大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆
【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α- SM - actin)。结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。
【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞
[Abstract]ObjectiveTo establish the culture model of rat aorta vascular smooth muscle cells (VSMCs) to provide important experimental method for the pathogenesis research of atherosclerosis in vitro. MethodsEmploying the explants technique, the primary and sub-culture were completed by
modified tissue-piece inoculation and trypsin digestion respectively. The cultured cells were identified by phase contrast microscopy and immunohistochemical and immunofluorescent staining.ResultsAfter 3 days of inoculation of tissue-pieces, VSMCs migrated from the vessel pieces. The cultured cells showed the typical “hills and valleys”morphological features under the microscope. Immunohistochemical and immunofluorescent staining with monoclonal antibody against mouse α-SM- actin demonstrated these cells were positive. ConculsionIt is a simple and reliable method for obtaining highly purified and satisfactory VSMCs in short term, providing a favorable experimental platform for research into the mechanism of vascular proliferous diseases such as atherosclerosis and restenosis.
[Key words]rat;thoracic aorta;explants method;vascular smooth muscle cells
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neointima formation)及动脉粥样硬化
(atherosclerosis)密切相关[1~4]。因此，研究防治VSMCs增殖与迁移成为血管生物学领域研究的热点。本研究在参考国内外文献的基础上[5~8]，结合自己的经验，采用改良的植块贴壁法成功建立了大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型。
1材料与方法
1.1动物与试剂SPF级雄性SD大鼠1只，体重(150±10)g，中山大学实验动物中心提供，合格证号(粤监证字2006A064)。DMEM (Gibco) 、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所) 、胰蛋白酶(trypsin , Sigma) 、T25 塑料培养瓶(Costar) 、特异性鼠平滑肌肌动蛋白抗体、SABC试剂盒、DAB 显色试剂盒 (武汉博士德公司) 、FITC标记的羊抗鼠荧光二抗(Santa Cruz Biochem)
1.2大鼠VSMCs的分离与原代培养SPF级雄性SD大鼠1只, 重约150g，颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒2min，同时用酒精浇灌大鼠的胸腹部，移入超净台内。无菌条件下迅速取出全段胸主动脉, 立即移入含冷PBS的无菌平皿中。使用 1ml的一次性注射器拔去针尖后吸取PBS清洗去除血污，眼科镊去外膜结缔组织，此时将洁净血管转移到另一含冷PBS的无菌平皿中，用眼科剪小心剪去血管绒毛后用两弯镊反向牵拉去除外膜，再用眼科弯镊穿过血管沿两端来回牵拉一次，纵向剖开血管，使内膜面朝上,并用弯镊摊平血管，再将血管转移到含
