液相色谱仪基本操作培训
一、HPLC常规分析操作步骤及规程
1）严格过滤色谱纯流动相，根据需要选择不同的滤膜
2）对抽滤后的流动性进行超声脱气20-30min
3）首先进行液相色谱仪使用登记，更换需要使用的色谱柱。4）打开仪器泵系统的电源开关，仪器启动自检完成后，打开色谱工作站，进行参数设置。
5）松开排气旋钮，进行排气处理。
6）调节流速，初次使用新的流动相，可以需要先关注压力，根据压力的情况调节合适的流速
7）基线稳定后即可进样分析，分析样品时对样品的前处理非常重要
8）分分析实验结束后，先关检测器氘灯，根据流动相的成分和所分析样品的溶解性，用相应的冲洗液冲洗液路。如果流动相成分中含盐，必须用含甲醇10％左右的甲醇水溶液充分冲洗系统（冲洗时间不少于40分钟），再用相应的色谱柱保护液（反相色谱柱用乙腈或甲醇，正相色谱柱用正己烷或正庚烷）冲洗色谱柱约20-30分钟
9）冲洗完毕后，停止泵系统，关闭电源。卸下色谱柱，封口保存10）检查系统处于停止状态，电源断开后方可离开。
二、使用注意事项：
1、液路系统
1）试剂首先必须是色谱级的
2）脱气：由于流动相中含有微量的空气，经泵的压力左右，会在流通池里产生气泡，这对分析产生一定的影响，如噪音增大，甚至于掩盖信号峰，因此，流动相在使用前必须经超声脱气20min以上
3）过滤：由于流动相里面有微小的颗粒杂质，如不经过过滤，会使单向阀堵塞，从而产生压力波动。同时样品溶液注入液相色谱仪之前也要采用0.45um的滤膜过滤，这一点很多操作人员不太注意，等到产生压力波动又不知道什么原因产生的。
4）在线过滤器必须埋于液面以下。
5）液路中的软管保持平整，避免受挤压。
6）泵运行过程中，不可进行液路的连接和拆卸。
7）泵运行中的系统压力一般不可超过250kg。如果压力过高，会引起进样阀泄露，严重时会引起泵的毁坏。
8）进行液路的连接和拆卸（排气、更换色谱柱、液路管等）时，必须先停泵，等压力降至10附近才可进行更换。
9）泵的关闭：仪器断开电源前，必须先停泵，等压力降至10左右才能关闭电源开关。
10）泵系统的停置：如果仪器使用了水性缓冲剂（尤其是腐蚀性强的卤化物盐类）时，泵停置前应用大量的水性溶剂冲洗，然后用有机溶剂冲洗。否则腐蚀盐在系统内保持不动，会严重的减少不锈钢元件的寿命。
11）系统所有管路、连接部件、密封部件及泵头，在更换之后都必须按一定程序进行清洗（丙酮---无水乙醇---二次蒸馏水顺次冲洗）后
再用氮气吹干。
12）泵头单向阀的清洗：长期使用过程中单向阀容易被污染，将单向阀取下，放入丙酮或异丙醇中超声处理半小时即可，超声时要让单向阀保持竖直状态。
13）泵头的清洗：位于泵头后部的两根四氟液路管为清洗管，若流动相中含有盐的比例较大时，必须对液路进行清洗，清洗步骤如下：将一根清洗管放入到过滤过的蒸馏水中，蒸馏水瓶放置在高处；用针管吸另一根清洗管当有水滴出时将其放在一空瓶中，空瓶放在低处，在实验过程中一直对泵头进行清洗直到实验结束。泵头每月要定期冲洗一次，时间为1小时。
14）若泵运行时压力突然上升，说明液路有堵塞的地方，检验方法遵循从后往前的原则，逐段拆下后，若压力下降说明此段堵塞，更换或冲洗即可。
15）泵工作时要注意流动相不要被用完，设置警戒停泵溶剂量，否则空泵运转会加快磨损柱塞杆和密封圈。输液泵的压力不要太高，否则会使密封圈变形，降低密封圈使用寿命
2、色谱柱
1）连接时注意流向的正确性
2）新柱在使用前必须仔细阅读使用说明书后，按说明书的要求使用。3）色谱柱长时间保存时，需用相应的色谱柱保护液进行保护，正相色谱柱一般保存于纯正己烷中，反相色谱柱一般保存于纯甲醇或乙腈中，柱接头要拧紧，仿制保护液挥发失去保护的作用。
4）连接色谱柱及其他不锈钢管时，需细心，各个接头需配套，不可
用力过猛。否则会出现系统漏液或色谱柱柱效降低的情况。
5）流经反相色谱柱的流动相发生改变时，不可从有机溶剂直接全部变为水，反之亦然。
6）若冲洗色谱柱时间较长，注意流动相的体积和流速的大小，以及废液瓶的装量情况。
7）色谱柱应避免压力和温度的急剧变化以及机械震动。在进样的时候，进样阀扳手不能转动太慢，更不能停留在中间，如停留在中间，泵内压力剧增，这时再转动到进样位置时，过高的压力会损坏色谱柱。如出现机械震动（掉在地上）则会改变填料的充填状态。
8）以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃，为了改善分离度可适当提高色谱柱的使用温度，但不能高于60℃。
9）流动相的pH值大于8时，可使载体硅胶溶解，当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。因此选择色谱柱时应注意，当色谱系统中需要使用pH值大于8的流动相时，应选用耐碱性的填充剂，当色谱系统中需要使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸性的填充剂。现在的色谱柱商品有很多种，也开发了很多耐酸碱的色谱柱，选择时应注意其使用的范围。
10）色谱柱的再生
因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。
（1）、反相柱的再生：依次采用20-30倍的色谱柱体积的用甲醇冲洗，用二氯甲烷冲洗，再用甲醇冲洗。
（2）、正相柱的再生：依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱。
3、检测器
1）检测器的氘灯有使用寿命，平衡色谱柱或冲洗液路时可关闭氘灯。2）氘灯关闭后再次开启中间的间隔时间至少为5分钟。
3）检测器的流通池在分析过程中容易被污染而导致基线无法平衡时，需要对检测器进行清洗，一般先采用水－甲醇（约90﹕10）冲洗30分钟，然后用流速为2ml/min的30％的硝酸冲洗30分钟，然后用纯水冲洗直到流出的水溶液显中性，然后在用纯甲醇冲洗2分钟即可。
三、HPLC系统日常维护保养操作程序（适用于所有液相色谱仪）
1、HPLC的日常操作环境条件：温度：10—30℃；相对湿度<80％；应远离高电干扰、高振动设备。仪器应避免强酸、强碱的腐蚀，避免流动相及其他异物进入仪器内部。
2 、流动相处理
2.1 流动相均需色谱纯度，水用去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
2.2 流动相使用前需用0.45um的适当滤膜进行过滤。
