海州香薷总黄酮对离体大鼠主动脉环张力的作用及机制
徐佳1陈军津1 周育成1 王会平2
（1浙江大学医学院2004级临床医学专业3系3A班，浙江杭州 310058；
2浙江大学医学院生理教研室，浙江杭州310058）
[摘要] 目的：研究海州香薷总黄酮（total flavones from Elsholtzia splendens ，TFES）对离体大
鼠胸主动脉环收缩张力的作用及其机制。方法：采用大鼠离体胸主动脉灌流模型，累积加药，
检测海州香薷总黄酮对去氧肾上腺素（PE）和KCL预收缩的胸主动脉环收缩张力的影响。结果：海州香薷总黄酮对内皮完整的离体主动脉环基础张力的作用不明显（p>0.05）；内皮完整和去
内皮时，海洲香薷总黄酮（5、10、25、50、100、200ug/mL）对PE（10-4mol/L）和KCL（3mol/L）预收缩的血管环均产生舒张作用（p﹤0.05）；而用NO 合酶（NOS）抑制剂L-NAME（10-4mol/L），鸟苷酸环化酶（GC）抑制剂ODQ（10μmol/L）以及环氧酶（COX）抑制剂Indo（10-5mol/L）处理血管后，对低浓度及高浓度下海州香薷总黄酮舒张血管效应的阻断作用均不明显(p>0.05)；使用电压依赖性的K+通道阻断剂4-AP(1mmol/L)，Ca2+敏感性的K+通道阻断剂TEA(1mmol/L)
以及ATP 敏感性的K+通道阻断剂格列苯脲（Glib）(3μmol/L)处理后，对海州香薷总黄酮舒血
管效应的阻断作用亦均不明显；内皮完整和去内皮时，海州香薷总黄酮对PE（10-4mol/L）预收缩血管环的舒张作用均具有时间依赖性。结论：在低浓度及高浓度下，海州香薷总黄酮对大鼠
离体胸主动脉环产生的舒张效应并非通过NO-鸟苷酸环化酶途径，环氧合酶途径以及直接作用
于平滑肌细胞膜上电压依赖性的K+通道、Ca2+敏感性的K+通道、ATP 敏感性的K+通道的途径产生的，其中浓度下的舒张作用可能与鸟苷酸环化酶有关，其机制待进一步研究明确。
[关键词]海州香薷总黄酮;胸主动脉环;血管舒张;内皮
Effects and Mechanism of Total Flavonoids of Elsholtzia Splendens on Rat Thoracic aortic XU jia1,CHEN jun-jin1,ZHOU yu-cheng1，WANG hui-ping2
(1Clinical Medicine,2Department of Physioligy,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310058,China)
[Abstract] Objective：To investigate the effect of total flavones from Elsholtzia splendens（TFES）on rat thoracic aorta rings and the underlying mechanisms. Methods: The study was performed with the model of isolate rat thoracic aorta rings in organ bath, we investigate the effects of accumulated total flavones from Elsholtzia splendens on the constriction of high KCL and Phenylephrine(PE) preconstricted rat thoracicaorta with endothelium. Results: There is no effect of total flavones from Elsholtzia splendens (TFES) on the basal tonus in rat isolated aortic rings with endothelium(p>0.05).Total flavones from Elsholtzia splendens（5、10、25、50、100、200ug/mL）concentration dependently caused relaxation in vessels with or without endothelium precontracted both with 10-4mol/L phenylephrine (PE) and 60mmol/L KCL(p<0.05).However, the relaxation evoked by TFES of High and low concentration wasn’t inhibited by 10-4mol/L NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)，10μmol/L guanyly cyclase inhibitor 1H-[1,2,4] oxadiazolo [4,3-alpha] quinoxalin-1-one (ODQ) and 10-5mol/L Indomethacin（Indo）(p>0.05). Also, the relaxation to the total flavones from Elsholtzia splendens was not inhibited by 1mmol/L tetraethylammonium (TEA) 、1mmol/L 4-aminopyridine（4-AP）and 3μmol/L Glibenclamide（Glib）. TFES time dependently caused relaxation in vessels with or without endothelium precontracted with 10-4mol/L phenylephrine (PE).Conclusion:The results indicate that TFES can relax the rat thoracic aorta rings with or without endothelium . At the same time, the relaxation by TFES of High and low concentration isn’t mediated by the NO-guanylyl cyclase pathway ,COX pathway and three kinds of K+-channels on the membrane of vascular smooth muscle,yet,the relaxation by TFES of mediate concentration may be mediated by GC,so the mechanisms need more research.
[Key words] TFES; thoracic aorta rings；vascular relaxation；endothelium
香薷（Elsholtzia Splendens）是传统中药，主要用于治疗暑湿感冒、恶寒发热、头痛无汗，也用于治疗腹痛吐泻，小便不利，风湿关节痛等疾病[1]。近来研究表明它还有抗氧化活性、心肌缺血保护、加强内分泌系统免疫、降血脂、抗炎症、抗病原微生物等作用。香薷化学成分复杂，包括黄酮类、香豆素类、木脂素类、萜类，以及各种脂肪酸、挥发油等[2]。早在20世纪60年代，国内外就已研究并证实了银杏叶总黄酮(FG）的扩血管活性，并已初步用于临床，获得较好的疗效[2]。另外据相关研究表明，生物类黄酮具有抗氧化、降低脂质过氧化反应、预防心血管疾病、抗氧、防癌等作用[3]。而香薷总黄酮对血管的作用及其机制方面的研究基本尚属空白。因此，本实验采用大鼠离体胸主动脉灌流模型，在内皮完整和去内皮的条件下，累积加药，检测海州香薷总黄酮对去氧肾上腺素（PE）和KCL预收缩的胸主动脉环收缩张力的影响，探讨其对血管平滑肌的作用及可能的机制。
1 材料与方法
1.1 设备 离体血管环灌流装置，JZJ01 型肌肉张力换能器，HSS－1B 型数字式超级恒温浴槽，RM6240B 型多道生理信号采集处理系统，均为成都仪器厂产品。
1.2 药物与试剂 苯肾上腺素（Phenylephrine，PE），乙酰胆碱（Acetylcholine，Ach），左旋硝基精氨酸甲脂（N（omega）-nitro-L-methyl-ester ，L-NAME）， 吲哚美辛（ Indomethacin ， Indo ），1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-alpha]quinoxalin-1-one(ODQ)，格列苯脲（Glibenclamide），以上均为Sigma公司产品，海州香薷总黄酮由王会平老师提供，用K-H 液配制含海洲香薷总黄酮原液。Krebs-Henseleit （K-H）液（mmol/L）：NaCL 118、KCL 4.7、KH2PO4 1.2、MgSO4 ?7H2O 1.2、NaHCO325，glucose 10、CaCL2 1.25。
1.3 血管环的制备 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，体重200－280 g，由浙江大学医学院动物实验中心提供。每个大鼠的胸主动脉被分成6-8 段，并随机分入8 个实验组进行平行研究。具体方法为：用钝器击昏大鼠后充分放血，迅速取胸主动脉，置于通以95％O2和5％CO2混合气体预饱和地4°C K-H液中，去除周围结缔组织后将血管剪成约3~4mm的血管环，避免过度牵拉，以防损伤内皮。根据实验需要，去除血管内皮时，用镊子磨擦血管环内表面以去除内皮细胞。将血管环悬挂于预置10ml K-H液的浴槽内，37°C恒温，持续通以95％O2和5％CO2的混合气体。静息张力1g稳定血管30min，每隔15min换一次K-H液，每隔10min调整一下张力使其稳定在1g，此后调节静息张力为2g，稳定稳定1h，期间每隔15min换一次K-H液每隔10min调整一下张力使其稳定在2g。用3mol/L的KCL重复刺激3次，以诱发血管的最大收缩幅度。待血管稳定后，用10-4 mol/L PE预收缩血管环达峰值，加入10-4 mol/L Ach检验内皮的完整性。加入Ach后使PE预收缩的血管环舒张60％~90％，认为内皮完整，反之，认为内皮被破坏。实验用RM6240B 型生物信号采集处理系统记录血管张力的变化，分别以末次KCL（终浓度6×10-2mol/L）、PE（终浓度10-6 mol/L）刺激引起的最大收缩幅度为标准，以加入药物后的血管张力幅度与之相比所得百分比比值表示。
1.4 实验分组
1.4.1ES对主动脉环基础张力影响组。ES对内皮完整主动脉环基础张力影响组(n=3)：采用累积加药方法，每18 min加入ES，使灌流液中ES浓度分别达5、10、25、50、100、200 μg/ml；ES 对去内皮主动脉环基础张力影响组(n=4)：使用去除内皮血管环，其余方法同上。
1.4.2ES对PE预收缩主动脉环张力影响组。ES对内皮完整PE预收缩主动脉环张力影响组(n=13)：PE(1μmol/L)预收缩达稳态后，采用累积加药方法，每18 min加入ES，使灌流液中ES浓度分别达5、10、25、50、100、200 μg/ml；ES对去内皮PE预收缩主动脉环张力影响组(n=6)：使用去除内皮血管环，其余方法同上。
