对各主要原材料的功能性研究。并对制备完成的原料成品进行质量检验以确认其符合标准要求，且整个生产工艺应稳定可控。如为申请人外购的主要原材料，应详述每一种原材料外购方来源，提交外购方出具的每种原材料性能指标及质量控制资料，并详述申请人对外购主要原材料的各指标质量要求以及确定该原材料作为本产品主要原材料的详细依据。核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（Deoxyribonuclease,DNase）和核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）污染。
3.生物信息分析及数据库要求
NGS的数据分析流程或生物信息学流程一般可以分为碱基识别、序列比对、变异识别和变异注释等。明确参考序列类型，不同突变类型可能需要开发不同的变异/突变检测算法。其次，应根据产品设计类型提供软件工具的范围和所需的验证类型。如
—5 —
涉及数据库使用，建议申请人提交数据库的溯源信息、数据库类型、完整性、实时性、维护以及分析软件的版本、性能验证等资料。
4.参考品要求
内部参考品是保证产品性能稳定性以及检测值可溯源的重要构成之一。参考品研究应包括原料选择、制备过程、定值研究及评价指标等。申请人应对内部阳性/阴性参考品的来源、基因序列设置等信息进行验证，并提供参考品溯源过程的测量程序或参考方法的相关信息及详细的验证资料。
具体要求如下：
4.1阳性参考品及阳性质控品：
4.1.1阳性参考品
理想状态下，阳性参考品应当包括对所申报产品每个基因型的质控样本。但考虑到基于NGS技术的可检测基因数量较多，申请人应结合产品预期用途、临床意义及基因类型等因素进行针对性和代表性的设计。
对于有明确肿瘤伴随诊断相关的基因，应考虑该类基因参考品设置的合理性和完整性，需包括伴随诊断相关的全部热点基因，建议采用临床样本或细胞系提取的核酸储备液作为原料。
对于具有显著临床意义或潜在临床意义的基因，应考虑代表性问题，明确具有临床诊断意义的基因类型及基因型中不同的变异类型。突变频率、变异类型的选取应具有代表性，包括不同外显子，不同基因变异突变等。
—6 —
如检测编码区较大且存在非热点区域设计（如大于1M），建议在阳性参考品中考虑对检测整体区域的灵敏度验证（主要关注SNV等），如混合的永生化正常人白细胞DNA储存液等。
不同突变/变异的变异丰度及突变频率，浓度范围设置应具有代表性并提供这样设定的依据。阳性参考品的突变形式及拷贝数需采用有效方法进行确认，并明确接受标准。申请人在设计阳性参考品时可一并考虑检测限参考品的设置及确认方式，并提供相关的依据。
4.1.2阳性质控品
模拟病人样本的目标核酸序列，并用于质控整个检测过程，包括核酸提取（如适用）、文库构建、测序和数据分析。目前阳性质控检测和分析过程应与临床样本方式一致。
4.2阴性参考品及阴性质控品
阴性参考品及阴性质控品建议为正常临床样本的混合物或细胞系，应明确不含有目标区域肿瘤突变基因。
4.3精密度参考品
精密度参考品设置要求可参考阳性/阴性参考品。
4.4 PCR 试剂无模板质控品（No Template Control，NTC）（如适用）
申请人应根据申报产品特点设置NTC质控品及检测接受标准，监测检测过程中是否存在污染。
（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料
NGS检测是一个复杂的工作流程，它由很多独立步骤组合
—7 —
而成。一般而言，对于每个检测组成部分，申请人应建立其特定检测的指标和验收标准。必须对NGS每个操作流程的性能表现进行一个内部的验证。每步流程都需要分别优化到一个最佳经验值，以此来综合决定最佳的实验操作条件及各参数的设置。
1.应能对反应体系涉及到的基本内容，如临床样本用量、试剂用量、反应条件、质控体系设置等，提供确切的依据，配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求。
2.主要生产工艺、反应原理介绍。逆转录过程（如涉及）及最佳反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）浓度、阳离子浓度等。
3.申报产品如包含核酸分离/纯化试剂，应提交对核酸分离/纯化过程进行工艺优化的研究资料。如包括但不限于核酸体积、质量、浓度、纯度及完整性等。核酸浓度、纯度检测方法包括但不限于荧光法等；核酸完整性检测方法包括但不限于琼脂糖凝胶法等。
（四）分析性能评估资料
分析性能评估是反映产品主要原材料选择，生产工艺及反应体系等多方面因素设置是否合理的客观评价指标。检测试剂性能的研究方案应结合产品的反应原理，临床预期用途，使用条件等综合因素进行设计。性能研究应涵盖产品研制阶段对试剂盒进行的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、内控标准、实验数据、统计分析等详细资料。
—8 —
本部分内容将从NGS检验流程中的质量控制要求和主要性能指标两部分进行阐述：
1.NGS检验流程
检测方法中，应明确所有检测要素（如仪器、软件、消耗品、试剂）。确定设计方案和标准并详细记录设计研究过程。对于基于NGS的检测的每个组成，应该确定规范并记录。记录每个检测组成对于关键因素（如覆盖率、碱基质量等）的局限性。确定并记录基因组的检测区域，包括基因和变异类型，如果关键的测序区域不符合最低性能要求（如最小覆盖标准等），则应修改检测并重新验证以达到最低性能要求。同时，应在产品说明书和/或标签中明确可能影响或限制产品检测性能情形。
1.1样本制备
申请人需考虑可接受检测的样本类型对检测结果的影响，应明确组织样本采集标准依据。用于肿瘤组织突变基因检测的标本，在进行检测前，须对肿瘤细胞进行评估。肿瘤细胞所占比例需达到后续检测方法的要求。
在NGS检测试剂的设计开发过程中，申请人应对配套使用的核酸提取、分离、纯化及富集试剂进行验证并提供验证方案的依据，应明确样品质量（包括但不限于核酸浓度、纯度及完整性）的最低要求并进行质量控制。如分离/纯化后的核酸储备液质量（如浓度范围）不符合要求，应重新取材或扩大样本量再进行核酸分离/纯化。
—9 —
1.2测序文库制备
文库制备是产生特定大小范围的DNA或cDNA片段的过程。文库质量非常重要，申请人应建立文库构建浓度、文库片段大小要求，文库浓度检测方法包括但不限于实时荧光定量PCR 法；文库片段大小检测方法包括但不限于毛细管电泳法等。申请人应关注不同测序平台的性能特点，确保片段长度分布符合后续测序要求。如需要进行片段化处理。申请人应制定核酸序列片段化操作流程及质量控制方案。对经过片段化的核酸短序列的浓度及片段分布等参数进行验证。
文库制备的关键步骤是在DNA片段的两端连接测序接头，接头序列是一段人为设计的序列，包含用于测序过程的多个目的的多个序列组分。如启动测序反应的通用测序引物序列，用于PCR扩增引物序列、锚定序列、索引（条形码）序列等。如申请人采用自定义序列，应提供设计依据及研究资料。加接头可以是独立的步骤，也可以在靶向序列富集过程中添加。申请人使用条码或标签时，需充分验证并满足测序的质量要求，如测序深度、覆盖度等条件。申请人应报告有效的条码或标签数量，并对每个条码或标签的序列及其位置有详细、清晰的记录。
1.3测序及碱基读取
目前可用的测序平台具有不同的测序方法，包括联合探针锚定聚合测序法、边合成边测序和离子半导体测序，以及不同的检测方法。尽管技术性能相似，但平台之间存在差异，特别是不同的DNA输入量要求、不同的测序通量、运行时间、测序读长和不同的碱基识别技术。这些差异会影响仪器处理低质量样本的能—10 —
力、检测插入/缺失/融合等变异类型的能力以及样本通量。
申请人应根据所选用的测序平台，选择合适的参数指标对测序质量进行监控，制定相应的管理制度及质量标准，并明确失控情况下的纠正措施。申请人应根据具体应用情况，如测序区域的大小及序列特征等因素确定测序所需要的覆盖度及深度。在测序过程中，申请人应建立标准操作流程及质量控制方案监控整个测序过程中的测序质量。