2.3 对抽滤后的流动相进行超声脱气5分钟。如果流动相由缓冲液和色谱纯有机溶剂混合组成，应先将缓冲液过滤，按比例将缓冲液和有机溶剂混匀后再超声脱气。
2.4 所有过柱子的液体均需严格的过滤。
2.5正常情况下，样品测试前仪器首先用不含盐的流动相或（50％甲醇或50％乙睛）冲洗10-20分钟，然后再进入测试用流动相【如流动相为缓冲试剂，则先要用90%水（10%流动相相应的有机相）冲洗
10-20分钟，直至色谱柱中有机相冲净为止】。
2.6 每次在使用流动相时，必须先观察流动相内是否有异物及浑浊，如有则不能使用。
2.7 配好的流动相应贴好标签，并做好相应的配制记录，过期的流动相不能使用，对于含有缓冲盐的流动相一般应新鲜配制使用，如果确实需要贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，使用前必须过滤。
2.8 避免使用金属腐蚀性溶剂。
2.9避免使用腐蚀石英及损坏检测池光学特性的碱性溶剂。
2.10 应根据流动相的使用情况，配制相应量的流动相，避免浪费。
2.11 储存流动相的瓶子随时保持加盖状态，防止灰尘掉入和有机溶剂挥发，保护实验人员身体健康。
3、泵的维护保养：
3.1 使用流动相尽量要清洁；
3.2 进液处的砂芯过滤头每月应定期清洗：先用洗液浸泡，再用水超声清洗2-3次，再用水煮2-3次，最后用甲醇浸泡处理。
3.3 流动相交换时要防止沉淀；流动相交换时应逐步过渡到要换的流动相，特别是交换后易产生沉淀的流动相。
3.4 避免泵内堵塞或有气泡；每次使用时做排气泡处理。排气时，旋开清洗阀1 1/2圈左右，用4mL/min流速排气泡，旋紧时不得过紧。
3.5 泵壳体必须保持清洁，清洁时用一柔软的擦布沾上少许水或中性去污剂的水溶液轻轻擦拭，不要用过分湿润的擦布，以免液体流进泵内。
3.6 当压力不稳定波动，运行渗漏测试证实后，需要更换球形输出阀。
3.7 通过过滤芯的压力大于10bar时，提示过滤芯有污染物或阻塞现象，用纯甲醇浸泡过滤芯并于超声波清洗器进行清洗，如清洗后仍不能正常工作应提出申请更换过滤芯。
3.8 泵头低的一端出现渗漏，说明泵密封圈破损，需要更换密封圈。
3.9 在仪器正常运行过程中，不得使泵在没有流动相的情况下空运行。
3.10 带Seal wash的设备，在使用有盐流动相时应开Seal wash，用10％异丙醇水溶液冲洗，冲洗速度为每分钟2～3滴。注意冲洗溶液应每周更换一次。
3.11 岛津仪器使用含盐流动相后，应用纯化水冲洗泵壳。
4、进样器的维护保养：
4.1 每次分析结束后，要反复冲洗进样口及进样针，防止样品的交叉污染；
4.2 进样针要使用专用的配套进样针，使用前后均要处理干净，避免污染；不得使用气相色谱仪的尖头进样针。
4.3 手动进样器不使用时，将带注射器的进样针插上或套上注射器帽，避免灰尘或异物进入。
4.4 所有样品进样前必须经过过滤，不得将未溶解异物或样品注入进样器。
4.5 若使用自动进样器，在取样机械臂活动范围内不应有任何的管线或其他阻挡取样的物品出现。
4.6 自动进样器六通阀上的进出口管线未经许可不得随意拆卸。
4.7 样品检测完后，应清洗自动进样器进样针。
5、色谱柱的保养：
5.1 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。
5.2 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；联结时松紧程度要适当，避免漏液及过紧损坏联结处，特别是不同类型仪器间色谱柱的连接。
5.3 要注意流动相的脱气，避免使用高粘度的溶剂作为流动相。5.4 压力不能太大，最好不要超过200Bar。
5.5 进样样品要提纯；严格控制进样量。
5.6 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品。
5.7 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱，不得使用纯水冲洗色谱柱；如使用了含盐的流动相，应先用10％不含盐的有机相（有机相为流动相中所含有的有机相）溶液冲洗柱20分钟，然后用不含盐的流动相或50％甲醇（或乙睛）冲洗柱30分钟，再用甲醇或乙睛冲洗柱子20分钟。
5.8 若分析柱长期不使用，反向色谱柱应用100％甲醇保存并两端封闭严实，平放于规定的地方。严禁色谱柱未经冲洗就存放。
5.9 应注意色谱柱的适用范围，如pH值等，以及流动相在色谱柱中的流动方向。
6、检测器的维护保养：
6.1 紫外灯的保养：在分析前、柱平衡得差不多时，方可打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。
6.2 启用新的紫外灯时，应将灯的使用时间清零。使用时应观察紫外灯的使用时间，当紫外灯达到使用寿命时及时更换。
6.3 检测器不得频繁开关电源。
6.4 检测器应保持清洁，平时可用软布蘸取少许水或温和洗涤剂的水溶液进行清洗。清洗布不要过分润湿以防止液体流入检测器内。
6.5 在检测过程中如发现噪声或漂移超过规定的应用限制或灯不亮时说明紫外灯出现了故障或已经达到了紫外灯的使用期限，应申请更换氘灯，更换后应进行VWD测试。
6.6 如出现渗漏或由于污染使流通池窗口的强度降低,流通池出现背景较高，应用相同的有机溶剂如纯甲醇低流速长时间冲洗流通池，如仍不能正常工作通知设备员，上报设备部申请维修或更换流通池。更换完毕后应做密封测试。
6.7 DAD检测器维护：在使用DAD检测器时，如果不要求进行波长扫描或峰纯度检测，应将spectral项下的store 选择None，不得选择
其他值。进行波长扫描或峰纯度检测时选择All。
7、色谱工作站的维护
7.1 方法设定按液相色谱标准操作规范（SOP）进行，其它参数不得随意更改。
7.2 数据文件不得覆盖、修改、删除，各品种检测数据应按规定存放于相应目录下，不得擅自创建、修改或变动目录。
7.3 未经培训合格的人员不得使用色谱工作站及色谱仪。
8、系统维护
8.1 严格按照操作规程进行操作；系统不得随意拆卸，如发生故障及时报告主管做出妥善处理，并如实在使用记录上填写好“检验仪器故障及异常情况登记记录”，不得擅自进行处理。
8.2 关机时，先关色谱工作站，再关液相色谱仪。
8.3 如实填写好仪器使用登记。