1.4.3ES对KCl预收缩主动脉环张力影响组。ES对内皮完整KCl预收缩主动脉环张力影响组(n=9)：KCl (6×10-2mol/L)预收缩达稳态后，采用累积加药方法，每18 min加入ES，使灌流液中ES浓度分别达5、10、25、50、100、200 μg/ml；ES对去内皮KCl预收缩主动脉环张力影响组(n=6)：使用去除内皮血管环，其余方法同上。
1.4.4ODQ、L-NAME、吲哚美辛对香薷总黄酮诱导的舒张反应影响组。ODQ对香薷总黄酮诱导的
舒张反应影响组(n=5)：ODQ 预处理15min，PE （1μmol/L）预收缩达稳态后，采用累积加药方法，每18 min 加入ES，使灌流液中ES 浓度分别达5、10、25、50、100、200 μg/ml；L-NAME 对香薷总黄酮诱导的舒张反应影响组(n=5)：L-NAME 预处理15min，PE（1μmol/L）预收缩达稳态后，采用累积加药方法，每18 min 加入ES，使灌流液中ES 浓度分别达5、10、25、50、100、200 μg/ml；吲哚美辛对香薷总黄酮诱导的舒张反应影响组(n=5)：吲哚美辛预处理15min，PE（1μmol/L）预收缩达稳态后，采用累积加药方法，每18 min 加入ES，使灌流液中ES 浓度分别达5、10、25、50、100、200 μg/ml。
1.4.5格列苯脲、4-氨基吡啶、四乙胺对香薷总黄酮诱导的舒张反应影响组。格列苯脲对香薷总黄酮诱导的舒张反应影响组：格列苯脲预处理15min，PE（1μmol/L）预收缩达稳态后，采用累积加药方法，每18 min 加入ES，使灌流液中ES 浓度分别达5、10、25、50、100、200 μg/ml；4-氨基吡啶对香薷总黄酮诱导的舒张反应影响组：4-氨基吡啶预处理15min，PE（1μmol/L）预收缩达稳态后，采用累积加药方法，每18 min 加入ES，使灌流液中ES 浓度分别达5、10、25、50、100、200 μg/ml；四乙胺对香薷总黄酮诱导的舒张反应影响组：四乙胺预处理15min，PE （1μmol/L）预收缩达稳态后，采用累积加药方法，每18 min 加入ES，使灌流液中ES 浓度分别达5、10、25、50、100、200 μg/ml。
1.4.6香薷总黄酮诱导的舒张反应的时间依赖性变化。内皮完整组：PE（1μmol/L）预收缩内皮完整主动脉环达稳态后，加入香薷总黄酮(0.05g/ml)使灌流液浓度达到100 μg/ml，每3min 记录血管张力变化；去内皮组：PE（1μmol/L）预收缩去内皮主动脉环达稳态后方法同上。记录：Time(min)-----T1/2、TmaxMaximal、relaxation(%)
1.5 统计处理 试验结果用X ±s 表示，用MicrosoftExcel 软件处理，两组间比较采用t 检验，p<0.05 认为有显著性差异。
2 结果
2.1ES 对大鼠离体主动脉环基础张力的影响
TFES 浓度为5、10、25、50、100和200 ug/ml 的条件下，内皮完整主动脉环的张力分别
与基础张力无显著影响(＊＊p>0.05)。同等条件下，去内皮动脉环张力与基础张力有显著影响(＊
p<0.05)。并且浓度为5、10、25、50、100、200μg/ml 的ES 对内皮完整和去内皮的主动脉环的
基础张力在各浓度下均无显著性影响（＊
p>0.05）。见图1
Fig1. Effects of TFES on the basal tonus in rat isolated aortic rings
Pooled data of mean normalized vessel tension aorta rings with or whithout endothelium.And there is no effect of total flavones from Elsholtzia splendens (TFES) on the basal tonus in rat isolated aortic
rings with endothelium(＊
p>0.05)
图1 ES 对离体主动脉环基础张力的影响 （＊＊p>0.05 VS “有内皮未加药”组，＊p<0.05 VS “无内皮未加药”组，＊
p>0.05 vs ”有内皮加ES ”组）
0.00%
5.00%10.00%15.00%20.00%25.00%30.00%35.00%0
50
100150200250ES 浓度（ug/ml）
收缩幅度
有内皮加ES 组
无内皮加ES 组
2.2ES 对PE 预收缩主动脉环张力的影响。
TFES 浓度为5、10、25、50、100、200μg/ml 的条件下，可使PE 预收缩的内皮完整的主
动脉环舒张，比PE 预收缩时的张力明显降低（＊
p<0.05），并呈现浓度依赖性，ES 对去内皮
动脉环PE 预收缩后的血管张力也具有明显的舒张效应（＃
p<0.01），并呈现浓度依赖性，见，并且内皮完整和去内皮的主动脉环组间各数据无明显差异(P>0．05）见（图1）
A
B
Fig.2Effect of TFES on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat.
A: Records from experiments illustrating the effect of increasing dose of TFES the tension of PE precontracted aorta ringswith(up, E+)or without(underside, E-)endothelium. B :Pooled data of mean
normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings with or whithout endothelium.
＊
p<0.05 compared PE （E+）with predrug value , ＃
p<0.01 compared PE （E-）with predrug value,p >0.05 compare PE （+E ）with PE （E －）.
2.3 ES 对KCl 预收缩主动脉环张力的影响。
TFES 浓度为5、10、25、50、100和200 ug/ml 的条件下，可使KCl 预收缩的内皮完整主
动脉环舒张，比KCl 预收缩时的张力明显降低(＊
P<0.01);对去内皮主动脉环KCl 预收缩后的血
管张力也有舒张作用，张力降低(＃
P<0.05) 去内皮组和内皮完整主动脉环各数据无显著性差异(p>0.05)。
A
图2 ES 对PE 预收缩的主动脉环张力的影响0.00%
20.00% 40.00% 60.00% 80.00%
100.00% 120.00% 0
50 100150200250
ES 浓度（ug/ml）
收缩幅度
E+ ES 对血管环的作 用
E- ES 对血管环的作 用E+ 对照E- 对照
E-
B
E-
Fig.3 Effect of TFES on tension of KCl A: Records from experiments illustrating the effect of
increasing dose of TFES the tension of KCl precontracted aorta ringswith(up, E+)or without(underside, E-)endothelium. B :Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form KCl precontracted
aorta rings with or whithout endothelium.＊p<0.01 compared PE （E+）with predrug value , ＃
p<0.05 compared PE （E-）with predrug value,p >0.05 compare PE （+E ）with PE （E －）.
2.4 ODQ 对香薷总黄酮诱导的舒张反应的影响。
为了探讨鸟苷酸环化酶途径是否参与TFES 的血管舒张作用，用鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ 处理内皮完整的血管环后，观察TFES 对血管张力的影响。ODQ 处理后， 在ES 浓度为25-50 μg/ml
时使PE 预收缩的血管产生舒张的作用被显著性减弱（＊
P<0.05
）；在较高或较低时，无显著性差
图3 ES 对KCl 预收缩的主动脉环张力的影响
0.00%
20.00%40.00%60.00%80.00%100.00%120.00%
140.00%160.00%0
50
100150200250ES 浓度（ug/ml）
收缩幅度
E+ CONTROL E- CONTROL E+ ES E- ES
异。
A
B
Fig. 4 Effect of TFES on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by ODQ. A: Records from experiments illustrating the effect of TFES on the
phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by ODQ .B ：Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings(pretreated
by ODQ) with endothelium. ＊
P<0.05 compared PE
（E+）（mediate concentration ）with predrug value
2.5 L-NAME 对香薷总黄酮诱导的舒张反应的影响。
为了探讨NO-GC 途径是否参与TFES 的血管舒张作用，用NO 抑制剂L-NAME 处理内皮完整的血管环后，观察TFES 对血管张力的影响。L-NAME 预处理后，ES 对PE 预收缩血管的舒张效应
与未经L-NAME 处理的血管舒张效应之间无显著性差异(＊
P>0.05)。 A
B
图4 ODQ 对ES 血管作用的影响-20.00%0.00% 20.00%40.00%60.00%80.00%100.00%120.00%ES 浓度（ug/ml）
收缩幅度
ODQ 有内皮
有内皮 ES 累积对PE 收缩的作用
Fig 5. Effect of TFES on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by L-NAME. A: Records from experiments illustrating the effect of TFES on the
phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by L-NAME. B:Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta
rings(pretreated by L-NAME) with endothelium.＊
P>0.05 compare PE （＋E ）group with L-NAME ＋PE （＋E ）group.
