基因表达谱芯片常见问题分析
1 芯片实验和定量PCR的优劣比较?
基因表达谱芯片实验可以对大量基因一次性进行定量研究,定量PCR则对大量基因需逐一进行定量研究。
2 在芯片制作过程中的PCR原液是否可以为客户保存?
可以抽干冷冻保存一年。
3 可否用DNA和芯片杂交?
不可以，因为芯片上的样品是cDNA而真核基因DNA中普遍存在內显子，核酸杂交无法顺利进行。
4 对于临床症状不明显的的遗传病,如何取样?
可以从病人抽取血样或者骨髓。
5 如何保存血样?
将血样中血细胞分离出来，然后-80℃低温保存。
6 脱落细胞是否都是死亡的细胞, 其中是否可以抽提mRNA?
不完全是死亡的细胞, 但是mRNA的含量比较少, 建议最好用正常细胞抽提mRNA。
7 完成一张芯片的实验,需要的细胞的量是多少?
需要5×106的细胞量
8 提供的电泳图和OD值如何评价mRNA的质量？
电泳图可以分析mRNA和总RNA是否降解, OD值可以判断纯度。
9 是否可以将同一症状的病例混合后抽提,看共性表达?
可以。
10 芯片是否可以重复使用?
不可以。
11 杂交后的芯片如何保存?
避光常温保存几个星期。
12 在实验前期,如何定参照物?
根据实验设计来确定使用共同参照物还是各自的参照物。
13 如何消除基因芯片实验中的个体差异？
可以使用同一样品重复芯片实验,取其共性,获得可靠的数据结果。
14 芯片在杂交过程中为什么会发生非特异性杂交, 如何降低?
这是由于DNA碱基错配造成, 提高芯片杂交后洗脱液的温度可以降低非特异性杂交。
15 芯片上基因cDNA是从什么组织中取得的?
芯片上基因cDNA来源于美国I.M.A.G.E.项目，是从人的各种组织中分离确定的，并且每个基因cDNA 具有明确功能定义的，与其它基因不相重复的。
16 芯片上有多少条有效基因?
目前芯片上的有效基因数目最多有7500条，每条基因都有明确的功能定义，不相重复。
17 基因表达谱芯片是如何进行分类的?
基因表达谱芯片是根据芯片的用途来分类的，每种芯片上包括与特定用途相关的基因。
18表达谱芯片是否可以按照器官来进行分类?
不可以。
19 基因芯片的假阳性率是多少?
一般控制在1%---2%。
20 芯片制作中如何控制芯片的质量
控制芯片的质量主要要以下几个方面, 玻片的选择, 点样的规范, 固定率, 芯片的背景,有效的避免融点等。
21 实验结果中的荧光信号散点图有何意义?
可以-直观反映杂交后的差异表达与正常表达的比率, 显示相关度和实验结果的好坏。
21 扫描背景不清楚会对实验结果产生什么影响?
会导致实验结果混乱,而导致实验失败, 如果是杂质污染等原因造成,可以通过洗片解决, 如果是mRNA 不纯,则需要重新抽提。
22 实验失败有几种原因?
mRNA的降解, MRNA的纯度差, 反转录酶失败, 标记效率低, CY3容易见光降解。
23 得到实验的结果后, 可以进行那些研究的工作?
可以通过基因的差异表达, 寻找目标基因, 进行聚类分析, 对差异基因进行进一步的功能研究。
基因芯片可靠性分析及数据处理
高利宏,曹佳(第三军医大学军事预防医学院卫生毒理学教研室,重庆400038)
基因芯片(gene chip)又称为DNA微阵列(DNA microar-ray),其基本原理是将众多的靶基因序列或寡聚核苷酸片段有序而高密度地排列在玻璃、硅、尼龙膜等固相载体上,用待检测的标记样本分子与之杂交,并利用激光共聚焦显微扫描等技术对芯片上成千上万的杂交信号进行实时、灵敏而准确的检测,辅以计算机统计分析从而得到样本的基因表达信息。
自1992年美国Affymitrix公司制备出世界上第1张寡聚核苷酸生物芯片至今,仅短短10余年时间,基因芯片技术已广泛运用于生物学与医学的基础研究、疾病诊断、新药开发、环境保护等许多方面。在MEDLINE 上以genechip和icroarray为关键词检索, 2000年以前仅数百篇相关文献,而到2004年已达4 000余篇文献。该技术最大的优点在于具备高通量平行检测的特点,能在更全面广泛的基因组水平上揭示不同基因之间内在的相互关系,使研究效率明显提高,并极大地降低了基因表达检测的平均成本,这对于继人类基因计划(human genomeproject, HGP)实施以来呈几何级数增加的基因序列资源的利用有至关重要的意义。众多学者认为,该项技术是继DNA重组、PCR技术以后又一项生物科学领域的革命性进展,将对21世纪生命科学的研究思维和方式产生重要影响。
但不可否认,作为一项新兴的技术,基因芯片也是处于不断探索和完善的过程中。就技术本身而言,可以把它形容为“强大但不完美”———基因芯片实验从前期设计到最后的数据提呈目前都还存在着一些技术难点和缺点,在应用过程中也非全能,而存在一定的局限性,需要人们对其有更全面和深刻的认识。目前世界各地芯片研究人员正致力于其方法学的改进、实验流程的规范以及共同实验标准的建立。现主要对芯片技术的可靠性和数据处理两方面进行综述。
1芯片技术的可靠性分析
认识芯片技术的可靠性,首先应该了解该技术的定位。一般来说,基于芯片高通量和高灵敏的检测特点,在成千上万探针数量的基因表达谱水平上研究特定时间组织的多基因表达程度,看似既多又好,但这实际上是一把双刃剑。因为在实际情况中,动物组织、细胞的基因表达谱并非“均质性”,不同个体或细胞株之间存在着一定的变异,而且表达谱对实验条件的变动也高度易感,在RNA抽提、cDNA逆转录等操作步骤上的微小差别,往往都能引起不同基因的表达改变,这样使微阵列检测所呈现的大量“阳性改变”基因中可能相当一部分难以判断确定的生物学意义。另一方面,微阵列实验是成百上千个核酸探针进行“同时杂交”,能影响芯片探针和实验样本中相应的靶片段的结合效率的因素可来自多方面———序列自身因素(序列长度、碱基比例、互补性等)、杂交实验条件(探针和靶序列浓度、阳离子浓度、pH等)及非特异性杂交片段等。以目前的芯片
制作工艺,还难以保证每个探针杂交反应能同时具备最佳反应条件,因此实际的芯片探针杂交往往会产生大量的假阳性和假阴性。对单个基因测定的精度而言,高通量性的微阵列并不如低通量的Northern、real-time PCR等技术更精确。还应该注意到,微阵列技术的另一大应用限制是其测定的mRNA水平的改变仅属于基因表达的中间产物,并非功能蛋白,还远不能直接解释在细胞和组织水平上主要由功能蛋白参与的多种生理、病理变化的机制。而且,即使是在微阵列表达谱上表现出明显变化的不同基因,它们之间的因果关系如何,单靠微阵列技术本身也不能单独进行确切判断,需要进一步利用相应实验技术进一步研究[1, 2]。所以在目前阶段,DNA微阵列应主要定位于一种运用高通量手段在特定实验条件下观察基因组的整体性变化,以利于从纷繁的表达谱数据中寻找有效线索展开后续深入研究的定性实验。当然我们也应该看到,微阵列观察大批表达谱的特定的mRNA表达类型比传统分子生物学技术所检测的单个或少数基因表达更能全面地反映和预测相应的生物学机制,在蛋白质组技术普及应用以前,DNA微阵列技术还是在基因组水平研究基因表达最有效的方法。
一般来说,具备良好的灵敏度和较高特异度的核酸探针是保证芯片杂交数据可靠性的一个关键因素。目前,DNA微阵列根据探针的选择主要有两种类型———cDNA微阵列和寡聚核苷酸点阵芯片。
cDNA微阵列的探针一般来自于cDNA或EST文库的PCR扩增产物,长度为100~2 000 bp。这一类微阵列因其长链探针
灵敏性高、造价低、技术平台易于获得而被许多实验室广泛使用。但就探针构建而言存在以下一些不可靠因素:①cDNA探针针对来自同一基因家族不同成员的靶序列的检测时特异性不高,在序列选择时需注意尽量挑选文库中带3 '-末端的克隆片段以增强杂交特异性[3];②以不同荧光染料标记的探针进行杂交时存在标记效率不平衡的现象,常常需要试验组和对照组样本进行荧光交换标记重复试验;③双链cDNA探针相对于单链寡聚核苷酸更容易产生交联而影响杂交;④大规模的cDNA克隆文库往往存在克隆交叉污染,影响cDNA 微阵列探针质量[4]。
