组织培养细胞生物学
细胞在体外培养后，如一切条件适宜，便可生存和进行生命活动，如移动等，但最主要的是生长和增殖。生长和增殖并非同一概念，细胞生长指的是：细胞体积增大，而细胞增殖是细胞数量增多。体外培养细胞来源于体内，其基本细胞生物学规律和体内相同。但随生活环境的改变，很多方面如形态结构和增殖规律等，与体内时又有所别。这里所叙述的是“体外培养细胞生物学”，即有关细胞在体外培养条件下的细胞生物学行
为。它具有着本身的特点和规律，不能为一般细胞生物学完全替代，是组织培养工作者应熟知的知识。
一、体内外细胞的差异和分化
已如前述，目前人体内所有细胞基本上皆可进行培养。培养细胞已成为人们借以研究人体内相应器官、组织和细胞的正常和异常生命活动的重要对象。但却面临一个重要的问题，即体外培养细胞和体内细胞有否差异，是否可视为同一？如否，则培养细胞将失掉其应用价值。因此这是一个十分重要和应首先阐明和回答的理论问题。比较体内、外细胞可见，它们的增殖方式是相同的，均赖于有丝分裂。体内、外细胞的差异关键在于细胞的分化，从而细胞分化是检测细胞差异的核心问题。
（一）体内外细胞的差异
当前人工模拟体内环境的技术已经很高，细胞生活在人工培养条件下不仅能很好的生存、生长和增殖，在一定程度上，人们已能控制细胞的分化。但当前我们毕竟尚未能彻底了解人体内一切细胞活动的内在联系，人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。这样，当细胞被置于体外培养后，一旦失去神经体液的调节和细胞相互间的影响、生活在缺乏动态平衡的环境中，日久天长，发生变化是必然的。培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、出现类似“反祖”（Atavism）现象；表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。上述变化曾使组织培养者困惑多年，近年随分子生物学研究进展，很多问题已获得了初步答案。
细胞增殖和分化是细胞生命进化中所获得的基本属性。组成人体结构、功能和生长发育的基本单位的细胞，是已发生了高度分化的成分。表现在人体细胞与细胞之间呈现着高度的相互依存性、和个体细胞相对失去独立性。从受精卵形成开始，细胞的两个基本过程增殖和分化，便协调地进行着。增殖使细胞数量增多，分化使机体结构和功能多样化，最终演变形成完整的人体。此间每个细胞的生命活动，均听命于外源信号（来自
其它细胞），通过相关基因的调控，使之发生增殖或分化的表达。当细胞被离体培养后，信号来源切断，特定基因分化表达减弱或停止。而进化中保守的细胞增殖活动却可维持；遂使体内外细胞出现了差异。实
际上这种差异从细胞离体培养的刹那间就开始了。（生物秀https://www.doczj.com/doc/e4337625.html,）
（二）培养细胞的分化（表1-1）
个体从一个受精卵通过发育形成组织、器官等特殊结构和进行功能的过程，也可看作为细胞分化表达的过程。细胞分化机制是极其复杂的，是在细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，由众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程。细胞离体培养因环境的改变，失掉上述在体内时的关系，细胞的分化可能发生如下的变化：
1．不适应（Deadaption）：
表现为，细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，如肝细胞产生酪氨酸转移酶（Tyrosine Aminotransferase）特性的丧失；有人证明肝细胞产生酪氨酸转移酶需要激素（胰岛素、可的松）的诱导和与相应细胞基质（如Collagen）的相互作用，只要这些条件存在，便可产生。培养细胞分化的改变主要因环境改变所致。细胞在体外培养时间越长，分化改变越大；细胞刚离体培养时，先出现的现象可能属不适应，即由于环境的改变而出现的变化。
2．脱分化或去分化（Dedifferentiation）：
细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化的能力。仍以肝细胞为例，当肝细胞失掉产生精氨酸酶（Arginase）、氨基转移酶等特性后，则失掉贮存肝糖原能力，并很难再现。因此不适应和脱分化两上概念不同。不适应是因生存条件的改变使分化发生阻抑；从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致，因此应分析体外培养细胞分化的改变属何种性质。很多细胞在培养中的改变只是因培养环境的改变和分化因子的缺乏，导致细胞分化表达受阻、分化基因表达抑制或不充分而已。但即便是脱分化也并不意味着细胞分化能力完全丧失。从细胞遗传学角度考虑，体外培养细胞，不论正常或肿瘤细胞都源于二倍体细胞，也即含有与体内细胞基本相同的基因组（Genome），也即存在着发生分化的依据。一种分化特性的丧失，不等于彻底消除了分化能力。
总的来看，体外培养细胞不仅有分化潜能，实际上随细胞来源种属和遗传性状的不同，很多细胞也仍然呈现着一定程度的分化表达现象（表1-1）。如毛细血管内皮细胞的体外培养时，可形成类似血管样结构，但仅限于初代培养和接种在类似基膜物质底物上生长时才可发生。说明与体内条件越近似时，细胞愈易发生分化。细胞离体培养时间越长，分化能力越差；培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。另外细胞置于
体外培养时，因环境的改变，细胞分化的表达形式也发生了与原体内时不同的变化。如二倍体成纤维细胞，在体外可传30~50 代，相当于150~300 个细胞周期，最后衰老死亡，呈现着生命发展分化过程。在体内脱原蛋白（Collagen）是成纤维细胞和骨细胞的主要产物。而在体外培养的细胞，不仅成纤维细胞能产生胶原，在一定条件下，上皮细胞、神经细胞，甚至一些肿瘤细胞也能产生胶原。根据细胞分化是众多蛋白
质和酶参与的过程考虑，特异蛋白质或酶的表达也属分化现象。因此，细胞产生某一特定蛋白质的表达过程，可视为分化表达现象。杂交瘤细胞产生特异的抗体也是细胞分化行为。
细胞分化的关键，在于存在有诱导细胞发生分化的因子。如在培养液中存在有相应的因子时，体外培养细胞同样能发生分化现象。如Friend 细胞（小鼠红白血病细胞）在一定条件下可以合成血红蛋白，标志着肿瘤细胞向正常细胞状态转变。细胞恶变的本质是细胞增殖生长和分化调控的失控。诱导癌细胞发生分化是癌细胞逆转的表现。近年证明维生素A 酸（Retionoic Acid）能诱导恶性细胞逆转，环腺苷酸cATP 也有类似作用；现已发现能诱导癌细胞发生分化的作用物已非常多，此不赘述。阐明细胞分化机制不仅是了解癌变机理和攻克癌症的核心问题，也是人们支配生物生长、解决人类物质需要的极重要的手段，培养细胞是研究分化最理想的实验对象。
二、培养细胞形态分类（图1-3）
图1-3 体外培养细胞类型
体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类：
（一）贴附型
这类细胞在培养时能贴附在支持物表面生长。大多数培养细胞呈贴附型生长；只赖于贴附才能生长的细胞称贴附性细胞或锚着依存性细胞（Anchorage-dependent Cells）。关于细胞的贴附过程和机制将另加叙述。当细胞贴附在支持物上之后，易失去它们在体内时原有的特征，细胞分化现象常变得不显著。在形态上常表现单一化的现象，并常反映其胚层起源，呈现类似前述“反祖现象”。如来源于内、外胚层的细胞多呈上皮型；
来自中胚层的则易呈成纤维细胞型（这种现象又与供体的年龄有密切关系；原供体越幼稚则“反祖”越明显）；显然与细胞分化有关。由于上述原因，体外培养细胞形态常表现有一般化的倾向。因此在判定培养细胞形态时，很难再按体内细胞标准确定，仅能大致如下分类：
1．成纤维型细胞：
本型细胞形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名；细胞体呈梭形或不规则三角型，中央有卵圆形核，胞质向外伸出2~3 个长短不同的突起。细胞在生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走行。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本类形态。另外在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。因此组织培养中的成纤维细胞一词是一种习惯上的
称法，此点与体内细胞不同。
2．上皮型细胞：
本型细胞具有扁平不规则多角形，中有圆形核，细胞紧密相连成单层膜。细胞增殖数量增多时，整块上皮膜随之移动；处于上皮膜边缘的细胞多与膜相连，很少脱离细胞群单独活动。起源于内、外胚层细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮等组织培养时，皆呈上皮型形态。上皮型细胞生长时，尤其是外胚层起源的细胞，细胞之间常出现所谓“拉网”（Netting）现象（见图8-3），即在构成上皮膜状生长的细胞群中一些细胞常相互分离卷曲，致使上皮细胞膜中形成网眼状空洞。拉网的形成可能与细胞分泌透明质酸酶有关。（生物秀https://www.doczj.com/doc/e4337625.html,）
3．游走型细胞：
本型细胞在支持物上散在生长，一般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快而且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞相区别。在一定条件下，由于细胞密度增大联接成片后，可呈类似多角形；或因培养基化学性质变动等，也可能变成成纤维细胞形态。
4．多形型细胞：
除上述三型细胞外，还有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定它们规律的形态，可统归入多形型细胞。
（二）悬浮型
有的细胞在培养时不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，如某些癌细胞和血液白细胞可呈悬浮型。细胞悬浮生长时，胞体为圆形，观察时不如贴附型方便。其优点是细胞悬浮在培养液中生长，生存空间大，容许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢等研究。
本书所叙述的内容主要是贴附型细胞培养法及其有关问题的探讨。
（三）对培养细胞形态分类的探讨