2.6 吲哚美辛对香薷总黄酮诱导的舒张反应的影响。
为了探讨环氧合酶（COX ）途径是否参与TFES 的血管舒张作用，采用内皮完整的血管环用环氧合酶抑制剂Indo 处理后，观察TFES 对血管张力的影响。Indo 预处理后，ES 对PE 预收缩血
管的舒张效应与未经Indo 处理的血管舒张效应之间无显著性差异(＊
P>0.05)。
A
B
图6 Indo 对ES 血管作用的影响
-20.00%0.00% 20.00%40.00%60.00%80.00%100.00%120.00%ES 浓度（ug/ml）
收缩幅度
Indo 有内皮 有内皮 ES 累积对PE 收缩的作用
图5 L-NAME 对ES 血管作用的影响-20.00%0.00% 20.00%40.00%60.00%80.00%100.00%120.00%ES 浓度（ug/ml）
收缩幅度
L-NAME 有内皮 有内皮 ES 累积对PE 收缩的作用
Fig. 6 Effect of TFES on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by Indo. A: Records from experiments illustrating the effect of TFES on the
phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by Indo . B:Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta
rings(pretreated by indomethacin) with endothelium 。＊
P>0.05 compare PE （＋E ）group with Indo ＋PE （＋E ）group.
2.7 格列苯脲对香薷总黄酮诱导的舒张反应的影响。
为了探讨TFES 的血管舒张作用是否通过ATP 敏感性K ＋通道发挥作用，用ATP 敏感的K ＋通道抑制剂格列本脲（Glib ）处理完整的血管环后，观察TFES 对血管张力的影响。Glib 预处理后，在5、10ug/ml 浓度ES 时对PE 预收缩血管的舒张效应与未经Glib 处理的血管舒张效应之间
无显著性差异(＊P>0.05);当ES 浓度较高时两组之间存在显著性差异(＊＊
P<0.05),但ES 的舒张作用加强。
A
B
Fig. 7 Effect of TFES on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by Glib A: Records from experiments illustrating the effect of TFES on the
phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by Glib. B: Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings(pretreated by Glib)with endothelium.
2.8 4-氨基吡啶对香薷总黄酮诱导的舒张反应的影响。
为了探讨TFES 的血管舒张作用是否通过电压门控K ＋通道发挥作用，用电压门控K ＋通道阻断剂4-AP 处理内皮完整的血管环后，观察TFES 的血管效应。4-AP 预处理后，在5、10、25ug/ml
浓度ES 时对PE 预收缩血管的舒张效应与未经TEA 处理的血管舒张效应之间无显著性差异(＊
P
>0.05);当ES 浓度升高后两组之间存在显著性差异(＊＊
P <0.05)，但ES 的舒张作用加强。
-20.00%
0.00%20.00%40.00%60.00%
80.00%100.00%
120.00%ES 终浓度(ug/ml)
E+ ES 对血管环的作用
图7． Glib 对ES 血管作用的影响收缩幅度
A
B
Fig.8 Effect of TFES on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by 4-aminopyridine(4-AP). A: Records form experiments illustrating the effect of TFES on the phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by 4-AP. B: Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings(pretreated by 4-AP ) with endothelium.
2.9 四乙胺对香薷总黄酮诱导的舒张反应的影响。
为了探讨TFES 的血管舒张作用是否通过Ca 2＋敏感性K ＋通道发挥作用，用Ca 2＋敏感性K ＋
通道抑制剂TEA 处理内皮完整的血管环后，观察TFES 对血管张力的影响。TEA 预处理后，在5、10、25ug/ml 浓度ES 时对PE 预收缩血管的舒张效应与未经TEA 处理的血管舒张效应之间无显著性
差异(＊P >0.05);当ES 浓度升高后两组之间存在显著性差异(＊＊
P <0.05)，但ES 的舒张作用加强。
A
B
-20.00%
0.00%20.00%40.00%60.00%80.00%100.00%
120.00%140.00%ES 终浓度(ug/ml)
E+ ES 对血管环的作用
图8． 4-AP 对ES 血管作用的影响收缩幅度
Fig. 9 Effect of TFES on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat which have been pretreated by TEA. A: Records from experiments illustrating the effect of TFES on the
phenylephrine(PE) precontracted tension of aorta rings of rat which have been pretreated by TEA.B: Pooled data of mean normalized vessel tension obtained form PE precontracted aorta rings(pretreated by TEA) with endothelium.
2.10 探讨ES 舒血管作用是否存在时间依赖性，对内皮完整的血管环用PE 预处理，在保持ES100μg/ml 浓度环境下观察血管的张力变化，得到血管内皮最大舒张程度是峰值的37.34±0.15%，最大舒张时间Tmax 及舒张一半时间T1/2分别为20.42±1.24s 和8.7±4.19s 。同理对去内皮血管进行相同操作，得到血管内皮最大舒张程度是峰值的70.7±0.10%，与内皮完整组有显著性差异（p<0.05），最大舒张时间Tmax 及舒张一半时间T1/2分别为19.24±
3.62s 和11.3±1.29s 。
A
B
图9． TEA 对ES 血管作用的影响-40.00%
-20.00%0.00%20.00%40.00%
60.00%80.00%
100.00%120.00%140.00%ES 终浓度(ug/ml)
E+ ES 对血管环的作用
收缩幅度
Fig.10The time dependent effect of TFES on tension of phenylephrine(PE) precontracted aorta rings of rat.