寡聚核苷酸点阵芯片的探针由20~80 bp的短链寡聚核苷酸构成,研究人员可以从GenBank、EMBL等的核酸序列数据库及EST数据库(dbEST)寻找感兴趣的序列数据作为参考直接合成,不需要如cDNA微阵列一样准备cDNA克隆文库。为提高短链寡聚核苷酸探针的特异鉴别能力和容错能力,通常此类芯片会针对每一个目标序列的不同区域设计多组“冗余”探针,提高杂交信噪比,并且如Affymetrix公司的GeneChip专利设计以一组完全匹配(perfectmatch, PM)及中间有一错误位点匹配(mismatch, MM)探针区分特异性结合与非特异性结合的靶片段。这样,使寡聚核苷酸点阵芯片的特异性可以达到能区分大部分基因家族成员序列的水平,除可进行表达谱研究外,还可以用于检测基因突变和多态性[5]。但此类芯片因制作成本相对较高,不如cDNA 微阵列使用广泛。
另外需要注意的一个问题是,虽然根据目前的制作工艺,每张芯片高密度集成寡聚核苷酸探针可达100 000个以上,但探针数量水平应该根据实验目来选择。使用高密度探针的芯片有利于进行基因组筛选和基因表达谱全面性观察,以期对研究对象有一个更全面的认识或者发现新的线索———一种基于“假想发生”的“fish”科学[6]。但如果研究人员期望能更有针对性地研究某类代谢途径,或能更有效地对芯片数据结果进行统计分析处理,选择低密度的“focused”芯片往往可靠性更好,也更为经济[7]。
芯片的系统误差存在于实验的全过程,包括如前所述的样本的生物差异、样本荧光双色标记偏差、以及探针杂交和洗脱条件不一致、信号采集误差等等,因此在芯片实验的设计上,重复性是保证数据可靠性的一个必要原则。一般而言,芯片的重复性设计包括3个层次:①芯片内同一基因探针多次点样;②同一份RNA样本进行多次芯片杂交;③用来自同一品系或类型的不同生物学个体进行重复实验。前两种类型的重复性试验主要针对的是芯片实验的技术性误差,有利于提高芯片数据的精确度,而后一种类型还包含了样本的生物性变异,使实验的重复性结果更具有广泛的生物和统计学意义[8]。在样本的重复次数上存在着一定争论, Lee等[9]认为3次比较适宜,Til-stone[10]认为重复次数的多少应该与想获得怎样的结果密切相关。而事实上,由于芯片昂贵的成本,很多实验室在具体的实验研究中却往往难以满足统计学分析所要求的重复例数,一些所发表的芯片实验论文也缺乏标准的统计学框架。在对芯片重复性进行了研究的文献中, Bartosiewicz等[11]报道芯片内点间误差为10%,片间误差14%;Y ue等[12]报道片内误差为5%~10%,片间为10% ~30%,由此看出使用芯
片技术获得的数据结果仍然存在较大的波动。
2芯片数据处理、分析和提呈
虽然芯片技术的优势是可以大范围高通量研究基因表达,但如果在完成杂交实验以后,如早期一些文献,数据分析仅停留于简单人工处理的原始数据列表上,大量有价值的信息和线索就会被湮没和浪费。因此生物信息学和统计学的有效参与,对芯片资料进行合理修正、规范分析、信息挖掘和提呈,往往是芯片实验研究中更为重要的部分,也是提高芯片数据可靠性的必要保证。
归纳起来,芯片数据的整理和分析一般有以下的步骤。
2. 1芯片扫描提取杂交信号
用于芯片荧光扫描的扫描仪目前主要有两类:基于光电倍增管(photomultiplier tube, PMT)的激光共聚焦显微镜检测系统;基于电荷偶连装置(charge-coupled devices, CCD)摄像原理检测光子。
2. 2芯片信号的背景扣减
其意义在于减除芯片杂交信号中属于非特异性的背景噪音部分。以前多以图像处理软件划格后每个杂交点周围区域的背景平均值来计算,但存在芯片不同区域背景扣减不均匀的缺点,也可利用芯片最低信号强度的点(代表非特异性的样本与探针结合值)或综合整个芯片非杂交点背景所得平均值做为背景扣减[13]。2. 3数据校正
以求校正样本提取、荧光标记及芯片杂交等过程中的系统误差对实验数据的影响。很多文献采用“稳定”的看家基因的表达比率作为校正标准,但目前认为它们在不同实验条件下同样存在改变。为克服此缺陷,有研究人员改用平衡对照和实验点的芯片整体信号强度整体平均值或中位数做标准,以及Lowess密度依赖性校正方法[14]。
2. 4数据分析
通过以上计算机的图像分析和标准化处理,我们得到代表芯片上每个基因信号强度数值的电子数据表,下一步工作是如何在其中挖掘寻找众多基因在表达上的差异性和相似性规律,进而发现其所代表的生物学意义。分析微阵列上基因的差异表达,很多文献都采用根据处理和对照组相应基因的信号比率,用人为界定的阈值确定之———Ratio分析(Ratio Analysis)(多为处理/对照<0. 5作为基因显著下调标准,处理/对照>2作为基因显著上调标准)。该方法简单直观,但其阈值的划分主观性较强、缺乏生物学和统计学支持,尤其对于分析样本中的低拷贝或高拷贝转录子,容易产生假阳性和假阴性问题。Ideker等[15]阐述了通过重复性实验中的误差评估(variabilityand ErrorAss essment)和基因定标后特异性t检验(significanceanalysis ofmicroarrays)来判断差异表达基因的方法,以及其他一些报道的方案[16],但目前尚无统一性标准,芯片后验证性实验(RT-PCR、荧光定量R T-PCR、Northern等)是确定样本基因差异表达的金标准。寻找基因表达水平的相似性规律时则常用聚类统计分析对基因表达谱数据统计归类,探索代表不同生
物学意义的分类标准、同类基因的共同功能以及在基因表达水平上预测新的生物模式等。主要策略有监督分析和非监督分析两类,前者根据特定样本或基因的已知生物学信息对表达谱建立分类器,进而对各基因进行功能分类和预测,后者则通过计算和比较表达谱各基因统计学距离,聚类“相似性”样本或基因。代表性的数学模型有层次聚类hierarchical clustering)、自组织作图(self-organizingmaps)、k-means、主元分析方法(princi-ple component analysis)、LDA ( linear discriminant analysis)81等[17],不过Zhou等[18]认为,一些相似功能的基因并不总是表现相似的表达谱,针对此他们提出了“过度共表达基因”概念及相应的数学模型鉴定表达谱中此类基因,作为聚类分析的补充。在Internet网络上许多商业和学术机构所提供的大量芯片数据统计分析软件包等资源可供研究人员参考使用(http: //www. lab-on-a-chip. com /suppliers/inform. html及http: //genome-www5. stanford. edu/restech. shtml等)。
2. 5芯片数据的管理和交流
进行芯片的数据分析以后并不标志着实验的结束,研究人员逐渐认识到,要对呈数量级增长的实验数据进行有效管理、交流和验证,需要建立起通行的数据储存和交流平台,以及一套科学的策略和统一的标准化管理方案。Brazma的研究小组在2001年提出记录和报告芯片实验数据的建议标准———MI-AME(minimum information about microarray experiment最小化阵列表达信息)[19],该方案主要从6个方面对芯片实验的描述
进行了规划:整体实验规划和设计、芯片阵列的设计、样本收集提取和标记的方案、芯片杂交的流程和参数、影像数据的测量和规范、数据标准化校正分析,以期统一芯片报告的格式和整合相关资讯。至今为止,MIAME 策略已得到较为广泛的响应、认同和发展,尤其以学术界和商界组成的微阵列基因表达数据(MGED)协会加快了其应用普及,一些公共的生物芯片信息数据库如EBI的ArrayExpress、NCBI的GEO、日本的CIBEX等均采用MIAME标准接纳芯片数据Nature、The Lancet等一些专业