8.4 仪器使用人员应对仪器的正常运行负责，在使用仪器前及仪器使用过程中应确定仪器状态，确保在仪器正常状态下进行分析事件。
8.5 仪器使用结束后，应做好仪器的清洁，并清理好现场，做好维护保养记录。
四、故障排除
1、HPLC系统中气泡对检测的影响及其解决方法
在我们进行液相色谱分析时，有时也会遇到这样一个问题，系统的流路中存在气泡，由于气泡的存在，会造成色谱图上出现尖锐的噪音峰，严重时会造成分析灵敏度下降；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，使基线起伏，造成以上现象的主要原因有三项：
1）是流动相溶液中往往因溶解有氧气或混入了空气而形成的气
泡；
2）是系统开始工作时未能将流路中的空气驱赶干净造成的；
3）是在进样时不注意混入了空气造成的
为了避免这类问题的出现，液相色谱实际分析过程中必须重视对流动相进行脱气处理，流路系统存在气泡可采用以下几种方法解决：1）采用大流量的方式驱赶气泡：取下色谱柱，采用双通替代色谱柱连接后采用大流速的方式将系统中的气泡排除。
2）吹氮排气法：将高纯氮气接入管路，在0.1Mpa压力下，将整个系统中的液体和气泡一并吹出，再重新采用流动相将系统冲洗。
2、压力和流量不稳。原因①可能有气泡；②单向阀污染，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗；③沙滤棒内有杂质或微生物堵塞，可将沙滤棒浸入流动相中超声清洗，也可将滤头放入4mol/l硝酸溶液中，迅速除去微生物。也可能是盐堵塞，可放入水中清洗；④在线过滤器堵塞⑤进样阀损坏；⑥密封圈性能不好。
3、压力过高。①管路堵塞；②保护柱堵塞；③检测池堵塞，发生情况立即停泵，否则会损坏流通池。
高效液相色谱基本概念和术语 第一篇：高效液相色谱基本概念和术语 高压液相色谱HPLC培训教程(一)I．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压-压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。高速-流速为0.1~10.0 ml/min。 高效-可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快-通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min 内即可完成。分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
Ultimate 3000型高效液相色谱仪自主操作培训教材 福州大学测试中心 2018年9月
第一部分 Ultimate 3000型高效液相色谱原理和仪器配置
一、液相色谱原理简介 1、色谱法起源 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 2、液相色谱法的分离原理 溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相(stationary phase)时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子交换、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。英文为High Performance Liquid Chromatography，简称为HPLC。 3、HPLC分离模式 包括反相模式 (RP-LC)；正相模式 (NP-LC)；离子对色谱 (IPC)；离子交换色谱 (IEC)；体积排阻色谱 (GPC/GFC)；亲和色谱（AC）等。其中，反相和正相模式又属于液液分配色谱。 •流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（常用反相柱）。
4、HPLC与经典液相色谱方法以及气相色谱（GC）方法的比较 4.1 HPLC与经典液相色谱方法比较 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。 4.2 HPLC与GC比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，占有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。 5、HPLC应用 由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。可应用于氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析。 二、HPLC基本术语和色谱图 色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生
L600系列液相色谱仪培训内容 一、基本原理 色谱技术是利用待测组分与流动相、固定相之间的作用（分配系数）不同，从而实现分离的过程。 先解释2个名词： 1、流动相：顾名思义是在整个系统中处于流动状态的流体。流动相是液体的叫液相（就是 我们今天要学习的这一款仪器），起到运输样品和参与组分分离的作用。流动相是气体的叫气相，只起运输样品的作用。 2、固定相：是静止不动的一相，装填或涂布于色谱柱内，参与组分分离。 “分离”是色谱区别于光谱仪器最大的特点和作用，一般的光谱仪器只能通过波长等特性从混合物中去选择待测物，一般一次只能检测一种物质；而色谱能够将复杂的混合物逐一分离成单一组分，逐个检测，可以实现多种组分的同时分析，比如我们熟悉的色素，苏丹红 1、2、3、4，就可以一针进样同时检测。 二、仪器结构及各部分的使用要点 液相色谱一般由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统构成。下面我们按照这个组成的顺序逐一讲解每一部分的使用要点。 1、输液系统 输液系统顾名思义就是用来输送流动相的部分，它包含了“输”和“液”两部分，“输”的部分就是指高压输液泵，它就像我们人体的心脏一样，是一切动力的源头，没有它液体不可能流动。“液”就是指流动相了，它就像我们人体的血液一样，在泵给与的动力下，运送到整个系统。下面分别讲解这两部分的使用方法和注意事项。 （1）流动相 a、流动相类型：我们一般使用的流动相有三种类型，第一种是纯的有机溶剂，如甲醇、 乙腈、四氢呋喃等，其中甲醇是最常用的，通常用它来冲洗平衡系统，C18柱在工作完后需要保存在纯甲醇中。第二种是检测样品用的流动相，根据标准或方法来配置，通常含有缓冲盐。第三种是10%-20%的甲醇水溶液（比例并不需要非常的准确），它是用于纯有机溶剂与含有缓冲盐的流动相之间的过渡冲洗液，因为缓冲盐溶于水但不溶于有机溶剂，如果不过渡直接更换，就会使缓冲盐在有机溶剂中析出成结晶盐，造成系统的堵塞，尤其是色谱柱，这是不可逆的损坏。但也不能直接用纯水来
