酵母双杂交系统及其应用
Yeast Two-hybrid System and Its Application
1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生物学特性
（1）单细胞真核生物
尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。
（2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少；
1996年已完成酵母全基因组测序（1.5 x 107 bp），是第一个被测序的真核生物。大约有6000个基因。目前已经建立了一个6000个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。其中5000多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。
（3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖
在指数生长期每90分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。
（4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析
酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。
有两种单倍体细胞类型，分别为a型和α型。在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/α双倍体细胞。在营养匮乏时，a/α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。
一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒
bud，芽, 蓓蕾starvation，饥饿, 饿死
ascus，n.[微生物]子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂
haploid，n.[生物]单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的
diploid，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体
ascospore，n.[植]囊孢子
rupture，v.破裂, 裂开, 断绝(关系等), 割裂。n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂
spore，n.孢子vi.长孢子germinate，v.发芽, 发育, 使生长
酿酒酵母生活周期
2 酵母双杂交系统的原理
蛋白质的相互作用是生命活动的基础，一切生命活动几乎都是通过蛋白质之间的相互作用而实现的。在生物体发育的不同阶段，细胞分裂、分化的不同时期，都离不开蛋白质间的相互作用。
酵母双杂交系统是一种采用分子遗传学手段、通过鉴定报告基因的转录活性检测蛋白质－蛋白质相互作用的方法。Y2H是由纽约州立大学的Stanley Fields于1989年首先创立的。
转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即这些因子往往由两个或两个以上相互
独立的结构域构成。
●DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)
●转录激活结构域(activation domain, AD)
例如，酵母转录子Gal4分子由一条多肽链组成，含有881个氨基酸。它有两个结构域：●DNA结合结构域（DNA binding domain, DB）由位于N-末端1~147个氨基酸构成，
能识别效应基因的上游激活序列（UAS, upstream activating sequence）,此外，在其N-端还具有一段核定位序列；转录激活结构域（activation domain, AD）由位于C-末端的768~881位氨基酸构成。
当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能够恢复Gal4作为转录因子的活性。
Fields等将Snf1与DB融合，Snf4与AD融合，构建在穿梭质粒上。其中，Snf1是一