杂志已经把MIAME格式作为接受芯片研究论文的必要条件(http: //www. nature. com /nature/submit/policies/),许多著名的芯片及软件生产商,如Affymetrix公司、Rosetta Biosoftware公司、Iobion Informatics公司等也纷纷将MIAME标准整合到相关产品中。从MIAME建立的意义上来说,它是一个随着芯片技术研究进展而不断发展的指导策略,而并非固定教条(2001年文献提出的是 1. 0版本, 2002年已改进为 1. 1版本)。关于MIAME较为近期和深入的讨论与进展可以查阅http: //www.mged. org/Workgroups/MIAME/miame. html。
总之,在人类基因组计划初步完成,开始进入后基因组时代的今天,作为高通量筛选技术的代表———基因芯片存在着巨大的科研需求,将可能成为未来生命科学研究的主要分析手段之一。因此,寻找芯片实验技术上的突破,有效提高其检测效能和可靠性,并对微阵列所提供的巨大数据进行有效的分析和管理,是基因芯片技术能否向前突破的关键。相信在世界各地研究人员的共同努力下,基因芯片所存在的技术性缺陷和壁垒将被逐一克服,这项具有时代意义的技术会很快成熟起来。
关键词:基因芯片;微阵列;可靠性;数据处理
中图法分类号:R318. 04文献标识码:A
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全基因组表达谱分析方法（DGE）----基于新一代测序技术的 技术路线 该方法首先从每个mRNA的3’端酶切得到一段21bp的TAG片段（特异性标记该基因）；然后通过高通量测序，得到大量的TAG序列，不同的TAG序列的数量就代表了相应基因的表达量；通过生物信息学分析得到TAG代表的基因、基因表达水平、以及样品间基因表达差异等信息。技术路线如下： 1、样品准备： a) 提供浓度≥300ng/ul、总量≥6ug、OD260/280为1.8~2.2的总RNA样品； 2、样品制备（见图1-1）： a) 类似SAGE技术，通过特异性酶切的方法从每个mRNA的3’末端得到一段21bp 的特异性片段，用来标记该基因，称为TAG； b) 在TAG片段两端连接上用于测序的接头引物； 3、上机测序： a) 通过高通量测序每个样品可以得到至少250万条TAG序列； 4、基本信息分析： a) 对原始数据进行基本处理，得到高质量的TAG序列； b) 通过统计每个TAG序列的数量，得到该TAG标记的基因的表达量； c) 对TAG进行注释，建立TAG和基因的对应关系； d) 基因在正义链和反义链上表达量间的关系； e) 其它统计分析； 5、高级信息分析： a) 基因在样品间差异表达分析； b) 库容量饱和度分析；
c) 其它分析； 测序优势 利用高通量测序进行表达谱研究的优势很明显，具体如下： 1．数字化信号：直接测定每个基因的特异性表达标签序列，通过计数表达标签序列的数目来确定该基因的表达量，大大提高了定量分析的准确度。整体表达差异分布符合正态分布，不会因为不同批次实验引起不必要的误差。 2．可重复性高：不同批次的表达谱度量准确，能够更准确的进行表达差异分析。 3．高灵敏度：对于表达差异不大的基因能够灵敏的检测其表达差异；能够检测出低丰度的表达基因。 4．全基因组分析，高性价比：由于该技术不用事先设计探针，而是直接测序的方式，因此无需了解物种基因信息，可以直接对任何物种进行包括未知基因在内的全基因组表达谱分析，因此性价比很高。 5．高通量测序：已有数据表明，当测序通量达到200万个表达标签时，即可得到样本中接近全部表达基因的表达量数据，而目前每个样本分析可以得到300 万~600万个表达标签。
抗核抗体谱检测的临床意义（1） 自身抗体：是指抗自身细胞内、细胞表面和细胞外抗原的免疫球蛋白。 抗细胞内抗原的抗体包括： 1、抗细胞核成分的抗体（抗核抗体）。 2、抗细胞浆内成分的抗体（抗中性粒细胞及其他细胞胞浆抗体、抗线粒体抗体、抗核糖体抗体等）。 3、抗细胞表面抗原的抗体。 抗细胞外抗原的抗体包括：类风湿因子、抗甲状腺球蛋白抗体等。 抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）:又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白（DNP）、DNA、可提取的核抗原（ENA）和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。抗核抗体是一组对细胞核内的DNA，RNA，蛋白或这些物质的分子复合物的自身抗体。按其核内各个分子的性能不同可将各ANA区分开来，如(一)抗DNA抗体，（二）抗组蛋白抗体，（三）抗非组蛋白抗体，（四）抗核仁抗体等。每一大类又因不同抗原特性而再分为许多种类。因此ANA在广义上是一组各有不同临床意义的自身抗体，更确切的名称应为抗核抗体谱。ANA 主要存在于IgG，也见于IgM、IgA，甚至LgD及LgE中。 常见的核免疫荧光杭核抗体试验有以下几种图形：（1）均质型：核质染色均匀一致，这种染色型常与抗组蛋白和抗DNA抗体有关；（2）斑点型：核质染色呈斑点状，抗可提取性核抗原（ENA）抗体常呈这种染色型；（3）周边型：荧光染色围绕在核膜周围，它与抗DNA抗体有关；（4）核仁型：仅有核仁染色，具有抗4-6sRNA抗体呈现这种染色型；（5）着丝点型：在体外培养的细胞株（喉癌细胞）在核分裂相期时，可见到荧光染色的着丝点排列成特殊图型，而在鼠肝做底物中看不到此类图型，而被遗漏。 抗核抗体在多种自身免疫病中均呈不同程度的阳性率，如系统性红斑狼疮（SLE，95%~100%）、类风湿性关节炎（RA，10%~20%）、混合性结缔组织病（MCTD，80%~100%）、干燥综合症（SjS,10%~40%）、全身性硬皮病（85%~90%）、狼疮性肝炎（95%~100%）、原发性胆汁性肝硬化（95%~100%）等，但经皮质激素治疗后，阳性率可降低。抗核抗体在类风湿病人中约有20％～50％IgG型ANA呈阳性，小儿类风湿ANA的阳性率约19％～35％，伴发虹膜睫状体炎者阳性率高（505~90%），故ANA 阳性预示类风湿有发生慢性睫状体炎的可能。已发现75％类风湿病人有多形核白细胞的特异性ANA或抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）可使白细胞核受到破坏。 ★抗核抗体谱（ANAs）
基因表达谱测序 背景介绍 基因表达谱分析利用HiSeq 2000高通量测序平台对mRNA进行测序，获得10M读长为49nt的原始reads，每一个reads可以对应到相应的转录本，从而研究基因的表达差异情况。与转录组测序相比，基因表达谱分析要求的读长更短，测序通量更小，仅可用于基因表达差异的研究。该方法具有定量准、可重复性高、检测阈值宽、成本低等特点，能很好的替代以往的数字化表达谱分析。 技术路线
生物信息学分析 送样要求 样品要求 1. 所需Total RNA 的量均不少于 20μg/文库，Total RNA 可以保存在DEPC 处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明。 2. 如提供实验材料为动物组织材料，样品质量需大于2g ； 3. 如提供实验材料为植物样品，样品质量需大于4g ； 4. 如提供实验材料为培养细胞，请提供1×107培养好的细胞； 5. 如提供实验材料为血液样品，请提供≥2ml 的样品。 我们强烈建议在送样的同时客户做好备份，以备后续实验之用。 样品纯度要求 1. OD 260/OD 280在1.8- 2.0之间，RNA 无降解、28S 和18S 核糖体RNA 条带非常亮且清晰（其
