酵母双杂交
原理：酵母双杂交（Yeast two-hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术，用于检测蛋白质间的物理相互作用关系。其原理基于转录因子的两个功能域的可拆分性。①转录因子可拆分性：构建酵母诱饵（bait）和猎物（prey）表达载体：将目标蛋白分别将其编码序列分别克隆到两个表达载体中。其中，诱饵载体通常包含一个“催化域”（activation domain，AD），用于连接目标蛋白和转录激活子域；猎物载体通常包含一个“DNA结合域”（DNA binding domain，BD），与转录因子的靶位点序列结合。通过将目标蛋白的相互作用引入到转录因子中，可以重新组装功能域并激活报告基因表达。②目标蛋白的诱饵和猎物构建：将目标蛋白分别克隆到诱饵载体和猎物载体中。诱饵载体中的目标蛋白与BD结合，形成诱饵蛋白-BD复合物；猎物载体中的目标蛋白与AD结合，形成猎物蛋白-AD复合物。③互补的转录因子和报告基因：将诱饵和猎物载体转化到同一酵母细胞中，诱饵蛋白与猎物蛋白发生相互作用后，诱饵蛋白的BD域与猎物蛋白的AD域重新组装为完整的转录因子。该转录因子能够结合到特定的报告基因启动子上，激活报告基因的表达。④报告基因表达和筛选：通过培养在所选的选择性培养基上，只有发生了特定蛋白相互作用的酵母细胞才能生长。选择性培养基可能缺乏某些必需营养物质，当酵母菌株与目标蛋白质发生相互作用时，新的遗传特征和功能产物的表达则能够弥补酵母细胞在选择性培养基上的缺陷。例如，当使用缺乏组氨酸（histidine）的培养基时，只有酵母菌株表达了完整的转录因子，才能够合成组氨酸并正常生长。⑤结果验证：据此可以筛选出具有蛋白相互作用的酵母突变株。验证通常通过进一步的亲和试验（如共免疫沉淀）或其他技术（如荧光共定位）来确认蛋白质相互作用的可靠性。总体来说，酵母双杂交实验通过利用转录因子可拆分性的原理来检测蛋白质的相互作用。
方法：
1、构建酵母双杂交核系统载体AD-TET8、BD-P8：利用同源重组方法将载体AD和BD选择合适酶切位点并设计带有相应酶切位点的引物→扩增目的基因AD-TET8、BD-P2N，回收并与已酶切的载体进行连接，转化至大肠杆菌感受态，37 ℃生长12-14 h后挑取阳性菌落进行PCR检测→测序。
2、酵母双杂交验证互作：
①酵母感受态的制备：将-80℃的酵母菌株划线于YPDA平板上，30 ℃生长3-5 d长出单菌落→将单菌落接种到3 mL YPDA液体培养基中，30℃，220 r/min过夜摇菌→转移1mL菌液至100 mL YPDA中，调整OD600在0.2左右→30℃，220 r/min使得OD600达到0.4-0.6→菌液用50 mL灭菌离心管以1000 g离心5 min，弃上清，加适量水悬浮菌体，重复1000 g离心5 min→弃上清，用1 mL新配制的1×TE/LiAC悬浮菌体，获得溶液即为酵母感受态。
②酵母质粒转化：在超净台将两种质粒（各0.5 μg）和Carrier DNA（0.1 mg）加入到离心管中，混匀（Carrier DNA起保护、防止变性作用，使用前按照99 ℃金属浴加热5 min，冰浴3 min重复两次）→向加有质粒的离心管中各加入制好的酵母感受态100
μL，混匀→向每管离心管中加入600 μL PEG/LiAC，混匀（剧烈振荡以提高转化效率）→将离心管放入30℃摇床以220 r/min振荡培养30 min→取出离心管，向每管加入70 μL DMSO(利于质粒细胞)，轻轻混匀，42℃水浴15 min，每5 min翻转一次→快速插入冰上2 min→室温，12000 rpm离心20 s→弃上清，用适量1×TE悬浮菌体，涂布于SD/-Leu/-Trp培养基，风干后用封口膜封好，30℃倒置培养3-5 d→将SD/-Leu/-Trp 培养基生长出的单菌落挑至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上划线（培养基已提前涂布好X-α-Gal显色液），28℃避光倒置放置1-3 d，观察是否变蓝。
酵母转化 (一)原理： 我们采用的是PEG/LiAc法转化酵母。 LiAc可使酵母细胞产生一种短暂的感受性状态，此时它们能够摄取外源性DNA。PEG是一种高分子聚合物，只有分子量达到3000左右的PEG才会发挥最 大的转化促进作用。本文使用的PEG分子量为3350，实验结果表明转化效果可以 达到103～105cfu/μg。PEG在酵母转化中起到在高浓度LiAc环境中保护细胞膜， 减少LiAc对细胞膜结构的过渡损伤，同时促进质粒与细胞膜接触更紧密。PEG的 浓度是务必适宜，这一点很重要。 鲑鱼精DNA为短的线形单链DNA，在转化实验中主要是保护质粒免于被DNA 酶降解。另外还可能在酵母细胞摄取外源性环形质粒DNA中发挥协助作用。在每 次使用前务必进行热变性，使可能结合的双链DNA打开，保证鲑鱼精DNA在转 化实验体系中以单链形式存在。 (二)材料、仪器设备及试剂： 1.SD 培养基： ●YNB：1.6g/L ●硫酸铵：5g/L ●氨基酸：根据质粒的筛选压力选择性添加 ●调节pH=5.8，121°灭菌20min。 2.YPDA培养基 ●胰蛋白胨：20g/L ●酵母浸膏：10g/L ●琼脂：20g/L(固体) ●腺嘌呤：15ml 0.2%腺嘌呤/L ●调节pH =7.5，121°灭菌20min。 3.100%DMSO 4.10×TE（pH=7.5）：（0.1M Tris-HCl，10mM EDTA） ●Tris-HCl：1.211g/100ml ●EDTA：0.37g/100ml ●调节pH=7.5，121°灭菌20min。 5.10×LiAc（pH=7.5） ●1M LiAc：10.202g/100ml ●用醋酸调节pH=7.5，121°灭菌20min。 6.1×TE/1×LiAc 现配现用，在超净台中操作，吸取母液到ep管或50ml离心管中 终浓度10ml H2O 8ml
酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA 结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备，并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别于其他实验的特点，而其操作技术本身并不十分困难。特别应提出的是，一个阳性克隆的编号往往要被反复记录多次，因此，要时时注意编号的正确性。另外，若从公司购得待筛选的酵母cDNA文库，应注意不同的公司有不同的产品，且各公司的
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素） pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) 各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四 缺”） 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”） 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度%的YNB中再加入%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为的YNB与硫酸铵。
酵母双杂交原理及步骤 以酵母双杂交原理及步骤为标题，本文将探讨酵母双杂交的原理和步骤。酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用、信号转导和基因调控等生物学过程。 酵母双杂交是一种基于酵母菌的遗传系统的实验方法，通过检测两个蛋白质是否相互作用，从而揭示它们之间的相互作用关系。这种方法的核心原理是将两个感兴趣的蛋白质分别与DNA结合域和激活域相连，当这两个蛋白质相互作用时，DNA结合域和激活域会靠近，从而激活报告基因的表达。 酵母双杂交实验的步骤如下： 1. 构建融合基因：首先需要选取两个感兴趣的蛋白质，并将它们的编码序列分别克隆到酵母双杂交载体的DNA结合域和激活域上。DNA结合域和激活域是两个功能区域，当两个蛋白质相互作用时，这两个功能区域会靠近并激活报告基因的表达。 2. 转化酵母菌：将构建好的酵母双杂交载体导入酵母菌中。酵母菌是双杂交实验中常用的宿主，因为它具有简单的遗传系统和易于生长的特点。 3. 筛选阳性克隆：将转化后的酵母菌分别接种在缺失报告基因所需的营养物的培养基上。只有当两个蛋白质相互作用时，DNA结合域
和激活域才能靠近并激活报告基因的表达，从而使酵母菌能够在缺失营养物的培养基上生长。 4. 验证相互作用：通过进一步的实验证实阳性克隆的相互作用。常用的方法包括酵母菌营养物补充实验、酵母菌生长曲线分析和蛋白质互聚实验等。 酵母双杂交技术的优点在于它能够直接在真核细胞中研究蛋白质相互作用，同时具有灵敏度高、结果可靠、重复性好等特点。然而，也需要注意到酵母双杂交实验存在一定的局限性，如假阳性和假阴性结果的可能性，以及蛋白质结构和功能的局限性等。 酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，通过构建融合基因、转化酵母菌、筛选阳性克隆和验证相互作用等步骤，可以研究蛋白质相互作用等生物学过程。在实际应用中，需要综合考虑实验设计、阳性和阴性对照、验证方法等因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理 1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 酵母双杂交系统由三个部分组成： (1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。 (2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。 (3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。 二.所用的载体及相关信息 1. pGBKT7载体的图谱和相关信息 The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1). b. pGADT7载体的图谱和相关信息