申请人应描述清晰，如在确立测序深度时需要明确指出是平均测序深度还是最低测序深度；还需要说明测序数据类型，如原始测序数据（原始reads数）、过滤之后的高质量测序数据或去除重复之后的测序深度。
碱基识别是指识别一段基因序列片段每一个位点的核苷酸的过程。不同测序平台具有不同的测序偏好性，可影响碱基读取过程中的错误类型与比率。碱基读取后，申请人应对每个碱基读取的质量进行评估。
1.4生物信息学分析
申请人应对生物信息学分析流程有完整的记录，建立完善的生物信息学分析软件的版本控制方案。申请人应建立生物信息学分析标准操作流程及质量控制方案，保证测序数据的分析、解读及报告的准确性与严谨性。生物信息学分析流程应描述清晰，包括每一步骤使用软件的名称、版本、参数设置要求，包括但不限以下指标：说明检查每个位点的碱基质量值和每个读段的平均质量值，碱基的频率分布，读长分布及是否存在重复序列和人工序
—11 —
列的评价方法，以保证按照该流程生物信息学分析结果可复现。生物信息学分析应至少报告具有明确临床指导意义的结果。
生物信息学分析一般包括但不限于数据预处理、数据比对及质控、变异识别和变异注释。根据测序类型和检测报告的变异类型选择生物信息流程，并考虑变异识别和评估流程过程中的限制因素以及第三方生物信息学工具对整个生物信息流程的影响。
1.4.1数据预处理：申请人应说明分析流程使用的软件类型及数据预处理步骤。数据文件（如FASTQ格式文件）应包含质控参数，如每个位点碱基质量值的控制参数、GC含量以及序列长度分布等。明确测序碱基质量值（Base Call Quality，如质量值Q值得分）的阈值。明确判定实验有效的符合碱基质量值的最低百分比。如采用其他方法，应提供研究资料及选择依据。
1.4.2数据比对及质控：申请人应提供BAM （Sequence Alignment/Map）文件生成过程软件类型，每个样本数据参数标准以及判定实验有效的最低接受标准。提供参考序列的选择依据，如为特殊序列，应提供采用该序列的依据。
1.4.3突变分析：根据申报产品可检测的基因类型，申请人应确认软件工具类型及选择依据。明确不同基因类型质控标准以及判定实验有效的最低接受标准。
1.4.4突变注释：申请人应提供每个突变预测的功能性作用以及临床解释注释的形成过程及数据来源依据。
1.5软件研究（如适用）
根据申报产品预期用途，可能存在一些软件产品不包含在申—12 —
报产品组成成分中，但生物信息分析过程中需要用到该软件，则该软件被视为检测系统一部分，申请人应提供该部分软件相关适用性研究资料。
1.6 NGS数据的存储、传输与共享（如适用）
用于储存原始和经过分析后的检测结果。建议申请人提交数据存储中心的安全性、稳定性、维护与升级方案以及异常情况处置方案等资料。
1.7公共/内部数据库应用（如适用）
如申报产品的测序结果需要借助公共/内部数据库进行结果注释或报告解读，申请人需提供所使用的公共/内部数据库在产品检测中起到的作用说明，公共/内部数据库类型、功能介绍、版本号、标准操作流程及质量控制方案等。
2.主要性能指标
分析性能验证包括通过一组预定义性能评价方式，以证明性能是否足以满足其预期用途并符合预定义的性能标准。通常涉及是否符合统计学评价要求，或检测是否存在与患者的疾病相关的变异等。
2.1分析性能用样本设置要求
申请人应提供用于评估各项性能研究的标本数量和类型设定的依据。根据产品预期用途，样本研究应包括代表性变异和变异类型。研究应考虑与检测适应症相关的临床意义区域，跨不同基因区域的变异、难以测序或难以比对的基因区域，人工混合嵌合体以及任何其他变异类型、检测区域。例如：如果检测旨在用
—13 —
于检测和报告插入、缺失位点等，应包括但不限于不同大小的基因片段、突变所在区域等。
应在研究中使用含有与检测适应症相关的临床样本，临床样本应具有适当的代表性，确保可覆盖申报产品声称的临床相关序列变异等。
2.2准确性
2.2.1总体要求
准确性包括对比检测值与被检测值之间一致性。对于基于NGS测序原理的检测，通过与适当的对比方法比较，如核酸测序或其他经过验证的方法，评估申报产品准确性能。根据检测的性能指标，准确性研究应包括代表性变异和变异类型验证（准确性研究样本要求详见2.1分析性能用样本设置要求）。
对于每种变异类型以及代表性临床相关变异，应考虑变异频率。对于变异类型，为了确定检测的变异类型以及检测它们的测序区域（不管变异是否具有致病性），可以使用具有代表性的参考物质或具有高置信度的样本进行研究。对于临床相关的变异，准确性计算包含使用基于临床样本的研究数据与临床样本相关的指标。
准确性研究中应含有代表性临床相关变异与检测适应症的临床样本，以确保临床相关序列变异被检测和报告。准确性评估如采用前瞻性临床样本时，收集和处理的方式应与产品预期用途一致。如果前瞻性的临床样本不可用，则可以使用临床相关区域中含有特定变异的冻存临床样本或人类细胞系样本替代或补充—14 —
研究。
根据待评价方法和对比方法对所有变异的检测结果分别计算阳性符合率（Positive Percent Agreement，PPA）、阴性符合率（Negative Percent Agreement，NPA）、阳性预测值（Positive Predictive Value，PPV）。通过检测评估的每种类型的变异，如单核苷酸多态性（Single Nucleotide Variant，SNV）、插入、结构变异，和测序区域范围（如高度同源、高度多态或其他困难的区域），分别计算PPA、NPA等。
表1 准确性评估方法
表1注：PPA通过将A（真阳性结果数）除以（A+C）、NPA通过将D（真阴性结果数）除以（B+D）。这些计算不应包含任何无应答或无效应答，无应答或无效应答结果应被单独列出（见表2）。根据适用情况计算每种变体类型以及临床相关变异PPA、NPA等。
表2 准确性评估方法
—15 —
表2注：准确性研究中无应答或无效应答的百分比应该被估计为（E + F）/ N以及95％的双侧置信区间。此外，应评价阳性结果中的无应答或无效应答E /（A + C + E）和阴性结果中的无应答或无效应答F /（B + D + F）。申请人应设定无应答或无效应答的最小可接受标准并提供依据。样本总数（N = A + B + C + D + E + F）。申请人应对无应答或无效应答产生原因进行分析，注意区分无应答或无效结果与模棱两可结果，如质控正常但结果无法识别的情况等。
2.2.2参考品准确性
各水平、各突变位点的阳性参考品均应按要求检出阳性，考虑到浓度梯度或突变梯度的不同，应对各水平阳性参考品设置相应检出要求；阴性参考品在各个引物探针组合的检测条件下均应检出为阴性。
2.3检测限
明确可接受的最低检测限（Limit of Detection，LoD），并明确无效应答或无应答检测结果的可接受标准。为预期用途中包含的每种变异类型建立LoD。如果检测人工混合的样本（如嵌合样本），需要考虑不同的等位基因比率，确定检测限。
试剂LoD的研究中应在常规临床实验室条件和确定的样本类型下进行。通常，LoD值采用分析物最低浓度计算得出，在此浓度下，可从相应检测重复中获得至少95%的阳性检出和可接受水平的无应答或无效应答。当不同的变异类型可能具有不同的LoD时，需要计算不同的序列被测区域范围中的每个变异类型的LoD。NGS检测方法可以同时检测多种类型突变基因，因此灵敏—16 —
度的设置应根据不同突变基因类型及判读方式进行验证。
2.4空白限（检测基线）
应确认不会对报告区域的质量分数或覆盖率产生负面影响。应包含具有代表性的基因区域、变异类型和序列背景进行验证研究。设置空白检测限检测标准，设定评价方案及方法。
2.5分析特异性
分析特异性是评估产品仅可检测到预期待测变异的能力。根据预期用途和产品设计，一些潜在的内源性或外源性物质干扰和交叉反应或交叉污染可能会对产品检测性能产生影响。