3.讨论
香薷是一种传统中药，主要用于治疗暑湿感冒、恶寒发热、头痛无汗，也用于治疗腹痛吐泻，小便不利，风湿关节痛等疾病[1]。近来研究表明它还有抗氧化活性、心肌缺血保护、加强内分泌系统免疫、降血脂、抗炎症、抗病原微生物等作用。香薷化学成分复杂，包括黄酮类、香豆素类、木脂素类、萜类，以及各种脂肪酸、挥发油等[2]。早在20世纪60年代，国内外就已研究并证实了银杏叶总黄酮(FG ）的扩血管活性，并已初步用于临床，获得较好的疗效[2]。另外据相关研究表明，生物类黄酮具有抗氧化、降低脂质过氧化反应、预防心血管疾病、抗氧、防癌等作用[3]。对香薷总黄酮血管方面的可能作用尚基于以上研究的推测。
本实验研究结果表明，海州香薷总黄酮可使PE 及KCL 预收缩的大鼠胸主动脉环产生舒张，而这一作用并不依赖于内皮的存在，其作用机制与血管床直接相关，同时也不排除其尚有内皮途径参与的可能，其作用有明显的浓度依赖性，且在中浓度下具有明显差异。同时试验结果显示，用NO 合酶（NOS ）抑制剂L-NAME 和鸟苷酸环化酶（GC ）抑制剂ODQ 均不能阻断TFES
低浓度及高浓度下的舒张血管效应，用电压依赖性的K + 通道阻断剂4-AP ，
Ca 2+ 敏感性的K + 通道阻断剂TEA 以及ATP 敏感性的K +通道阻断剂格列苯脲处理后，对海州香薷总黄酮介导的舒血管效应亦无阻断作用。这些结果提示我们：NO-GC 途径和COX 途径这两条内皮途径并不参与香薷总黄酮的舒血管作用，并且直接作用于平滑肌的3种K+ 通道也和香薷总黄酮的舒血管作用没有密切关系。本研究还表明，TFES 可以时间依赖性地抑制内皮完整及去内皮血管由PE 引起的血管收缩。
KCL 是通过平滑肌细胞去极化而诱导血管收缩，其机制主要是细胞外高K + 使Ca 2+ 通道开放，细胞外Ca 2+ 内流，从而增加了细胞内Ca 2+的浓度[4]。然而，PE 诱导的血管收缩是由α1 肾上腺素受体的激活造成的，主要通过激活磷脂酶C （PLC ），产生甘油二酯（diacylglycerol ，DG ）和三磷酸肌醇（1，4，5－triphosphate inositol ，IP3），主要通过IP3 诱导肌浆网内的Ca 2+释放[5] 。其最终结果都是使细胞内Ca 2+浓度升高，促进血管平滑肌细胞肌凝蛋白和肌纤蛋白的相互作用，从而引起收缩。海州香薷总黄酮对两者诱导的内皮完整及去内皮的血管环都产生舒张作用，因此考虑其可能是通过某些机制来影响内钙的释放和外钙内流来产生舒张血管的作用。对于TFES 如何影响内钙释放或外钙内流，本实验并未详细涉及，目前研究已知细胞内钙的释放与肌浆网上的RyR 受体和IP 3 受体有关[6]，而细胞膜上Ca 2+通道亦有电压依赖性和受体依赖性之分[7]，若实验条件允许，可通过使用无钙液、RyR 受体和IP 3 受体的阻断剂等多种手段，在这方面进一步深入研究。
内皮细胞通过释放血管舒张物质在在调节平滑肌的张力中起到了重要的作用[8，
9]。
内皮细胞中释放的最重要的一种物质是内皮源性舒张因子（Endithelium －derived relaxing factor ，EDRF ），
已被Furchgott 等确认是NO
[8，10]
。其它舒血管物质还有前列环素（PGI2
）等。通过内皮产生血图10 ES 舒血管作用的时间依赖性变化0.00%
20.00%40.00%60.00%80.00%100.00%120.00%0
5
10
15
20
25
时间（min）
收缩幅度
有内皮的
无内皮
管作用一般包括以下3条途径：NO-GC途径，COX途径，细胞超极化(DEHF)与细胞色素P450途径[11]。NO-GC途径的具体过程如下：血管内皮细胞中内皮型NO合酶（eNOS）催化生成NO后，其可透过细胞膜扩散进入平滑肌细胞，并且与平滑肌细胞那的可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）血红素部分结合，活化sGC，在Mg2＋与ATP 存在的条件下活化的sGC催化GTP 形成cGMP，后者作为一种重要的信号分子可激活cGMP 依赖的蛋白激酶（PKG），活化的PKG 使平滑肌细胞膜L 型Ca2+通道（ICa，L），肌浆网（SR）膜的IP3 受体和rya-nodine 受体磷酸化，磷酸化可以使这些通道失活、关闭，前者使Ca2+内流减少，而后者使SR释放Ca2+减少，两者都使平滑肌细胞内的Ca2+减少，诱发血管平滑肌的舒张[6]。COX 途径中，COX 活性增强，PGI2 合成增多，PGI2 介导了血管的舒张[6]。
在本实验中，NOS抑制剂L-NAME及GC 阻断剂ODQ都不能阻断了海州香薷总黄酮在低浓度及高浓度下引起的舒血管作用，证明TFES的舒血管作用可能与细胞超极化(DEHF)与细胞色素P450途径有关，或是不通过内皮途径产生作用。中浓度下GC 阻断剂ODQ可以阻断TFES的舒血管作用，可见中浓度TFES的舒张血管作用，可能与sGC有关。在大血管中,由于NO作用的存在, EDHF的作用难以显现[11] ,可以通过合并使用L - NAME 和P450抑制剂SKF - 525A 与单独使用
L – NAME比较有无显著差异,来证明TFES的舒血管作用是否涉及DEHF[11]。
血管平滑肌细胞上电压激活的钾通道(voltageactivatedK+-channel, KV)、钙激活的钾通道(Ca2+-activated K+-channels, KCa)、ATP 敏感性钾通道(ATP-sensitive K+-channel, KATP)和内向整流钾通道(inwardly-rectifying K+-channel, KIR)均参与血管舒张反应和血管基本紧张度(vascular basal tone)的维持[12]。近年来不断发现有扩血管作用的钾通道开放剂，一些传统扩血管药物也相继报道有钾通道开放作用。各种钾通道激活造成的血管舒张反应与其引起血管平滑肌细胞膜复极化或超极化有关[12]。本实验显示，用电压依赖性的K+通道阻断剂4-AP，Ca2+敏感性的K+通道阻断剂TEA以及ATP敏感性的K+通道阻断剂格列苯脲处理后，对海州香薷总黄酮介导的舒血管效应均无阻断作用，提示我们直接作用于平滑肌的这3种K+ 通道与香薷总黄酮的舒血管作用没有密切关系。那么，这一结果就提示我们，香薷总黄酮的舒血管作用可能与内向整流钾通道(inwardly-rectifying K+-channel, KIR)有关，或是与直接作用于血管平滑肌上的其他途径有关。现在已经知道NA、组织胺和5-羟色胺分别通过激活血管平滑肌细胞上α1肾上腺素受体、H1组
织胺受体和5-HT2受体收缩血管[13]，因此推测TFES可能通过非选择性阻断α1受体、H1 受体或5-HT2受体扩张血管；或不直接作用于上述膜受体, 而是作用于受体激活后细胞内信号转导过程的某一或多个环节，因为α1受体、H1 受体和5-HT2 受体均为G蛋白耦联的膜受体，有相似的细胞内信号转导通路。而对于内向整流钾通道，我们可以选用BaCl2作为阻断剂进行研究，亦可考虑使用非选择性的钾通道阻断剂来研究。若有条件能进一步完成上述深入研究实验，相信会对TFES的舒血管作用的机制有更清楚的了解。
在本实验中，使用电压依赖性的K+通道阻断剂4-AP，Ca2+敏感性的K+通道阻断剂TEA 以及ATP敏感性的K+通道阻断剂格列苯脲处理后，TFES的舒张作用没有被阻断，反而与对照相比舒张得更加厉害，Glib组是有显著性差异的(p<0.05)，对于这一现象，按照药物本身的作用未能得到明确的解释，因此更多考虑为对照组的问题，本实验对照组是由多次实验共同组成，很多实验因素有所改变，且由于取血管的操作尚不纯熟，血管的活性得不到很好的保证，因此数据处理后效果仍不满意。
本次实验尚存在一些问题，最大的不足就是对照组较少，且对照组的实验条件未能严格的控制；其次，由于同学操作中的失误，造成部分实验数据的组数太少，说服力欠佳。总之，海州香薷总黄酮对大鼠离体胸主动脉环产生的舒张效应具有浓度依赖性和时间依赖性，中浓度下其舒张作用可被ODQ阻断，低浓度和高浓度下的舒张作用并非通过NO-鸟苷酸环化酶途径，环氧合酶途径以及直接作用于平滑肌细胞膜上电压依赖性的K+通道、Ca2+敏感性的K+通道、ATP 敏感性的K+通道的途径，具体作用机制待进一步研究明确。
致谢：衷心感谢王会平老师对我们的耐心指导和帮助，感谢厉旭云老师为我们准备实验仪器和药剂，感谢陈军津同学协助绘制本文图表，感谢周育成同学协助处理本文数据，感谢浙江大学医学院2004级临床医学专业3系3A班全体同学齐心协力共同完成本次研究性实验。
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小鼠、大鼠采血法 1.剪尾采血 当所需血量很少时采用本法。固定动物并露出鼠尾。将尾部毛剪去后消毒，然后浸在45℃左右的温水中数分钟，使尾部血管充盈。再将尾擦干，用锐器（刀或剪刀）割去尾尖0.3-0.5cm，让血液自由滴入盛器或用血红蛋白吸管吸取，采血结束，伤口消毒并压迫止血。也可在尾部作一横切口，割破尾动脉或静脉，收集血液的方法同上。每鼠一般可采血10余次以上。小鼠每次可取血0.1ml，大鼠0.3～0.5ml。 2.鼠尾刺血法 大鼠用血量不多时（仅做白细胞计数或血红蛋白检查），可采用本法。先将鼠尾用温水擦拭，再用酒精消毒和擦拭，使鼠尾充血。用7号或8号注射针头，刺入鼠尾静脉，拔出针头时即有血滴出，一次可采集10～50mm3。如果长期反复取血，应先靠近鼠尾末端穿刺，以后再逐渐向近心端穿刺。 3.眼眶静脉丛采血 采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部（大鼠采血需带上纱手套），应防止动物窒息。当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈（3～4cm）硬质玻璃滴管（毛细管内径0.5-1.0mm），使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。刺入浓度，小鼠约2～3mm，大鼠约4～5mm。当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。左右两眼轮换更好。体重20-25g的小鼠每次可采血0.2-0.3ml；体重200-300g大鼠每次可采血0.5-1.0ml，可适用于某些生物化学项目的检验。 4.断头取血 采血者的左手拇指和食指以背部较紧地握住大（小）鼠的颈部皮肤，并作动物头朝下倾的姿势。右手用剪刀猛剪鼠颈，约1/2-4/5的颈部前剪断，让血自由滴入盛器。小鼠可采用约0.8～1.2ml;大鼠约5-10ml。 5.心脏采血 鼠类的心脏较小，且心率较快，心脏采血比较困难，故少用。活体采血方法与豚鼠相同。若做开胸一次死亡采血，先将动物作深麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用针头刺入右心室，吸取血液。小鼠约0.5-0.6ml；大鼠约0.8-1.2ml。 6.颈动静脉采血 先将动物仰位固定，切开颈部皮肤，分离皮下结缔组织，使颈静脉充分暴露，可用注射器吸出血液。在气管两侧分离出颈动脉，离心端结扎，向心端剪口将血滴入试管内。 7.腹主动脉采血