液相色谱质谱联用仪的操作流程液相色谱质谱联用仪（LC-MS）是一种常用的分析仪器，广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。本文将介绍液相色谱质谱联用仪的操作流程，以保证准确的实验结果和最佳的分析效果。 1. 仪器准备 在进行操作之前，需要先进行仪器的准备工作。首先，确保仪器处于正常工作状态，检查液氮和氮气等供应是否充足。检查并调整离子源的温度，通常设置在250-350摄氏度之间。接下来，检查和校准离子注入器和内部标准品的浓度。 2. 样品准备 将待测样品进行适当的前处理工作，如提取、稀释等。确保样品处理的步骤符合分析要求，并且不会对仪器造成损坏。如果需要，可以进行样品的保护，避免样品因为长时间接触大气而发生变化。 3. 仪器设置 打开液相色谱质谱联用仪的软件，并进行仪器参数的设置。根据分析的需要，选择适当的色谱柱和流动相组合。确保流动相的纯度和质量，并根据实验要求调整流速、温度和梯度程序等参数。在设置离子源参数时，根据样品的性质选择合适的离子化方式和离子源温度。 4. 校准和质控
进行仪器的校准和质控工作，以验证仪器的准确性和灵敏度。校准通常使用标准品进行，根据标准曲线来确定待测物的浓度。质控工作包括运行质控样品，监测仪器的性能和稳定性，以及进行数据的准确性和可重复性评估。 5. 样品进样 将经过准备的样品注入到液相色谱质谱联用仪中。通常使用自动进样器来进行样品进样，确保样品进样的精确性和稳定性。根据样品的性质和分析的要求，选择合适的进样方式和进样体积。 6. 分析运行 根据实验需要启动分析运行，控制仪器按照预设的方法进行分析。需要注意的是，在分析过程中要监测仪器的工作状态，确保仪器正常运行。同时，对于出现异常的情况，要及时采取措施进行排除，并记录相关信息。 7. 数据处理 实验完成后，对得到的数据进行处理和分析。通常使用液相色谱质谱联用仪软件或其他统计软件进行数据处理。可以根据实验要求进行峰面积、保留时间等参数的计算和结果的评估。同时，要保存原始数据和相关信息，以备将来参考和验证。 8. 仪器维护 实验结束后，进行仪器的维护工作。包括清洗色谱柱、离子源等部分，保持仪器的干净和良好性能。同时检查仪器的供气供液系统，确
高效液相色谱仪理论及组合培训 高效液相色谱仪（HPLC）是一种基于液相的分析技术，不仅用于化学分析、生物分析、医药检测等领域，还是环保、食品、材料科学等领域中必不可少的分析工具。本文将详细介绍HPLC的理论和组合培训。 一、HPLC理论 HPLC的原理是将分离物质通过液体移动相在填充柱中的固定相上进行分离，通俗地讲，就是利用强化固定相和构造强烈的相互作用力，将混合物分离成不同的组分。相较于传统的液相色谱法，HPLC的操作速度更快，分离效率更高，分离结果也更加精准和可靠。 具体来说，HPLC的分离过程主要通过如下三个步骤来实现： 1. 进样待分离的混合物被吸入自动进样器中，再通过管路进入分离柱； 2. 分离进入分离柱中的分子将根据它们与固定相的交互作用力或化学性质的不同而以不同的速度被分离； 3. 检测分离后的不同物种被识别，并被解析出来。如荧光检测器，质谱检测器等。
以上是HPLC的基本过程，其中液相移动相、固定相和进 样器的选择以及柱温度、流速等条件的调控对分离效果有着重要的影响。 二、HPLC组合培训 HPLC的应用越来越广泛，许多人需要通过培训来学习HPLC理论、仪器使用技能以及操作流程。能够在行业内领先 的培训课程应该是一种综合性的课程，应该覆盖以下几个方面： 1. HPLC理论知识培训应该包括HPLC的原理、仪器的构造、液相或固定相的特性等理论知识，帮助学习者理解HPLC 的分离过程和如何选择正确的仪器配置。 2. 设备操作培训课程应该包括如何正确使用HPLC设备，包括如何设置参数、如何进行校准和维护，以及保持仪器性能和稳定性的方法。 3. 样品制备及进样培训应着重介绍如何正确制备样品，并进行进样操作，确保精确可靠的检测结果。 4. 数据分析培训课程应该包括数据分析的方法和工具，如何处理和解释HPLC所得数据的相关技巧。 5. 安全实践培训课程应该包括如何保持实验室安全， 如何正确处理实验室废液和化学品，如何防止意外和急救措施等方面的安全实践培训。
高效液相色谱使用操作步骤 一、泵操作面板 PUMP：运行键 START：梯度运行键 PURGE：快冲键RESET：复位键 HOLD：程序暂停键 STOP：泵停止键 TIME：程序开启键 FLOW：流速： RSVR： A B C PROG：程序 DEL：删除程序 PMAX：最大压力PMIN：最小压力 ENTER：确定 TIME 0 FLOW ENTER （设置流速） TIME 0 RSVR ABC ENTER （设置溶剂） TIME 0 PROG ENTER （设置程序） TIME 0 % A 30 ENTER （设置比例） TIME 0 % B 30 ENTER （设置比例） TIME 0 % C 40 ENTER （设置比例） DEL PROG 1 ENTER （删除程序） 1.对于梯度泵设定举例如下：(人参皂苷的梯度) TIME 0 PROG 1 ENTER TIME 0 % A 81 ENTER TIME 15 % A 81 ENTER
TIME 60 % A 65 ENTER TIME 65 % A 0 ENTER TIME 80 % A 0 ENTER TIME 81 % A 81 ENTER TIME 100 % A 81 ENTER 因为A+B之和始终是100%，所以B相就不用设了。7．对于对照品在这种条件下只要对照品的峰全部出完后按下RESET键等20分钟即可进第二针进完针后按START键运行梯度程序。但是对样品来说一定要等峰出完后再按下RESET键等基线基走直才可进下一针。 二、检测器操作面板 RESET：复位键 A/Z：调零键 WL：调波长 ENTER：确定 三、实验前的准备工作 1、实验前流动相提前配好过滤脱气。 2、置换流动相时把泵的滤头从原来的流动相中换到新的 流动相中滤头要轻拿轻放。 3、液路排气顺序：首先打开排气阀—按PURGE键进行排 气结束后—按STOP键停止—再拧紧排气阀—按PUMP 键让泵运行。 4、打开检测器首先观察右上角氘灯指示灯确认氘灯是否