对组织培养细胞形态的分类，主要根据细胞在培养中的表现以及描述上的方便而定。当细胞处于较好的培养条件时，形态上有相对的稳定性，在一定程度上能反映细胞的起源、正常和异常（恶性）也可能区别开来，故可作为判定细胞生物学性状的一个指标或依据。但必须意识到，培养细胞的一般形态，并不是一项很可靠的指标，原因是它可受很多因素的影响而发生改变。譬如拿培养条件来说，就很难控制到丝毫不发生变化
的程度。如反复开关温箱，除可影响温度，使这波动，并能放出培养箱内CO2，促培养基变碱。还有支原体污染、培养基pH 改变等都可使细胞形态发生变化。如HeLa 细胞本属上皮型，但在过酸或过碱的情况下可变成梭形，pH 适宜时又可恢复。从细胞拦种到细胞密度增大的一代生长过程中，细胞形态表现也有所不同，如上皮型细胞在刚接种后不久，因细胞数量较少，细胞可能呈星形或三角形。只有当细胞数量增多后，多角形
态特点和上皮膜状结构才逐渐变得明显起来。另外贴附型和悬浮型细胞性质也不是绝对一成不变的；在一定条件下，悬浮型细胞可呈贴附状生长，贴附型细胞也可呈悬浮状生长。当细胞发生转化后，细胞形态变化更大；成纤维细胞转化后可变成上皮形态。另外在一些类型相同细胞之间，如癌细胞等，也难以在形态上看出有什么明显区别。
由于培养细胞形态的易变性，在利用形态学指标判定细胞类型和其它一些性状时应持谨慎态度。不应仅仅依赖光学显微镜观察所见，必要时须做超微结构和其它方法的分析；如电镜下观察到桥粒时，可确认为上皮型细胞，因桥粒是上皮细胞所特有的结构，但在光镜下不可见，只有在电子显微镜下才能观察到。因此电子显微镜所提供的形态学论据显然更为可靠。
三、培养细胞形态结构
组织培养细胞形态结构与体内细胞基本相同，但在大体形态以及某些细微结构方面仍存在着一定的差异。（一）大体形态
根据细胞是否贴附于支持物上生长，形态有所不同。呈悬浮生长时，不论细胞原来源于体内何种类型细胞，由于生长在液体环境中，胞体基本呈圆形。当贴附于支持物表面后，开始仍为圆形，但为时很短，很快便经过形态演变过渡成扁平形态。细胞大体形态可随支持物的构形而改变；附于球体表面时，细胞与球体呈
同心圆层。支持物表面平坦时，则细胞先由圆形延展成圆饼形。此时的细胞可称之为放射延展细胞（Radial Spread Cell）。其细胞质可区分为：①中心区或内质，细胞中央为细胞核，核周胞质稠密区即内质（Endoplasm），内含有较多的细胞器（主要为线状或颗粒状线粒体和内质网）；②外质（Exoplasm）或板层区，是胞质外周部分，无色透明包绕内质，用特殊的染色法在外质中，可显示出微丝和微管。放射延展细胞持续0.5~2 小时便过渡为极性细胞（Polarized Cell）。极性细胞可呈纺锤形、三角形可不规则多角形等多种形态。极性细胞形态常随细胞运动发生改变。它们外质的周边部可分为活跃与不活跃的两部分；不活跃部分比较稳定，活跃部常伸出伪足，使细胞发生定向运动。有时细胞从悬浮状贴壁附于支持物上后，也可不经过放射延展阶段直接进入极性细胞（图1-4）。当细胞相互接攘成片后，极性常变得不明显，外质周边部也无明显活跃部分与不活跃部分的区别。
在一般光镜下直接观察体外培养健康活细胞时，细胞是均质而透明的，结构及不明显。只有用相差显微镜才能看清细胞轮廓和内部结构。培养中细胞一般有1~2 个核仁。用固定染色法和特殊技术可显示出细胞器等结构，但在生活时的细胞中却不易观察到。在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。在胞质中时而出现颗粒、脂滴和空泡等，是细胞代谢不良的表现；反差很大的暗色小颗粒是变形的线粒体。细胞形态结
构与细胞在体外生存时间的长短、细胞种类等有直接关系。初代培养的正常二倍体细胞，除大体形态外，在构造和生物学性状上与原体内细胞近似性大，细胞均质性和透明度都很强。随细胞在体外生活时间的延长和反复传代，会发生一定的变化，如轮廓增强、核仁增多、有时出现双核或多核巨细胞等。如细胞发生转化，它们的形态发生的变化更大。肿瘤细胞与正常细胞有明显的区别，有关肿瘤细胞的培养和生物学性状等问题，后将详述。
图1-4 细胞贴壁延展过程
（二）超微结构
电镜下观察组织培养细胞膜亦分为三层结构，总厚度约7.5nm，由双层类脂分子组成，亲水极互相对应，疏水极向外，双层分子间嵌有蛋白质分子。细胞膜向外凸出形成泡状、叶状、丝状和指状突起，长度比较一致，存在时间也长，这类突起称微绒毛。随细胞类型、正常或异常（肿瘤细胞），以及处于周期阶段不同，微绒毛的形状和数量均有差别。即使细胞连接成片时，在细胞之间仍存在着一定的间隙。成纤维细胞之间的间
隙不恒定，上皮细胞相互之间一般有1.5nm~15nm 的间隙。细胞相互接触部并可见到桥粒（Desmosome）；桥粒的有无可作为识别上皮细胞的标志。
细胞膜表面常附有由细胞分泌形成的糖蛋白膜，即细胞外衣。它对细胞的运动，尤其对细胞贴附于支持物生长有很大作用。用胰蛋白酶消化处理细胞，能改变细胞外衣的性质，使细胞易从支持物上脱落下来，此外细胞外衣与物质交换、酸碱平衡及膜电位等均有一定的关系。
在细胞膜下面有一层厚100nm~500nm 的胞质区，称膜下皮质层。该层具有中等电子密度，其中常见有直径5-7nm 的微丝。微丝在膜下皮质层中分布甚广，它们主要由多聚肌纤蛋白组成。它们在膜下皮质层中有两种存在形式，一是呈不定形基质，二是组成微丝束，后者可观察到。当细胞在悬液中生长或从支持物脱
离时，微丝可能消失再变成无定形基质，当细胞贴附于支持物后，胞质延展，微丝又出现。微丝受温度的影响，低
温时解聚，温度恢复又重新组装再现。微丝可逆性变化存在形式，与微丝组成成分肌动球蛋白有密切关系。微管是另一种细丝，比微丝粗而长，由管蛋白（Tublin）组成，分散在细胞中各处。微丝和微管构成细胞质中骨架系统（Cytoskeleton System：CSS）；CSS除与细胞形态和细胞运动有关外，对细胞膜的功能如吞饮、免疫反应等都有关。细胞松弛素B（Cytochalasin B）、秋水仙素（Chochicine）和刀豆球蛋白等对细胞的特殊效应也与CSS 有关。转化细胞中的CSS 的排列状态与正常细胞不同，正常细胞中的微丝微管走行有一定方向性，细胞转化后走行紊乱（组装差），被视为一项检测的标志。微丝和微管在光学显微镜下也可观察到（见照片8-4）。
细胞质中的其它结构如线粒体、内质网、高尔基氏复合体、中心体和溶酶体等多集中在细胞内质。线粒体形态结构与体内细胞相似，但常随细胞生长状态不同有很大变化；在机能状态良好的细胞中，呈杆状或卵圆形，数量较多，当细胞机能低下或代谢不浪时，能变成颗粒形或集聚成更大的团粒，在光镜下明显可见。细胞核超微结构与体内细胞无大差别，核膜仍为双层结构，也能看到核孔。女性细胞核仍可见到Barr 氏体。永生性细胞系和肿瘤细胞的细胞核一般比较大，染色质比较丰富，核仁大而多。
四、组织培养细胞的生长和增殖过程
体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胸和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage 或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。另外，很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存也不是无限的，存在着一个发展过程。所有这一切，使组织细胞在培养中有着一系列与体内不同的生存特点。
（一）组织培养细胞生命期（Life Span of Culture Cells）
所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。组织和细胞在培养中生命期如何？这要要细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况。人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30~50 代，相当于150~300 个细胞增殖周期，能维持一年左右的生存时间，最后衰老凋亡（Apoptosis）。如供体为成体或衰老个体，则生存时间更短；如培
养的为其它细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。对此以后将详叙。
但进行正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段（图1-5）：
1．原代培养（Primary Culture）期：
也称初代培养，即从体内取出组织按种培养到第一次传代阶段，一般持续1~4 周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性细。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克
隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。
图1-5 正常培养细胞生命期
2．传代期：
初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。
为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代30~50 次后，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。
3．衰退期：
此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖：细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点(多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性Malignancy)。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line)，也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。在早期文献中无限细胞系也称已建立细胞系（Established Cell Line），现已不用。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工人工诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状（见第十二章）。
（二）组织培养细胞一代生存期
所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。