交叉反应（如同源区域、假基因和其他类型的交叉反应序列）可能导致错误检测，从而产生假阳性结果。患者标本的交叉污染可能将其他不正常的序列引入到检测中，从而导致假阳性或假阴性结果。因此，应选择产品预期用途所覆盖样本或样本类型以及DNA提取方法中相关的干扰物质开展研究。同时，应对已知交叉反应的等位基因和同源区域进行评估。
2.6精密度
精密度研究主要是指使用相同的样本（包括检测临界值附近的样本）在各种特定条件下进行检测（如不同操作员，不同操作条件，不同检测天数，不同仪器等），并考虑检测中主要的变异来源。申请人应评估变异和野生型基因的精密度，其中应分别报告不同检测区域和变异类型的检测值。申请人应使用客观证据和有效的统计方法来验证这些指标设定标准。
对可能导致检测结果多样性的主要因素进行评价，包括但不
—17 —
限于检测多个样本、不同检测批间、不同适用机型、试剂批次、检测天数和操作员。
此外，申请人应考虑外部因素相同的情况下，应进行申报试剂在相同或相似被测物的重复性检测以评价检测结果。申请人需对每个检测条件和检测区域下每个变异类型精密度分别进行报告，还应报告无应答或无效应答的百分比。
2.7体细胞与胚系突变鉴别研究（如适用）
申请人需提交资料明确申报产品如何有效鉴别胚系突变，申请人无论使用何种方法，都应遵循保证准确检测的原则。如：对肿瘤样本进行检测的同时对该患者正常配对样本（正常癌旁组织或外周血白细胞）进行检测，根据配对样本与癌组织样本中鉴定出的突变信息进行鉴别筛选，应确认样本中特有的基因多态性，并明确混合后的每个多态性位点的预期频率。当无配对样本时，申请人需提供如何有效区分体细胞突变和胚系突变鉴定标准并提供相关研究资料。
2.8批次互通性（如适用）
NGS的检测通常包括试剂，消耗品，仪器和软件。各部分相对独立，申请人需对各批次之间是否互通进行研究。
2.9生物分析流程的性能补充研究（如适用）
当临床样本、细胞系或生物合成材料不可用或无法完全覆盖生物分析流程时，可以使用含有各种要求类型的已知序列变异（如：SNV、插入、缺失、结构变异等）的计算机构建的序列标本。申请人可采用软件编辑满足验证需要的模拟样本或数学模—18 —
型，对生物分析流程进行补充验证。这些数据文件应使用与申报产品相同的预分析和分析方法来生成。需要注意，编辑样本不能替代生物学样本，只能作为生物学样本不能满足所有验证条件下的补充情形。
2.10其他
评估检测局限性时，申请人应采用特殊样本，如大于特定大小的插入或缺失或重排，并确定检测无法以预期的准确度和精确度检测到的序列变化类型。如果这些区域是申报产品检测预期用途的一部分，则需要验证高度同源、高度多态或其他困难区域的变异的检测性能。如果被检测的基因区域的一部分难以测序并且不能达到性能阈值，则应该将其报告为检测局限性。如适用，申请人应记录申报产品不会报告的检测类型。
在设计和验证过程中，申请人应记录所有检测失败情况并分析原因。例如，由于未能满足其一个或多个检测运行质量指标等。不符合质量标准的检测区域不应报告变异结果。由于未能达到检测运行质量标准而未被检测到的区域，则应如实报告。
申报产品上市后，通过上市后临床数据收集和分析或药品说明书中明确具有伴随诊断用途的基因，在不改变原有反应体系和检测方式等情况，申请人可通过收集本产品临床有效性资料申请变更其临床用途。
三、名称解释
通量测序（High-throughput sequencing）：又称下一代测序技术（Next-generation sequencing），可以一次性对数百万条核
—19 —
酸分子进行大规模平行测序。
全基因组测序：对某种生物基因组中的全部碱基进行测序，即把细胞内完整的基因组序列从第一个DNA分子开始直到最后一个DNA分子完整检出，并按顺序排列。
从头测序（de novo sequencing）：即不依赖于任何已知的基因组参考序列和其他序列信息，而直接对某个物种的全基因组DNA进行测序，然后利用生物信息学工具对下机序列进行拼接和组装，从而获得该基因组的全序列或连续的大片段。
永生化正常人白细胞：将正常人的白细胞进行体外培养，并通过基因转染等技术将外源性永生化基因，如病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等，导入目的细胞内以增加永生化的发生率，从而得到的永生化细胞株。
变异丰度：变异基因型在所有基因型中所占的比例，计算方式为变异基因型数量除以野生型和变异型基因总量。
变异频率：变异基因型在总人群中的基因频率。
原始reads数：经过高通量测序后，测序下机数据总reads 数。
有效测序深度（如经过去重处理等）：去除PCR重复等后的平均深度。
符合最低测序深度和平均测序深度要求的区域（%）：最低测序深度和平均测序深度均大于阈值的区域数与区域总数的比值。
GC含量（GC content）：在测序所得的所有碱基中G（鸟—20 —
基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。
人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书 【产品名称】 通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法） 英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和 RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。 【检验原理】 本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras基因12，13密码子是否存在突变。用一对K-ras基因特异引物，该引物可
一、名词解释 1、广义分子生物学：在分子水平上研究生命本质的科学，其研究对象是生物大分子的结构和功能。2 2、狭义分子生物学：即核酸（基因）的分子生物学，研究基因的结构和功能、复制、转录、翻译、表达调控、重组、修复等过程，以及其中涉及到与过程相关的蛋白质和酶的结构与功能 3、基因：遗传信息的基本单位。编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列(对以RNA作为遗传信息载体的RNA病毒而言则是RNA序列)。 4、基因：基因是含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，包含产生一条多肽链或功能RNA 所必需的全部核苷酸序列。 5、功能基因组学：是依附于对DNA序列的了解，应用基因组学的知识和工具去了解影响发育和整个生物体的特定序列表达谱。 6、蛋白质组学：是以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学。 7、生物信息学：对DNA和蛋白质序列资料中各种类型信息进行识别、存储、分析、模拟和转输 8、蛋白质组：指的是由一个基因组表达的全部蛋白质 9、功能蛋白质组学：是指研究在特定时间、特定环境和实验条件下细胞内表达的全部蛋白质。 10、单细胞蛋白：也叫微生物蛋白，它是用许多工农业废料及石油废料人工培养的微生物菌体。因而，单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。 11、基因组：指生物体或细胞一套完整单倍体的遗传物质总和。 12、C值：指生物单倍体基因组的全部DNA的含量，单位以pg或Mb表示。 13、C值矛盾：C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象。 14、重叠基因：共有同一段DNA序列的两个或多个基因。 15、基因重叠：同一段核酸序列参与了不同基因编码的现象。 16、单拷贝序列：单拷贝顺序在单倍体基因组中只出现一次，因而复性速度很慢。单拷贝顺序中储存了巨大的遗传信息，编码各种不同功能的蛋白质。 