大小决定于用于抽提RNA的物种类型），28S的密度大约是18S的2倍；Agilent 2100检测仪分析RNA完整性数据RIN≥8。 2. 无蛋白质、基因组DNA污染，如有污染请去蛋白并进行DNase I处理。 请提供至少一种样品的凝胶电泳或者Agilent 2100检测仪检测图片，并注明其浓度、体积、OD260/OD280、溶剂名称、制备时间、物种来源以及特别备注。最终以我方定量、质检为准。 样品采集 为了保证提取RNA的完整性，确保后续实验的顺利进行，请务必确保样品的新鲜，对于如何确保样品的新鲜针对不同的样品获取材料的方法如下： 1. 动物组织：从活体上迅速的取下组织（切成黄豆粒大小的块状），每切成一个黄豆粒大小的块状立即放入液氮中，重复上述操作，直至足够提取总RNA的量；准备一个50ml的离心管，做相应的标记（样品名称、编号、客户姓名、时间），最好既在管盖上做好标记，也在管壁上做好相应的标记，先放入液氮中预冷2-3min，拿出离心管（离心管的下部分还是保持在液氮中），打开离心管的盖子，将液氮中黄豆粒大小的块状收集进离心管中。 2. 植物组织： （1）如所采集的是果实、麦穗等体积偏大的样品，收集样品请参照1.动物组织取样方法；（2）如采集的是叶片等体积偏小的样品，请尽量采集嫩叶、幼芽等，每采集一片叶片立即放入液氮中，直至足够提取总RNA的量，后续操作请参照动物组织的采集。 （3）如是植物的花，在采集花骨朵的时候请尽量不要采集到花萼、叶片等，每采集一个花骨朵请立即放入液氮中，直至足够提取总RNA的量；后续操作请参照动物组织的采集。3. 如提供实验材料为菌丝体，请取500μl的菌液于1.5ml离心管中，离心去上清，剩余菌丝体放入液氮或干冰中，请提供不少于5管的菌丝体。 样品运输 从液氮中取出准备好的样品，请立即放入干冰中，并用干冰掩埋好样品。请填写完整订单，放入自封袋中与样品一起邮寄。为防止RNA的降解，请确保干冰的量足够运送到目的地。我们强烈建议在寄送RNA样品时将RNA保存在75%的乙醇或异丙醇中。 如是特殊样品，关于送样量和保存问题请与我们联系沟通，以便双方共同协商解决。 提供结果 根据客户需求，提供不同深度的信息分析结果。
小鼠表达谱芯片及服务 热点推荐 芯片名称：Agilent SurePrint G3 Mouse Gene Expression 8x60K HOT！ 芯片介绍：安捷伦基于G3平台最新设计的小鼠表达谱芯片。涵盖39,430 条Entrez Gene RNAs 外，及16,251条lincRNA。除了检测蛋白编码RNA表达量变化，还能检测非编码lincRNA 的表达量变化。探针设计参照的数据库为：RefSeq Build 37；Ensembl Release 55；Unigene Build 176；GenBank (April 2009)；RIKEN 3。lincRNA探针是Agilent和John Rinn 实验室（麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所）共同设计的。 Agilent 小鼠表达谱芯片服务 芯片名称：Agilent SurePrint G3 Mouse Gene Expression 8x60K NEW！ 芯片介绍：安捷伦基于G3平台最新设计的小鼠表达谱芯片。涵盖39,430 条Entrez Gene RNAs 外，及16,251条lincRNA。除了检测蛋白编码RNA表达量变化，还能检测非编码lincRNA 的表达量变化。探针设计参照的数据库为：RefSeq Build 37；Ensembl Release 55；Unigene Build 176；GenBank (April 2009)；RIKEN 3。lincRNA探针是Agilent和John Rinn 实验室（麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所）共同设计的。 芯片推荐：Agilent Whole Mouse Genome Oligo Microarray（4×44K） 芯片介绍：Agilent小鼠全基因组表达谱芯片，真正代表小鼠基因组中所有已知基因及其产生的转录本，代表了超过41,174 个小鼠基因和转录本。设计该产品所用的序列信息源于UCSC、NIA、RefSeq、Ensembl、Unigene和RIKEN等数据库，而且绝大多数探针经过Agilent专利的实验验证程序的检验和优化。 Affymetrix 小鼠表达谱芯片服务 芯片名称：GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array 详细介绍：涵盖了39,000个转录本，代表34,000个的小鼠基因。序列信息基于GeneBank、dbEST、RefSeq，The sequence clusters 在UniGene database (Build 107, June 2002)创建，并通过了Whitehead Institute for Genome Research (MGSC, April 2002)小鼠基因组进行了分析比较。 芯片推荐：Affymetrix GeneChip HT MG-430 PM Array Plate 芯片介绍：该款芯片信息与Affymetrix 小鼠基因组430 2.0芯片相同。涵盖了39,000个转录本，代表34,000个的小鼠基因。序列信息基于GeneBank、dbEST、RefSeq，The sequence clusters 在UniGene database (Build 107, June 2002)创建，并通过了Whitehead Institute for Genome Research (MGSC, April 2002)小鼠基因组进行了分析比较。 Phalanx小鼠表达谱芯片及服务 芯片名称：Phalanx MOA V5 Mouse OneArray? 芯片介绍：源自台湾工业研究院专利生产技术，依据美国食品药品管理局（FDA）制定的生物芯片质量评估标准MAQC计划规范，总探针数27,294个，基因探针数26,423个，参考数据库：RefSeq release 42；Ensemble release 59。 Illumina小鼠表达谱芯片服务 芯片推荐：Illumina Mouse WG-6 expression beadchips
基因表达谱芯片的数据分析(2012-03-13 15:25:58)转载▼ 标签：杂谈分类：生物信息 摘要 基因芯片数据分析的目的就是从看似杂乱无序的数据中找出它固有的规律, 本文根据数据分析的目的, 从差异基因表达分析、聚类分析、判别分析以及其它分析等角度对芯片数据分析进行综述, 并对每一种方法的优缺点进行评述, 为正确选用基因芯片数据分析方法提供参考. 关键词: 基因芯片; 数据分析; 差异基因表达; 聚类分析; 判别分析 吴斌, 沈自尹. 基因表达谱芯片的数据分析. 世界华人消化杂志2006;14(1):68-74 https://www.doczj.com/doc/e214064179.html,/1009-3079/14/68.asp 0 引言 基因芯片数据分析就是对从基因芯片高密度杂交点阵图中提取的杂交点荧光强度信号进行的定量分析, 通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类, 最终整合杂交点的生物学信息, 发现基因的表达谱与功能可能存在的联系. 然而每次实验都产生海量数据, 如何解读芯片上成千上万个基因点的杂交信息, 将无机的信息数据与有机的生命活动联系起来, 阐释生命特征和规律以及基因的功能, 是生物信息学研究的重要课题[1]. 基因芯片的数据分析方法从机器学习的角度可分为监督分析和非监督分析, 假如分类还没有形成, 非监督分析和聚类方法是恰当的分析方法; 假如分类已经存在, 则监督分析和判别方法就比非监督分析和聚类方法更有效率。根据研究目的的不同[2,3], 我们对基因芯片数据分析方法分类如下: (1)差异基因表达分析: 基因芯片可用于监测基因在不同组织样品中的表达差异, 例如在正常细胞和肿瘤细胞中; (2)聚类分析: 分析基因或样本之间的相互关系, 使用的统计方法主要是聚类分析; (3)判别分析: 以某些在不同样品中表达差异显著的基因作为模版, 通过判别分析就可建立有效的疾病诊断方法. 1 差异基因表达分析(difference expression, DE) 对于使用参照实验设计进行的重复实验, 可以对2样本的基因表达数据进行差异基因表达分