所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153 代细胞，即指该细胞系已传代153 次。它与细胞世代（Generation）或倍增（Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增3~6 次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段（图1-6）：
图1-6 体外培养细胞一代增殖生长过程
1．潜伏期（Latent Phase）：
细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢，可长达10~24 小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10~30 分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴
附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素（Fibronectin），又称LETS（Large External Transformation Substance），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面（如CSP），有的则来自培养基中的血清（LETS）。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。
细胞贴附于支持物后，除先经过前述延展过程变成极性细胞，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂伏期长，约24~96 小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6~24 小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。
2．指数增生期（Logarithmic growth Phase）：
这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指灵敏介于0.1%~0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%~5%（肿瘤细胞偏高）。
pH 和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响（后将详述）。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3~5 天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一（图1-7）。肿瘤细胞由于无接触抑制能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（Piled up）。细胞接触汇合成片后，是发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。
图1-7 细胞接触抑制
3．停滞期（Stagnate Phase）：
细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量持平，故也称平顶期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH 降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至
少还要再传1~2 两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。结果反而耽误了时间，这是在实验中应特别注意的。
五、培养细胞增殖动力学（Culture Cell Kinetics）
组织培养细胞是研究细胞动力学和细胞有丝分裂过程非常好的对象。当前对培养细胞的增殖过程和周期规律已有很深入的了解。
自50 年代细胞周期学说建立后，遂即形成至今仍沿用的传统概念，即细胞周期=间期（G1期+S 期+G2期）+M 期，可简称之为GSM 周期。在GSM 周期中的G1期阶段，细胞可进入持续时间不定的G0期。这一概念虽基本符合体内外细胞增殖生长的规律，但却未完全反映细胞增殖生长状态，这一概念存在着有待修饰的必要。因此本书中将按新的理解进行介绍。
按人体细胞，包括体外培养细胞，有两种基本状态：即增殖态和功能态（图1-8）。
图1-8 细胞存在形式和细胞增殖周期关系
（一）增殖态（Proliferation State）
增殖态即细胞进行增殖的状态或过程；细胞增殖或自我复制的手段为细胞有丝分裂（Mitosis）。细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制；两者是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。只有在两者完成后，细胞才能发生分裂；而细胞有丝分裂所完成的主要是细胞质和细胞核的分配。以上三个基本过程是细胞增殖态主要的活动，三个过程有阶段性，又相互依存。
1．G1期：
发生于上一个增殖周期的分裂期后，DNA 合成期前，故也称为细胞分裂后期，或DNA 合成前期。G1期是细胞质复制的主要阶段，细胞进入G1期标志细胞已进入增殖态。上一次细胞分裂后所形成的子细胞是否能进入G1期，取决于外源生长因子（GrowthFacter）和其它增殖相关因子的调控。细胞进入G1期后，也仍然受其它因子以及营养物质的影响。在G1期中，能接受外界因子影响的特定阶段，称调节点（Regulation Point：RP）。近年研究证明G1期存着不止一个RP。细胞在G 期时因营养物质缺乏和在调节因子的作用下，可导致发生阻滞，使G1期延长；发生阻滞的G1期，可称之为G1s（G1 in Stagnation）。因此G1期的持续时间变化很大，短则4~6 小时，长可到几天。增殖旺盛细胞的G1期持续时间短，衰退细胞持续时间长；培养细胞属旺盛增殖细胞群体，一般具有较短的G1期。G1期细胞中进行着非常复杂的分子变化过程。据此Pardee（1989）把
G1期又分成G1a、G1b 等数个亚阶段。G1期主要活动为细胞内的蛋白质合成、RNA 合成、多聚核蛋白体合成增多等；G1期胞体逐渐增大，是镜下唯一可感知的变化。G1期末细胞进入S 期前尚存在着一个调节点，越过此点后细胞才能进入S 期。
2．S 期：
即DNA 合成期，主要机能活动为进行DNA 合成。各种细胞DNA 合成持续时间差别不大，比较恒定，平均6~8 小时，除用抑制DNA 合成药物如5-氟尿嘧啶等外，细胞一旦进入S 期，DNA 合成过程一经开始，大多能持续进行，独立性较大，对环境不利因素有一定耐受能力。但DNA在进行合成时，多核苷酸双链发生分离，在此阶段，易受致突变或致癌因素作用；DNA 合成期是遗传物质易受致突变物损伤的时期。3．G2期：
发生在DNA 合成后和本次细胞分裂期之前，故也称DNA 合成后期或细胞分裂前期。细胞进入G2期后，DNA 含量已加倍，具有4 倍量的DNA。在G2期主要的变化是与细胞分裂相关的RNA 的合成和染色质的螺旋化。本期持续时间较短，平均2~5 小时。G2期对外界环境敏感，易受温度、pH 及各种其它因素的影响而受阻不能进入M 期，但不利作用消除后却能很快恢复。
4．M 期：
即细胞有丝分裂期，组织培养细胞分裂仍以有丝分裂方式进行增殖。M 期结束形成两个子细胞，是细胞增殖周期的终结期。处于分裂中的细胞叫分裂相，在生活状态下可以直接观察到（见照片8-6）。组织培养细胞是研究细胞有丝分裂过程理想的对象，活细胞的分裂相形态和分裂过程，在相差显微镜下可清晰观察到。细胞分裂过程分前中后末
四期，活细胞分裂过程表现如下：
①前期：G2期结束后的细胞是如何过渡到前期的，尚难确定出明显的标志。用缩时逐格显微摄电影技术显示，细胞核发生转动可能是前期的开始。当染色体在核中出现并愈来愈清楚时，证明细胞已进入分裂前期。稍后，核膜和核仁突然解体消失，染色体遂混于细胞质中并呈现活跃的运动（类似布朗运动）。与此同时，整个细胞也显现活跃的运动；从细胞膜表面向外伸出很多长短不等的突起，它们引起彼伏犹如液面沸腾，蔚为壮观。此时细胞质逐渐回缩，细胞体趋于变圆，遂与底物附着面减少，易脱落入培养液中。染色体内分散状态渐向细胞中央部移动，然后突然“冻结”于赤道平面，到此前期结束，中期开始；前期持续时间20~30 分钟。
②中期：细胞进入分裂中期后，胞质进一步回缩，胞体呈圆球形，与支持物附着面缩小达极限。如于此时
摇动培养瓶壁，在培养液的冲击下，细胞极易从瓶壁脱落，依此可作为收集中期分裂相的简易方法。由于中期细胞呈圆形，折光性强，在镜下极易识别。染色体集中于过道平面后，失去明显的运动；中期染色体集聚在赤道平面上称中期板（Metaphase Plate）。中期板有一定的方向性，即中期板常与支持物平面相垂直，两中心
体分别们于两端（极），此现象可能与两中心体密度较大有关；镜下观察呈“一”字形。细胞分裂中期持续20~30 分钟。本期细胞对外界因素敏感，易受外界因素如秋水仙素作用发生阻滞、延缓或停止向后期过渡。
③后期：一旦中期板染色体开始一分为二，即标志后期开始。接着染色体分成两组分别向两极移动，与此同时整个细胞由圆球形逐渐变成椭圆球形；在赤道部并出现绞窄，胞体呈哑铃形。后期时两组染色体相互分离，是细胞分裂过程中最快的，仅持续5~7 分钟，在显微镜下可直接观察到。
④末期：此时两组染色体已达于两极，胞体中部进一步变细。继之一切变化与前期相反；染色体变成染色质、核仁核膜再现、胞体逐渐分离、形成两个子细胞，但两者间仍有细丝相连，经过较长时间后才彻底分开。两个子细胞独立后，细胞质又复延展附于底物变扁，整个细胞又恢复成原有状态；末期持续时间20~30 分钟。细胞分裂全程持续时间一般为30~60 分钟，但因细胞种类不同和温度的变动，分裂时间可有一定差别。另外在长期传代或培养环境中某些因素影响下，经常见有异常分裂现象，如三极分裂或多极分裂等。正常细胞的一次增殖过程，以分裂结束形成两上相同的子细胞后而告完成。这既赖于细胞质、遗传物质复制和细胞分裂三个过程的完成，也依赖于它们之间的相互协调性。受精卵开始增殖可无G1期，是因其胞质富余，一旦达一般细胞大小时，G1期便将再现。没有细胞质的合成只有遗传物质的合成，细胞也不能生存。细胞质和细胞核分裂的不协调，如只有胞核分裂而胞质不分裂，反复经过几个细胞增殖周期后，可导致形成多核巨细胞。另有一种异常的分裂叫核内有丝分裂（Endomitosis ），又称内复制（Endordduplication），即仅有DNA 的复制，而无核分裂现象，经下一次细胞增殖击期或经过几个细胞增殖周期后才出现分裂，可导致产生多倍体（Polyploid ），并常伴有双染色体（Diplochromosomes ）现象（照片1-1）。上述几种异常分裂，在体外培养细胞尤以无限细胞系和肿瘤细胞系等是比较常见的。