17、低度重复序列：低度重复序列是指在基因组中含有2～10个拷贝的序列 18、中度重复序列：中度重复序列大致指在真核基因组中重复数十至数万（<105）次的重复顺序。其复性速度快于单拷贝顺序，但慢于高度重复顺序。 19、高度重复序列：基因组中有数千个到几百万个拷贝的DNA序列。这些重复序列的长度为6~200碱基对。 20、基因家族：真核生物基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因，可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生。 21、基因簇：基因家族的各成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位，定位于染色体的特殊区域。 22、超基因家族：由基因家族和单基因组成的大基因家族，各成员序列同源性低，但编码的产物功能相似。如免疫球蛋白家族。 23、假基因：一种类似于基因序列，其核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同、但却不能合成功能蛋白的失活基因。 24、复制：是指以原来DNA（母链）为模板合成新DNA（子链）的过程。或生物体以DNA/RNA
第十章基因突变 一、教学目的与要求： （1）了解基因突变的类型和性质、特征 （2）掌握基因突变分子机理和诱变因素的作用方式 （3）理解基因突变的检测方法 (4) 掌握基因突变的修复途径 二、教学重点、难点、疑点： 1.突变的概念、类型和性质 2.诱发突变的分子基础 3.诱发突变与人类癌症 4.生物体基因突变的修复机制 5.果蝇基因突变的检出 6.植物基因突变的检出 7.人类基因突变的检出 [解决方法] （1）通过出示基因结构变化的示意图，加深学生对基因突变内涵的理解。 （2）课堂教学中不断提出问题，让学生通过概念的运用达到巩固概念和知识迁移的目的。 2．教学难点及解决办法 基因突变的原因。 [解决办法] 对人类镰刀型细胞贫血症病因结合图解进行分析，使学生真正明白基因突变的原因——DNA复制过程也可能发生差错，基因中个别碱基的变化，就会造成性状改变。 3．教学疑点及解决办法 为什么说基因突变是变异的主要来源？ [解决办法]讲明基因突变与基因重组的区别，联系实际举例。 三、教学方法设计： 四、教具或教学手段：多媒体课件 五、教学过程与板书设计：
第一节基因突变的概念和特征 一、基因突变的概念及类别 1、基因突变：指在染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变基因突变：指染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变 2、类别 隐性突变：A a 显性突变：a A 自发突变—外界环境条件的自然作用或生物体内的生理生化变化而产生的突变 诱发突变—在专门诱变因素影响引起的突变，为“诱发突变” 形态突变型—可见突变：指造成外形改变的突变型 至死突变型—能造成个体死亡或生命力明显下降的突变型 条件突变型—在一定条件下有致死效应 3.一般特征 ①突变的频率：指生物体在每一世代中发生突变的机率，或者在一定时 间内突变可能发生的次数。 高等植物 10-5— 10-8 细菌和噬菌体 10-4—10-10范围大、突变频率比动植物高 例如：氨基酸过程中三种疾病是由三种基因突变导致酶发生变化引起的，有一定的突变频率 苯丙氨酸羟化酶缺乏导致苯丙酮尿症；尿黑尿酸氧化酶缺乏会产生尿黑酸尿症；酪氨酸酶缺乏导致白化病 苯丙氨酸羟化酶 苯丙酮酸苯丙氨酸酪氨酸 积累尿黑尿酸氧化酶 酪氨酸酶 苯丙酮尿症尿黑酸黑色素
此文档下载后即可编辑 基因突变的检测方法 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且 由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化 程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据 检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象， 一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp 的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过
B-raf基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法) 标准化操作流程 1、预期用途 该产品用于定性检测确诊的结直肠癌患者石蜡包埋病理组织切片DNA的B-rafV600E 基因突变。B-raf 基因是一种癌基因，编码一种丝/ 苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。B-raf 基因位于7p34，长约190kb，转录mRNA 长2.5kb，编码783 氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000-95000 Da。 研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf 突变，B-raf 突变主要发生在Exon15 上的激活区的第1799 氨基酸上(T 突变为A)，导致编码的氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸(V600E)，该突变能使B-raf 激酶活性提高，V600E 突变能模拟T598 和S601 两个位点磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活。近来研究表明，对于野生型Kras、但存在B-raf 基因V600E 突变患者，抗EGFR 单抗治疗无效。2010 年版《NCCN 结直肠癌临床实践指南》中已明确指出“如K-ras 基因无突变时，需检测B-raf 基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR 单抗治疗。” 2、仪器配置要求 移液器，振荡器，微型离心机，生物安全柜，高速冷冻离心机，定性PCR仪，荧光定量PCR仪（ABI7500，LightCycler? 480，MX3000P，CFX-96等），微量紫外分光光度计，基因分析仪（ABI3130，ABI3500DX）。 3、耗材要求 无菌带滤芯吸头、吸水纸，离心管（1.5ml，0.5ml，0.2ml）、PCR反应管（配套荧光定量PCR仪型号）及无粉一次性乳胶手套，基因分析板。 4、责任人 基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。 5、执行人 操作人员应经过专业培训，具有合格的操作技能的检验专业技术人员。 6、检测原理 本产品选取人类基因组B-raf 基因Exon 15 上设计特异性引物和探针，对扩增后的PCR 产物片段进行测序分析。使用尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR 扩增产物的污染。 7、试剂来源 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 8、样本要求 8.1用量：每例标本切5张(10μm)白片，连续切片，不漂洗脱蜡，直接封存于1.5ml EP管中； 8.2质量：为确保DNA提取成功率，必须选择2年以内的石蜡标本； 8.3标本收集方法：石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为了保证切片组织中