第24章 基因表达谱分析的生物信息学方法 思考与练习参考答案 1．据教材表24–3提供的数据信息可以构建一棵决策树，请利用最大信息增益方法写出如何选出根结点中用于分割的特征。 教材表24-3 天气情况与是否去打球的关系数据集 注：该信息表示根据天气情况决定是否出去打球，数据集共包含14个样本，两个类别信息（Yes 、No ），每个样本包含3 个特征信息（Outlook 、Temp 、Windy ）。 解：计算用每一个特征进行分割时所获取的信息增益，取信息增益最大的那个特征作为分割特征，以Outlook 特征为例计算（参照练习图24-1） 练习图24-1 同Outlook 特征进行分割所获得的信息增益 )14 9 log 149145 log 145()(220+-=S H
)5 2 log 5253 log 53()(2211+-=S H 0)4 4 log 44()(212=-=S H )52 log 5253 log 53()(2213+-=S H )(14 5 )(144)(145)(1312111S H S H S H S H ++= infor-gain （Outlook ）=)()(10S H S H - 同理，计算其他两个特征的信息增益，最后从三个值中选取最大的一个对应的特征作为根结点的分割特征。 2．请从https://www.doczj.com/doc/e214064179.html,/上下载一原始未经标准化的表达谱数据，并对该数据进行如下分析： （1）对数据进行标准化处理。 （2）对数据进行分类分析。 （3）分别对基因和样本进行聚类分析。 （4）选择特征基因。 （答案略）
抗核抗体谱检测的临床意义 自身抗体：是指抗自身细胞内、细胞表面和细胞外抗原的免疫球蛋白。抗细胞内抗原的抗体 包括：1、抗细胞核成分的抗体（抗核抗体）。2、抗细胞浆内成分的抗体（抗中性粒细胞及 其他细胞胞浆抗体、抗线粒体抗体、抗核糖体抗体等）。3、抗细胞表面抗原的抗体。抗细 胞外抗原的抗体包括：类风湿因子、抗甲状腺球蛋白抗体等。 ★抗核抗体谱（ANAS （一）.抗DNA抗体 又可分为单链和双链DNA抗体： 1. 抗双链DNA（ double stranded DNA,ds-DNA抗体）：又称为天然DNA抗体,其靶抗原为双 螺旋dNA.对诊断SLE有较高的特异性，30%-90%勺活动期SLE患者此抗体阳性，且抗体滴度的消长与SLE的活动程度相关，随着疾病活动的控制，抗dsDNA抗体滴度可以下降或消失, 可作为治疗监测和预后评价的指标。抗dsDNA抗体与DNA结合成为免疫复合物在肾小球基底 膜沉积，或抗dsDNA抗体直接作用于肾小球抗原造成SLE患者的肾损害。抗dsDNA抗体阳性 的患者较阴性患者发生肾炎的危险性高12倍。 2. 抗单链DNA（ single strand DNA,ss-DNA ）抗体：又称为变性DNA抗体,其靶抗原为核搪或脱氧核糖?在SLE患者有较高的检出率（50%-60%），但结果缺乏疾病特异性，在其他风湿病如混合性结缔组织病，药物诱导的狼疮，硬皮病，皮肌炎，干燥综合征，类风湿性关节炎等也有10%-70%勺检出率?有些正常老年人也存在。 （二） .抗组蛋白抗体：具有H1、H2A H2B H3和H4四个亚单位，常以四聚体形式存在，与DNA构成的复合物称为染色质，染色质最基本的单位是核小体（nu cleosome）.所有组蛋白各 成分均可能成为自身抗体的靶抗原 1.SLE的阳性率约30%-80%并常伴有抗dsDNA抗体阳性，主要以抗H2A H2A-H2B复合物和抗H1的IgG型抗体为主. 2.药物性狼疮的阳性率达95%以上，但不伴有抗dsDNA抗体阳性，主要以抗H2A-H2B为主. 常见的药物有肼苯达嗪、异烟肼及氯丙嗪. （三）.抗非组蛋白抗体： 1. 抗可提取性核抗原抗体（Extractable Nuclear Antigen,ENA ）:此类抗蛋白可以溶于盐 水而被提取，故称为可提取性核抗原.对弥漫性结缔组织病的诊断尤为重要，但与疾病的严
康成生物全基因组表达谱芯片技术服务 康成生物为您提供全基因组表达谱芯片技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，康成的芯片技术服务人员就可为您完成全部实验操作, 并提供完整的实验报告。根据您的需要您可选择不同厂家提供的全基因组表达谱芯片，包括Phalanx , Agilent和NimbleGen。 Phala nx 全基因组表达谱芯片 华联生物科技开发的标准规格的高密度基因组芯片(Phalanx Whole Genome Microarray)在开发过程中透过台湾工业技术研究院与英国 Sanger Institute等国外权威研究机构合作，从设计到生产再到实验的各个步骤中均执行严格标准，采用创新技术，广泛吸收现有芯片的优点，使得其生产的高密度基因组芯片获得了优异的国际品质。康成生物为您提供华联生物高密度基因组芯片及全程技术服务。 Phalanx Slide TM专利片基处理技术 华联生物的高密度基因组芯片，探针设计采用台湾工业技术研究院特有探针设计软件平台( Integrated Massive Probes Optimal Recognition Tool ，IMPORT )。在芯片的制作过程中，华联生物应用表面化学专利技术( PhalanxSlide TM Technology )对片基表面进行处理，使得片基与寡核苷酸探针的亲和活力更高，背景噪音更低，点阵的均一性更强。 高速的PhalanxArray探针布放技术 华联生物在点样过程中，采用非接触式基因探针布放技术，并以方阵基因探针高速布放技术(PhalanxArray Technology)之优势，大量生产。PhalanxArray 同时使用196个排列整齐的PhalanxJets，在一张芯片上布放39，200个均一的探针。PhalanxArray能够布放多达1，000，000张高 密度芯片，布放效率和产量是目前市场上一般芯片布放系统的100倍。 先进的PhalanxJet TM专利点样技术 华联生物开发出独特的PhalanxJet TM系统，结合其先进的非接触式基因探针布放技术和专利的片基处理技术，保证了探针布放的高重复性。尤其重要 的是，PhalanxJet TM系统可以最大限度的避免探针布放中可能的探针交叉污染。每个单独的PhalanxJet TM包含200个独立的点样针，分别对应不同 的探针，在布放时彼此独立，不会相互干扰。 严谨的检测探针和控制探针设计 华联生物的的高密度基因组芯片，寡核苷酸探针均经过严格筛选，能特异性检测数据库中的基因，灵敏度高，特异性强。人类基因组表达谱芯片，探针 信息主要基于数据库UniGene V.175版，同时整合了各大重要数据库信息。小鼠基因组表达谱芯片，探针信息基于数据库MEEBO (Mouse Exonic Evidence Based Oligonucleotide) 。 华联生物的高密度基因组芯片，实验控制探针设计严谨，包括GAM，OGAM，CGAMs，IHCs，ITQC，ETQC等等，并且还采用了多家公司已经设计好的芯片检测探针，如SpotReport Oligo Array 验证系统，Stratagene 的Alien Oligo Array 验证系统，以及Ambion 公司的ArrayControl Sense Oligo Spots系统等等，从而全面检测样品质量，杂交反应效果，标记反应效果等。使得芯片质量与实验效果得到双重保障。 生物芯片质量评估标准MAQC规范 依据美国食品药物管理局(FDA)与国际上主要生物芯片企业协商制定的生物芯片质量评估标准MAQC计划规范，华联全基因组表达谱芯片各项指标，