酵母双杂交 原理：酵母双杂交（Yeast two-hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术，用于检测蛋白质间的物理相互作用关系。其原理基于转录因子的两个功能域的可拆分性。①转录因子可拆分性：构建酵母诱饵（bait）和猎物（prey）表达载体：将目标蛋白分别将其编码序列分别克隆到两个表达载体中。其中，诱饵载体通常包含一个“催化域”（activation domain，AD），用于连接目标蛋白和转录激活子域；猎物载体通常包含一个“DNA结合域”（DNA binding domain，BD），与转录因子的靶位点序列结合。通过将目标蛋白的相互作用引入到转录因子中，可以重新组装功能域并激活报告基因表达。②目标蛋白的诱饵和猎物构建：将目标蛋白分别克隆到诱饵载体和猎物载体中。诱饵载体中的目标蛋白与BD结合，形成诱饵蛋白-BD复合物；猎物载体中的目标蛋白与AD结合，形成猎物蛋白-AD复合物。③互补的转录因子和报告基因：将诱饵和猎物载体转化到同一酵母细胞中，诱饵蛋白与猎物蛋白发生相互作用后，诱饵蛋白的BD域与猎物蛋白的AD域重新组装为完整的转录因子。该转录因子能够结合到特定的报告基因启动子上，激活报告基因的表达。④报告基因表达和筛选：通过培养在所选的选择性培养基上，只有发生了特定蛋白相互作用的酵母细胞才能生长。选择性培养基可能缺乏某些必需营养物质，当酵母菌株与目标蛋白质发生相互作用时，新的遗传特征和功能产物的表达则能够弥补酵母细胞在选择性培养基上的缺陷。例如，当使用缺乏组氨酸（histidine）的培养基时，只有酵母菌株表达了完整的转录因子，才能够合成组氨酸并正常生长。⑤结果验证：据此可以筛选出具有蛋白相互作用的酵母突变株。验证通常通过进一步的亲和试验（如共免疫沉淀）或其他技术（如荧光共定位）来确认蛋白质相互作用的可靠性。总体来说，酵母双杂交实验通过利用转录因子可拆分性的原理来检测蛋白质的相互作用。 方法：
LexA酵母双杂交系统简介 一、LexA酵母双杂交系统的设计原理 报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。 质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。 质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。 根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。 如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。 二、商品化酵母双杂交系统的组成 1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库 2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株） 3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株 4. 对照质粒： 质粒用途 pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照 pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照 pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒 5. 引物： pLexA测序引物及pB42AD测序引物。 三、酵母双杂交实验的基本流程 1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。 2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。 3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。 4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。 转化质粒选择培养基克隆生长情况说明
酵母双杂交技术的原理及其应用 1. 引言 酵母双杂交技术是一种经典而常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质间相互作用以及蛋白质与DNA或RNA的相互作用。本文将介绍酵母双杂交技术的原理及其应用。 2. 原理 酵母双杂交技术基于酵母细胞内的转录因子相互作用原理，利用酵母细胞内的转录活性来检测蛋白质间的相互作用。其基本步骤如下： 1.构建载体：将目标蛋白质的编码序列克隆到酵母双杂交载体中，该载 体通常包含一个激活域和一个DNA结合域。 2.构建酵母菌株：将构建好的双杂交载体转化到酵母菌株中，产生转录 因子的表达。 3.杂交实验：将两个不同的酵母菌株分别转化目标蛋白质的编码序列， 使得两个蛋白质分别与激活域和DNA结合域相连。 4.检测蛋白质相互作用：利用报告基因检测酵母菌株中的转录活性，若 目标蛋白质间存在相互作用，则报告基因被激活，并产生可观察的表型。 3. 应用 3.1 蛋白质相互作用研究 酵母双杂交技术广泛应用于研究蛋白质间的相互作用关系。通过构建不同的载体和菌株，可以很方便地筛选和鉴定蛋白质相互作用的结构域和关键基序。这有助于揭示蛋白质相互作用的机制和信号通路。 3.2 酶底物筛选 酵母双杂交技术还可以用于酶底物的筛选。通过将酶和可能的底物序列构建成双杂交载体，并转化到酵母菌株中，可以快速筛选出与酶底物结合的蛋白质。这对于研究酶的底物特异性和酶促反应机理具有重要意义。 3.3 药物靶点筛选 利用酵母双杂交技术，可以通过构建包含药物分子和可能的靶点蛋白质的双杂交载体，进行药物靶点的筛选。这种方法可以高效地从大量的分子库中筛选出与药物相互作用的潜在靶点，对于药物开发具有重要意义。