1病原生物基因组在医学上有何应用？详见书P3 a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查 2什么是原癌基因，原癌基因有什么特性，原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的激活机制有哪些？ 原癌基因是指人类或其他动物细胞（以及致癌病毒）固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的 基因总称。 特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。 功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白，核调节蛋白，细胞周期调节蛋白，抑制凋亡蛋白 激活机制：插入激活，基因重排，基因点突变，基因扩增，基因转录改变 3试述Down综合征（21三体综合征）的主要临床特征及核型。 临床特征：生长发育障碍，智力低。呆滞面容，又称伸舌样痴呆。40%患者有先天性心脏畸形。肌张力低，50%患者有贯通手，男患者无生育能力，女患者少数有生育能力，遗传风险高。 核型：92.5%患者游离型：核型为47，XX（XY）,+21 2.5%患者为嵌合型：46, XX（XY）/47 ，XX（XY）,+21 5%患者为易位型：46，XX（XY）,-14 ，+t（14q21q） 4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法的优势1直接涂片染镜检：敏感度和特异性差，不能用于确诊。 2分离培养法：诊断NG感染的金标准，但是其对标本和培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。 3免疫学法：分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制，推广受限。 分子生物学的优点：敏感，特异，可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌，适应于快速检测 5、在单基因遗传病的分子生物学检验中，点突变检测常用方法有哪些？ 1异源双链分析法（HA）2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法 6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术 6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法 白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNA）的检测、基因分型和耐药基因分析 等。 1PCR技术：选择高度特异性的天冬氨酸蛋白酶基因设计引物 PCR—斑点杂交技术：正向杂交和反向杂交，后者可一次检测多种真菌 DNA指纹技术：RFLPRAPD电泳核型分析 AP —PCR技术：定义方法简便，快速，特别适合临床应用 DNA序列分析：可测定rDNA序列也适用于基因突变引起的耐药 基因芯片技术：适用于病原体的耐药研究 7、 F VIII基因倒位导致血友病A，DMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良，珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。 （第11章，P197，P203，P207。窝觉得大家把题目读三遍就可以了） 答：F VIII基因倒位是导致的血友病A的主要原因（占50%）其它基因突变，如点突变，缺失，插入也会导致血友病A。 同理DMD基因外显子缺失是迪谢内肌营养不良（杜氏肌营养不良）发生的主要原因（60%-70%）。 珠蛋白合成障碍性贫血有六种，主要的两种是a珠蛋白生成障碍性贫血和B珠蛋白生成障碍性贫血，基因突变是主要发病原因。&基因多态性有哪些的临床应用？（P4）
从临床进入基因检测流程是入口，检测结果结合临床信息进行合理解读是出口，这一入一出之间需经历检测前临床咨询部分、实验室部分、信息分析部分、临床解读部分共四个环节。其中的第四部分临床解读部分即是根据检测结果、患者信息、医生共识综合判断，临床和遗传咨询有效衔接、充分沟通，最终出具临床解读报告。 在做成临床解读报告之前，首先需要将解读的各个环节进行明确，包括解读的步骤流程，解读的技术细节。这样才有可能真正的做到解读的规范化，使解读过程有据可依，有章可循，才能出具一份好的临床解读报告，基因检测才能更好的服务患者和临床医生。从大的框架讲，基因检测数据解读可分为三个步骤：原始数据→分析数据、基于数据库的解读→与患者个体表征/临床病例结合的解读。1、读懂原始数据 将测序的原始序列数据（FASTQ）去除接头及低质量序列，经BWA软件比对至GRCh37/38（NCBI版本）或hg19/hg38（UCSC版本）人类基因组参考序列上，Picard 去除重复序列，使用GATK检测SNV与Indel变异，使用ANNOVAR进行变异注释。最后获得一份.vcf文件（图1）。
Func.refGene：变异所处参考基因的功能区（exonic，intronic，UTR3，UTR5，splicing，upstream，downstream，intergenic）（此处的exonic特指外显子编码氨基酸区，不包括外显子的UTR区） Gene.refGene：变异所处参考基因名称（如果是基因间，则是两侧的基因）GeneDetail.refGene：非外显子区处于特定转录本中的具体位置（如果是基因间，则是距离两侧的基因的距离） ExonicFunc.refGene：外显子区的变异类型（frameshift insertion，frameshiftdeletion，stopgain，stoploss，nonframeshift insertion，nonframeshiftdeletion，synonymous SNV，nonsynonymous SNV），如果这一栏是一个“.”的话，就说明该变异不在外显子区 AAChange.refGene：氨基酸水平的改变（同一个基因可能具有多个转录本，氨基酸改变的位置在不同的转录本中有可能不一样） 经注释后的vcf文件还会包含如下信息： CLINSIG：该变异在ClinVar数据库中的临床意义（Benign，Likely benign，Uncertain significance，Likelypathogenic，Pathogenic，Drug-response）CLINDBN：该变异所引起的疾病名称 CLINACC：该变异的登记号和版本号（VariantAccession and Versions）
基因突变的鉴定 (2010-07-05 17:37:50) 转载▼ 标签： 杂谈 一．植物形态突变的鉴定 经人工诱发或自然发生的变异是否属于真实的基因突变，是显性突变还是隐性突变，突变频率的高低等，都应进行鉴定。 1．真实遗传变异的鉴定 变异有可遗传的变异，有不可遗传的变异。基因本身发生化学性质的变化而引起的变异是可以遗传的，因环境条件而导致的表现型变异是不遗传的。所以，在诱变处理材料的后代中一旦发现与原始亲本不同的变异体，首先要鉴定它是否真实遗传。例如，在农作物诱变育种过程中，某种高杆植物经理化因素处理后，在其后代中发现个别矮杆植株，这种变异究竟是基因突变引起的呢？还是由环境条件引起的呢？二者如何鉴别呢？ 把变异体与原来的亲本种植在土壤条件和栽培条件均匀一致的环境下，若变异体与原始亲本的表现大体相似，即原来的变异消失了，说明它不是遗传的变异；反之，若变异体与原始亲本不同，仍然表现为矮杆，说明它是基因突变的结果。 2．如何鉴别显性突变和隐性突变 利用杂交试验的方法，可以区分显性突变还是隐性突变。以上例而言，让矮杆突变体植株与原始亲本杂交，若F1表现高杆，F2中既有高杆，也有矮杆植株，说明矮杆突变是隐性突变。若是显性突变情况又如何呢？F1表现为矮杆，F2中矮杆：高杆为3：1。 3．利用花粉直感现象估算配子的突变率 为了测定玉米子粒非甜籽变为甜粒（Su→su）的基因突变频率，以甜粒玉米纯合体作母本，用经诱变处理过的非甜粒纯合体的花粉授粉。 susu×SuSu 在正常情况下，非甜（Su）对甜(su)为显性，授粉后的果穗应该完全是非甜粒种子，假如在果穗上发现甜粒种子，就可以认为是Su花粉经诱发处理以后发生了Su→su突变，并可计算出突变频率。