LC3000现场培训教程 ——基础部分 一、培训目的 A、了解LC3000高效液相色谱仪结构和基本操作。 B、掌握CXTH-3000色谱工作站的打开、设备连接、数据采集、数据处理，打印报告。 C、常见故障排除 二、培训设备 CXTH LC3000色谱仪 P3000高压输液泵 UV3000紫外检测器 7725i手动进样阀 T2000柱温箱（可选） C18色谱柱250×4.6 5u （可选） 其它色谱基本条件（流动相准备、电脑和实验台等） 三、溶剂准备 1、条件：色谱级纯或者优级纯甲醇或者乙腈（ACN）、二次蒸馏水 2、流动相的过滤和超声 3、样品的前处理和过滤 四、LC3000色谱仪组成 1、P3000泵和UV3000检测器 一元（等度）系统两元（梯度）系统
P3000泵界面和基本操作 高压输液泵 泵头压力传感器+排空 泵壳体结构图
泵头以及传动结构图 单向阀 单向阀内部结构 基本操作：泵的基本操作可以通过CXTH-3000工作站（推荐使用）或者泵仪器面板控制。 工作站的控制在下面色谱工作站基本控制内容中讲到，以下是泵面板的基本控制按钮：
PUMP/STOP键：按一下该按键可以运行泵，再按一下停止泵运行。 START/HOLD键：按一下该键运行预先设定的程序链（PROGRAM）。再按一下保持此时的程序运行。 PURGE键：冲洗键。按一次泵按照（SYSTEM SETING）系统设定中设定冲洗流量运行冲洗。再按一次泵停止冲洗。作用：冲洗泵头气泡和快速更换流动相。 DEL键：退出键或者删除键。进入子菜单下通过此键退回上一菜单。 ENTER键：进入键或者确认键。按该键进入子菜单。 方向键：光标的上下左右移动。 2、UV3000检测器 UV3000紫外检测器 流通池 基本操作：检测器基本操作可以通过CXTH-3000工作站（推荐使用）或者检测器仪器面板控制。 波长的设定：按下λ按键进入波长设定界面，通过数字键设定预设波长 TIME CONSTANT(时间常数)：在MAIN MENU主菜单下，按ENTER键进 入第一项DETECTOR PARAMETERS，将光标移动到TIME CONTANT下修 改合适的TC值。 RANGE(量程)设定：按下RANGE 按键，进入量程设定界面，通过数字键 设定波长。 检测器注意事项：流通池中有气泡的处理办法，流通池脏处理办法（见常见故 障维护）。
液相色谱仪工作原理及操作 液相色谱仪（Liquid Chromatography, LC）是一种常用的分析 仪器，用于将混合物中的化合物分离，并测定各组分的含量。液相色谱仪的工作原理主要包括样品进样、柱和固定相、流动相、检测器和数据处理等几个方面。 1. 样品进样：液相色谱仪将待测样品以固、液、气体的形式输入柱中。常见的进样方式有自动进样器和手动进样器。自动进样器可以自动控制固定体或液体样品的注射量和速度。 2. 柱和固定相：液相色谱仪的柱由具有一定孔径大小的粒子填充而成，柱内填充物也称为固定相。不同的柱和固定相具有不同的分离能力和选择性。常见的固定相有反相柱、离子交换柱、空气气化柱等。 3. 流动相：流动相是指柱中运动的溶剂，可以是液体或气体。选择合适的流动相对于分离和计量样品至关重要。不同样品可使用不同的溶剂系统，如水、甲醇、醋酸等。 4. 检测器：液相色谱仪多种多样的检测器可以用来检测和记录柱顶流出溶液的特性，如吸收光谱、荧光光谱、电导率、质谱等。其中，常用的有紫外/可见光检测器（UV/VIS）和荧光检 测器。 5. 数据处理：液相色谱仪通过检测器获得的信号经过放大、滤波和数据处理等操作，最终生成色谱图。色谱图可以用来测定样品中各组分的含量、分离度和峰面积等。
操作液相色谱仪时，首先需要准备好样品溶液和运行所需的流动相，并进行必要的校准。然后将样品通过进样器引入柱中。设置合适的分离条件，如流速、温度、波长等，开始运行仪器。运行结束后，通过检测器获得的信号转换成色谱图，利用数据处理软件进行数据分析和定量计算。 注：以上内容并不完整，仅涵盖了液相色谱仪的基本工作原理和操作流程，具体细节和具体仪器的操作方法还需要参考仪器的使用手册和相关文献。
高效液相色谱仪的操作步骤 高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分析技术。它利用液体流动相和固定相之间的相 互作用，将样品中的混合物分离出来，并通过检测器进行定量分析。 本文将介绍高效液相色谱仪的具体操作步骤。 1. 准备工作 在进行高效液相色谱仪的操作之前，首先需要进行一些准备工作。 检查色谱柱是否安装正确，确保色谱柱是干净的，并检查流动相的配 制是否准确。 2. 样品制备 根据需要分析的物质，准备好待测样品。样品制备可以包括溶解样品、过滤样品等步骤，以确保样品的纯净度和稳定性。 3. 仪器开机 将高效液相色谱仪接通电源，打开仪器的电源开关。等待仪器初始化，并确保仪器各个部分正常工作。 4. 设置参数 在仪器上设置分析所需的参数。包括选择适当的检测器类型和检测 波长、设置流量、温度等。 5. 启动系统
启动高效液相色谱仪系统，等待系统稳定。通常需要一段时间使得 流动相在管路中充分平衡，并确保流量稳定。 6. 校正 进行色谱柱的校正。校正过程包括流量校正、波长校正等。通过校 正可以保证仪器输出结果的准确性和可靠性。 7. 注射样品 将样品通过注射器引入色谱柱中，控制样品的注射量，通常在微升 至毫升的量级。确保样品的注射量稳定和准确。 8. 分离分析 开始运行高效液相色谱仪系统，进行样品的分离与分析。在此期间，流动相通过色谱柱，将样品中的化合物根据它们与固定相之间的相互 作用进行分离。 9. 监测结果 通过检测器对分离后的化合物进行监测。根据检测器的信号，可以 得到每个化合物的峰面积、保留时间等数据。 10. 数据处理 将监测到的信号输入到数据处理软件中，进行结果的计算和分析。 通常可以得到各个化合物的峰高、峰面积等数据，从而实现对样品的 定量分析。 11. 关机