杜仲乙醇提取物对大鼠离体胸主动脉环的作用及机制 岳晓洁1，，张炯炯1，许逸飞1 ，叶志孟1 ，张薇1，王会平2 （1.浙江大学医学院临床二系，浙江杭州 310031; 2.浙江大学医学院生理学教研室，浙江杭州 310031） [摘要]：目的：探讨杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）醇提物对离体大鼠主动脉环收缩张力的作用及其可能机制。方法：采用大鼠离体胸主动脉环灌流模型，采用累积加药法，观察杜仲醇提物对PE预收缩（苯肾上腺素组+E,-E）、氯化钾预收缩（氯化钾组+E,-E）的血管环的作用; 并检测杜仲对经无钙液预处理后的血管环的作用。结果：不论是否有内皮，累计浓度杜仲对高浓度KCL及PE引起的血管环收缩均有明显的舒张作用。格列苯脲（Glib），4－氨基吡啶(4－AP),四乙胺（TEA）,L-NAME,ODQ，吲哚（Indo）不能阻断杜仲对PE预收缩血管环的舒张。胸主动脉环经无钙液孵育和杜仲处理后对PE的反应性降低。结论：杜仲对胸主动脉环有非内皮依赖性的舒张作用，杜仲能通过抑制内钙释放而起到舒张血管环的作用。 [关键词]：杜仲乙醇提取物；胸主动脉环；内皮；钙通道 Relaxant effect of Eucommia ulmoides Oliv On rat thoracic aorta YUE Xiao-jie, ZHANG Jiong-jiong, XU Yi-fei, YE Zhi-men, ZHANG Wei ,et al (The Second Department of Clinical Medicine, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310031) [Abstract] Objective: To investigate the effect of Eucommia ulmoides Oliv on vascular circles and the underlying mechanisms. Methods: The study was performed with the model of isolate rat thoracic aorta rings in organ bath.The effect of accumulated of ethanol extract of the eucommia bark(EB) on aorta rings (+E,-E), pre-contracted with PE, and pre-contracted with KCl was observed. The effect of EB on aorta rings(-E) pre-contracted with PE(-E) with Ca2+ -free medium was also observed. Conclusion:With or without endothelium, communicative concentration EB has vasorelaxant effects on the thoracic aorta pre-contracted by KCL or PE. nitric oxide synthase inhibitor L-N (G)-nitroarginine methyl ester ( L-NAME), the Soluble guanylyl cyclase Inhibitor ODQ, voltage-dependent K+ channel inhibitor 4-AP, calcium-activated K+ channel inhibitor TEA, ATP-sensitive K+ channel inhibitor Glib, and cyclooxygenase inhibitor indomethacin can’t inhibit EB’s vasorelaxant effects. EB has no relaxation effect on aorta rings which are incubated with Ca2+ -free Kreb’s solution and pre-contracted with PE. Conclusion: EB can relax the rat thoracic aorta rings endothelium independent. And one mechanism is by inhibiting of intracellular calcium ions release . [Key words] :ethanol extract of the eucommia bark；The ring of thoracic aorta；endothelium；Ca2+ channel 杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是杜仲科植物，我国特有经济树种。杜仲皮是传统中药，具有补肝肾，强筋骨，安胎，益寿和降血压的作用。甚至在抗HIV方面,心血管方面，免疫系统，抗衰老，骨细胞增殖，抗肿瘤作用都有发现，在临床上已应用复方杜仲降压片治疗高血压病[1-2]。然而关于杜仲对离体血管作用的研究尚处在初始阶段，并没有大家公认的确切作用及机制的报道。因此，本实验在大鼠离体胸主动脉环灌流模型的基础上，研究杜仲醇提掖对血管张力的影响并探讨其可能的作用机制。
图Ⅷ-31左心房与左心室The left atrium and left ventricle 11左心房left atrium 12左心室left ventricle 13肺动脉右支right branch of pulmonary artery 14肺静脉pulmonary vein 15前腔静脉precavalvein 16肺动脉左支left branch of pulmonary art 7tery 17后腔静脉postcaval vein 18心中静脉 middle cardiac vein 19头臂动脉brachiocephalic artery 20主动脉弓aortic arch 21乳头肌papillary muscles 22左颈总动脉left common carotid artery 23左锁骨下动脉left subclavian artery 24右前腔静脉right precaval vein 25心外膜extracardium
图Ⅷ-56前肢内侧面The anterior limb. Medial aspect
图Ⅷ-57后肢内侧面(1)The posterior limb. Medial aspect（1） 1腋神经axillary nerve 2桡神经radial nerve 3头静脉cephalic vein 4正中神经median nerve 5正中动脉median artery 6肌支muscular branch 7尺神经ulnar nerve 8臂动脉brachial artery 9胸长神经long thoracic nerve 10胸外侧动脉external thoracic artery I1颈总动脉common carotid artery 12主动脉弓aorta arch 13左心耳left auricle 14右心耳right auricle 15食管esophagus 16胸主动脉thoracic aorta 17腹壁浅动脉superficial epigastric artery 18腹壁浅静脉superficial epigastric vein 19隐动脉saphenous artery 20隐大静脉great saphenous vein
离体大鼠胸主动脉环实验 目的： 观察药物对大鼠离体胸主动脉血管环收缩活动的影响； 动物： 健康的SD大鼠，雄性，体重250～280克 药品与试剂： 20%氨基甲酸乙酯，3mo1氯化钾，10-5mo1/L维拉帕米，0.1％苯肾上腺素，1％酚妥拉明，Krebs液，95%O2+5%CO2混合气体 器材： HV-4/SV-4离体组织器官恒温灌流装置，超级恒温水浴，温度计，5g张力换能器，BL-420生物信号采集系统，手术剪刀，眼科剪，眼科镊，培养皿，烧杯，100μl、1m1移液器，棉线； 方法： 1．BL-420生物信号采集系统参数设置： T:DC , F:10Hz ,采样率：100Hz, 扫描速度：25s/div，放大倍数200～500。 2．标本制备 （1）大鼠用20%氨基甲酸乙酯按1g/kg体重腹腔注射麻醉，剪开胸腔，迅速取出心脏及胸主动脉放入盛有4℃的混合气体饱和的Krebs营养液的培养皿中，连续用混合气体充气。 分离出主动脉，将血管内的残存血液冲洗干净，小心剥去外围的结缔组织，将主动脉弓以下的胸主动脉剪成4mm长的动脉环数段备用。 （2）需要保存内皮的血管，动作应轻柔。如需无内皮的血管环，可用棉签或牙签将血管内皮轻轻檫去。 （3）将不锈钢三角钩轻轻穿入血管环，并将另一的三角形不锈钢挂钩也轻轻穿入，通过挂钩悬挂于浴管内，下方固定于固定钩上，上方以一细钢丝挂钩连于张力换能器，通入混合气体，调节通气量至一个一个小气泡逸出为（如下图示）。浴槽内温度应保持37±0.5℃。
图1 离体主动脉血管环孵育测量方式图示 4）血管环的初始张力前15分钟调为1g，15分钟后调至2g，并以此张力平衡60分钟。每隔15分钟换液一次。 5）用终浓度60mmol KCL收缩血管环，作用15 min诱导血管环收缩，激发舒缩活性，待收缩稳定后用预热的Krebs洗脱，反复冲洗直至张力恢复到初始值为止；重复加入同一浓度KCL，连续3次，用Krebs液反复脱洗标本观察收缩曲线波形使其张力信号回复初始值。6）稳定30 min后进行后续实验，记录血管环张力变化数值。张力变化以血管环收缩幅度变化相对值的百分比（%）来表示。