（二）功能态（Functional State）
功能态为细胞进行特定功能活动如分泌、传导、吞噬、收缩等的时期，是细胞的第二种生存状态。细胞完成特定功能是在细胞发生分化基础上完成的。因此，细胞功能态也是细胞的分化态（Differtentiation State）。功能态存在于细胞分裂之后，G1期前，也即在两次增殖态之间。若从细胞增殖态周期角度看，功能态是两次增殖周期之间的间期（Interphase）或G0期。同一G0期，由于细胞的不同，其生物学的意义是不一样的。以功能活动为主的细胞的G0期是功能期；以增殖活动为主的细胞的G0期则是名副其实的间期。传统GSM 增殖周期概念中，把G0期归属于G1期，视为G1期的阻滞。本书以G1s 表示阻滞的G1期，显然更为合理。
细胞的增殖态和功能态是相对的状态，能发生交替和有相互依存的关系。根据这两种状态属性的不同，可把细胞分作如下三类：
1．活跃增殖细胞：
这类细胞是以增殖为主的细胞，它们增殖频繁，具有较短的G0期，无分化现象。从而它们的G0期最为符合间期概念，故可称之为G0i（G0 of Ineterphase：G0i）。体内各种干细胞、肿瘤细胞和体外培养细胞均属之。本型细胞在体外易于培养，成活率高。
2．功能I 型细胞：
这类细胞是以完成功能活动为主的细胞，其G0期是完成功能活动的主要阶段。故本型细胞的G0期可称之为G0f（G0 of Function：G0f）。体内各种腺细胞、结缔组织细胞、淋巴细胞等属之。在一定条件下，本型细胞尚可重返增殖态；如肝细胞，受损后能重新再进入增殖态，损伤修复后又恢复成功能态，故可称为G0f1 型细胞。本型细胞也可在体外培养，但要求条件较复杂。
3．功能II 型细胞：
体内神经细胞、骨骼肌细胞等，是终末分化细胞。它们长期处于G0期进行功能活动，少见或不进行增殖，这类细胞的G0f 可称为G0f2。本型细胞在体外难以培养和存活
（成体）。
（三）体内外细胞增殖和分化调控的差别
细胞生长与细胞增殖两个概念并不完全相同。细胞生长是细胞质进行合成，导致细胞体积增大，细胞增殖则是细胞数量的增多。细胞群的增殖率主要取决于细胞增殖周期的相继密度和细胞群体中参与增殖细胞数（增殖的细胞/群体），而不在于一个M 期本身持续时间的长短。
体外培养细胞属活跃增殖细胞，在培养液中营养充分条件下，可反复进行增殖活动，具有较短的G0i 期。但当营养缺乏、尤其是缺乏生长因子时(如降低血清含量)，细胞多停滞于G0i 期。此时的细胞由于蛋白质和RNA 的降解、核糖体为单体而非多聚体，酶的活性和越膜活动等较低，因此细胞体积较小。培养中的成纤维细胞当被置于不良状态时，如降低培养基中血清含量，一小时后即进入G0i 期，如再补加血清，又可再返G1期。从
阻滞的G0i 期期进入S期所需时间较长，如3T3细胞需12小时。在无G0i 期阻滞时，一次细胞分裂完了，只需6小时便可进入到S期。说明体外培养细胞的生存中，正常情况下，G0i期是很短的。但也随细胞种类不同而异，二倍体细胞较长，永生细胞和肿瘤细胞系较短。体内细胞进入增殖抑或分生分化，均取决于自身以外的调控信号。正常细胞离体培养后，信号来源切断，在培养液中如无促细胞增殖因子或不充分时，细胞便停止增殖。向培养液中补加血清，在于供给细胞所需生长因子，对于正常细胞尤为重要。如细胞发生恶性转化，则出现血清需求降低的现象。研究证明，是与恶怀转化细胞获得能以自泌（Autocrine）方式产生生长因子所致，即细胞具有“自给自足”供生长因子能力。因此细胞降低血清需求可视为细胞恶交的一项指标。
六、组织培养细胞遗传学特征
利用组织培养细胞很适于做细胞遗传学研究。细胞遗传学特征是检测培养细胞一项极重要的指标。体内细胞的遗传学特征是比较稳定的，但细胞离体培养后，在培养过程中，却很易发生细胞遗传学变动。因此掌握培养细胞的细胞遗传学动向，是为解细胞性状的一个极重要方面。随着近年细胞融合、免疫组化、原位杂交、基因工作和DNA 重组技术的发展和应用，弥补了细胞遗传学和分子遗传学间的不足，使它们已形成了更加
完整的体系。但细胞遗传学仍然是了解培养细胞遗传性状最基本和必要的技术，因此利用培养细胞进行研究的工作者，必应具有一定细胞遗传学知识。
（一）核型变化
染色体、染色质和脱氧核蛋白是细胞中同一遗传物质的不同的存在形式（图1-9）。间期细胞核中的染色质在细胞进入分裂时变成染色体；在分裂中期时染色体呈标准形态是研究染色体形态结构最好的阶段。人体体细胞具有二倍体核型（照片1-2），在组织培养中呈二倍体核型的细胞群体称二倍体细胞（Diploid Cells），染色体数目为46（2n）（照片1-3）。能维持培养细胞保持二倍体状态的培养方法称二倍体细胞培养。初代正常培养细胞多呈二倍体，通过传代成细胞系后，在培养条件良好的情况下，二倍体细胞可能长期保持二倍体状态。但体外细胞培养环境的稳定性是相对的，细胞经过长期传代后，会发生偏离二倍体现象，即染色体数变成多于或少于46。但只要具有二倍体核型细胞数在这一群体中仍居优势，即占75%以上时，这样的细胞系或细胞株仍可视为二倍体。当细胞发生转化、恶变或原来即为肿瘤细胞的情况下，大多失去二倍体核型，成为多倍体（Polyploid）、异倍体（Heteroploid）或其它形式的变化。其中以异倍体居多，培养细胞经常发生着异倍化，可视为是细胞随环境的变化呈现自然选择和淘汰的过程。结束导致在细胞中可存在几个不同核型的细胞系；当某一核型的细胞，在该细胞群中居多数时，具有该数值染色体数的细胞群即称为干系（Stem Line），也叫众数或主流数（图1-10）。主流细胞可能是有生长优势的细胞群。不同细胞系（或株），或同一细胞系处于不同代，它们的主流数皆可有别。困此实验者对长期使用的细胞或新引起的细胞，应做定期核型检查，以掌握细胞的遗传动向。
在各类培养细胞中，有时可见到异形染色体，如双着丝点、环形染色体、长臂或短臂缺失等。当某一特殊形态的染色体不断反复出现并点有很大比例时，这种染色体可称之为标记染色体（Marker Chromosome），
可作为描述细胞群细胞遗传学特征和改变的一项标志。
（二）永生化（Immortolization）和恶变（Malignancy）
细胞永生化也称不死性，是细胞获得持续生长增殖能力的特性。而恶性细胞不仅能长期增殖生长并有异体接种致癌性。已如前述，在体外培养的正常细胞有两个主要的特征，一是具有二倍体核型，二是增殖生长期是有限的。而永生化的细胞则具有无限增殖生长性，长期传代不死，并多伴有核型改变。早年曾把永生性和恶变视为同一，近年研究证明两者是细胞两种不同的性状。永生化的细胞不一定具有恶性，但却易进一步演变
成恶性细胞，因此人们认为永生化可能为癌变过程中的一个阶段。关于永生化和恶变的检测技术方法将在细胞转化和癌基因章节详述。
（三）细胞性别
女性的两个X染色体中的一个在间期时呈明显的异固缩（Heteropycnosis）状态，呈三角形或半月状小体，紧附在核膜内面，称巴氏小体（Barr’s body）；男性Y 染色体在间期则形成颗粒状Y 小体，位于胞核的近中央部位。女性细胞的巴氏体和男性的Y 小体在培养细胞群中都可检测到。说明培养细胞仍保持着性别特征。用特殊染色法可显现出巴氏体和Y 小体。初代培养细胞易于显现，细胞系或已发生转化细胞有可能发生改变。
1.植物组织培养按培养对象分为______ 、 _______ 、________ 、 ________ 、________ 等几种类型。 2.一个己停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成耒分化的愈伤组织的现象称为 n tv 3.不同的灭菌剂其灭菌的机理一般不一样，次氯酸钙和次氯酸钠都是利用分解产生 _________ 来杀菌的；升汞是靠 ________ 来达到灭菌日的。 4.去除植物病毒的主耍方法是 _____ 和_______ 两种方法，当把二者结合起來脱毒效 果最好 5.在通过微茎尖培养脱毒时，外植体的大小应以成苗率和脱毒率综合确定，一般以 __________ mm、带 ________ 个叶原基为好。 6.White培养基________ 浓度低，适合生根培养。 7.一个已停止分裂的成熟细胞转变为_________ 状态，并形成_________ 的现象称为“ 脱分化”。 8.BA/NAA的高低决定了外植体的发育方向，比值低时促进 ________ 的生长，这时 _________ 占主导地位；比值高促进_________ 的生长，这时 _________ 占主导地位。 9.进行植物组织培养最基本的前提条件是 _____ 。 1、植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。 2、组织培养实验室必要的设备有超净工作台、高压灭菌器、空调机、夭平、显微镜、蒸饱水发生器等。 3、糖在植物组织培养中是不可缺少的，它不但作为离体组织赖以生长的碳源，而且还能维持培养菇渗透压 4、培养基灭菌一般在-108 kPa的压力下,锅内温度达121 °C ,维持20-30 min o 5、在离体叶培养中，6?BA和KT利于芽的形成:24D利于愈伤纟FI织的形成 6、在离体叶组织脱分化和再分化培养屮，茎和芽的分化主要有4个途径：方?接产生不泄芽、由愈伤组织产工不定芽、胚状体形成、形成球状体或小鳞茎等途径。 7、目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径是茎尖培养脱毒。 8、花药培养前的预处理:低温冷藏是最常用的方法。 1、植物组织培养的发展分为三个阶段：萌芽阶段、奠基阶段和快速发展和丿、'、/「用阶段。 2、培养基最常用的碳源是蔗糖,使用浓度在1%?5%常用 _3_%o 3、培养基的种类按其态相不同分为固体培养基与液体培养基，其火菌方法一般采用壷热消毒灭菌方法。 4、 pll的大小会影响琼脂的凝固能力，一般当pll大于6.0时，，培养基将会 ___________ ,低于5.0时，琼脂不能很好地凝同。 5、一般情况下，生长索/细胞分裂素的比值高，有利于根的形成和愈伤组织的形成:比值低有利于芽的形成。