抗核抗体谱（ANAs）检测项目及项目物价收费： 注明：项目编号3-2抗核提取物抗体测定，其中包含检测抗体（抗SSA、抗SSB、抗JO
－1、抗Sm、抗nRNP、抗ScL-70、抗着丝点抗体的测定） 该表中湛江及附院收费是参考2011年版的湛江物价局医疗收费及附院0212年收费，请核对并完善。 抗核抗体谱17s亚辉龙中标编号：3179998，中标价：T, 优惠价：T ，抗核抗体谱12S亚辉龙中标编号：3179999, 中标价格：T, 优惠价：T，抗核抗体谱8S亚辉龙中标编号：3180000 ，中标价格：T, 优惠价：T 项目的临床意义如下： 1.高滴度的抗U1-nRNP抗体是混合性结缔组织病（MCTD，夏普综合征）的标志， 阳性率为95-100％，抗体滴度与疾病活动性相关。在30-40％的系统性红斑狼疮患 者中也可检出抗U1-nRNP抗体，但几乎总伴有抗Sm抗体。 2.抗SmD1抗体是系统性红斑狼疮的特异性标志，与抗dsDNA抗体一起，是系统性 红斑狼疮的诊断指标，但阳性率仅为5-10％。 3.抗SS-A（Ro60）抗体最常见于干燥综合征（40-80％）、也见于系统性红斑狼疮 （30-40％）和原发性胆汁性肝硬化（20％）中，偶见于慢性活动性肝炎。此外， 在100％的新生儿红斑狼疮中可出现抗SS-A抗体。该抗体可经胎盘传给胎儿引起 炎症反应和新生儿先天性心脏传导阻滞。 4.抗SS-A（Ro52）抗体在自身免疫性疾病中是一个非特异性指标，与多种自 身免疫性疾病都有相关性，在很多疾病处于稳定期、控制好的情况下会 显示阴性；如果阳性会提示复发或者优先于其它指标预警，起到预防提 示作用。此指标合并其它指标阳性，常会提示预后不好。 5.抗SS-B抗体几乎仅见于干燥综合征（40-80％）和系统性红斑狼疮（10-20％）的 女性患者中，男女比例为29:1。在干燥综合征中抗SS-A抗体和抗SS-B抗体常同 时出现。 6.抗Scl-70抗体见于25-75％的进行性系统性硬化症（弥散型）患者中，因实验方法 和疾病活动性而异（Scl=硬化症）。在局限型硬化症中不出现。 7.抗Jo-1抗体见于多肌炎，阳性率为25-35％。常与合并肺间质纤维化相关。 8.1977年，Wolfe及其同事首先在多肌炎病人中描述了抗PM-Scl抗体，并把该抗体 叫做抗PM抗体。在1984年，Reichlin与其同事经过研究，发现了抗PM-1抗体的 更准确的特征和命名（抗PM-Scl抗体）。在50-70%的所谓的重叠综合征患者中可 检出这些抗体，在这些患者中可合并出现多肌炎（PM）、皮肌炎（DM）和进行性 系统性硬化症（Scl）。抗PM-Scl抗体在进行性系统性硬化症（弥散型）中的阳性 率为3%，在多肌炎和皮肌炎中的阳性率为8%。 9.抗着丝点抗体与局限型进行性系统性硬化症（CREST综合征：钙质沉着、Raynaud’s 病、食管功能障碍、指硬皮病、远端血管扩张）有关，阳性率为70-90%。 10.抗PCNA抗体对系统性红斑狼疮具有很高的特异性，但其阳性率仅为3％ 11.抗dsDNA抗体对系统性红斑狼疮具有很高的特异性。除抗Sm抗体外，抗dsDNA 抗体也可作为该病的一个血清学指标，阳性率为40-90%。
基因表达谱芯片数据分析及其Bioconductor实现 1.表达谱芯片及其应用 表达谱DNA芯片（DNA microarrays for gene expression profiles）是指将大量DNA片段或寡核昔酸固定在玻璃、硅、塑料等硬质载体上制备成基因芯片，待测样品中的mRNA被提取后，通过逆转录获得cDNA,并在此过程中标记荧光，然后与包含上千个基因的DNA芯片进行杂交反应30min~20h后，将芯片上未发生结合反应的片段洗去，再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定芯片上个点的荧光强度，从而推算出待测样品中各种基因的表达水平。用于硏究基因表达的芯片可以有两种：①cDNA芯片；② 寡核昔酸芯片。 cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核昔酸芯片采用双色荧光系统：U前常用Cy3—dUTP （绿色）标记对照组mRNA, Cy5—dUTP （红色）标记样品组mRNAUl。用不同波长的荧光扫描芯片，将扫描所得每一点荧光信号值自动输入计?算机并进行信息处理，给出每个点在不同波长下的荧光强度值及其比值（ratio值），同时计算机还给出直观的显色图。在样品中呈高表达的基因其杂交点呈红色，相反，在对照组中高表达的基因其杂交点呈绿色，在两组中表达水平相当的显黄色，这些信号就代表了样品中基因的转录表达情况⑵。 基因芯片因具有高效率，高通量、高精度以及能平行对照研究等特点，被迅速应用于动、植物和人类基因的研究领域，如病原微生物毒力相关基因的。基因表达谱可直接检测mRNA的种类及丰度，可以同时分析上万个基因的表达变化，来揭示基因之间表达变化的相互关系。表达谱芯片可用于研究：①同一个体在同一时间里，不同基因的表达差异。芯片上固定的已知序列的cDNA或寡聚核昔酸最多可以达到30 000多个序列，与人类全基因组基因数相当，所以基因芯片一次反应儿乎就能够分析整个人的基因⑶。②同一个体在不同时间里，相同基因的表达差异。 ③不同个体的相同基因表达上的差异。利用基因芯片可以分析多个样本，同时筛选不同样本（如肿瘤组织、癌前病变和正常组织）之间差异表达的基因，这样可以避免了芯片间的变异造成的误差⑷。张辛燕⑸ 等将512个人癌基因和抑癌基因的cDNA用点样仪点在特制玻片上制成表达谱芯片，对正常人卵巢组织及卵巢癌组织基因表达的差异性进行比较研究，结果发现在卵巢癌组织中下调的基因有23个，上调的基因有15个，初步筛选出了卵巢癌相关基因。Lowe⑹等利用胰腺癌、问充质细胞癌等组织的cDNA制备基因芯片，筛选到胰腺癌细胞中高表达的基因，为医疗诊断、病理研究及新药设计 奠定基础。 2.表达谱芯片的数据处理技术
基因表达谱聚类分析 [ 文章来源：| 文章作者：| 发布时间：2006-12-21| 字体：[大中小] 学习过程可以采用从全局到局部的策略。采取这种策略时，学习初期可设定较大的交互作用半径R ，随着学习过程的不断推进，逐步减小R ，直至不考虑对邻近单元的影响。邻域的形状可以是正方形或者圆形。 KFM 的聚类结果与K 均值相似，它的优点是自动提取样本数据中的信息，同时也是一种全局的决策方法，能避免陷入局部最小，缺点在于必须实现人为设定类的数目与学习参数，而且学习时间较长。KFM 方法克服了K- 均值聚类的一些缺点：它应用类间的全局关系，能提供大数据集内相似性关系的综合看法，便于研究数据变量值的分布及发现类结构。而且，它具有更稳健更准确的特点，对噪声稳定，一般不依赖于数据分布的形状。 8.4.2.5 其它聚类方法 聚类方法是数据挖掘中的基本方法，数据挖掘的方法很多，在基因表达谱的分析中，除了以上常用方法外，还有一些其它的方法。由于对聚类结果尚没有一种有效的方法进行评价，尤其是对聚类结果的进一步生物学知识发现尚没有新的分析思路和成功应用，因此，科学家们在不断地研究一些新方法。这些方法有不同的原理，能够提取不同数据特征，有可能对具体的数据得到更有意义的结果，发现更多的生物学知识。这里，简单介绍这些方法的原理，更详细的介绍请参看相关文献。 (1)模糊聚类分析方法:这是一种模拟人类的思维方法，通过隶属度函数来反映某一对象属于某一类的程度。基本思路是计算两两基因表达谱之间的相似性程度，构建模糊相似矩阵，利用模糊数学中的传递闭包计算方法得到模糊等价矩阵，选择不同的置信水平从模糊等价矩阵中构建动态聚类图。对于特定的置信水平，可以实现对基因表达谱的分类。该方法的优点是利用了模糊数学中的隶属度概念，能够更好的反映基因表达谱之间的相互关系，而且它是一种全局的优化方法，与向量的顺序无关。 (2)模糊C均值算法:该方法同样将模糊数学中的隶属度概念引入到常用的K 均值聚类方法中。对于K 均值算法，一个基因表达谱所属的类只有一个，因此，它与各类别的关系要么是 1 ，要么是0 ，即属于或不属于某一类。而对于模糊 C 均值法，一个基因表达谱是否属于某一类，是以隶属度来确定第i 个样本属于第j 类的可能性。最终的聚类结果取决于分析的目的，可以根据最大隶属度来确定基因表达谱的分类，即一个基因表达谱只属于一类；但往往是确定隶属度的阈值，只要大于该阈值，就可以将基因表达谱划分为该类，这样的划分结果是一个基因表达谱可以属于多个类，这也是可以被生物学家接受的。模糊 C 均值法与K 均值法的实现过程基本相同，所不同的是对于