小鼠脑动脉血管平滑肌细胞 小鼠脑动脉血管平滑肌细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠脑动脉血管平滑肌细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠脑动脉血管平滑肌细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠脑动脉血管平滑肌细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠脑动脉血管平滑肌细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
血管平滑肌细胞表型转换的机制 基础医学院07级临床一班陈依然90701114 摘要 由血管平滑肌异常增殖导致的血管重构是PCI术后再狭窄的重要原因之一。血管平滑肌细胞增殖能力与其表型转换密切相关。本文讨论了血管平滑肌细胞表型转换的特点、机制和相关信号传导途径。 关键词 血管平滑肌细胞表型转换信号传导途径 正文 自1977年冠心病介入治疗技术问世以来，其术后再狭窄（RS）一直是一个影响其远期疗效的重要问题。虽然RS的具体机制尚不明确，但目前已经公认血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cell, VSMC）异常增殖、迁移及大量合成细胞外基质是其主要原因。而VSMC增殖的首要条件就是表型转换。 VSMC的表型可分为分化程度较高的收缩型（分化型）和分化程度较低的分泌型（未分化型或去分化型），我将就其特点和两者之间相互转换的相关信号传导途径进行探讨。 1. 表型转换的特点 VSMC来自胚胎发育时期的中胚层，逐渐分化为不同的细胞群并获得具有成年特征的分化表型，即收缩型。但与骨骼肌、心肌细胞不同的是，VSMC在分化成熟后仍可在某些因素的刺激下去分化成为分化程度较低的分泌型。有报告称，这两种表型可能代表了共存于血管壁内一系列不同表现型的两个极端类型，且表
达不同的基因和蛋白。正常成人动脉血管的VSMC以收缩型为主，其主要功能是维持血管的弹性和收缩血管。收缩型VSMC增殖、迁移能力差或无，胞体呈梭形或带状，含大量肌丝和结构蛋白含，合成细胞器如粗面内质网、高尔基复合体含量较少，合成基质的能力差或无，体积较小。分泌型VSMC主要存在于胚胎中期血管和病理血管中，其主要功能是增殖、迁移入内膜以及合成细胞外基质蛋白。形态上类似成纤维细胞，肌丝和结构蛋白含量较少，合成细胞器增多，合成和分泌基质蛋白的能力较强，体积较收缩型大。 根据VSMC两种表型表达蛋白的不同可以找到表型转换时相应的标志物。其中α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）在收缩型细胞中优势表达而在分泌型细胞中表达甚微，它是VSMC分化的早期特异性标志物，也是应用最多的收缩型标志蛋白。而骨桥蛋白（osteopontin, OPN）则作为应用较多的合成型标志物。有实验显示OPN mRNA在正常的动脉中并不存在，而在动脉粥样硬化中的表达程度则随粥样硬化程度的增加而增加。 下表列VSMC表型转换的主要标志物。
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良 [ 08-10-30 13:48:00 ] 作者：吴建芳编辑：studa20 【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。方法改良酶消化法。结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98% 以上，足以满足各种细胞试验需求。结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士 【关键词】小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养 Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity. Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult 在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。 1 材料与试剂 1．1 组织来源：C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。 1．2 试剂：鼠抗SMC-α -actin ,Cy2 conjugated affinity purified anti-mouse IgG［H/L］，戊巴比妥钠注射液。 1．3 培养基：在DMEM 培养基中添加１５％胎牛血清、１％青霉素、链霉素、１％谷氨酰胺，过滤除菌备用（不要超过四4周）。 1．4 酶消化液：Collagenase TypeⅡ 7 mg 溶于5 ml DMEM 培养基中(无血清)，过滤除菌即用。