大鼠胸主动脉内皮细胞的体外培养技术 发表时间：2014-12-26T14:14:42.107Z 来源：《医药前沿》2014年第23期供稿作者：杨帆 [导读] 原代培养5～7 d后，可见细胞从组织块边缘爬出，逐渐长成梭形或多角形。 杨帆 (安徽医科大学第一附属医院儿科安徽合肥 230032) 【摘要】目的建立有效、易行、成本低的血管内皮细胞培养方法。方法取幼鼠胸主动脉，分别用酶消化法、机械刮取法、组织块贴壁法、瞬间热处理植环法原代培养大鼠主动脉内皮细胞，消化、传代，观察细胞形态，VIII因子相关抗原免疫细胞化学染色进行细胞鉴定，确定建立动脉内皮细胞体外细胞模型的最有效、易行的培养技术。结果瞬间热处理植环法原代培养大鼠主动脉内皮细胞的细胞纯度和细胞活力都远较酶消化法、机械刮取法、组织块贴壁法高。结论瞬间热处理植环法原代培养大鼠主动脉内皮细胞可获取数量多、纯度高、活性好的细胞，是大鼠胸主动脉内皮细胞的体外培养最有效、易行的培养技术。 【关键词】大鼠主动脉内皮细胞培养 【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）23-0038-01 血管内皮细胞为覆盖于血管内膜表面的单层扁平或多角形的细胞，不仅是血液和组织的屏障，还具有减少血管通透性、抗血栓、调节血管平滑肌功能、抑制壁细胞的游走和增殖的作用，内皮细胞功能的改变是血管性疾病的重要环节，因此建立有效的血管内皮细胞培养方法有助于众多与血管相关疾病的研究。 1 材料与方法 1.1实验动物:体重100-130 g雄性4-5周龄SD大鼠，SPF级。 1.2瞬间热处理植环法原代培养大鼠内皮细胞 1%明胶包被培养皿，4℃过夜后PBS冲洗培养皿，置培养箱2h备用。取材前30 min，大鼠腹腔注射肝素钠800 u/kg。处死大鼠，75%乙醇浸泡5分钟灭菌。准备培养皿A，加入4℃PBS液，培养皿B加入预温过的培养液。取胸主动脉并放入培养皿A中，去除血管外的脂肪、结缔组织、动脉分支，PBS冲洗血管。以血管钳将血管两端结扎，置60℃无菌水中停留2S后取出至B皿。将血管切成1 mm厚度的血管环，移至明胶包被过的培养皿，每皿20-25个血管环，血管轴垂直于培养皿底，置培养箱干培养2h后加入培养液3ml。静置培养72h后，去除血管环，部分换液继续培养。 1.3传代培养原代细胞培养10-14d后，细胞汇合成单层。PBS冲洗2次后加0.25% 胰蛋白酶室温消化约1 min。当镜下见细胞连接松解时加等体积含胎牛血清的DMEM液终止消化，吹打细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入2 mL新的培养液，吹打混匀，(2-3)×105个/皿的密度接种到培养皿中，继续培养，每3d换液一次。 1.4内皮细胞鉴定—SP法 VonWillebrand Factor/Ⅷ因子相关抗原位于内皮细胞胞浆是内皮细胞的可靠标记物[1]。方法如下:内皮细胞接种于盖玻片，约24-48h待细胞爬满玻片，弃培养液，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗5 min×3次；0.2%TritonX-100，室温下渗透20 min；PBS洗5 min×3次；3%H2O2孵育15 min；羊血清室温阻断15 min，弃血清勿洗，加入鼠Ⅷ因子相关抗原抗体，4℃过夜；PBS洗3 min×3次；滴加二抗（羊抗兔），室温15 min；PBS洗3 min×3次；加S-P复合物，室温15 min；PBS洗3 min×3次，培养孔中滴加DAB显色剂，约5～30 min后ddH2O快速中止反应；自来水冲洗、脱水、透明、封片。 2 实验结果 原代培养5～7 d后，可见细胞从组织块边缘爬出，逐渐长成梭形或多角形。10-14 d后细胞生长融合，呈单层铺路石镶嵌状排列生长。传代培养的细胞0.5 h开始贴壁，2 h后约90 %的细胞贴壁，3-4d细胞汇合成单层。用免疫细胞化学S-P法检查Ⅷ因子相关抗原，镜下内皮细胞胞质呈棕黄色，即呈阳性反应，证明其为内皮细胞，非内皮细胞及空白对照组无此着色。 3 讨论 血管内皮细胞的原代分离与培养是研究其分子生物学特性及相关疾病的重要前提，但其对生长环境营养要求高，易老化[2]，冻存后复苏难，故建立简单、有效、可重复的培养方法非常必要。大鼠来源丰富，价格低廉，取材方便，探索大鼠主动脉内皮细胞的培养方法具有重要的意义。 目前较为常见的培养方法有酶消化法、机械刮取法、组织块贴壁法、瞬间热处理植环法等[3-5]。本研究中发现:常用酶消化法有两种:1.在动脉腔内注入消化酶；2.将动脉内膜外翻，放入消化液中消化。大鼠主动脉直径细，不易将内膜翻出，且分支多，不易结扎封闭管腔，酶难以在血管内有效保留进行消化。此方法主要用于大血管内皮细胞的培养，操作复杂、技术要求较高，消化时间长短不易掌握。 机械刮取法:即在内膜外翻后借助剪刀或刀片刮取细胞。常与酶消化法结合。但大鼠动脉细，外翻过程中对内皮细胞损伤已较大，机械刮取后严重影响细胞活性，故培养效果不佳。 组织块贴壁法与平滑肌细胞培养方法相似[6]，将血管剪成1-2mm2小块，内膜向下贴壁于培养皿中，但易混杂平滑肌细胞降低细胞纯度；且将血管剖开剪碎的过程中易损伤细胞，较大的组织块在加培养液及移动培养皿过程中易漂浮，不易贴壁，而较小的组织块需更多的机械分割，对细胞的损伤作用大。 本研究最终选用的植环法具有相对简单、经济、细胞损伤少的优点。操作所需时间少，所需步骤少，可减少内皮细胞受到的损伤；不仅可利用内皮细胞迁出比非内皮细胞快的特点[7]纯化细胞，瞬间热处理法能显著减少成纤维细胞及血管平滑肌细胞混入生长的几率，提高细胞纯度。Diglio[8]等在动脉环培养血管形成实验中曾用70%乙醇固定血管外膜来纯化细胞。本实验中发现，由于大鼠主动脉分支多，乙醇易与血管内膜面相接触，会影响到内皮细胞活性。而瞬间热处理法使外膜细胞受抑制，血管内腔面没有直接暴露于热水中，且短时间内不致使热传导至血管内膜面，因此内皮细胞活性不受影响，而杂细胞的迁出率明显减低。 结论 本研究通过将大鼠主动脉外膜做瞬间热处理后再进行环块植入法获取血管内皮细胞，结果发现血管内皮细胞呈现接触性抑制的“鹅卵石”样特征，其标志物vWF 表达阳性，细胞纯度较高。此方法的优势在于:1.提高了细胞纯度。对动脉外膜做瞬间热处理后大大抑制了其他细胞如成纤维细胞等的混入。2.减低对内皮细胞的损伤:本方法无需酶的消化，无需机械刮取，大大减低了原代取材中对内皮细胞的损伤。3.降
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定 段超 陈鑫 邱志兵 许欢 【摘要】 目的 探讨大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养方法,了解生长特性,为血管增生性疾病的治疗研究提供试验材料。方法 采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用倒置相差显微镜观察其生长情况,用免疫组化染色做鉴定,台盼蓝染色进行活力检测。结果 85%的组织块接种存活,原代培养后2周左右即可传代,至少可以传8代以上,并且细胞形态、生长特点不发生明显的改变,6代的血管平滑肌细胞纯度达97%以上。台盼蓝染色约有94%以上的细胞为活细胞。镜下培养的血管平滑肌细胞呈典型的“谷峰状”生长,免疫组化染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论 正确地利用组织贴块法可以简单、经济、高效地培养出血管平滑肌细胞,为血管增生性疾病的治疗研究提供了理想的细胞模型。 【关键词】 大鼠;血管平滑肌细胞;原代培养;组织贴块法 P r i m a r y c u l t u r e a n di d e n t i f i c a t i o no f r a t t h o r a c i ca o r t av a s c u l a rs m o o t hmu s c l ec e l l s D U A NC h a o ,C H E N X i n ,Q I UZ h i -b i n g ,X UH u a n . D e p a r t m e n t o f C a r d i o t h o r a c i c S u r g e r y ,N a n j i n g F i r s t H o s p i t a l A f f i l i a t e dt oN a n j i n gM e d i c a l U -n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210006,C h i n a 【A b s t r a c t 】 O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h e p r i m a r y c u l t u r e m e t h o d o f r a t t h o r a c i c a o r t a v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l s (V S M C s ),t o a n a l y z ec e l l g r o w t h a n d b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n dt o p r o v i d e t e s t m a t e r i a l f o r t h e r e s e a r c ho f t h ep r o l i f e r a t i o n o f t h e v a s c u l a r d i s e a s e s .Me t h o d s T h e c u l t u r eo f r a t t h o r a c i c a o r t av a s c u l a r s m o o t h m u c l ec e l l s w a s d o n eb yt i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n .T h e c u l t u r e dc e l l s w e r e o b -s e r v e d a n d i d e n t i f i e d b y m o r p h o l o g y a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y w i t hp h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p ea n di m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g r e s p e c -t i v e l y .T h e c e l l v i a b i l i t y w a s d e t e r m i n e dw i t h T y p a nb l u e .R e s u l t s 85%i n o c u l a t e d t i s s u e p i e c e s s u r v i v e d .P r i m a r y c u l t u r e d c e