对于基因表达谱数据的分析是生物信息学的研究热点和难点。转化为数学问题，分析任务是从数据矩阵 M 中找出显著性结构，结构类型包括全局模型 (model) 和局部模式 (pattern) 。对基因表达谱数据的分析是数据挖掘问题，所采用的方法包括通过可视化进行探索性数据分析（ Exploratory Data Analysis ）、描述建模 (descriptive modeling) 、分类、聚类、回归和机器学习等。 基因表达谱分析所采用的常用方法是聚类，其目的就是将基因分组。从数学的角度，聚类得到的基因分组，一般是组内各成员在数学特征上彼此相似，但与其它组中的成员不同。从生物学的角度，聚类分析方法所隐含的生物学意义或基本假设是，组内基因的表达谱相似，它们可能有相似的功能。然而，产物有相同功能的编码基因（例如对其它蛋白质有磷酸化作用），不一定共享相似的转录模式。相反，有不同功能的基因可能因为巧合或随机扰动而有相似的表达谱。尽管有许多意外的情况存在，大量功能相关的基因的确在相关的一组条件下有非常相似的表达谱，特别是被共同的转录因子共调控的基因，或者产物构成同一个蛋白复合体，或者参与相同的调控路径。因此，在具体的应用中，可以根据对相似表达谱的基因进行聚类，从而指派未知基因的功能。 聚类分析是模式识别和数据挖掘中普遍使用的一种方法，是基于数据的知识发现的有效方法，特别适用于模式分类数不知道的情况。聚类分析是一种无监督学习方法，不需要任何先验领域知识，它根据数学特征提取分类标准，对数据进行分类，这种数学特征的例子有统计平均值、相关系数、协方差矩阵的本征值及本征向量等。聚类分析在基因表达数据分析中应用得很多，主要有层次聚类、 K 均值、自组织特征映射网络等。本节将介绍基因表达数据分析中常用的聚类方法及与此相关的内容。 8.4.1 相似性度量函数 对基因表达谱进行聚类分析之前，必须首先确定反映不同基因表达谱相似程度的度量函数，根据该函数可以将相似程度高的基因分为一类。在实际计算中，还可以用距离代替相似的概念，相似性度量被转化为两个基因表达谱之间的距离。距离越小，表达模式越相近；反之，则表达模式差异大。 常见的相似性度量有距离、点积、相关系数（ correlation coefficient ）、互信息（ mutual information ）等。假设两个基因表达谱分别为X = （x 1 ,x 2 ,…,x m ）和Y = （y 1 ,y 2 ,…, y m ） , 距离函数 d( X ，Y ) 必须满足如下条件： d( X ，Y ) ≧ 0 d( X ，Y ) = d( Y ，X ) d( X ，Y ) = 0 if X = Y
基因表达谱分析技术 1微阵列技术（microarray） 这是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差别表达、基因组表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项新的基因功能研究技术。其原理基本是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术,在固相表面合成成千上万个寡核苷酸“探针”（cDNA、ESTs或基因特异的寡核苷酸），并与放射性同位素或荧光物标记的来自不同细胞、组织或整个器官的DNA或mRNA反转录生成的第一链cDNA进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。其优点是可以同时对大量基因，甚至整个基因组的基因表达进行对比分析。包括cDNA芯片（cDNA microarray）和DNA芯片（DNA chips）。 cDNA芯片使用的载体可以是尼龙膜，也可以是玻片。当使用尼龙膜时，目前的技术水平可以将20000份材料点在一张12cm×18cm的膜上。尼龙膜上所点的一般是编好顺序的变性了的双链cDNA片段。要得到基因表达情况的数据，只需要将未知的样品与其杂交即可。杂交的结果表示这一样品中基因的表达模式，而比较两份不同样品的杂交结果就可以得到在不同样品中表达模式存在差异的基因。杂交使用的探针一般为mRNA的反转录产物，标记探针使用32PdATP。如果使用玻片为载体，点阵的密度要高于尼龙膜。杂交时使用两种不同颜色的荧光标记不同的两份样品，然后将两份样品混合起来与一张芯片杂交。洗去未杂交的探针以后，能够结合标记cDNA的点受到激发后会发出荧光。通过扫描装置可以检测各个点发出荧光的强度。对每一个点而言，所发出的两种不同荧光的强度的比值，就代表它在不同样品中的丰度。一般来讲，显示出来的图像中，黄色的点表示在不同的样品中丰度的差异不大，红色和绿色的点代表在不同样品中其丰度各不相同。使用尼龙膜为载体制作cDNA芯片进行研究的费用要比玻片低，因为尼龙膜可以重复杂交。检测两种不同的组织或相同组织在不同条件下基因表达的差异，只需要使用少量的尼龙膜。但是利用玻片制作的cDNA芯片灵敏度更高，而且可以使用2种探针同时与芯片杂交，从而降低了因为杂交操作带来的差异；缺点是无法重复使用还必须使用更为复杂的仪器。 Guo等（2004）将包含104个重组子的cDNA文库点在芯片上，用于检测拟南芥叶片衰老时的基因表达模式，得到大约6200差异表达的ESTs，对应2491个非重复基因。其中有134个基因编码转录因子，182个基因预测参与信号传导，如MAPK级联传导路径。Li等（2006）设计高密度的寡核苷酸tiling microarray方法，检测籼稻全基因组转录表达情况。芯片上包含13,078,888个36-mer寡核苷酸探针，基于籼稻全基因组shot-gun测序的序列合成，大约81.9%（35,970）的基因发生转录事件。Hu等（2006）用含有60,000寡核苷酸探针（代表水稻全部预测表达基因）的芯片检测抗旱转基因植株（过量表达SNAC1水稻）中基因的表达情况，揭示大量的逆境相关基因都是上升表达的。 2基因表达系列分析（Serial analysis of gene expression,SAGE） 基因表达系列分析（SAGE）是一种转录物水平上研究细胞或组织基因表达模式的快速、有效的技术，也是一种高通量的功能基因组研究方法，它可以同时将不同基因的表达情况进行量化研究（Velculescu et al.,1995）。SAGE的基本原理是：每一条mRNA序列都可以用它包含的9bp的小片段（TAG）代替，因此考查这些TAGs出现的频率就能知道每一种mRNA 的丰度。首先利用生物素标记的oligo（dT）引物将mRNA反转录成双链cDNA，然后利用NlaIII 酶切双链cDNA。NlaIII酶的识别位点只有4bp，因此cDNA都被切成几十bp的小片段。带有生物素标记的小片段cDNA被分离出来，平均分成2份。这2份cDNA分别跟2个接头连接，2个接头中均有一个FokI酶切位点。FokI是一种II S型核酸内切酶，其识别位点不对称，切割位点位于识别位点下游9bp且不依赖于特异的DNA序列。FokI酶切分成2份的cDNA之