高效液相色谱使用操纵步调之马矢奏春创作 一、泵操纵面板 PUMP：运行键 START：梯度运行键 PURGE：快冲键RESET：复位键 HOLD：程序暂停键 STOP：泵停止键TIME：程序开启键 FLOW：流速： RSVR： A B C PROG：程序 DEL：删除程序 PMAX：最大压力PMIN：最小压力 ENTER：确定 TIME 0 FLOW ENTER （设置流速） TIME 0 RSVR ABC ENTER （设置溶剂） TIME 0 PROG ENTER （设置程序） TIME 0 % A 30 ENTER （设置比例） TIME 0 % B 30 ENTER （设置比例） TIME 0 % C 40 ENTER （设置比例） DEL PROG 1 ENTER （删除程序）1.对于梯度泵设定举例如下：(人参皂苷的梯度) TIME 0 PROG 1 ENTER TIME 0 % A 81 ENTER TIME 15 % A 81 ENTER TIME 60 % A 65 ENTER TIME 65 % A 0 ENTER
TIME 80 % A 0 ENTER TIME 81 % A 81 ENTER TIME 100 % A 81 ENTER 因为A+B之和始终是100%，所以B相就不必设了。 7．对于对照品在这种条件下只要对照品的峰全部出完后按下RESET键等20分钟即可进第二针进完针后按START键运行梯度程序。但是对样品来说一定要等峰出完后再按下RESET键等基线基走直才可进下一针。 二、检测器操纵面板 RESET：复位键 A/Z：调零键 WL：调波长 ENTER：确定 三、实验前的准备工作 1、实验前流动相提前配好过滤脱气。 2、置换流动相时把泵的滤头从原来的流动相中换到新的流动相中 滤头要轻拿轻放。 3、液路排气顺序：首先打开排气阀—按PURGE键进行排气结束后 —按STOP键停止—再拧紧排气阀—按PUMP键让泵运行。4、打开检测器首先观察右上角氘灯指示灯确认氘灯是否点亮，按 WL键调好实验波长后按A/Z键调零。 5、打开电脑打开在线工站选择对应的通道，输入实验信息、 方法、包含采样控制，积分和仪器条件，积分面积外标法测绝对含量归一法相对含量内标法测绝对含量；后点数据收集，将电压调到-20~20，时间调到0~30，点零点校正后再点检查基线，大约
Agilent1100高效液相色谱仪操作规程 Agilent 1100高效液相色谱仪操作规程 一、引言 Agilent 1100高效液相色谱仪（以下简称为HPLC）是一种广泛应用于科研实验室和工业生产过程中的分析仪器。本操作规程旨在提供详细的操作指导，以确保用户正确、安全地操作HPLC，并获得准确可靠的分析结果。 二、设备概述 Agilent 1100高效液相色谱仪由以下主要部件组成： 1. 溶剂输送系统：包括溶剂瓶、泵、混合器和阀门，用于输送溶剂到色谱柱。 2. 采样系统：包括自动进样器或手动进样器，用于将待测样品引入色谱柱。 3. 色谱柱：用于分离待测样品中的化合物。 4. 检测器：根据化合物的特性进行检测和定量。 5. 数据处理系统：用于采集、分析和存储分析结果。 三、操作步骤 1. 准备工作 a. 打开HPLC主机，确保各个部件正常运行。 b. 检查溶剂瓶中的溶剂是否充足，并根据需要添加或更换溶剂。 c. 检查色谱柱是否安装正确，并根据需要更换新的色谱柱。 d. 打开数据处理系统，确保与HPLC主机的连接正常。
2. 设置方法参数 a. 在数据处理系统中选择或创建适当的分析方法，并设置相关参数，如流速、波长等。 b. 根据分析要求，在自动进样器中设置进样体积和进样模式。 3. 样品进样 a. 使用自动进样器或手动进样器将待测样品引入色谱柱。 b. 确保进样器和进样针干净，避免交叉污染。 4. 开始分析 a. 在数据处理系统中点击“开始”按钮，启动HPLC分析。 b. 监控色谱柱前后的压力和流速，确保正常运行。 c. 观察检测器的信号，记录峰的出现时间和峰面积。 5. 数据处理 a. 在数据处理系统中对采集到的数据进行处理，如峰识别、定量等。 b. 导出分析结果，并进行必要的统计分析。 6. 关机 a. 停止HPLC分析，关闭数据处理系统。 b. 关闭HPLC主机，依次关闭各个部件的电源。 四、安全注意事项 1. 在操作HPLC时，应穿戴实验室安全所需的个人防护装备，如实验手套、护 目镜等。
液相色谱仪的操作步骤 液相色谱仪（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）是 一种在实验室常用的分析仪器，广泛用于化学分析、生化分析、药物 分析等领域。正确的操作步骤能够保证实验的准确性和可重复性。下 面将介绍液相色谱仪的操作步骤。 1. 准备工作 在进行液相色谱实验前，需要准备好所需的试剂、样品和标准品。 同时，检查仪器状态，确保所有连接管路的连接紧固，并检查进样器、检测器和泵的工作情况。确保试剂瓶中有足够的溶剂，并检查柱温箱 和样品转移系统的温度设定。 2. 样品准备 根据实验目的，准备好待分析的样品。样品准备包括样品提取和预 处理。提取要求根据分析物的特性选择适当的方法，如溶剂萃取、固 相萃取等。预处理包括滤过、稀释、调整pH等步骤，确保样品符合分 析要求。 3. 进样 将待分析样品按照一定比例稀释后，通过进样器进入液相色谱柱。 在进样之前，需要通过洗涤进样针和管道以去除前一个样品的残留物。进样体积和进样速度根据样品的浓度和分析需要进行设定。 4. 色谱柱选择与操作
选择适合分析目标化合物的色谱柱，并根据分离要求进行调试与优化。首先，打开流动相泵，并调节压力和流速使其稳定。然后，调节 流动相的比例和温度，保持恒定。 5. 检测器设置与操作 根据分析的目标化合物的特性，选择合适的检测器，如紫外检测器、荧光检测器、电导检测器等。设置检测器的波长、灵敏度和采集速率，并进行空白检测和灵敏度校准。 6. 数据采集与分析 连接计算机或数据采集仪器，设置数据采集参数，并开始采集数据。实时观察色谱图，确保峰形对称、峰高一致和无明显的杂散峰。数据 采集完毕后，进行数据处理和分析，包括峰面积计算、峰高计算、相 对保留时间计算等。 7. 清洗与保养 实验结束后，关闭仪器各个部分的进样、流动相和电源开关。进行 液相色谱柱的冲洗，使用纯溶剂和纯水，以去除残留的样品和流动相。清理进样器和检测器，保持仪器干净。定期检查仪器各个部件的状态，并进行维护和保养。 总结： 液相色谱仪的操作步骤包括准备工作、样品准备、进样、色谱柱选 择与操作、检测器设置与操作、数据采集与分析以及清洗与保养。正 确的操作步骤能够确保实验的准确性和可靠性，确保分析结果的准确