1100 Human Brain Vascular Smooth Muscle Cells 人脑血管平滑肌细胞 血管平滑肌细胞是许多动脉疾病的细胞水平的根源。血管平滑肌细胞的加速生长潜能是血管疾病进展的关键因素。最新研究表明血管平滑肌细胞表达的ICAM-1 和VCAM-1能促进血管壁的炎症反应，并且与血管疾病的发展及稳定性有关.人血管平滑肌细胞的体外培养是血管研究中的重要模型，并将对血管疾病的药理学和治疗研究提供大量信息. 细胞培养说明 注意：冷冻保存的细胞非常脆弱。将小瓶置于37°C水浴，然后尽快移入培养物中，尽量减少操作。 经过以下步骤后开始培养细胞 1.准备多聚赖氨酸包被的培养瓶(2μg/cm2，推荐用T-75的培养瓶)。向T-75瓶内加入10ml 无菌水，然后加入15μl多聚赖氨酸原液(10mg/ml,ScienCell cat. no. 0413).将培养瓶放入培养箱中过夜(至少在37°C中过一小时) 2.准备完全培养基：用70%的酒精为培养基和添加物的外表面消毒，然后放到无菌的地方。在无菌环境下打开每一个添加物小管并用吸管加入到基本培养基中。用培养基冲洗每一个小管以保证添加物全部加入基本培养基中。 3.用无菌水冲洗多聚赖氨酸包被的培养瓶两次并向瓶内加入20 ml完全培养基。将培养瓶放入超净台中，然后融化细胞。 4. .将小瓶放入37°C水浴中，轻轻地握住并旋转小瓶直到完全融化。将小瓶立刻移出水浴，擦干，用70%的酒精冲洗小瓶，然后放到无菌环境中。小心地打开盖子，注意手指不要碰到里面。用1ml eppendorf吸管轻轻重悬管内容物。 5.将管中内含物放入均匀的，多聚赖氨酸包被的培养瓶中。推荐接种密度为5,000 cells/cm2。注意：细胞融化后不推荐稀释和离心，因为这些操作比培养基中DMSO残留物对细胞的伤害大。血管平滑肌细胞接种在多聚赖氨酸包被的培养瓶中能促进细胞帖壁。 6.盖好盖子，轻轻地摇晃培养瓶以使细胞分布均匀，如需气体交换则打开瓶盖。 7.将培养容器放入培养箱中。 8.为了得到良好的结果，在培养开始后至少16个小时内不要动培养物。第天天更换培养基以去除残留的DMSO和未贴壁的细胞，然后每隔一天进行如上操作。培养良好的细胞将呈现纺锤体形，通常细胞呈均匀的丛状或板状而不是单个分散的细胞，并且细胞数量在培养2-3天后会加倍。 维持培养
血管平滑肌细胞表型转换的机制 基础医学院 07级临床一班陈依然 90701114 摘要 由血管平滑肌异常增殖导致的血管重构是PCI术后再狭窄的重要原因之一。血管平滑肌细胞增殖能力与其表型转换密切相关。本文讨论了血管平滑肌细胞表型转换的特点、机制和相关信号传导途径。 关键词 血管平滑肌细胞表型转换信号传导途径 正文 自1977年冠心病介入治疗技术问世以来，其术后再狭窄（RS）一直是一个影响其远期疗效的重要问题。虽然RS的具体机制尚不明确，但目前已经公认血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cell, VSMC）异常增殖、迁移及大量合成细胞外基质是其主要原因。而VSMC增殖的首要条件就是表型转换。 VSMC的表型可分为分化程度较高的收缩型（分化型）和分化程度较低的分泌型（未分化型或去分化型），我将就其特点和两者之间相互转换的相关信号传导途径进行探讨。 1. 表型转换的特点 VSMC来自胚胎发育时期的中胚层，逐渐分化为不同的细胞群并获得具有成年特征的分化表型，即收缩型。但与骨骼肌、心肌细胞不同的是，VSMC在分化成熟后仍可在某些因素的刺激下去分化成为分化程度较低的分泌型。有报告称，这两种表型可能代表了共存于血管壁内一系列不同表现型的两个极端类型，且表达不同的基因和蛋白。正常成人动脉血管的VSMC以收缩型为主，其主要功能是维持血管的弹性和收缩血管。收缩型VSMC增殖、迁移能力差或无，胞体呈梭形或带状，含大量肌丝和结构蛋白含，合成细胞器如粗面内质网、高尔基复合体含量较少，合成基质的能力差或无，体积较小。分泌型VSMC主要存在于胚胎中期血管和病理血管中，其主要功能是增殖、迁移入内膜以及合成细胞外基质蛋白。形态上类似成纤维细胞，肌丝和结构蛋白含量较少，合成细胞器增多，合成和分泌基质蛋白的能力较强，体积较收缩型大。
小鼠肺血管平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠肺血管平滑肌细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠肺血管平滑肌细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠肺血管平滑肌细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠肺血管平滑肌细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