酵母双杂交的原理和应用 前言 酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究蛋白质间相互作用。本文将介绍酵母双杂交的原理和应用，并详细说明相关实验步骤和注意事项。 一、酵母双杂交原理 酵母双杂交利用酵母细胞中的转录因子来检测两个蛋白质是否发生相互作用。 该技术包括两个主要步骤：酵母杂交库的构建和蛋白质相互作用的检测。 1.酵母杂交库的构建 –首先，需要构建一个酵母细胞库，其中包含目标蛋白的编码序列，以及与之它相互作用的蛋白编码序列。 –这些蛋白编码序列被插入一个特殊的酵母表达载体中，该载体包含一个转录因子启动子和一个可变启动子。当目标蛋白与与之相互作 用的蛋白结合时，转录因子被激活，并启动报告基因的表达。 2.蛋白质相互作用的检测 –将酵母杂交库与一个可能与目标蛋白相互作用的蛋白质编码序列进行杂交。 –利用筛选或选择的方法，检测是否存在转录因子的激活，从而判断蛋白质是否发生相互作用。 二、酵母双杂交的应用 酵母双杂交技术在生物学研究中有广泛的应用，主要用于以下方面： 1.蛋白质相互作用的筛选 –酵母双杂交可以用于大规模筛选蛋白质间的相互作用。通过构建酵母杂交库，并与目标蛋白进行杂交，可以鉴定潜在的相互作用蛋白， 从而探索蛋白质间的相互作用网络。 2.功能区域的鉴定 –通过酵母双杂交，可以鉴定特定的蛋白质功能区域。例如，在研究某个转录因子的结构和功能时，可以利用酵母双杂交技术识别其与 其他蛋白质相互作用的功能区域。 3.药物靶点的鉴定 –酵母双杂交可以用于鉴定药物的靶点。通过与已知药物相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与特定药物相互作用的蛋白质，进 而确定药物的作用机制和潜在靶点。
酵母双杂交鉴别 酵母双杂交鉴别是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用和酵母细胞中的信号转导通路。本文将介绍酵母双杂交鉴别的原理、操作步骤和应用，并探讨其优缺点及未来发展方向。 一、原理 酵母双杂交鉴别是基于酵母细胞中的转录激活子-蛋白质相互作用的原理。该技术利用酵母细胞内的转录激活子（activation domain，AD）和DNA结合域（DNA-binding domain，BD）的相互作用，实现对蛋白质相互作用的鉴定。在酵母双杂交系统中，AD和BD分别与待测蛋白质的两个亚单位相连，形成一个复合物。当两个蛋白质相互作用时，AD和BD也会相互作用，激活报告基因的表达，从而产生可观察的表型。 二、操作步骤 酵母双杂交鉴别的操作步骤主要包括以下几个方面： 1. 构建酵母表达载体：将待测蛋白质的AD和BD亚单位分别克隆到酵母表达载体中，构建AD和BD融合蛋白的表达载体。 2. 转化酵母细胞：将构建好的表达载体转化到酵母细胞中，使其表达AD和BD融合蛋白。 3. 交配：将含有不同AD和BD融合蛋白的酵母细胞进行交配，使
其杂交。 4. 筛选：通过对交配后的酵母细胞进行选择培养基的筛选，筛选出能够表达报告基因的阳性克隆。 5. 验证：通过进一步的实验证实，确定阳性克隆中的相互作用是否真实可靠。 三、应用 酵母双杂交鉴别在蛋白质相互作用研究中有着广泛的应用。它可以用于鉴定蛋白质间的直接相互作用、建立蛋白质相互作用网络、研究蛋白质的功能和信号通路等。此外，酵母双杂交鉴别还可以用于药物筛选和疾病相关蛋白质相互作用的研究。 四、优缺点 酵母双杂交鉴别有以下优点：操作简便、高通量、适用于大规模蛋白质相互作用筛选，可以筛选出潜在的蛋白质相互作用对。然而，酵母双杂交鉴别也存在一定的局限性：可能存在假阳性和假阴性结果，无法鉴定动态和间接的蛋白质相互作用。 五、未来发展方向 随着技术的不断发展，酵母双杂交鉴别也在不断改进和完善。未来的发展方向主要包括以下几个方面： 1. 提高鉴定准确性：通过改进酵母双杂交鉴别的实验设计和筛选条
酵母单双杂交原理 酵母单双杂交是一种常用的遗传学实验方法，用于研究酵母细胞中基因的功能和相互作用。该方法基于酵母细胞的性别特性和遗传特性，通过交配产生单倍体和双倍体的酵母细胞，从而实现对基因的分离和分析。 酵母菌是一种单细胞真核生物，其遗传特性与其他真核生物类似，具有两个性别类型：雌性和雄性。雌性细胞称为a型细胞，雄性细胞称为α型细胞。在酵母的生命周期中，单倍体细胞可以通过有丝分裂不断繁殖，也可以通过配子体形成双倍体细胞。 酵母单双杂交的基本原理是将a型和α型的酵母细胞进行交配，形成双倍体细胞。具体步骤如下： 1. 培养酵母细胞：首先，分别培养纯合的a型和α型酵母细胞。培养条件包括适当的培养基和温度，以及适当的培养时间，使酵母细胞处于最佳生长状态。 2. 交配：将纯合的a型和α型酵母细胞混合在一起，通过搅拌或震荡等方式使其充分接触。在一定条件下，a型和α型酵母细胞会发生交配，并形成双倍体细胞。 3. 选择双倍体细胞：将混合后的酵母细胞接种在含有特定抗生素的培养基中。抗生素可以选择性地杀死单倍体细胞，而对双倍体细胞
不起作用。这样就可以通过选择性培养，筛选出双倍体细胞。 4. 分离双倍体细胞：将筛选出的双倍体细胞进行分离，分别培养成单倍体细胞。这可以通过稀释培养、染色体分离或其他方法实现。通过酵母单双杂交实验，可以研究基因的功能和相互作用。通过将感兴趣的基因与报告基因或标签基因相连，可以观察其在双倍体细胞中的表达情况。此外，还可以通过检测特定基因在双倍体细胞中的相互作用，探索基因网络和信号传导途径。 酵母单双杂交方法具有以下优点： 1. 快速：酵母细胞繁殖快速，培养周期短，可以在短时间内获得大量的杂交细胞。 2. 简单：酵母单双杂交实验步骤简单，操作相对容易，不需要昂贵的设备和材料。 3. 灵活性：酵母单双杂交方法可以用于不同的研究目的，包括研究基因的功能、相互作用、信号传导途径等。 4. 可靠性：酵母单双杂交方法已被广泛应用于许多研究领域，具有较高的可靠性和重复性。 总结起来，酵母单双杂交是一种常用的遗传学实验方法，通过交配和选择分离，可以获得双倍体酵母细胞，用于研究基因的功能和相