第三章细胞生物学研究方法 如何学习细胞生物学？ ?抽象思维与动态观点 ?结构与功能统一的观点 ?同一性(unity)和多样性(diversity)的问题 ?细胞生物学的主要内容： 结构与功能（动态特征）； 细胞的生命活动； ?实验科学与实验技术——细胞真知源于实验室 ——What we know//How we know. 第三章细胞生物学研究方法 细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第一节细胞形态结构的观察方法 光学显微镜技术（light microscopy）
电子显微镜技术(Electro microscopy) 扫描探针显微镜（Scanning Probe Microscope） 扫描遂道显微镜(scanning tunneling microscope ) 第二节细胞组分的分析方法 离心分离技术 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 特异蛋白抗原的定位与定性 细胞内特异核酸的定位与定性 放射自显影技术 定量细胞化学分析技术 第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术 细胞的培养 细胞工程 一、光学显微镜技术（light microscopy) 普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy）
激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） 相差显微镜（phase-contrast microscope） 微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC） 录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） 二、电子显微镜技术 电子显微镜的基本知识 电镜与光镜的比较 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术 负染色技术 冰冻蚀刻技术 超薄切片技术 电镜三维重构技术 扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM） SPM(Scanning probe microscope) 三、扫描遂道显微镜 Scanning Probe Microscope,SPM (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括：STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等 原理：扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力，如 量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等， 并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电
实验1 植物细胞组织培养 1.1 相关基础知识 细胞分化(cell diferentiation)指细胞后代在形态、结构和功能等发生变化的过程，归根结底是某些功能基因的开启或者关闭。一般说来，终端分化细胞已经失去分化潜能，只具有单能性；而大部分细胞只保留了部分分化潜能，称为多能性。对于动物而言，只有部分干细胞仍保留了分化的全能性。而植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力，称为植物细胞的全能性(totipotency)。 植物组织培养就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术。植物组织培养最原始的意义是指愈伤组织培养，但发展至今，其范围已经扩展至植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体的离体无菌培养： 1)植株培养。指以具备完整植株形态的材料（如幼苗和较大的植株）作为外植体的无菌培养。 2)胚胎培养。指以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体的离体无菌培养。 3)器官培养。指以植物的根，茎，叶，花，果等器官为外植体的离体无菌培养，如根的根尖和切段， 茎的茎尖，茎节和切段，叶的叶原基，叶片，叶柄，叶鞘和子叶，花器的花瓣，雄蕊（花药，花丝），胚珠，子房，果实等的离体无菌培养。 4)组织培养。指以分离出植物各部位的组织（如分生组织，形成层，木质部，韧皮部，表皮，皮层， 胚乳组织，薄壁组织，髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。这是狭义的组织 ．．．．． 培养 ．．。 5)细胞培养。指以单个的游离细胞（如用果酸酶从组织中分离的体细胞，或花粉细胞，卵细胞）为 接种体的离体无菌培养。 6)原生质体培养。指以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无菌培养。 植物组织培养的成功与否取决于外植体的制备、无菌操作和人工培养环境。外植体的制备是能否建成离体繁殖系要过的第一关。所谓的外植体是指将外界生长的植物的细胞和组织经过一系列的无菌处理形成的有活性的无菌组织和细胞。习惯上我们经常使用化学药剂处理，例如氯化汞、次氯酸盐或者抗生素等。将从母株上取下的组织进行一定的剥离和分割，经过流水冲洗数分钟，再浸入适宜浓度的化学药剂中一段时间，最后经无菌水冲洗并适当分割即成外植体。制备外植体的原则是无菌和有活
第二章细胞生物学研究方法一、名词解释1、resolution：分辨力是指显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小距离的能力。能够区分的两点间的距离越小，表示分辨力越高。2、显微结构：通过光学显微镜所观察到的样品的各种结构，如细胞的大小、外部形态以及细胞核、线粒体、高尔基复合体、中心体等内部构成都属于显微结构。3、超微结构：也称亚显微结构。指在电子显微镜下所观察到的细胞结构，如细胞核、线粒体、高尔基复合体、中心体、核糖体、微管、微丝等细胞器的微细结构。4、细胞培养：指活细胞在体外的培养技术，即在无菌条件下，从机体中取出组织或细胞、模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件，让它在培养皿中继续生存、生长和繁殖的方法。5、原代培养：指从机体组织中取材后接种到培养基中所进行的细胞培养，即直接取材于机体的细胞培养。所形成的细胞称原代细胞，它是在体外培养任何一种体细胞所必须经历的阶段和传代培养的基础。6、传代培养：指当原代培养的细胞在培养瓶中生长、增殖到一定密度后，一分为二或以其他比例分装或转移到2个以上的培养瓶中所进行的再培养。7、细胞融合：又称为细胞杂交，指细胞彼此接触时，2个或2个以上的细胞合并成为一个细胞的现象。8、cell line ：原代培养首次传代成功后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系；已获无限繁殖能力，能持续生存的细胞系，则称为连
续细胞系或无限细胞系。二、选择题【A1型题】1、A；2、B； 3、B； 4、A； 5、C； 6、D； 7、A； 8、D； 9、C；10、D；11、C；12、A；13、A；14、B；15、C；16、A；17、E；18、A；19、C；20、D；21、C；22、E；23、A；24、D；25、B；26、E 【A2型题】1、E；2、D；3、C；4、D；5、A；6、B；7、C；8、D；9、D；10、A 【X型题】1、ACE；2、CDE；3、AE；4、CE； 5、ABCD； 6、ABC； 7、ABCED； 8、ACD； 9、ABCD 三、填空题1、普通显微镜相差显微镜暗视野显微镜荧光显微镜 2、照明系统光学放大系统机械装置系统 3、电子照明系统电磁透镜成像系统真空系统记录系统电源系统 4、物镜和照明系统的位置颠倒5、扫描电子显微镜透射电子显微镜6、0.1μm 0.1mm 3nm 7、差速离心法密度梯度离心法8、0.2μm R=0.61λ／N.A. N.A.=n·sinα／2 9、细胞化学法荧光细胞化学和免疫荧光镜检术放射自显影技术细胞显微分光光度测定技术流式细胞计量术细胞组分的分级分离法10、冰冻蚀刻11、原代培养传代培养 12、单层生长形态变成多态性具有接触抑制现象13、体外环境不能与体内的条件完全等同四、判断题1、√；2、×；3、√；4、×；5、√；6、×；7、√；8、√；9、√；10、×；11、√；12、×；13、×；14、× 五、简答题1、光学显微镜上调节光线强弱的装置有反光镜、聚光镜和光阑。（1）反光镜：反光镜是安装在镜台下面、镜柱前方的—面可转动的圆镜。用来调节光线，能将来自不同
第九章细胞分裂和细胞周期习题 一、选择题 A-九-1. 有丝分裂前期的最主要特征是（）。 A. 核仁. 核膜. 核仁组织者都要消失 B. 染色质凝缩成染色体 C. 核糖体解体 D. 中心体消失 A-九-2. 细胞周期包括（）两个主要时期。 A. G1期和G2期 B. 间期和M期 C. 间期和S期 D. M期和G1期 B-九-3. 虽然不同的细胞有不同的细胞周期，但一般来说，都是（）。 A. G1期长，S期短 B. S期长，G2期短 C. S期长，M期短 D. M期长，G1期短 A-九-4. 在细胞周期中，核仁、核膜要消失，这一消失出现在（）。 A. G1期 B. S期 C. G2期 D. M期 A-九-5. 在有丝分裂过程中，姐妹染色单体着丝粒的分开发生于（）。 A. 前期 B. 中期 C. 后期 D. 末期 C-九-6. 同步生长于M期的HeLa细胞与另一同步生长的细胞融合，除看到中期染色体外还见到凝缩成粉末状的染色体，推测这种同步生长的细胞是处于（）。 A. G1期 B. S期 C. G2期 D. M期 C-九-7. P53基因抑制受损伤细胞进入G2期的机制是（）。 A. 通过P21基因作用于周期蛋白 B. 通过抑制P21基因的启动
C. P53蛋白直接作用于周期蛋白 D. P53与P21共同作用于周期蛋白A-九-8. 成熟促进因子是在（）合成的。 A. G1期 B. S期 C. G2期 D. M期 B-九-9. 在有丝分裂的哪个时期染色体最分散（）。 A. 前期 B. 前中期 C. 中期 D. 后期 B-九-10. 下列减数分裂过程中，要发生染色体减数，此过程发生在（）。 A. 前期Ⅰ B. 中期Ⅰ C. 后期I D. 后期Ⅱ B-九-11. 染色体出现成倍状态发生于细胞周期中的（）。 A. G2期和早M期 B. G1期和S期 C. 晚M期和G1期 D. G0期和G1期 B-九-12. 在减数分裂的粗线期，（）。 A. 常发生姐妹染色体单体的交换从而导致重组配子的产生 B. 常发生姐妹染色体单体的交叉从而导致重组配子的产生 C. RNA聚合酶明显增多 D. 组蛋白成倍增加 B-九-13. 在有丝分裂中，（）。 A. 细胞周期长短主要由S期长短决定 B. 这个时期对不利条件敏感导致G1期阻滞 C. S期的长短与染色体的倍数有关