综合microRNA和基因表达谱分析 在肺癌新的肿瘤标记物和机制的研究 摘要 背景： microRNA（miRNA）在非小细胞肺癌诊断中准确性的研究仍有争议。因此，我们系统的识别非小细胞肺癌相关的miRNA，使用微阵列数据来观察目标基因改变。 方法：我们从非小细胞肺癌中，筛选出五组miRNAs，从基因表达数据库里，筛选出六组基因微列阵数据。 结果：我们研究表明，非小细胞肺癌中，有14对miRNA发生显著性变化。其中五对上调（miR-9，miR-708，miR-296-3p，miR-892b，miR-140-5p），9对下调（miR-584，miR-218，miR-30b，miR-522，miR-486-5p、miR-34c-3p，miR-34b，miR-516b，miR-592）。其诊断敏感性（SE）和特异性(SP)分别为82.6%和89.9%.有14对目标基因（P<0.05，倍数变化>2.0）和14对发现的miRNA显著相关，我们建立了一个受检者分类，使得验证有了较高的准确度（SE=0.987，SP=0.824） 结论：我们研究发现，综合的miRNA和目标基因对发现和识别非小细胞肺癌的生物标记物有价值，而且为发现非小细胞肺癌的机制提供了新的视角，此外，我们精心设计了实验，对目标基因相关的14种miRNA在非小细胞肺癌的预测和预后进行了研究。 前言：
在世界范围内，非小细胞肺癌因其高死亡率仍然是引起癌症死亡的主要原因之一，在2014年，其死亡率占到了癌症死亡人数的1/4.近年来，在很多研究报道了非小细胞肺癌鉴别诊断的潜在标记物，然而，精确的非小细胞肺癌的生物学标记物仍需摸索。 当前，microRNA （miRNA），一组小的非编码RNA的发现，为肿瘤的预测提供了新的视野，为肿瘤如非小细胞肺癌的初始筛选提供了新的方法。新的研究数据表明，miRNA在肿瘤中显著改变，和非小细胞肺癌的发生和发展有关。此外，由于miRNA的固有性质，它在标本中高度稳定，可提供更多的精准预测因素。以上发现表明，miRNA可作为非小细胞肺癌诊断的稳定的生物学标记物。 然而，一些独立的研究中，对此仍有不少争议，这往往通过不同的miRNA的表达谱的系统和平台解释。虽然他们分别证实了miRNA在肿瘤分化中的价值，然而收集资料系统的分析对进一步探讨miRNA作为非小细胞肺癌预测的标记物的适用性仍然是 必不可少的。 所以，我们的荟萃分析回答了一下3个问题：（1）是否有miRNA可以识别或抑制非小细胞肺癌组织。（2）和目标基因功能注释的潜在miRNA和通路是否有关系，（3）这些miRNA的靶向基因是否和非小细胞肺癌的起始和进程有关。 讨论： 研究中，我们主要关注利用miRNA数据集，是否可以将潜在的miRNA可以作为精准的生物标记物，从而从正常组织中来区分
第18卷第6期微阵列技术[1-3]的到来对生物学和医学来说是一场 革命，通过它可以同时观测成千上万个基因的表达水平，从而能够在基因组水平上以系统的、 全局的观念去研究生命现象及其本质。还可以根据基因在不同条件下表达的差异性来进行复杂疾病诊断、药物筛选、个性化治疗、基因功能发现、农作物优育和优选、环境检测和防治、食品卫生监督及司法鉴定等，因此对基因表达谱的研究具有重要的理论价值和应用意义。微阵列基因表达数据具有维数高、样本小、非线性的特点，这对一些传统的机器学习方法提出了新的挑战，对其数据的分析已成为生物信息学研究的焦点。 1基因表达数据采集 基因表达数据采集可分为三个步骤：微阵列设计、 图像分析和数据获取、过滤、标准化。基因芯片（gene chip ），简称为微阵列,就是指固着在载体上的高密度 DNA 微点阵，具体地说就是将靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度排列在玻璃、硅等载体上。mRNA （信使核糖核酸）的表达水平的获得是通过选取来自不同状态的样本（如正常组织与肿瘤组织、不同发育阶段组织，或用药之前与用药之后组织等，一种称为实验样本，另外一种称为参考样本），在逆转录过程中,实验样本和参考样本RNA （核糖核酸）分别用不同的红、绿荧光染料去标记，并将它们混合，与微阵列上的探针序列进行杂交，经适当的洗脱步骤与激光扫描仪对芯片进行扫描，获得对应于每种荧光的荧光强度图像，通过专用的图像分析软件，可获得微阵列上每个点的红、绿荧光强度（Cy5和Cy3），其比值（Cy5/Cy3）表示该基因在实验样本中的表达水平。在通常情况下，考虑Cy5和Cy3的数值时，还应考虑相应的背景数值，如果微阵列上某个基因的Cy5或Cy3数值比相应的背景数值低，则该基因的表达水平无法确定。为了方便数据处理，常 孟令梅等：一种基于DCT 变换的图像认证算法文章编号：1005－1228（2010）06－0017－03 基因表达谱数据分析技术 刘 玲 （江苏财经职业技术学院，江苏淮安 223001） 摘 要：人类基因组计划的研究已进入后基因组时代，后基因组时代研究的焦点已经从测序转向功能研究，主要采用无监 督和有监督技术来分析基因表达谱和识别基因功能，通过基因转录调控网络分析细胞内基因之间的相互作用关系的整体表示，说明生命功能在基因表达层面的展现，对目前基因表达谱数据分析技术及它们的发展，进行了综述性的研究，分析了它们的优缺点,提出了解决问题的思路和方法，为基因表达谱的进一步研究提供了新的途径。关键词：基因表达谱；分类；无监督；有监督；基因调控网络中图分类号：Q81；TP181 文献标识码：A Gene Expression Data Analysis LIU Ling （Jiangsu Vocational College of Finance &Econimics ，huai ’an 223001,China ） Abstract ：As the work of sequencing the genome of the human has been fully finished,the post-genomic era has begun.Scientists are turning their focus toward identifying gene function from sequencing.Clustering technology,as one of the important tools of analyzing gene expression data and identifying gene function,has been used widely.Transcriptive regulatory networks are the global representation of multiple interactions between genes and their products ,which can help us understand the cell ’s function at the level of gene expression In this paper we discuss main clustering technology about gene expression data at present,analyze their advantages and disadvantages ,present the methods to solve the problems and given approaches to study gene expression data. Key words:gene expression profile ； classification ；gene regulatory network Vol．18No．6Dec 2010 第18卷第6期2010年12月 电脑与信息技术Computer and Information Technology 收稿日期： 2010-06-09项目资助： 江苏省淮安市科技发展计划项目(HAG08015）作者简介： 刘玲（1964-），山东胶州人，副教授，硕士，主要研究方向:生物信息。