种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶，Snf4是它的一个结合蛋白。
研究者将两种穿梭质粒转化酵母GGY: 171菌株，该菌株含有LacZ报告基因，并已去除相应转录因子基因。该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近，激活了报告基因LacZ的转录。一般地，将DB-x的融合蛋白称作诱饵(bait) , X往往是已知蛋白; AD-Y称作猎物(prey) ,Y称作猎物;整个实验过程称作“狩猎”( hunt或fish)。
3 酵母双杂交系统的应用
目前,在许多具有国际水准的实验室中,酵母双杂交系统及其衍生方法已成为研究蛋白质相互作用的首选方法,而且利用它已揭示了大量未知蛋白质的相互作用。据对文献的统计,目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的。
●鉴定两种已知蛋白之间有无相互作用
●鉴定已明确有相互作用蛋白质发生作用所必需的的结构域及特定氨基酸的改变对相互
作用的影响寻找与某一特定蛋白质有相互作用的蛋白质
●蛋白质相互作用图谱的绘制
随着基因组研究计划的发展，以及mRNA在不同组织器官及不同发育阶段的表达图谱的构建(body map)，蛋白质在不同时空状态下相互作用图谱（即基因组蛋白连锁图谱Genome Protein Linkage Map）。的构建也逐渐展开。在双杂交系统的BD及AD均接上cDNA库，让它们随机表达蛋白，这样检测报告基因表达的可能是A-B，B-C…等一系列崭新的蛋白一蛋白相互作用，据此可以绘出A→B→C的蛋白联系图谱。Fromont-Racine等采用了相互作用结合技术(interaction mating strategy)，将BD-诱饵蛋白质(X)与AD－基因组文库(Y)分别转化两种不同交配型单倍体酵母菌株，使两者在滤膜上结合，然后涂布于选择培养基上，挑选出阳性克隆作为诱饵蛋白质进行第二轮筛选。该方法省去了利用二倍体菌株表达时筛选过程中繁琐的交叉影印以及大量培养皿的使用，并可以显著地提高效率。
研究蛋白质－蛋白质相互作用的方法有Western blotting、免疫沉淀法、噬菌体展示技术。
4 Y2H的优点
1.酵母双杂交体系研究蛋白一蛋白相互作用的整个过程只对核酸进行操作，充分利用了
成熟的核酸技术和酵母这一快速方便的操作体系，使得实验简单易行。现已发展出酵母双杂交体系的商品试剂盒和相应的cDNA库。
2.可以直接从基因文库中寻找编码相互作用蛋白的DNA序列，而不需要分离纯化蛋白。
3.可以研究蛋白之间的弱相互作用。在细胞内，弱相互作用与强相互作用一样起着极其重要的生物学作用。免疫沉淀法以及近来发展起来噬菌体展示技术要求蛋白一蛋白相互作用强度足够大，而不能检测蛋白之间的弱相互作用。酵母双杂交体系中蛋白一蛋白相互作用发生在酵母细胞这一自然的状态下，使得该方法的灵敏度很高。
4. 检测在活细胞内进行,可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
5 Y2H的局限性。
●报告基因的转录发生在细胞核内
首先，报告基因的转录发生在细胞核内，这要求两种杂交体蛋白都必需能进入核中，因此一些不容易进入核的蛋白就不适合用该体系进行研究。为了拓展其应用范围，近来发展的一些载体在融合蛋白中加入了蛋白质核定位序(nuclear localization sequaence,NLS)，部分解决了这个题。已成功地在该体系中研究过的蛋白除了许多核蛋白(如转录因子)外，还包括许多细胞浆、细胞膜以及线粒体蛋白。但对于发生在细胞质中或者细胞膜上的蛋白质相互作用是检测不到的。
●有一些蛋白不适于用该体系
但是，还有一些蛋白不适于用该体系。如需要翻译后修饰(磷酸化或糖基化)才能起相互作用的蛋白不能直接用该体系进行研究。因为在酵母中不一定会产生与高等动植物细胞内一样的翻译后修饰。要研究这样的相互作用，必需对该体系加以改造。另外有一些蛋白与DNA 结合结构域融合后，在没有转录激活杂交体蛋白存在的情况下也能激活报告基因的转录。这些蛋白往往本身含有转录激活结构域或类似的结构域。这样的蛋白需要经过改造，去掉它们的转录激活能力后才能用该体系研究。有些蛋白杂交体对酵母细胞的正常功能有影晌，有的甚至是致死性的，这样的蛋白也无法在该体系中研究。
●假阳性
一个值得注意的问题是筛库过程中出现的假阳性问题。虽然现有的体系都用两个报告基因进行双重筛选，但假阳性问题仍然存在。一种假阳性是由于转录激活杂交体中的库蛋白本身是参与转录的蛋白，即使在DNA结合域杂交体不存在的情况下，转录激活杂交体自身就能激活报告基因的转录，表现为阳性。因此在筛选出阳性克隆后，需要用回收的转录激活域杂交体质粒单独转化酵母，以判定克隆是否为假阳性克隆。