主要概念名词解释 细胞全能性：指细胞经分裂和分化后仍具有形成完整有机体的潜能或特性。 分化：指做工作使之瓦解；非特化的早期胚胎细胞获得特化细胞（如心脏、肝脏或肌肉细胞）特性的过程。 脱分化：已分化的细胞在一定因素作用下恢复细胞分裂能力,失去原有分化状态的过程。 再分化：已经脱分化的愈伤组织在一定条件下，再分化出胚状体，形成完整植株。 外植体：植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。 组织培养：植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。器官或细胞，原生质体等，通过无菌 操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或 生产具有经济价值的其他产品的技术。植物组织培养概念 （狭义）指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉 组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从 各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成 再生植物。 愈伤组织：指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。 它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组 织的活细胞。 定芽：生长在枝上有一定位置的芽称为定芽。象顶芽、腋芽、副芽
等均在一定部位生出的芽，称为定芽． 不定芽：从叶、根、或茎节间或是离体培养的愈伤组织上等通常不形成芽的部位生出的芽，则统称为不定芽。 继代培养：指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织 转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。消毒：指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。 人工种子：将组织培养产生的体细胞胚和性细胞胚包裹在能提供养分的胶囊里，再在胶囊外包上一层具有保护功能和防止机械损 伤的外膜，形成一种类似于种子的结构。 褐变：饲料在加工过程中或长期贮存于湿热环境下，其所含的氨基化合物如蛋白质、氨基酸及醛、酮等与还原糖相遇，经过一系列 反应生成褐色聚合物的现象称为褐变反应，简称褐变。 污染：指自然环境中混入了对人类或其他生物有害的物质，其数量或程度达到或超出环境承载力，从而改变环境正常状态的现象。玻璃化：将某种物质转变成玻璃样无定形体（玻璃态）的过程，是一种介于液态与固态之间的状态，在此形态中没有任何的晶体结 构存在。 体胚：由体细胞发育成的胚。又称体细胞胚。 茎尖培养：把茎尖的分生组织或包括有此分生组织的茎尖分离进行无菌培养的方法。
本章主要内容 ●商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备 ●培养基及其配制 ●外植体的选择与培养 ●试管苗的驯化与移载 第一节商业性组织培养实验室和小工厂 的设计与主要设备 ●培养皿的清洗； ●培养基的配制、分装和高压灭菌； ●无菌操作——材料的表面灭菌和接种； ●将培养物放到培养室培养； ●试管苗的驯化、移栽和初期管理。 (一)、洗涤室(cleaning room) ●洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。 ●室内配备： ●大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。 ●备有塑料筐，用于运输培养器皿。 ●备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。 (二)、准备室(repairing room) ●完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。准备室要求明亮、通风。 ●如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与 培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。 (三)、缓冲室 ●进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。 ●应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。控制无菌室及培养室的配电板等。 (四)、无菌操作室(transfering room) ●接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏 对组织培养成功与否起重要作用。 ●配置：
●在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁 尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。 ●接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射 灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对 流。 (五)、培养室(culturing room) ●培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、 数目、及其他附属设备而定。 ●设计原则： ●充分利用空间和节省 ●能源 ●高度比培养架略高为 ●宜 ●周围墙壁要求有绝热 防火的性能。 (五)、培养室(culturing room) ●培养架大多由金属制成。 ●规格： ●一般设5层，最低一层离地高约10 cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左 右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3 m，30 W 的长1m，宽度一般为60cm。 ●培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或 立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70％-80％为好，可安装加湿器。 ●控制日光照时间可安装定时开 关钟，一般需要每天光照10-16h。也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。 (六)、驯化室 ●驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、 通风口以及必要的杀菌剂。 (七)、温室 ●应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必 要的杀菌杀虫装置及相应药剂。 二、仪器设备和器皿用具 ●常见仪器设备 ●1、超净台 ●2、无菌箱 ●3、空调机
试卷编号NO： 高等函授教育《植物组织培养》试题 学号：姓名： 一名词解释：（10*2分=20分） 1、植物细胞组织培养 2、细胞全能性 3、脱分化 4、外植体 5、试管苗驯化 6、间接不定芽发生 7、双极性 8、微体嫁接 9、人工种子 10、体细胞无性系变异 二填空：（30*1分=30分） 1、目前植物组织培养应用最广泛的方面是 和。 2、由脱分化的细胞再分化出完整植株有两种途径，一种叫做，另一种叫做。 3、培养用具的常用灭菌方法有、、 。 4、某些生长调节物质及抗生素、酶类物质遇热不稳定，对其灭菌时不能进行，而要进行。 5、一般来说，黑暗条件下有利于的增殖，而往往需要一定的光照。 6、植物离体授粉技术通常包括、、 三个方面。 7、一般液体培养的继代时间较短，继代一次；而固体培
养继代时间可以长些，继代一次。 8、外植体器官发生的三种途径包括、、。 9、从再生植株倍性来看，小孢子培养通常产生植株，胚 培养通常产生植株，通常产生三倍体植株。 10、脱毒苗鉴定与检测的主要方法有、、 、。 11、在生长素中，对于许多作物花粉的启动、分裂、形成愈伤组织和胚状体起着决定性作用，但是对却有抑制作用。 12、用平板培养法培养单细胞或原生质体时，常用 来衡量细胞培养效果。 13、用药剂处理是诱导染色体加倍的传统方法。 三计算题（1*10分=10分） 某培养基的配方是MS＋BA 2.0mg/L＋NAA 0.5mg/L＋2.5%蔗糖＋0.7％琼脂粉。MS母液的浓度分别是：大量元素２０倍，微量元素500倍，铁盐100倍，有机物５０倍；BA母液浓度1.0 mg/ml ，NAA母液浓度0.1mg/ml。要配制400ml 该培养基，需要吸取各种母液各多少ml？分别称取蔗糖、琼脂粉各多少克？（要求写出计算步骤）四简答题（5*5分=25分） 1、造成组织培养过程中发生污染的原因有哪些？如何有效控制污染？ 2、简述外植体消毒的一般步骤。