高尿酸血症对内皮细胞损伤及血管平滑肌细胞增殖的影响（体外培养部分） 背景：关于高尿酸血症致肾脏损害的机制，既往的研究认为：当体内pH＜5.5或脱水时，可引起尿酸盐结晶沉积在肾小管间质部位，通过经典途径或替代途径激活补体、血小板、炎性细胞和巨噬细胞，引起细胞因子、转化生长因子（TGF-β）和活性氧的表达增多，刺激纤维母细胞向肌纤维细胞转化，激活胶原交联，最终导致纤维化或肾功能衰竭。新近国外的研究发现高尿酸血症导致肾脏损伤的原因有：①内皮细胞的损伤作用：Sanchez-Lozada等发现，尿酸可通过抑制NO（一氧化氮）产生和刺激内皮细胞增殖而导致内皮细胞损伤。中度的高尿酸血症就可以抑制NO的产生。②高尿酸血症诱导产生严重的肾小球血管病变，并且这种病变并非继发于高血压。高尿酸血症能直接刺激血小板衍生因子（PDGF）的表达和血管平滑肌的增殖，诱导产生严重的肾小球血管病变，而且这种病变并非继发于高血压，即在血压控制良好的情况下，高尿酸血症大鼠出现肾小球入球小动脉增厚，肾皮质血管收缩，肾小球内高压和肾小球肥大，最终导致肾小球硬化。因可溶性尿酸刺激单核细胞产生IL-2β、IL-6、IL-18及TNFa，因此推测尿酸对血管平滑肌的损伤作用可能是通过炎症样反应完成的。尿酸诱导大鼠平滑肌细胞炎症途径是经由有机离子转运系统进入血管平滑肌细胞，增加单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和环氧化酶2（COX2）的表达而实现的。MCP-1是一种非常重要的血管疾病和粥样硬化的化学趋化因子，而COX2是可导致炎症反应的重要蛋白之一。上述两种物质加重肾小球纤维化，肾小球肥厚，导致高血压、蛋白尿和肾功能恶化。目的：通过细胞体外培养，从
脐动脉血管平滑肌细胞的分离与培养 材料 1) 培养基和维持平滑肌细胞生长的溶液 a) 培养基: DMEM /F12 b) 基本培养基的添加剂(final concentrations): 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin 10% (v/v) FBS. 通常消毒冷冻储备。完全培养基4°C可达1 个月，常规细胞培养使用前预温到37°C。分离过程用无FBS 的培养基。 c) Hanks’平衡盐溶液(HBSS, Sigma)：用于组织标本的收集培养基。下面的添加剂在使用之前加入储备液 中(final concentrations): 100 μg/mL Gentamicin 0.025 M HEPES 20 mM bicarbonate 0.001% phenol red HBSS 可分装储存于4°C最多2周。 d) Bicarbonate (4.4%, 0.52 M)-Phenol red (0.03%) solution: 44 g NaHCO3 +30 mg phenol red in 1000 mL组织培养级的去离子水, 高压灭菌消毒10 min at 115°C. 15 mL分装4°C储存可达6 mo，2 aliquots used in 400 mL of medium. 2)Penicillin and streptomycin stock solution (80X concentrate): 480 mg penicillin+1.5g streptomycin sulfate in 200 mL组织培养级的去离子水 0.5 μm滤膜预过滤，0.22 μm滤膜过滤消毒。 5 mL分装，–20°C储存，1 aliquot used in 400 mL of medium. 3)Gentamicin solution (80X concentrate): 750 mg gentamicin sulfate in 100 mL组织培养级的去离子水 0.22 μm滤膜过滤消毒。 5 mL分装，–20°C储存，1 aliquot used in 400 mL of HBSS. 4)HEPES solution (1 M): 47.6 g of HEPES in 200 mL组织培养级的去离子水 0.22 μm滤膜过滤消毒。 5 mL分装，–20°C储存，2 aliquots used in 400 mL of HBSS. 5)胰蛋白酶溶液(2.5 %): Trypsin from porcine pancreas (Sigma) is dissolved (2.5 g/100 ml) in PBS-A 0.22 μm滤膜过滤消毒。 10 mL分装，–20°C储存 6)乙二胺四乙酸(EDTA) solution (1%): EDTA disodium salt is dissolved (500mg/ 50 mL) in 组织培养级的去离子水
表型血管平滑肌细胞平滑肌22αα-平滑肌肌动蛋白论文 【提示】本文仅提供摘要、关键词、篇名、目录等题录内容。为中国学术资源库知识代理，不涉版权。作者如有疑义，请联系版权单位或学校。 【摘要】目的：既往研究发现平滑肌22α(smooth muscle22alpha,SM22a)及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,a-SMA)特异性的表达于血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell. VSMC)胞质中,是VSMC发生细胞表型转化的重要标志,在维持细胞正常形态及收缩运动中具有重要的作用。本次研究的目的是检测下肢静脉曲张组织中SM22a及α-SMA的表达情况,并探讨其在下肢静脉曲张发生发展中的作用。