液相色谱仪操作流程 液相色谱仪（Liquid Chromatography, LC）是一种常见的分析仪器，被广泛应用于化学、生物化学、制药、环境监测等领域。正确的操作 流程对于获得准确的分析结果至关重要。本文将介绍液相色谱仪的基 本操作流程。 1. 仪器设置 在开始操作液相色谱仪之前，首先需要进行仪器设置。操作人员需 要将色谱柱与色谱仪连接好，并确保连接处密封良好，以避免泄漏。 接下来，调整色谱柱的工作温度和流速，根据实验需求选择合适的检 测波长和检测器类型。确保仪器处于正常工作状态后，即可进行样品 的准备与进样操作。 2. 样品准备 液相色谱仪需要对待分析物进行溶解、过滤等预处理步骤。首先， 称取适量的待分析样品，然后加入适量的溶剂，将待分析物充分溶解。溶解后，使用0.22μm的微孔滤膜过滤液体，以去除悬浮物和微粒。确 保样品无杂质后，即可进行进样操作。 3. 进样操作 将经过处理的样品注射进液相色谱仪中，可以通过手动进样或自动 进样方式进行。手动进样需要使用微量注射器，将适量的样品吸入注 射器，然后注射到进样口；自动进样则通过液相色谱仪的自动进样器 完成。确保样品进样完全后，即可开始进行分析。
4. 色谱条件设定 根据待分析物的性质和分析目的，需要设定好液相色谱的参数。这些参数包括：流动相的组成和流速、柱温、梯度程序等。调整这些参数可以影响分析结果的分离效果和分析时间。合理设定色谱条件可以提高分析的准确性和灵敏度。 5. 数据采集与解析 启动液相色谱仪，开始采集数据。液相色谱仪会根据设定的方法进行数据采集，并将采集到的数据保存在计算机中。数据采集完成后，可以使用相应的色谱软件对数据进行解析和处理，包括峰面积计算、定量分析、峰识别等。 6. 仪器维护与保养 操作结束后，需要对液相色谱仪进行适当的维护与保养工作。包括清洗进样口和色谱柱，检查各部件的密封性能，并及时更换损坏的零部件。定期进行系统的校准和液相色谱针对性保养，确保仪器的正常工作状态和精确性。 总结： 液相色谱仪操作流程包括仪器设置、样品准备、进样操作、色谱条件设定、数据采集与解析以及仪器维护与保养。正确的操作流程可以确保仪器的正常工作和获得准确可靠的分析结果。操作人员应熟悉仪器的使用方法和维护要求，并严格按照操作流程进行操作，以获得最佳的实验效果。
使用液相色谱的流程 简介 液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种常用的分析技术，广泛 应用于化学、生物、药学等领域。它利用移动相在固定相上的吸附、分配或离子交换作用，将混合物中的组分逐个分离，通过检测器进行检测和定量分析。 流程步骤 使用液相色谱进行分析通常包括以下几个步骤： 1.样品准备 –将待分析的样品按照一定的方法进行预处理，如溶解、稀释、提取等，获得适合进行液相色谱分析的样品溶液。样品的准备对于分析 结果的准确性和重现性至关重要，需要严格控制实验条件和样品处理过 程。 2.选择色谱柱 –根据样品特性和分析目的，选择合适的色谱柱。液相色谱常用的色谱柱种类包括反相色谱柱、离子交换色谱柱、凝胶柱等，每种色谱 柱都有其特定的分离机理和适用范围。在选择色谱柱时，需要考虑样品 特性、分析目的、分离效果和分析时间等因素。 3.确定移动相 –根据样品特性和色谱柱类型，选择合适的移动相。移动相通常由溶剂和缓冲液组成，其成分和比例会影响到色谱分离效果。在确定移 动相时，需要考虑流动性、溶解度、选择性等因素，优化移动相条件以 提高分离效果。 4.进样与分离 –将样品溶液通过进样器引入液相色谱仪，进入色谱柱进行分离。 在进样过程中，需要控制进样量和进样速度，避免样品堵塞色谱柱或超 出检测器的线性范围。随后，色谱柱会根据样品特性，将组分逐个分离， 并进入检测器进行检测。 5.检测与分析 –在色谱柱出口处设置检测器，根据样品特性选择合适的检测器进行检测。常用的液相色谱检测器包括紫外-可见吸收光谱检测器、荧 光检测器、质谱检测器等。检测器将检测到的信号转换为电信号，并通 过计算机进行数据采集和分析。 6.结果解释
液相色谱的原理以及操作要点 原理： 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 特点 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型： 1 ．液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式： 式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度；Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。 a. 正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。
Agilent1100液相基本操作步骤 (一)、开机： 1、打开计算机,进入Windows NT （或Windows 2000）画面,并运行Bootp Server程序。 2、打开1100 LC 各模块电源。 3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。 4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。 5、把流动相放入溶剂瓶中。 6、打开Purge阀。 7、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入泵编辑画面。 8 、设Flow：5ml/min，单击OK。 9、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump control选项，选中On，单击OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。 10、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Pump Control选项，选中Off，单击Ok关泵，关闭Purge valve。 11、单击Pump图标，出现参数设定菜单，单击Setup pump选项，进入Pump编辑画面，设Flow：1.0ml/min。 12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok。 （二）数据采集方法编辑： 1、开始编辑完整方法： ●从“Method”菜单中选择“Edit entire method” 项，如上图所示选中除“Data analysis ”外的三项，单