细胞生物学复习资料 第一章绪论 1.什么叫细胞生物学 细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学，它是在不同层次（显微、亚显微与分子水平）上以研究细胞结构与功能、细胞增殖、分化、衰老与凋亡、细胞信号传递、真核细胞基因表达与调控、细胞起源与进化等为主要容。核心问题是将遗传与发育在细胞水平上结合起来。 第二章细胞基本知识概要 一、名词解释 1.古核细胞：也称古细菌，是一类很特殊的细菌，多生活在极端的生态环境中。具有原核生物的某些特征，如无核膜及膜系统；也有真核生物的特征。 2.含子：是基因不编码蛋白质的核苷酸序列，不出现在成熟的RNA分子中，在转录后通过加工被切除。大多数真核生物的基因都有含子。在古细菌中也有含子。 3.外显子：指真核细胞的基因在表达过程中能编码蛋白质的核苷酸序列。 二、简答 1.真核细胞的三大基本结构体系 （1）以脂质及蛋白质成分为基础的生物膜结构系统； （2）以核酸（DNA或RNA）与蛋白质为主要成分的遗传信息表达系统 （3）由特异蛋白分子装配构成的细胞骨架系统。 2.细胞的基本共性 （1）所有的细胞都有相似的化学组成 （2）所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜，即细胞膜。 （3）所有的细胞都含有两种核酸：即DNA与RNA作为遗传信息复制与转录的载体。 （4）作为蛋白质合成的机器─核糖体，毫无例外地存在于一切细胞。 （5）所有细胞的增殖都以一分为二的方式进行分裂。 3.病毒与细胞在起源与进化中的关系并说出证明 病毒是非细胞形态的生命体，它的主要生命活动必须要在细胞实现。病毒与细胞在起源上的关系，目前存在3种主要观点： 生物大分子→病毒→细胞 病毒 生物大分子→ 细胞 生物大分子→细胞→病毒（最有说服力） 认为病毒是细胞的演化产物的观点，其主要依据和论点如下: （1）由于病毒的彻底寄生性，必须在细胞复制和增殖，因此有细胞才能有病毒 （2）有些病毒（eg腺病毒）的核酸和哺乳动物细胞DNA某些片段的碱基序列十分相似。病毒癌基因起源于细胞癌基因 （3）病毒可以看做DNA与蛋白质或RNA与蛋白质的复合大分子，与细胞核蛋白分子有相似之处
植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用人工培养基，对离体的植物胚胎、器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称为植物离体培养 离体生态学：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件 外植体：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞 愈伤组织（callus）：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织 植物组织培养的特点 1.组培技术是无菌操作技术。 2.组培材料处于完全的异养状态。 3.组培材料可以是离体状态的器官、组织、细胞或原生质体。 4.组织培养物可以形成克隆（clone，无性繁殖系），也可以进行茎芽增殖或生根 5.组培容器内的气体和环境气体可通过封口材料进行交换，相对湿度通常是几乎100％，因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。 6.组培的环境温度、光照强度和时间都是人为设定的，其参数可调 植物组织培养的研究类型 组织培养 器官培养 胚胎培养 细胞培养 原生质体培养 植物组织培养的研究任务 研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件，细胞、组织或器官的形态发生和代谢规律，植物脱毒方法和机理，植物特别是一些难繁植物的大量快速繁殖方法，细胞融合方法和机理，再生个体的遗传和变异，种质资源的离体保存机理和方法等 德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann于1838-1839年提出的细胞学说 德国植物学家Haberlandt于1902年提出了植物细胞具有全能性 李继侗和沈同1933年成功培养了银杏的胚。 1952年，Morel和Martin提出了植物脱毒（virus free）技术 Guha和Maheshwari等——花药培养 Cocking等-原生质体培养
第一章植物的快速繁殖技术 一、快速繁殖的概念 植物一般通过有性繁殖和无性繁殖两种方式繁衍后代。很多花卉、果树林木和一部分粮食作物，由于它们的高度杂合性，常通过扦插、埋条、压条、嫁接或种植特殊的营养器官等方法进行营养繁殖，从而得到和亲本遗传性一致的后代；有些种子休眠期特别长的作物，用营养繁殖可以加快繁殖的速度；某些多年生作物用种子繁殖时要经过一个很长的幼年期，如用成年植物材料进行营养繁殖，常可大大缩短生长期。这些都是无性的营养繁殖。用组织培养繁殖植物的技术是一种特殊的营养繁殖方式，现在一般称之为“快速繁殖技术”（rapid propagation）或“微繁殖技术”（mic-ropropagation）。它是在无菌条件下，利用植物体的一部分，包括细胞、组织或器官，在人工控制的营养和环境条件下繁殖植物的方法。这可以看作是常规营养繁殖方式的一种扩展和延伸，它不但保持了常规方法的特点，而且还具有以下几个明显的优点：（1）使用的植物材料极少，往往只要少量的茎尖、叶片、剪切段或其他器官就能在试管中建立起反复增殖的系统。这样就可以节省常规营养繁殖时所需要的大量母本植株和因栽培和保持这些母株所需的土地和人力，对于珍贵稀有的植物材料还可能做到不毁坏原有的植株。(2)由于每个外植体产生的芽或胚状体常多于常规繁殖方法，每一个繁殖周期又比常规繁殖短得多，一般只要1一2个月，加上可以不受季节和气候条件的影响进行周年生产，所以繁殖速度往往比常规方法要高得多，繁殖的数量在一年中常可达几万、几十万甚至上百万倍。另外，由于试管中芽、植株或胚状体的小型化和利用多层的集约化培养架，可以在有限的空间生产大量的植株。在实际应用中，某些技术较完善的作物，每平方米培养面积一年约可生产一万到几万株，一个熟练工人一年约可生产数试管苗。如萱草，从30个外植体开始，在1.8平方米的培养面积上，8个月可以生产二万棵试管苗。（3）由于快速繁殖是在无菌的容器中进行的，在繁殖过程中不受病虫的侵害。如果和去病源技术相结合，可以大量生产高质、均一的无病苗木，而这一点用常规方法是很难做到的。这样的无菌无病的试管苗在远距离的运输中和国际交流中都是极安全和方便的，既可以防止病害的传播又可以免去复杂的检疫手续。（4）对于某些植物，组织培养产生的植株的表现型和从种子或常规营养繁殖方法得到的植株会有所不同，其性状要优于原植株。如波士顿蕨的试管植株由于不表现强烈的顶端优势而能形成更多的分枝，使植株形态更美观。非洲紫罗兰的试管植株呈莲座状，而用常规叶插方法得到的植株，叶柄长，整个植株更为直立，园艺性状也较差。 快速繁殖技术除了有上述明显的优点之外，和常规的营养繁殖方法相比也有其固有的一些特点，这方面常常容易被人们忽视而造成工作的失败或资金的浪费。首先，和常规方法相比较，要建立一个比较完整的组织培养实验室，需要相当的投资。在发达国家目前约要几万美元，在我国如建立一个包括实验室、培养室和有一定温室面积的系统也要投资几万、十几万以至几十万元，而且如完全使用电能调控光照和温度的话，运转费用也是相当可观的（我国大部分地区夏天需要降温，冬天需要升温，潮湿地区又需去温，以及培养的光照，都要消耗大量的电）。其次，此项工作对人员的要求比较高，除了要求能熟练和严格地进行无菌操作之外，对培养物的生长、分化和它的控制方法要有所了解。在探索一种新的植物的快速繁殖时需要进行大量的系统研究，这就要求有一定的理论知识和实践经验。另外，由于这种方法有可能在短时期内从极少量的外植体产生大量的新植株，所以在材料的选择、工艺流程稳定性的控制、周年生产中的各个环节的安排和衔接上要作精心的组织，否则常可能由于某一环节的失误而导致整个工作的失败。如由于选择了不良的原始材料（不良的基因型、未发现的变异体等），或在培养过程中由于培养方法不当，或因其他原因产生的遗传变异未能及早发现等，而导致最后产生大量的具有严重缺陷的植株。这一点在多年生木本植物中的后果 些性状要经过几年以至几十年的时间才表现出来。在某些培养系统中还会出现对于生产不利的遗传变异，如试管苗中残留的细胞分裂素效应常使分枝过多而影响某些作物的经济性状。 二、快速繁殖技术发展史简略
0．填空 1.根据培养的材料,植物组织培养分:愈伤组织培养、(器官培养、细胞格养、原生质体培养(悬浮培养 2.植物组织培养的发展分为三个阶段:萌芽阶段、奠基阶段，快速发展和快速发展和应用阶段 3，1902年,Haberlandt提出了植物细胞“全能性”学说,1934年, White出版了《植物组织培养手册》培养等类型从而使植物组织培养为一门新兴学科。 一．填空、 1，组织培养实验室必要的设备有超净工作台、高压灭菌器、调机、_天平、显微镜、_蒸馏水，发生器，酸度计 养基成分主要包括①无机营养成分、②有机营养成分)、_③植物生长调节物质、_④碳水化合物、⑤其它物质 3、培养基最常用的碳源是_蔗糖,使用浓度在1%-5%常用3% 4、糖在植物组织培养中是不可缺少的,它不但作为离体组织棱以生长的碳源而且还能维持培养基渗透压 5、在固体培养时琼脂是使用最方便、最好的凝固剂和支持物般用量6-10g/L之间 6.驯化的目的:在于于提高试管苗对外界环境条件的适应性,提高其光合作用的能力,促使试健壮,提高苗的移裁成活 7、生长素/细胞分裂素的高低决定着外植体的发育方向,其比值高:有利于根的形成和愈伤组织的形成:低:有利于芽的形成 8、培养基灭菌一般在108kPa的压力下,锅内温度达_121℃C,维持_20-30min、 9.选择外植体时应选择①选择优良的种质、②选健壮的植株、③选最适的时期和④选取适宜的大小。 10、诱导胚状体比诱导芽的优点:(1)数量多、(2)速度快、_(3)结构完整 11、试管苗的生态环境:高温且恒温、高湿、弱光、无菌 12、培养基中加入活性炭的目的:利用其吸附能力,减少一些有害物质的影响大 13、筛选培养基的方法:单因子试验法、多因子试验法、广谱实验法 14、植物培养技术:灭菌、接种种、培养、驯化四个环节 15、试管苗的驯化注意:基质、温、光、水、肥、气的综合管理 二．填空 1.绝大多数培养植物再生植株时都先经过愈伤组织阶段 2.愈伤伤组织形成大致经历诱导期、分裂期一和分化期三个时期 3、愈用植物生长调节物质时要注意:种类和浓度生长素和细胞分裂素的比值4.愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体方式 5.组织培养细胞再分化包括四个水平:细胞水平的再分化、组织水平的再分化、器官水平的再分化(器宣发生)和植株水平的分化 三．填空: 1.植物器官培养主要是指植物的根、茎、叶、花器和幼小果实的无菌培养。 2、茎尖培养根据培养目的和取材大小分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型。前者主要是对茎尖长度不超过,最小只有几十微米的茎尖进行培养,目的是获得无病毒植株:后者是对几毫米乃至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养,目的是离体快繁 3.不定芽产生的途径一是从外植体上直接产生二是从由外植体诱导产生的愈伤组织上产生 4.离体叶培养是指包括叶原基、叶栖、叶鞘、叶片、子吐等叶组织的无菌培养 5.在离体叶培养中,6-BA和KT利于芽的形成;24D利于愈伤组织的形成 四．填空 1、胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养 2、离体胚的培养分为二种类型:。成熟胚培养和_幼胚培养六