方法：(1)应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction)检测SM22a mRNA在曲张静脉组织及正常静脉组织标本中的表达。(2)应用免疫组织化学技术检测SM22a和α-SMA蛋白在曲张静脉组织及正常静脉组织标本中的表达。(3)应用电镜观察免疫组化片子中曲张静脉组织及正常静脉组织在组织形态结构上的改变。结果：(1) RT-PCR结果显示：密度扫描半定量示SM22a mRNA在静脉曲张组织和正常静脉组织中分别为0.2614±0.1168和0.5114±0.1554,差异有统计学意义 (t=5.020P<0.01)。(2)免疫组组织化学法化结果显示：SM22α和a-SM A均主要表达于血管平滑肌细胞质中。图像分析软件测阳性蛋白染色的累计吸光度(integrated opticaldensity. IOD)值示SM22α阳性蛋白IOD值在静脉曲张组织和正常静脉组织中分别为10054.79±3584.07和16226.05±3378.16,具有显著统计学差异 (t=4.991P<0.01),与RT-PCR结果基本一致。α-SMA阳性蛋白IOD值
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆 【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α- SM - actin)。结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。 【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞 [Abstract]ObjectiveTo establish the culture model of rat aorta vascular smooth muscle cells (VSMCs) to provide important experimental method for the pathogenesis research of atherosclerosis in vitro. MethodsEmploying the explants technique, the primary and sub-culture were completed by
modified tissue-piece inoculation and trypsin digestion respectively. The cultured cells were identified by phase contrast microscopy and immunohistochemical and immunofluorescent staining.ResultsAfter 3 days of inoculation of tissue-pieces, VSMCs migrated from the vessel pieces. The cultured cells showed the typical “hills and valleys”morphological features under the microscope. Immunohistochemical and immunofluorescent staining with monoclonal antibody against mouse α-SM- actin demonstrated these cells were positive. ConculsionIt is a simple and reliable method for obtaining highly purified and satisfactory VSMCs in short term, providing a favorable experimental platform for research into the mechanism of vascular proliferous diseases such as atherosclerosis and restenosis. [Key words]rat;thoracic aorta;explants method;vascular smooth muscle cells 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neointima formation)及动脉粥样硬化