另一类假阳性是在DNA结合域杂交体存在下表现为阳性，但对DNA结合域杂交体没有特异性，不相关的DNA结合域杂交体与其共转化酵母时也表现为阳性。在筛选出阳性克隆后，应将转录激活域杂交体同一些不相关的DNA结合域杂交体一起转化酵母，以排除这类假阳性克隆。Harper等利用酵母交配发展一种快速检别这类假阳性的方法。其大致过程是:让阳性克隆在一定的选择培养基上生长使其失去DNA结合域杂交体质粒，只剩下转录结合域杂交体质粒，然后与不同性别的含有与该蛋白无关的DNA结合域杂交体的酵母交配，从形成的二倍体酵母是否表现为阳性判定原来的克隆是否为假阳性克隆。而不需要提取回收阳性克隆的转录激活杂交体质粒，再与无关的DNA结合域杂交体共转化酵母细胞这样一个繁琐的过程。
筛到的蛋白和另一类假阳性来自cDNA库的构建。可能cDNA编码的某个蛋白的一部分能和目标蛋白起相互作用，而完整的蛋白则无法和目标蛋白结合;cDNA库一般由Oligo-dT 或由随机引物合成。随机引物构建的cDNA库中DNA的长度一般为几百bp，已将蛋白分成了多段，这样避免了一个蛋白内不同结构域间的相互影响，对用酵母双杂交体系进行筛库有利。但这种库又可能使得原来在整个蛋白中不暴露的区域暴露，筛库时有可能将这样的区域筛出。这样的假阳性需要用其它实验加以排除。
筛到的蛋白和目标蛋白的相互作用有可能是通过酵母的内源蛋白为介导产生的。
假阴性
在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性, 即两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。造成假阴性的原因主要有几方面:
一、是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。
二、是蛋白间的相互作用较弱, 应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。
三、GAL4和LexA系统要求被测蛋白定位于细胞核，然而有些蛋白却有强疏水结构域，
还有些蛋白携带定位于细胞其他细胞器的强信号，这样，涉及后2类蛋白的相互作用在GAL4和LexA系统中就检测不到;
四、GAL4和LexA系统依赖转录激活报告基因而检测蛋白相互作用，如果蛋白是抑制基因表达的，报告基因就不能被激活转录，双杂交系统就检测不到该蛋白相互作用了。
另外应该值得注意的是，从库中筛到的蛋白在体内是否真正同目的蛋白发生相互作用还需要有进一步实验加以证实。有可能两种蛋白根本不在同一种器官、组织或细胞内表达，或者不在同一发育阶段表达，或者存在于同一种细胞的不同区域，根本不可能产生真正的相互
作用。这也要求筛库时谨慎选择有生物学意义的基因库(器官、组织、细胞、发育阶段特异性)。
最后,有必要指出的是,酵母双杂交技术必须与其它技术结合才能有利于对实验结果作出更为完整和准确的判断。
6 酵母双杂交系统的优化6.1 BD结构域：GAL4, LexA,
6.2 AD结构域：GAL4，VP16，B42
酵母双杂交系统常用的DNA结合结构域有GAL4和来自E.coli的LexA（LexA不具有核定位序列）。常用的转录激活结构域有GAL4、VP16或B42。
由于转录因子具组件式特点，这些DNA结合结构域和激活结构域可以相互组合，但每一种组合均有其优缺点。比如VP16激活结构域有强激活性，可以用于检测亲和力较低的蛋白之间的相互作用，但与此同时势必伴随假阳性比率过高的问题。
按转录激活活性的大小排列，VP16较Ga14 regionⅡ大，Ga14 regionⅡ又较B42强。
由于存在毒性问题，并非转录活性越大越好。
其中B42能消除强转录活化子对酵母细胞的毒性，从而提高对靶蛋白的筛选范围。VP16来自于单纯疱疹病毒，它的转录激活活性高于其他两个；B42是一个异源的含有88个残基的酸性肽，来自E. coli，转录激活活性弱，可以缓和有毒性的基因表达对细胞的影响，并且在B42后有流感病毒HA抗原，易于将蛋白分离纯化。基于B42:LexA的酵母双杂交系统（GAL1启动子）的融合蛋白可以被诱导性表达，以防蛋白相互作用产生了细胞毒作用而抑制细胞生长，同时还可以为假阳性提供对照。
LexA系统可用以检测微弱、短暂结合的蛋白，以及可能对酵母菌具有一定毒性的蛋白，而GAL4系统则可有效地消除假阳性。
6.3 报告基因：lacZ, HIS3，