人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书 【产品名称】 通用名：人类B-raf基因V600E突变检测试剂盒（荧光PCR法） 英文名：Diagnostic kit for V600E Mutation of Human B-raf Gene(Fluorescence PCR Analysis) 【包装规格】 20测试/盒 【预期用途】 B-raf基因位于7号染色体长臂上，是一种癌基因，属RAF基因家族，有18个外显子，编码一种含783个氨基酸的B-raf蛋白，是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。 针对EGFR的肿瘤靶向药物通过抑制该途径发生药理作用。研究表明在非小细胞肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在B-raf基因突变，其中第15外显子上V600E点突变最常见，约占所有突变的90%以上，该突变导致B-raf蛋白被异常激活，从而使患者接受EGFR-TKI药物和EGFR单抗类药物治疗失效。据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》建议，对K-raf基因检测正常的非小细胞肺癌和结直肠癌患者，应进一步检查B-raf基因的突变状态，以指导靶向药物治疗方案。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于肿瘤组织B-raf 基因V600E点突变的定性检测，为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供依据。本公司尚无临床实例证实B-raf 基因突变与靶向药物的相关性，其相关性主要来自文献报道，因此本试剂盒检测结果仅用于辅助临床医生对肿瘤患者制定用药方案。 【检验原理】 本试剂盒基于实时荧光PCR平台，结合等位基因特异性扩增（ARMS）技术、野生型基因扩增抑制技术和多重PCR技术检测B-raf基因V600E突变。ARMS技术是指PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增，通过设计特异性ARMS引物，对存在V600E突变的B-raf基因靶序列进行PCR扩增放大，并利用FAM基团标记的Taqman 探针对扩增产物进行检测。因为采用了野生型基因扩增抑制剂，使ARMS体系能够耐受更高浓度的背景野生型B-raf基因，降低了试剂盒对基因组样本的DNA浓度要求，提高了检测灵敏度。 为质控扩增体系的有效性，试剂盒设置了内质控和外质控，内质控基因是人类基因组的一个保守片段，长
名词解释 1. 基因（gene）： 2. 结构基因（structural gene）： 3. 断裂基因（split gene）： 4. 外显子（exon）: 5. 内含子（intron）: 6. 多顺反子RNA（polycistronic/multicistronic RNA）: 7. 单顺反子RNA（monocistronic RNA）: 8. 核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA, hnRNA）: 9. 开放阅读框（open reading frame, ORF）: 10. 密码子（codon）: 11. 反密码子（anticodon）: 12. 顺式作用元件（cis-acting element）: 13. 启动子（promoter）: 14. 增强子（enhancer）: 15. 核酶（ribozyme） 16. 核内小分子RNA（small nuclear RNA, snRNA） 17. 信号识别颗粒（signal recognition particle, SRP） 18. 上游启动子元件（upstream promoter element） 19. 同义突变（same sense mutation） 20. 错义突变（missense mutation） 21. 无义突变（nonsense mutation） 22. 移码突变（frame-shifting mutation） 23. 转换（transition） 24. 颠换（transversion） （三）简答题 1. 顺式作用元件如何发挥转录调控作用？ 2. 比较原核细胞和真核细胞mRNA的异同。 3. 说明tRNA分子的结构特点及其与功能的关系。 4. 如何认识和利用核酶？ 5. 若某一基因的外显子发生一处颠换，对该基因表达产物的结构和功能有什么影响？ 6. 举例说明基因突变如何导致疾病。 （四）论述题 1. 真核生物基因中的非编码序列有何意义？ 2. 比较一般的真核生物基因与其转录初级产物、转录成熟产物的异同之处。 3. 真核生物的基因发生突变可能产生哪些效应？ （二）名词解释 1.基因组（genome） 2. 质粒（plasmid） 3.内含子（intron） 4.外显子（exon） 5.断裂基因（split gene） 6.假基因（pseudogene） 7.单顺反子RNA（monocistronic RNA）
人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书 【产品名称】 通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒 英文名称：Shuwen? Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR 【包装规格】 7测试/盒 【预期用途】 EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase，TK）活性，是原癌基因c-erbB-1（HER-1）的表达产物。EGFR 的主要信号转导途径有：PI3K-PDK 通路，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路，PLC-γ 通路，JAK-STAT 通路。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR异常调节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子-受体自分泌环的活化以及特定的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是EGFR的基因突变和过度表达。 EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%，其中以两种delE746-A750(2235_2249del15和 2236_2250del15)最为常见，占到外显子19缺失总数的75%；外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点突变（G719X）约占5%；外显子20的突变占1%左右。另外研究发现外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。 本试剂盒以肿瘤DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。本试剂盒仅为临床医生肿瘤靶向治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床诊断的唯一依据。 【检测原理】 本试剂盒结合特异性引物和TaqMan探针技术，用实时荧光PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基因。利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过TaqMan探针对扩增产物进行检测，使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。 【主要组成成分】 本试剂盒具体包含组分如表1 表1
肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂 技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是针对肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、范围 本指导原则所述肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂是指利用基于聚合酶链式反应（PCR）方法的核酸检测技术，以肿瘤个体化治疗相关的突变基因为检测目标，对人体样本（包括组织、体液等）提取的核酸组分中的目标序列进行体外检测的试剂。 本指导原则所指基因突变的类型包括置换、插入、缺失、基因重排、
拷贝数异常及核糖核酸（RNA）表达异常等广义的基因突变。 本指导原则的技术要求是基于荧光探针PCR方法确立的，对于高分辨熔解曲线PCR方法、Luminex平台或核酸检测芯片等其他基于PCR的分子生物学检测技术，可能部分要求不完全适用或本指导原则所述技术指标不够全面，申请人可以根据实际产品特性选择适合的方法或补充需要的评价和验证，但需阐述不适用的理由，并验证其科学合理性，同时确认性能评价的充分性。本指导原则所涉及试剂的方法学不包括荧光原位杂交（Fluorescence in situ Hybridization，FISH）、核酸序列测定、染色体核型分析及免疫组化技术等用于肿瘤个体化治疗指导的其他方法学。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。 二、注册申报资料要求 （一）综述资料 综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及不同基因突变类型检出能力等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。若尚无同品种批准上市，则应详细论述作为检测靶标的突变基因与个体化治疗方案的相关性，说明理论依据。 提交的资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法（试行）》（国食药监械〔2007〕229号）（以下简称《办法》）和《体外诊断试剂注册申报资料基本要求》（国食药监械〔2007〕609号）的相关要求。 （二）产品说明书 说明书承载了产品预期用途、标本采集及处理、实验方法、检测结果解释以及注意事项等重要信息，是指导实验室工作人员正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，因此，产品说明书
KRAS基因突变的检测及其临床意义 RAS基因家族由KRAS、HRAS 和NRAS组成，基因家族各成员间同源性可达85%。RAS 基因编码p21蛋白，分子量为21KD，位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参于传导细胞增殖信号的调控系统。其激活状态为GTP结合状态，失活状态为GDP结合状态，其转变为活性致癌基因的主要部位是第12、13 和61 密码子的突变，其中以第12 密码子点突变最常见。 RAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因，该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15%-30%，在结直肠癌患者中为20%-50%。作为EGFR信号通路下游最重要的的效应因子，KRAS在肿瘤信号转导中发挥重要作用。对KRAS基因突变的检测，可以为肿瘤患者的个体化治疗提供更确切的依据。 西妥昔单抗和帕尼单抗都是特异性针对人类EGFR胞外区的单克隆抗体。美国FDA批准该药单药用于治疗难治性结肠癌，及在放疗基础上治疗进展性头颈部癌。已知EGFR信号途径下游的基因突变则会使患者对西妥昔单抗和帕尼单抗治疗产生耐药性。2009年7月15日，美国FDA批准了对帕尼单抗和西妥昔单抗的说明书的修改，在西妥昔单抗和帕尼单抗说明书的“适应证和用法”部分明确指出，KRAS基因第12或13密码子突变的患者接受治疗无生存获益；不推荐这两种表皮生长因子受体（EGFR）抗体用于KRAS基因突变的转移性结直肠癌（mCRC）患者治疗。根据这一提示，临床医生可以将KRAS基因突变的患者排除在接受抗EGFR单抗治疗之外，重新安排其接受其他药物替代治疗，避免对不能获益的患者进行不必要的治疗。 此外，研究表明，K-ras基因突变状态与非小细胞肺癌对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关，直肠癌患者中K-ras的突变对西妥昔单抗等药物的耐药性有关。美国国家癌症综合网络(NCCN) 2011年版临床治疗指南指出：K-ras基因突变是EGFR酪氨酸激酶抑制剂疗效的预测指标，肿瘤患者在接受EGFR靶向药物治疗前必须进行K-ras基因突变检测，以帮助决定患者是否接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂类药物（易瑞沙/特罗凯/埃克替尼等）治疗。携带K-ras永久激活性突变的患者本检验所不建议使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂类药物（易瑞沙/特罗凯/埃克替尼等），建议使用靶向的Ras抑制剂药物治疗。 作为RAS/FTI（法尼基转移酶抑制剂）的安卓健通过抑制Ras 的活性，进而影响其下游讯息传递因子，包括抑制PI3K 的表现量与降低Akt 的磷酸化程度；以及活化AMPK促使TSC1/TSC2 结合更紧密，进而大大的降低mTORC1 的活性，开启癌细胞的自噬作用机制；安卓健同时会活化MEK1/ ERK1/2 的路径，促进癌细胞的自噬作用机制；另外，安卓健会使线粒体不稳定，降低Bcl-2、Bcl-XL 与MCl-1 的蛋白质量，使癌细胞程序性凋亡。由于安卓健能同时诱导癌细胞启动自噬作用与程序性凋亡的机制，而实验室的细胞毒性测试亦指出安卓健对多数的癌细胞（脑癌、淋巴癌、血癌、肺腺癌、乳癌、肝癌、胰脏癌、胃癌、直肠癌、前列腺癌与膀胱癌等) 都有药用效果。 上海佳辰投资发展有限公司联合上海张江转化医学研发中心研发K-ras基因突变检测，详细如下： 检测内容：K-ras基因突变 检测方法：ARMS法 主要材料：ABI荧光定量试剂盒 主要设备：ABI 7500荧光定量PCR仪 检测项目和样本类型：