l l s c o u l d b e s u b c u l t u r e da f t e r 2w e e k s a n d s u c c e s s f u l l y p a s s a g e df o r m o r e t h a n 8t i m e s ,w i t h o u t n o t i c e a b l e c h a n g e s i nm o r p h o l o g y a n dg r o w t h c h a r a c t e r -i s t i c s .T h e p u r i t y o f t h e s i x t hp a s s a g e V S M C s w a sm o r et h a n 97%.T h ec e l l v i a b i l i t yw a s m o r et h a n 94%b yt r y p a nb l u e .T h ec u l t u r e d V S M C s s h o w e dt h e t y p i c a l “p e a ka n dv a l l e y ”m o r p h o l o g i c a l a p p e a r a n c e u n d e r m i c r o s c o p e .I m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n gw i t ha n t i b o d y a -g a i n s t S M -α-a c t i n d e m o n s t r a t e d t h e s e c e l l s w e r e p o s i t i v e .C o n c l u s i o n T h e m e t h o d o f t i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n c u l t u r e o f V S M C s i s s i m p l e ,e c o n o m i c a n de f f i c i e n t .I t p r o v i d e s a ni d e a l c e l l m o d e l f o r t h e r e s e a r c ho f t h e p r o l i f e r a t i o no f v a s c u l a r d i s e a s e s . 【K e yw o r d s 】 r a t ;v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l ;p r i m a r yc u l t u r e ;t i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n 作者单位:210006 江苏南京,南京医科大学附属南京第一医院心胸 外科 血管平滑肌细胞(v a s c u l a r s m o o t hm u s c l ec e l l s ,V S M C s )的 增殖和迁移是血管增殖性疾病发病的核心环节,其病理学分子机制是近年来血管增殖性疾病的研究热点,也是目前防治的难点[1]。而要获得试验研究所需的血管平滑肌细胞就必须掌握一种简单、经济、高效的血管平滑肌细胞培养方法。本文作者运用组织贴块法进行大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定,并应用多种方法对传代细胞进行纯化,成功地获得了大量纯度较高、生长状态良好的血管平滑肌细胞。 材料与方法 一、材料 150～250g 雄性S D 大鼠,购自南京医科大学试验动物中心。P B S 缓冲液(凯基生物),胎牛血清(海克隆生物),D M E M 培养液/高糖(赛默飞世尔生物),青链霉素混合液(凯基生物),胰蛋白酶-E D T A 消化液(凯基生物),兔抗鼠平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体(北京博奥森生物),S P 免疫组化试剂盒(福州迈新生物),D A B 显色试剂盒(凯基生物)。 二、细胞培养大鼠2～3只,颈椎脱臼致死,75%乙醇浸泡消毒3m i n ,固定后依次剪开胸腹部皮肤,肌肉及胸骨,暴露胸腔,紧靠脊柱右前方,从主动脉弓至膈面处剪下胸主动脉,并放入盛有 P B S 缓冲液的细胞培养皿中,迅速转入细胞培养室的超净工 作台。眼科直镊和弯镊去除血凝块和血管外膜层,然后转移入另一盛有P B S 缓冲液的细胞培养皿中,剪去血管外的小分支。再转移入含20%胎牛血清和D M E M 混合液的细胞培养皿中,眼科直剪剪开血管腔,内膜面向上,以眼科弯镊或手术刀片轻轻擦拭内膜层,以去除内皮细胞。最后转移入另一含20%胎牛血清和D M E M 混合液的细胞培养皿中,用眼科剪将血管段剪成1m m×1m m 大小的组织块,用吸管把组织块转入25m l 细胞培养瓶中,并均匀贴壁于培养瓶底面,组织块的间距为0.5c m 。盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上,并向瓶内注入适量20%胎牛血清和D M E M 混合液以及相应比例的青链霉素混合液,置于37℃,5%C O 2培养箱内放置3～5h ,使得组织块干涸,并与瓶底贴附,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置3天,切勿移动,4～5天会有细胞从组织块周围游离出(见图1),即可换液。 7天左右大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞晕相接触,2周左右组织块周围长出的细胞相互汇合(见图2,3),逐渐铺满整个瓶底时,就可以进行首次传代:弃去瓶中原有培养液,用P B S 缓冲液清洗细胞表面2次,弃去P B S 缓冲液,加入胰蛋白酶-E D T A 消化液4～6滴,使消化液铺满瓶底,入37℃,5%C O 2培养箱中消化2～3m i n 左右,倒置相差显微镜下见细胞收缩变圆、细胞间隙增大(见图4,5,6)时,立即弃去胰酶消化液,用P B S 缓冲液清洗1次,弃去P B S 缓冲液,加入 468临床肺科杂志 2010年4月 第15卷第4期
离体兔主动脉环实验 07临床曲宁 一、目的 学习离体器官组织灌流的方法，掌握兔主动脉环制备技术，观察维拉帕米对电压门控通道的阻断作用及酚妥拉明对配体门控钙通道的阻断作用。 二、原理 高浓度的氯化钾液（60～100mmo1）可使血管平滑肌细胞去极化，促使电压门控钙通道开放，引起胞外Ca2+内流，导致血管平滑肌收缩。能阻断高钾液此作用的药物则为电压门控钙通道阻断药。 α受体激动药（如苯肾上腺素）诱导血管收缩是由α1肾上腺素受体的激活造成的，主要通过激活磷脂酶C，产生甘油二脂和三磷酸肌醇（IP3），主要由IP3诱导肌浆网内的Ca2+释放而致血管环（条）收缩，α受体阻断药可阻断此作用。当NE与血管平滑肌细胞α受体结合，可导致血管平滑肌收缩；与?受体结合则导致血管平滑肌舒张。NE与α受体结合能力较与?受体结合的能力强，故NE具有很强的血管收缩作用 逐步递增α受体激动药的浓度（累积浓度），引起血管环出现剂量依赖性收缩（可根据剂量调整在一定范围提高疗效），记录药物量效曲线。然后给予α受体阻断药，再重复上述实验，可使该量效曲线平衡右移，但最大效应不变，计算出α受体阻断药的拮抗参数（pA2）以确定该阻断药的阻断效价酚妥拉明(Phentolamine)为短效α-受体阻滞剂，与去甲肾上腺素能神经递质和拟肾上腺素药竞争α-受体而发挥阻滞作用。对α1和α2受体都有阻滞作用，能直接松弛动静脉平滑肌 维拉帕米为Ca离子通道阻滞剂，它在发挥作用前必须通过钙离子通道进入细胞。所以它的作用是与钙离子通道活性直接相关的。维拉帕米作用于开放状态的通道，具有频率依赖性和使用依赖性。 三、材料 1．实验对象健康的兔子，雄性，体重250～280克； 2．实验器材麦氏浴槽，超级恒温水浴，温度计，5g张力换能器，微机生物信号采集处理仪，手术剪刀，眼科剪，眼科镊，培养皿，烧杯，100μl、1m1移液器，棉线； 3．实验药品3mo1/L氯化钾，10-5mo1/L维拉帕米，10-3mo1/L肾上腺素，10g/L酚妥拉明，1mmol/L乙酰胆碱，Krebs液，95%O2+5%CO2混合气体. 四、实验步骤 1、实验系统连接和仪器参数设置 （1）实验装置连接按下图连接装置。将张力换能器固定于微距调节器上，换能器输出线接微机生物信号处理系统输入通道。麦氏浴槽中充以Krebs台氏液至固定水平面，调节超级恒温器的温度至37℃，保证麦氏浴槽内37±0.5℃恒温，
实验大鼠常见脏器形态学取材方法和注意事项 [取材内容] 大鼠肺组织、大鼠肝脏组织、大鼠胰腺组织、大鼠胃部组织、大鼠空场回肠组织、大鼠肾组织、门静脉血、淋巴组织、大鼠心脏。 [试剂及药品] 戊巴比妥钠或10%水合氯醛、75%酒精、生理盐水、多聚甲醛或福尔马林液、3戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4戊二醛、肝素钠、器械液器械清洗消毒液 [器材] 备皮刀、解剖台、弯盘、组织剪、眼科剪、手术刀柄、刀片、小号弯式血管钳、蚊式血管钳、眼科镊、无损伤血管夹、聚乙烯管、三通管、丝线、培养皿、天平、一次性离2ml、1.5ml 、冻存管、肝素锂真空采血管、微量移液器、高速离心机、注射器10ml、5ml、 2ml、无菌手套、冰箱、冰盒、液氮罐 [取材动物] 大鼠 [取材步骤] 1. 取材前夜禁食，自由饮水。 2. 小鼠称重，按照50mg/kg的比例用5ml的注射器配合针头抽取戊巴比妥钠备用。 3. 正左手的小指和无名指抓住大鼠的尾巴，另外三个手指抓住大鼠的颈部，使大鼠头部向向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。右手持注射器，从腹部近腿根处刺入后再腹部皮下穿行深入，动作轻柔，缓慢注射。注射完药物后，缓缓拔出针头，手指按住针口对小鼠腹部轻柔按摩，促进麻醉药物的吸收，掐小鼠尾部检测小鼠麻醉程度。 4.将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠整个胸部和腹部，修剪去腹部毛发，75%酒精消毒。 5.沿腹侧正中线自阴茎上源由下而上剪开腹部皮肤直至剑突，向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织，暴露腹壁浅肌层。沿白线钝性分离腹壁肌肉，剪开腹膜，暴露腹腔，将肝脏向上翻起，显露肝门。 6.门静脉血采集：将剪成斜口的聚乙烯管尖端背向肝门方向插入门静脉，抽取门静脉血2ml，无创血管夹夹闭门静脉止血。将抽取门静脉血加入一次性离心管低温静置过夜，4℃离心，3000-3500/min，10分钟，吸出上清液，分装，-80摄氏度保存备用。 7.肝脏取材：结扎剪断肝门管道系统，钝锐结合完整取出大鼠肝脏，放置于无菌培养皿，生理盐水冲洗，称重并记录。①切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆 【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α- SM - actin)。结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。 【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞 [Abstract]ObjectiveTo establish the culture model of rat aorta vascular smooth muscle cells (VSMCs) to provide important experimental method for the pathogenesis research of atherosclerosis in vitro. MethodsEmploying the explants technique, the primary and sub-culture were completed by