酵母双杂交系统的报告基因通常由一些营养选择标记HIS3(HIS3基因的转录激活能使酵母在缺乏组氨酸的培养基上生长)和（或）编码酶的基因lacZ基因的转录激活能使酵母产生α-半乳糖苷酶）组成。
最初的双杂交系统只采用一种报告基因来反映蛋白相互作用，假阳性通常可达10 %～90%不等，采用多个报告基因可以减少假阳性，近来的双杂交系统则使用3个甚至4个分别有独立启动子结构的选择标记来降低假阳性率。同时使用多个营养标记可使分析手段多样化，但相应的实验时间却并未增加。除此之外，因为不同的报告基因各有不同的上游激活序列，因此采用多个有独立启动子结构的选择标记能排除由于上游激活结构域融合蛋白和上游
激活序列直接作用而引起的假阳性结果。
双杂交系统的改进，使其不仅可以定性分析可以定量分析蛋白相互作用。在酵母双杂交系统中，实验者可以通过比较LacZ报告基因表达水平的相对高低，来比较一个目的蛋白和另一个己知与该目的蛋白有相互作用的蛋白的若干突变体之间相互作用的相对强弱。
然而值得注意的是，在定量双杂交分析中，只有使用相同的双杂交系统，检测大量转化子，并且进行大量平行试验，Lac Z报告基因表达水平的相对高低才被看作是有定量意义的。所有酵母双杂交实验都必须检测大量转化子，方可避免只检测单个酵母菌落所引起的偏差和错误。此外，要极力避免将不同实验团体的数据横向比较，因为不同实验室使用的双杂交系统、操作方法、分析比较方法都是不同的，不同蛋白在不同酵母中会有不同的表达水平，不同菌落中质粒的拷贝数不同，等等，这些都会使得横向比较没有意义。
液体培养实验(liquid growth assays)也是一种比较不同蛋白之间相互作用强弱的简便方法。其原理是：酵母在缺乏组氨酸的培养基里生长，必须依赖蛋白的相互作用来激活能够编码组氨酸的基因。蛋白作用强，该基因表达量高，酵母合成组氨酸的能力强，酵母培养物浓度升高快，则透光性就差。因此，2个蛋白之间相互作用的强弱可以通过培养物浓度的改变值(可用分光光度计等测得)的相对大小而估得。也就是说，蛋白相互作用强，酵母长得就快一些。
6.4 转化方式
酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是转化效率偏低。酵母细胞的转化效率比细菌要低约4个数量级。因此转化步骤就成为双杂交技术的瓶颈，是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一, 特别是对低丰度cDNA库进行筛选时, 必须提高转化效率。转化时可采用共转化或依次转化。相比之下共转化省时省力，更重要的是如果单独转化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时, 共转化则可以减弱或消除这种毒性。一种更有效的方法是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型的单倍体酵母中, 通过两种接合型单倍体细胞的杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞。Bendixen等人通过酵母接合型的引用,避免了两次转化操作,同时又提高了双杂交的效率。
7 Y2H的衍化系统
7.1核外双杂交系统（extra-nuclear two-hybrid system）
传统的酵母双杂交系统所研究的蛋白质-蛋白质之间的相互作用大都是在细胞核内完成的,但是许多定位在细胞质中或细胞膜上的蛋白质需要一系列复杂的加工修饰过程才能发挥其正常生理功能。用传统的酵母双杂交系统研究这些蛋白质与伙伴蛋白之间的关系是不合适
的。最近建立的以非转录读出为特点的Sos蛋白介导的双杂交系统、PI3K介导的靶蛋白识别系统以及断裂-泛素为基础的双杂交系统另辟蹊径,为需要复杂修饰后定位在胞质或细胞膜上的蛋白质间相互作用的研究提供了新思路。
7.1.1 Sos蛋白恢复系统(Sos recruiment system，SRS)
SRS是Aronheim等根据Sos蛋白的特点设计出的一种双杂交系统。Sos蛋白是人类的Ras通路中鸟苷酸交换因子(guanine exchange factors, GEF)定位于细胞质中,在细胞信号转导过程中能够使Ras蛋白由非活化型Ras-GDP转化成活化型Ras-GTP,从而激活Ras信号通路,细胞得以生长。酵母中的GEF是Cdc25蛋白,定位在细胞膜上,其功能与人类的Sos蛋白相同。它的突变型cdc25-2为温度敏感型,在37℃细胞不能生长。研究发现,在突变型cdc25酵母细胞中,当Sos蛋白通过某种方式定位于细胞膜上时,可替代Cdc25蛋白的功能, 激活Ras蛋白使细胞在37℃恢复生长。根据这个原理构建两个融合蛋白,其中蛋白X与Sos蛋白构成融合蛋白1, 蛋白Y与豆蔻酰基或法西尼基膜定位信号构成融合蛋白2, 两个融合蛋白在cdc25突变型的酵母细胞中共表达,如果X与Y相互作用,则能使Sos蛋白定位于细胞膜上,激活Ras 信号通路,使细胞在37℃下生长。