干细胞的突变与肿瘤 干细胞是一类具有自我更新和增殖分化能力的细胞，肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体，能够驱使肿瘤的形成。不同的是，干细胞的增殖具有相对稳定性，其数目保持相对恒定，而肿瘤细胞虽可以无限增殖，但却失去了自稳定性的特点。其机制可能是由于干细胞基因突变及突变累积、非整倍体扩增、不对称分裂、端粒酶作用以及信号转导途径和微环境异常导致干细胞增殖分化机制失调1。 早期的研究表明，单一细胞获得4~7次基因突变将发生恶性转化2。组织更新快的上皮组织、造血系统是肿瘤高发部位，组织自我更新越快，复制、转录过程中基因发生突变的概率越高。由于干细胞具有无限增生能力，在体内可长期存在，这使基因突变更容易在干细胞中发生和积累。已有报道指出某些结肠癌和白血病产生于积累了多次突变的干细胞3, 4。结直肠上皮所有的细胞来源于隐窝底部4~6个干细胞，干细胞不断向表面增生，干细胞增生形成分化细胞的数量和分化细胞死亡或脱落的数量维持平衡。用放射线诱导突变人类肠隐窝细胞发生表型变化大约需1年时间，分化细胞仅有2天的寿命，而1年正好是单一突变的干细胞增生形成肿瘤的时间。越来越多的证据表明，肿瘤产生于积累了多次突变的组织特异性干细胞或骨髓衍生的间充质干细胞（MSC）的恶性转化5-7。如果人体内存在积累了多次突变或恶性转化的干细胞8，它们是可能通过遗传传递给后代的,这也许是存在高癌发病家族的一种可能的原因和解释9。 最近，Nat Cell Biol发表的1篇文章阐述了老化过程中积累的基因组损伤对干细胞功能的影响10。干细胞和体细胞中年龄依赖的DNA损伤积累可能是老化的干细胞功能障碍的原因。干细胞具有长期的自我更新能力，然而这种能力同
人类Kras基因突变检测试剂盒说明书
人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）说明书【产品名称】 通用名：人类K-ras基因突变检测试剂盒（PCR-熔解曲线法） 英文名：Diagnostic kit for Mutations of Human K- ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis) 【包装规格】20测试/盒 【预期用途】 K-ras基因位于12号染色体短臂上，是重要的癌基因之一，编码一种21kD 的kras蛋白，参与细胞内的信号传递，主要包括PI3K/PTEN/AKT 和RAF/MEK/ERK信号转导途径，这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点，靶向药物经过抑制这些途径发生药理作用。K-ras基因第12和13密码子发生突变，将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态，使药物失效。。据中国《肿瘤学临床实践指南》，在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中，所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。K-ras突变者无一例缓解（0/18），而无K-ras突变者则有20例缓解（20/62，32%），差别有统计学意义（P <0.01）。因此，指南建议，非小细胞肺癌和结直肠癌患者
使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。 本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本，用于检测肿瘤组织K-ras基因第12，13密码子的12种体细胞突变（表1），提供突变状态的定性结果。为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据，本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。 【检验原理】 本试剂盒基于实时PCR平台，结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术，定性检测DNA样品中K-ras基因12，13密码子是否存在突变。用一对K-ras基因特异引物，该引物可扩增12种突变型和野生型的K-ras目标序列，利用标记了FAM荧光基团和淬灭基团的双标记探针一方面抑制野生型基因的扩增，提高突变基因的检测灵敏度，另一方面在扩增后用熔解曲线法实现对扩增产
从临床进入基因检测流程是入口,检测结果结合临床信息进行合理解读是出口，这一入一出之间需经历检测前临床咨询部分、实验室部分、信息分析部分、临床解读部分共四个环节。其中的策四部分临床解读部分即是根据检测结果、患者信息、医生共识综合判断，临床和遗传咨询有效衔接、充分沟通，最终出具临床解读报告。 在做成临床解读报告之前，首先需要将解读的各个环节进行明确，包括解读的步骤流程，解读的技术细节。这样才有可能真正的做到解读的规范化，使解读过程有据可依，有章可循，才能出具一份好的临床解读报告，基因检测才能更好的服务患者和临床医生。从大的框架讲，基因检测数据解读可分为三个步骤：原始数据T分析数据、基于数据库的解读-与患者个体表征/临床病例结合的解读。 1、读懂原始数据 将测序的原始序列数据（FASTQ ）去除接头及低质量序列，经BWA软件比对至GRCh37/38 （NCBI 版本）或hgl9/hg38 （UCSC版本）人类基因组参考序列上;Picard去除重复序列使用GATK 检测SNV与Indel变异使用ANNOVAR 进行变异注释。最后获得一份.vcf文件（图1）。
Ph?*e 1 ： primary processing R*w (FQW) 图1从测序的原始序列数据到vcf文件的流程—份vcf文件包含如下基本信息。 CI LT Start End Ref Alt Func. re fGenc Gene, re fGcno GeneDotail. refGone ExonicFunc. / efGeno ofGone Chr:变异所在的染色体 Start :变异在染色体上的起始位置 End :变异在染色体上的结束位置 Ref :参考基因组的序列 Alt:检测样本基因组的序列 Func.refGene :变异所处参考基因的功能区（exonic Jntronic ,UTR3 ,UTR5 , splicing , upstream , downstream , intergenic ）（此处的exonic 特扌旨夕卜显子编码氨基酸区，不包括外显子的UTR区） Phas? 2: variant detection Phase 3: variant annotation
第一章名词解释 1.基因（gene）是贮存遗传信息的核酸（DNA或RNA）片段，包括编码RNA和蛋白质的结构基因以及转录调控序列两部分。 2. 结构基因（structural gene）指基因中编码RNA和蛋白质的核苷酸序列。它们在原核生物中连续排列，在真核生物中则间断排列。 3.断裂基因（split gene真核生物的结构基因中，编码区与非编码区间隔排列。 4. 外显子（exon）指在真核生物的断裂基因及其成熟RNA中都存在的核酸序列。 5.内含子（intron）指在真核生物的断裂基因及其初级转录产物中出现，但在成熟RNA中被剪接除去的核酸序列。 6.多顺反子RNA（polycistronic/multicistronic RNA）一个RNA分子上包含几个结构基因的转录产物。原核生物的绝大多数基因和真核生物的个别基因可转录生成多顺反子RNA。 7.单顺反子RNA（monocistronic RNA）一个RNA分子上只包含一个结构基因的转录产物。真核生物的绝大多数基因和原核生物的个别基因可转录生成单顺反子RNA。 8. 核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA, hnRNA）是真核生物细胞核内的转录初始产物，含有外显子和内含子转录的序列，分子量大小不均一，经一系列转录后加工变为成熟mRNA。 9. 开放阅读框（open reading frame, ORF）mRNA分子上从起始密码子到终止密码子之间的核苷酸（碱基）序列，编码一个特定的多肽链。 10.密码子（codon） mRNA分子的开放读框内从5' 到3' 方向每3个相邻的核苷酸（碱基）为一组，编码多肽链中的20种氨基酸残基，或者代表翻译起始以及翻译终止信息。