兔血管平滑肌细胞原代培养 我是某医学院的硕士研究生，课题涉及到兔血管平滑肌细胞的原代培养，实验开始非常不顺利，进行了几次实验均一无所获。后来我在丁香园上发帖提问 （https://www.doczj.com/doc/f26863073.html,/bbs/topic/16215850?tpg=1&ppg=1&age=0#0），得到了丁香园网友的热情帮助，在网友的帮助下，经过不断尝试改进，最后我终于得到了想要的血管平滑肌细胞，完成了实验并顺利毕业。鉴于网上还有很多网友在提有关血管平滑肌细胞原代培养的问题，我现在将自己的毕业论文中细胞培养的部分共享，由于论文还没发表，部分图片不能公开，请见谅！欢迎转载。 ①DMEM培养基的配制： 在新购进的500ml DMEM/F12培养基内加入5ml双抗及适当比例的FBS(原代20%，3代后5%)，配制成完全培养基，4℃保存备用。 ②兔SVMCs的原代培养： 体重2kg～3kg的雄性日本大耳白兔，耳缘静脉注射空气栓塞处死后，置于操作台。从腹部切开，分离腹部血管，暴露腹主动脉，无菌条件下切下约5cm长的动脉，装入含双抗的PBS中备用。在超净台内将取材的血管在DMEM中漂洗数次，小心将外膜剥去，用双抗浸泡数分钟后，直接加入胰酶，在胰酶双抗混合液中用眼科剪将组织块剪碎，将双抗和胰酶混合后用1ml移液枪吸去，加入3ml培养基,用吸管吹打后将组织块和培养液吸入25cm2细胞培养瓶中，直接用移液器将液体大部分吸出，盖紧瓶口后瓶口向上竖立放入培养箱，约1.5h后加入DMEM/F12培养基(含20%FBS, 1%双抗)，每个培养瓶约2.0ml，缓慢将瓶身翻转，使培养基覆盖组织块，将瓶口拧松，放入CO2养箱，静置3d～4d观察。
原代平滑肌细胞培养Protocol 实验准备： 器材：注射器（10mL），玻璃吸管，胶头（用于细脚吸管，吹匀组织块用），枪头（蓝色、黄色），移液器（1000μL，100μL），电动移液器，玻璃培养皿（2-3个），小烧杯（10 mL或5 mL），青霉素瓶（配鼠尾胶原），剪刀（大，小，弯）多把，镊子（大，小，弯）多把，纱布，六孔板（真空包装），托盘（放老鼠），酒精棉球，乳胶手套 试剂：平滑肌细胞专用培养基，生理盐水，D-hank’s 液，鼠尾胶原，戊巴比妥钠（麻醉用），75%酒精 步骤： 1. 高压灭菌实验所需器材，超净台紫外照射30mins，吹风； 2. 配制鼠尾胶原应用液，一般1:15-1:19稀释，六孔板中每孔加入1mL稀释液待用（可省去）； 3. 大鼠（200g左右，一百五六十克较好）腹腔注射一定体积戊巴比妥钠（0.5mL/100g）麻醉，麻醉好后将大鼠全身（尤其是胸腹部）用酒精棉球擦拭干净，放入托盘置于超净台中紫外照射15mins左右，开始试验； 4. 用已消毒的剪刀将大鼠腹部表皮剪开，充分暴露出整个胸部，再换用干净的剪刀打开胸腔。将肝脏及肺脏等组织拨开（小心操作以避免伤到血管）。用小弯镊及小直镊分离胸主动脉外壁贴附的结缔组织及外膜等。分离干净后，用眼科剪小心剪断血管，去除血管中的血，置于干净玻璃培养皿中； 5. 用生理盐水多次冲洗分离出来的血管。冲洗干净后，将血管剪开，小心刮除血管内膜，去掉内皮细胞； 6. 将处理好的血管放入平滑肌细胞专用培养基（约200μL）中，用眼科剪将组织尽量剪碎成1mm3大小的小块，用细脚吸管吹匀后，均匀种入加了鼠尾胶原的六孔板中； 7. 用黄枪头小心吸弃多余的液体（避免将组织块吸起来），然后将六孔板盖好颠倒放在培养箱中约2h（待组织块粘牢培养板底）后，再加入培养基； 8. 过3-4d后拿出细胞在显微镜下观察，看其是否已长出。
[作者简介] 程孝中,男,安徽大学生命科学学院在读硕士研究生,主要从事细胞生物学研究 [作者单位] 1.安徽大学生命科学学院,合肥 230039;2.军事医学科学院生物工程研究所,北京 100850 [通讯作者] 钟 辉,Te:l 010-********,E-m ai:l t ow all @yahoo . co m;黄 蓓,E-m ai:l b ei huang @163.co m #安徽大学生命科学学院和军事医学科学院生物工程研究所共同为第一单位 人血管平滑肌细胞的原代培养及其钙化模型的建立 程孝中 1,2# ,宋 婷2,黄 蓓1,钟 辉 2 [摘要] 目的 利用B -甘油磷酸盐处理人血管平滑肌细胞(hu m an vascu l ar s m ooth m uscle ce lls ,HV S M Cs )制备体外血管钙化模型。方法 用组织贴壁法从人胚胎脐带动脉中分离原代人主动脉平滑肌细胞,原代细胞通过抗体A -s m-ac tin 染色鉴定,将传4~6代的细胞分为钙化组和对照组,对照组用正常D M EM 培养基培养,钙化组加入10mm o l/L B -甘油磷酸盐诱导细胞钙化,连续培养10d 。茜素红S 染色及碱性磷酸酶法鉴定。结果:分离的原代细胞经S -P 染色鉴定为阳性,呈淡黄色。钙化组细胞诱导钙化后,细胞增殖缓慢,并形成囊泡结构,茜素红S 染色形成红色的钙化结节,钙化组碱性磷酸酶活性较对照组在不同时间点(4,6,8,10d)都有所增加(P <0.01)。结论:B -甘油磷酸盐体外能够诱导HV S M C 钙化,此方法诱导的钙化模型是一种良好的研究血管疾病方面的体外模型。