第一章绪论 六、论述题 1、什么叫细胞生物学？试论述细胞生物学研究的主要容。 答:细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学,它是在三个水平(显微、亚显微与分子水平)上，以研究细胞的结构与功能、细胞增殖、细胞分化、细胞衰老与凋亡、细胞信号传递、真核细胞基因表达与调控、细胞起源与进化等为主要容的一门科学。 细胞生物学的主要研究容主要包括两个大方面：细胞结构与功能、细胞重要生命活动。涵盖九个方面的容：⑴细胞核、染色体以及基因表达的研究；⑵生物膜与细胞器的研究；⑶细胞骨架体系的研究；⑷细胞增殖及其调控；⑸细胞分化及其调控；⑹细胞的衰老与凋亡；⑺细胞的起源与进化；⑻细胞工程；⑼细胞信号转导。 第二章细胞的统一性与多样性 一、名词解释 1、细胞；由膜转围成的、能进行独立繁殖的最小原生质团，是生物体电基本的开矿结构和生理功能单位。其基本结构包括：细胞膜、细胞质、细胞核（拟核）。 2、原核细胞；没有由膜围成的明确的细胞核、体积小、结构简单、进化地位原始的细胞。 8、原核细胞和真核细胞核糖体的沉降系数分别为70S和 80S 。 9、细菌细胞表面主要是指细胞壁和细胞膜及其特化结构间体，荚膜和 鞭毛等。 10、真核细胞亚显微水平的三大基本结构体系是生物膜结构系统、遗传信息表达系统，和细胞骨架系统。 三、选择题 1、大肠杆菌的核糖体的沉降系数为（ B ） A、80S B、70S C、 60S D、50S 3、在病毒与细胞起源的关系上，下面的（ C ）观战越来越有说服力。 A、生物大分子→病毒→细胞 B、生物大分子→细胞和病毒 C、生物大分子→细胞→病毒 D、都不对 8、原核细胞的呼吸酶定位在（ B ）。 A、细胞质中 B、质膜上 C、线粒体膜上 D、类核区 7、细菌核糖体的沉降系数为70S，由50S大亚基和30S小亚基组成。（√） 五、简答题 1、为什么说支原体是目前发现的最小、最简单的能独立生活的细胞生物？ 答：支原体的的结构和机能极为简单：细胞膜、遗传信息载体DNA与RNA、进行蛋白质合成的一定数量的核糖体以及催化主要酶促反应所需要的酶。这些结构及其功能活动所需空间
细胞周期分析原理和分析结果解释 1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。 可分为四个阶段（见图）： ① G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间； ② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期； ③ G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间； ④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。 2、从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类： ①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。 ②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。 ③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。 细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人了成纤维细胞18小时，CHO 细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。 3、流式细胞结果图各参数的意义： 前面讲过，常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：
G1期：细胞DNA复制还没有开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰； S 期：细胞开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）； G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第二个峰； M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。 上图是DOS系统下分析细胞周期的一个示意图。不同的机器分析结果参数表示略有不同，但主要看G1、G2、S三个期的数值即可。 1、纵坐标Cell Number：即计数到的有效细胞数； 2、横坐标DNA Content：即DNA量，为什么用DNA量来区别各周期我们等下再讲； 3、G1、G2、S三期在上图已经用箭头标示； 4、右侧数字含义：Mean G1=195.4即G1期DNA含量平均值为195.4；%G1=73.6即G1期细胞数占总数的73.6%；以此类推……
蝴蝶兰植物组织培养全过程 一实验目的： 1 掌握植物细胞组织培养的原理和方法； 2了解植物组织培养的方法； 3 学习植物组织培养的原理； 4 了解不同浓度BA对蝴蝶兰生根的影响； 5了解炼苗的作用； 6掌握训化的方法步骤； 7观察蝴蝶兰组织培养到种植的全过程，并注意其中出现的问题。 二实验原理： 蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属植物,因花型奇特、色彩艳丽、花期长久而享有“洋兰皇后”的美誉。蝴蝶兰原产于缅甸、菲律宾、台湾、马来西亚、印度尼西亚等热带亚洲地区,具有极高的观赏和经济价值,是国际上最具商业价值的四大观赏热带兰之一。蝴蝶兰属单茎性气生兰,再生能力弱,很难进行分株繁殖,且种子无胚乳,自然条件下难以萌发,增殖系数低,难以满足日益增长的市场需求。应用植物组织培养技术进行蝴蝶兰快速繁殖可以缩短繁育周期,获得大量成株,并可以保持优良性状,维护种质资源,是蝴蝶兰快速繁殖的有效途径。在以蝴蝶兰根尖、茎尖、叶片和花梗芽为外植体诱导原球茎时,由于根尖的诱导率低,摘取茎尖会损失母株等原因,因此在蝴蝶兰组织培养中根和茎都不是诱导原球茎的理想材料。而蝴蝶兰叶片和花梗芽作为外植体诱导圆球茎时,其诱导率较高、对母株伤害不大,是较为理想的外植体材料。 三材料与用具： 蝴蝶兰的茎尖、1/ 2MS +BA2. 5 mg/L + NAA0. 2 mg/L花梗腋芽诱导培养基、1/ 2 MS + BA3. 5 mg/L + KT1. 0 mg/L + NAA0. 5 mg/L + 椰乳10 %增殖培养基、母液、量筒、烧杯、玻璃棒、移液管、无菌水、高压灭菌器、容量瓶、pH试纸、75%酒精、2%次氯酸钠、镊子、解剖刀、超净工作台、95%酒精、穴盘等。 四方法与步骤 （1）母液的配制 根据需要的母液量配制母液，配好后要贴好标签，以防弄错。标签上要注明是什么母液和母液的稀释倍数。将配好的母液进行储藏，要用的时候可以方便使用。 配制培养液时应注意：
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
试卷编号NO: 高等函授教育《植物组织培养》试题 学号: 姓名: 一名词解释:(10*2分=20分) 1、植物细胞组织培养 2、细胞全能性 3、脱分化 4、外植体 5、试管苗驯化 6、间接不定芽发生 7、双极性 8、微体嫁接 9、人工种子 10、体细胞无性系变异 二填空:(30*1分=30分) 1、目前植物组织培养应用最广泛的方面就是 与。 2、由脱分化的细胞再分化出完整植株有两种途径,一种叫做 ,另一种叫做。 3、培养用具的常用灭菌方法有、、 。 4、某些生长调节物质及抗生素、酶类物质遇热不稳定,对其灭菌时不能进行 ,而要进行。 5、一般来说,黑暗条件下有利于的增殖,而往往需要一定的光照。 6、植物离体授粉技术通常包括、、 三个方面。 7、一般液体培养的继代时间较短, 继代一次;而固体培养继代时间可以长些, 继代一次。 8、外植体器官发生的三种途径包括、、。 9、从再生植株倍性来瞧,小孢子培养通常产生植株,胚培养通常产生植株, 通常产生三倍体植株。 10、脱毒苗鉴定与检测的主要方法有、、 、。 11、在生长素中, 对于许多作物花粉的启动、分裂、形成愈伤组织与胚状体起着决定性作用,但就是对却有抑制作用。 12、用平板培养法培养单细胞或原生质体时,常用 来衡量细胞培养效果。 13、用药剂处理就是诱导染色体加倍的传统方法。 三计算题(1*10分=10分) 某培养基的配方就是MS＋BA 2、0mg/L＋NAA 0、5mg/L＋2、5%蔗糖＋0、7％琼脂粉。MS母液的浓度分别就是:大量元素２０倍,微量元素500倍,铁盐100倍,有机物５０倍;BA母液浓度1、0 mg/ml ,NAA母液浓度0、1mg/ml。要配制400ml该培养基,需要吸取各种母液各多少ml？分别称取蔗糖、琼脂粉各多少克？(要求写出计算步骤) 四简答题(5*5分=25分) 1、造成组织培养过程中发生污染的原因有哪些？如何有效控制污染？ 2、简述外植体消毒的一般步骤。 3、胚培养在科学研究及生产实践中有哪些应用？ 4、结合花粉培养,简述瞧护培养法。
培养细胞的细胞生物学 一、体内、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。且不论其有许多性状仍与体内相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto－genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启引起的现象，这并非是绝对缺陷。恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。 2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。 二、体外培养细胞的分型 （一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型： 1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。 2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密