模块七蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术; 让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2. 实验原理 1989年 Fields 和 Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与 ,提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。 (2作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 (3检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。 (4酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建 cDNA 文库,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。 (5 通过 mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先, 经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内, 因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使 DNA 结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含
（酵母菌储存在-70 C 中，引物和质粒 DNA 储存在-20 C 中） 概念： 1. 次序转化：指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是 DNA-BD/bait plasmid ）,在选择培 养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（ AD fusion library ）转化进去。优点： 就是比共转化使用更少的质粒 DNA 也就是节约质粒 DNA 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin （卡那霉素） pGADT7----的选择物是：ampicillin （ 氨苄西林） 酵母氮源（YNB ：; -leu DO suppleme nt 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖20g （ 即2%） 5） SD/-trp （1000 ml ） 酵母氮源（YNB ：; -ade/-leu/-trp/-his DO suppleme nt 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖20g （即2%） 注意：YNB 有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是 含硫酸铵的。（买 来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度 ％的 YNB 中再加入％的硫酸铵，即最终 在1000 ml 溶液中加入总量为的 YNB 与硫酸铵。 各种SD 培养基： 1） SD/-ade （腺嘌呤）/-leu （亮氨酸）/-trp 缺”） 酵母氮源（YNB ：; -ade/-leu/-trp/-his DO suppleme nt 0.60g 葡萄糖20g （即2%） 2） SD/-leu/-trp/-his （1000 ml ） 酵母氮源（YNB ：; -leu/-trp/-his DO suppleme nt 0.62g ; 葡萄糖20g.（ 即2%） 3） SD/-leu/-trp （1000 ml ） （“二 缺”） 酵母氮源（YNB ：; -ade/-leu/-trp/-his DO suppleme nt 0.64g 葡萄糖20g （ 即2%） （色氨酸）/-his （组氨酸）（1000 ml ）（"四 （购买来就配好的）； （购买来就配好的） （购买来就配好的）
酵母双杂交操作步骤(总9 页) 本页仅作为文档封面，使用时可以删除 This document is for reference only-rar21year.March
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素） pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) 各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”） 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”） 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）： ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%)