《液相色谱》实训指导书 制定人： 职业学院
实训一利用高效液相色谱测定混合样品中苯和甲苯 一、实训目的与要求 1.掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法。 2.了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术。 二、实训内容 高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动是，经过反复多次的吸附－解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。利用欲分离的诸组分在固定相和流动相间的分配有差异（即有不同的分配系数），当两相作相对运动史，这些组分在此两相中的分配反复进行，从几千次到百万次，及时组分的分配系数只有微笑差异，随着液体流动相移动却可以有明显的差距，最后使这些组分都得到分离。 三、实训场地、仪器、设备 1.实训场地 液相色谱实训室 2.药品及试剂 苯标准溶液：2.0μL/mL 甲苯标准溶液：2.0μL/mL 苯、甲苯混合标准溶液：0.2μL/mL 、2.0μL/mL、4.0μL/mL、10.0μL/mL 甲醇、苯和甲苯混合待测溶液。 3.仪器及设备 高效液相色谱仪、紫外—可见光检测器、贮温箱、色谱柱4.6mm×25cm、微量注射器 10μL、1μL各1支 四、实训步骤 1、最佳分离条件的选择 启动仪器，先注入5μL甲醇流动相，观察检测仪当峰斜率小于1000时，设
定流动相甲醇含量为60%，用10μL的微量注射器注入5μL的苯与甲苯混合液，观察检测仪显示的两峰保留时间及分离效果，双峰显示完毕后，改变流动相甲醇含量为85%，观察检测仪显示的两峰保留时间及分离效果，观察到此时出峰时间间隔短，两峰相隔较近，两峰显示完毕时间在5min左右，因此，设定最佳分离条件为流动相甲醇比例为85% 2、苯、甲苯定性分析 在最佳分离条件下，用10μL微量注射器，分别注射5.0μL苯、甲苯的标准溶液，观察记录保留时间，确定苯和甲苯的峰。 3、苯、甲苯定量分析 在最佳的分离条件下，用10μL微量注射器，分别注射5.0μL的0.2μL/m L、2μL/m L、4μL/m L、10μL/m L的混合标准溶液（各重复实验2次），再分别测定苯和甲苯的峰面积，求出平均值，以峰面积对浓度作图，作出标准曲线。在最佳的分离条件下，用10μL微量注射器，分别注射5.0μL的试样（重复进样2次），观察记录保留时间和峰面积。根据峰面积在工作曲线上查出苯和甲苯待测夜的浓度，取两次平均值为试样中苯和甲苯的含量。 4、苯和甲苯混合待测溶液分析 根据苯和甲苯混合待测溶液的液相色谱图上显示的峰面积值，从绘制的标准曲线上查出苯和甲苯混合待测溶液中苯和甲苯的各自的浓度。 五、实训小结 1．色谱条件优化 2．定性分析 3．定量分析 苯、甲苯混合标准溶液浓度分别为：1 ul/ml, 2 ul/ml,5 ul/ml, 10 ul/ml。 4．通过标准曲线求得样品溶液浓度 5.实验需注意的事项 由于液相色谱中使用的是液体流动相，不会出现气相色谱中由于汽化而干扰测定的现象，因此在测定的时候无需迅速加入试样，但也需注意气相与液相色谱
液相色谱检测 1 仪器的基本常识及术语 1.1 仪器结构：液相色谱仪主要包括泵、进样器、色谱柱、检测器； 1.2 仪器分类：液相色谱仪属于精密仪器中的色谱仪器； 按照分为离机制，吸附、分配、离子交换、亲和色谱，体积排阻色谱；按照流动相与固定相的极性，分为正相色谱法和反相色谱法； 1.2.2 高效液相色谱法的应用范围：高效液相色谱法适用于高沸点不易挥发、受热不稳定易分解、分子量大的，不同极性的有机化合物，生物活性物质和多种天然产物，合成的和天然的高分子化合物等。1.3 仪器检定：液相色谱仪检定周期为1年，在两次检定间期内进行一次期间核查，也可以根据情况增加核查次数； 1.4 维护保养：对于液相维护方式主要是周维护和日维护，其中周维护包括联机系统及中工作站软件维护、数据库整理备份、检测器自检、维护单向阀、溶剂砂芯滤头、进样器、电机泵检查维护、溶剂瓶清洗等；日维护包括环境温度、环境湿度、色谱柱温度、压力流速、进样口是否洁净、进液处的砂芯过滤头是否洁净、流动相交换时是否有沉淀； 1.5色谱法的常用基本术语 基线：在色谱操作条件下,没有被测组分通过鉴定器时,记录器所记录的检测器噪声随时间变化图线称为基线. 死时间,保留时间及校正保留时间:从进样到惰性气体峰出现极大值的
时间称为死时间,以td表示.从进样到出现色谱峰最高值所需的时间称保留时间,以tr表示.保留时间与死时间之差称校正保留时间.以Vd表示. 死体积,保留体积与校正保留体积:死时间与载气平均流速的乘积称为死体积,以Vd表示,载气平均流速以Fc表示,Vd=tdxFc.保留时间与载气平均流速的乘积称保留体积,以Vr表示,Vr=trxFc 峰面积：流出曲线(色谱峰)与基线构成之面积称峰面积,用A表示. 拖尾因子：是反映峰对称性的指标，计算公式：拖尾因子 T＝ W0.05h/2d1（其中W0.05h为5%峰高处的峰宽，d1为峰顶点至峰前沿之间的距离）。 峰高与半峰宽:由色谱峰的浓度极大点向时间座标引垂线与基线相交点间的高度称为峰高,一般以h表示.色谱峰高一半处的宽为半峰宽,一般以 x1/2表示； 1.7 色谱检测的特性 （1）灵敏度高； （2）线性范围宽； （3）分离度与柱效、选择因子、容量因子、分析时间的关系： （4）分离度与柱效的平方根成正比，选择因子一定时，增加柱效；（5）分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化：一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可增大选择因子； （6）增大选择因子的最有效方法是选择合适的固定液。对于液相色谱，