modified tissue-piece inoculation and trypsin digestion respectively. The cultured cells were identified by phase contrast microscopy and immunohistochemical and immunofluorescent staining.ResultsAfter 3 days of inoculation of tissue-pieces, VSMCs migrated from the vessel pieces. The cultured cells showed the typical “hills and valleys”morphological features under the microscope. Immunohistochemical and immunofluorescent staining with monoclonal antibody against mouse α-SM- actin demonstrated these cells were positive. ConculsionIt is a simple and reliable method for obtaining highly purified and satisfactory VSMCs in short term, providing a favorable experimental platform for research into the mechanism of vascular proliferous diseases such as atherosclerosis and restenosis. [Key words]rat;thoracic aorta;explants method;vascular smooth muscle cells 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neointima formation)及动脉粥样硬化
海州香薷总黄酮对离体大鼠主动脉环张力的作用及机制 徐佳1陈军津1 周育成1 王会平2 （1浙江大学医学院2004级临床医学专业3系3A班，浙江杭州 310058； 2浙江大学医学院生理教研室，浙江杭州310058） [摘要] 目的：研究海州香薷总黄酮（total flavones from Elsholtzia splendens ，TFES）对离体大 鼠胸主动脉环收缩张力的作用及其机制。方法：采用大鼠离体胸主动脉灌流模型，累积加药， 检测海州香薷总黄酮对去氧肾上腺素（PE）和KCL预收缩的胸主动脉环收缩张力的影响。结果：海州香薷总黄酮对内皮完整的离体主动脉环基础张力的作用不明显（p>0.05）；内皮完整和去 内皮时，海洲香薷总黄酮（5、10、25、50、100、200ug/mL）对PE（10-4mol/L）和KCL（3mol/L）预收缩的血管环均产生舒张作用（p﹤0.05）；而用NO 合酶（NOS）抑制剂L-NAME（10-4mol/L），鸟苷酸环化酶（GC）抑制剂ODQ（10μmol/L）以及环氧酶（COX）抑制剂Indo（10-5mol/L）处理血管后，对低浓度及高浓度下海州香薷总黄酮舒张血管效应的阻断作用均不明显(p>0.05)；使用电压依赖性的K+通道阻断剂4-AP(1mmol/L)，Ca2+敏感性的K+通道阻断剂TEA(1mmol/L) 以及ATP 敏感性的K+通道阻断剂格列苯脲（Glib）(3μmol/L)处理后，对海州香薷总黄酮舒血 管效应的阻断作用亦均不明显；内皮完整和去内皮时，海州香薷总黄酮对PE（10-4mol/L）预收缩血管环的舒张作用均具有时间依赖性。结论：在低浓度及高浓度下，海州香薷总黄酮对大鼠 离体胸主动脉环产生的舒张效应并非通过NO-鸟苷酸环化酶途径，环氧合酶途径以及直接作用 于平滑肌细胞膜上电压依赖性的K+通道、Ca2+敏感性的K+通道、ATP 敏感性的K+通道的途径产生的，其中浓度下的舒张作用可能与鸟苷酸环化酶有关，其机制待进一步研究明确。 [关键词]海州香薷总黄酮;胸主动脉环;血管舒张;内皮 Effects and Mechanism of Total Flavonoids of Elsholtzia Splendens on Rat Thoracic aortic XU jia1,CHEN jun-jin1,ZHOU yu-cheng1，WANG hui-ping2 (1Clinical Medicine,2Department of Physioligy,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310058,China) [Abstract] Objective：To investigate the effect of total flavones from Elsholtzia splendens（TFES）on rat thoracic aorta rings and the underlying mechanisms. Methods: The study was performed with the model of isolate rat thoracic aorta rings in organ bath, we investigate the effects of accumulated total flavones from Elsholtzia splendens on the constriction of high KCL and Phenylephrine(PE) preconstricted rat thoracicaorta with endothelium. Results: There is no effect of total flavones from Elsholtzia splendens (TFES) on the basal tonus in rat isolated aortic rings with endothelium(p>0.05).Total flavones from Elsholtzia splendens（5、10、25、50、100、200ug/mL）concentration dependently caused relaxation in vessels with or without endothelium precontracted both with 10-4mol/L phenylephrine (PE) and 60mmol/L KCL(p<0.05).However, the relaxation evoked by TFES of High and low concentration wasn’t inhibited by 10-4mol/L NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)，10μmol/L guanyly cyclase inhibitor 1H-[1,2,4] oxadiazolo [4,3-alpha] quinoxalin-1-one (ODQ) and 10-5mol/L Indomethacin（Indo）(p>0.05). Also, the relaxation to the total flavones from Elsholtzia splendens was not inhibited by 1mmol/L tetraethylammonium (TEA) 、1mmol/L 4-aminopyridine（4-AP）and 3μmol/L Glibenclamide（Glib）. TFES time dependently caused relaxation in vessels with or without endothelium precontracted with 10-4mol/L phenylephrine (PE).Conclusion:The results indicate that TFES can relax the rat thoracic aorta rings with or without endothelium . At the same time, the relaxation by TFES of High and low concentration isn’t mediated by the NO-guanylyl cyclase pathway ,COX pathway and three kinds of K+-channels on the membrane of vascular smooth muscle,yet,the relaxation by TFES of mediate concentration may be mediated by GC,so the mechanisms need more research. [Key words] TFES; thoracic aorta rings；vascular relaxation；endothelium