[关键词] 人胚胎血管平滑肌细胞;原代培养;钙化模型[中图分类号] R 543.5 [文献标志码] A [文章编号] 1000-5501(2010)01-0037-03 P ri m ary culture of hu m an vascular s m oot h muscle cells and their calcification m ode C HE NG X iao -zhong 1,2# ,SONG Ting 2,H UANG Bei 1*,Z HONG H ui 2* (1.L ife Sc i ence D epa rt m en t o f Anhu i U niversity ,H efe i 230039,Ch i na ;2.Be ijing Institute of B i o techno l ogy ,Be iji ng 100850,Ch i na) *C orres ponding au t hor ,Z HONG H u,i Te:l 010-********,E-m ai:l t owa l @l yahoo .co m;HUANG B e,i E -ma i :l bei huang @163.co m [Abstract] Ob jective T o establi sh a calc ificati on m ode i n vitro of hu m an vascular s mooth m uscle cells (HV S M C s)in - duced by B -GP.M ethod s P ri m ary HVS M Cs were obta i ned from hu m an embryo by p l antm et hod and confir m ed by sta i n w ith A -s m -ac tin anti body .T he ce lls after 4-6passagesw ere div i ded i nto t w o groups .The control group w as i ncubated w ith no r ma l DM E M m ed i u m w hile the ca l c ifi cati on g roup w as i ncubated w ith t he m ed i u m containi ng 10mm o l/L B -g l ycerophospha te f o r 10days .Ca lcifica tion w as confir m ed by a lizar i n red S stai n and a l kali ne phosphatase(ALP)assay s .Resu lts T he pr i m ary ce lls observed by S -P sta i n we re positi ve and the ce lls a fter be i ng stained w ere pa l e ye llo w.A fter be i ng i nduced w it h B -G P ,the ce lls of ca lcificati on g roup began concen tric gro w th and for m ed vesic l es .A lizar i n red S sta i n i ng s howed tha t the reaction o f ca lcify i ng nodu les was red ,A LP ac tiv ity w as h i gher than tha t of controls at var i ous ti m e po i nts(4d ,6d ,8d and 10d ,P <0.01).Con clusi on The HV S M Cs cou l d be i nduced i nto ca lcificati on in vitro by B -G P ,and this model contr i ba tes t o fur -t her stud i es o f vascular diseases . [K ey words] hu m an e m bryo vascu l ar s m ooth m uscle ce lls ;pri m ary cu lt u re ;calc ificati on mode 随着年龄的增长,多数老年人的主动脉都存在着渐进的钙盐沉积,即动脉钙化,其最终会导致高血压、动脉粥样硬化等血管疾病[1~3]。而血管平滑肌细胞(vascu l a r s moo t h m us -cle cells ,V S M Cs)是动脉发生钙化的主要细胞,VS M C s 体外诱导钙化是研究心血管疾病发病机制的重要细胞模型。目 前,V S M Cs 的体外原代培养主要来源于大鼠,本研究对分离自人胚胎组织的人V S M Cs(HVM Cs)进行体外原代培养,并经B -G P 诱导形成钙化,旨在为研究心血管疾病发病机制提供更准确的细胞模型。 1 材料与方法 1.1 材料 人胚胎(胎龄32周),解放军总医院提供;DM E M 培养基购自G i bco 公司;小牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司;B -磷酸甘油酯(B -GP )、茜素红购自北京欣经科生物技术有限公司;羊抗A -S M-acti n(带HR P 标签)购自Santa Cruz 公司;碱性磷酸酶检测试剂盒购自南京建成生物工程公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。