与传统的酵母双杂交系统相比,Sos恢复系统的主要优点在于被研究的蛋白质相互作用发生在细胞质而不是细胞核中, 因此在转录因子及胞质中行使生理功能的蛋白质的研究中可以得到广泛的应用。
7.1.2 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)介导的靶蛋白识别系统(targets of PI3K identification system, TOPIS)
TOPIS是Isakoff等将SRS进一步拓展建立而成的。该系统用来识别和筛选与PI3K催化产物磷脂酰肌醇3,4-二磷酸即PtdIns(3,4)P2及磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸即PtdIns(3,4,5)P3具有高度亲和力的蛋白。PI3K是一种膜结合脂类激酶,其功能是使磷脂酰肌醇的肌醇环D-3位置磷酸化而催化PtdIns(3,4)P2以及PtdIns(3,4,5)P3的形成。PtdIns(3,4)P2和PtdIns(3,4,5)P3在胞内可直接作为第二信使激活下游一系列信号分子。下游信号蛋白通常是通过其pleckstrin同源结构域(pleckstrin homology domain, PH domain)与PI3K催化产物结合。
另一方面,研究发现,在cdc25温度敏感型酵母细胞中,与Sos蛋白特点类似,当活化型的Ras蛋白(Ras2GTP)以某种方式定位于细胞膜上时,可补偿酵母细胞cdc25突变表型,使其在37℃恢复生长。
根据以上特点,将活化型的Ras蛋白与靶蛋白PH结构域融合构建融合蛋白,让它与PI3K 在酵母cdc25温度突变型细胞中共表达。在PI3K的介导下,如果靶蛋白的PH结构域与
PtdIns(3,4)P2或PtdIns(3,4,5)P3之一相结合,则将活化型的Ras蛋白定位于细胞膜上,允许酵母细胞在非允许温度下(37℃)生长。利用该系统,Isakoff从与PtdIns(3,4)P2或PtdIns(3,4,5)P3具有高度亲和力的一系列PH结构域中发现了几个保守的氨基酸位点,并且从这些保守的氨基酸位点出发,从Genebank中找到几个与PI3K产物相互作用的新蛋白。PI3K所介导的级联反应在细胞中具有广泛的生理效应"所以,TOPIS对于阐明PI3K下游信号通路提供了有力的工具。
7.1.3 断裂-泛素为基础的双杂交系统(yeast two-hybrid system based on split-ubiquitin)
上面介绍的两个系统是针对膜有关的Ras信号通路的特点设计的。近来Staglar等根据存在于胞质中的一种蛋白——泛素的特点建立了一种以断裂-泛素(split-ubiquitin)为基础的双杂交系统也用于研究膜蛋白之间的相互作用。泛素是一种在真核细胞中普遍存在的由76个氨基酸组成的蛋白质,结构保守。其生理功能是结合在蛋白的N-端作为泛素特异蛋白酶(ubiquitin-specific protease,UBP)剪切蛋白质的标记。研究发现,如果将泛素C-端(Cub,第35~76位氨基酸)与一个报告蛋白(通常是转录激活因子)构成融合蛋白,让它与N-端部分(Nub,第1~34位氨基酸)一起在酵母细胞中共表达,结果发现Nub与Cub能够重新形成有功能的泛素(断裂-泛素),并由UBP识别并切断Cub-报告蛋白之间的共价键,结果报告蛋白从泛素中释放出来。根据以上原理,Staglar等将Nub与蛋白X形成融合蛋白1,Cub-报告蛋白与蛋白Y形成融合蛋白2,二者在酵母细胞中共表达,如果X与Y相互作用,则迫使Nub与Cub空间上相接近,重建一个有功能的泛素,报告蛋白被UBP切割下来进入细胞核中,激活特定报告基因的表达。通常用于构建融合蛋白1的Nub使用一个点突变形式NubG，这样就避免了Nub与酵母自身的Cub结合而出现假阳性。
该系统巧妙地解决了膜蛋白之间的相互作用与核报告基因的激活二者在空间上的矛盾。此系统的另一大优点在于构建融合蛋白的Nub及Cub均为40个氨基酸左右的小分子链,所以对靶蛋白之间相互作用可能造成的空间障碍的可能性就很小。利用该系统,以proteinA-LexA-VP16（PLV）为报告蛋白, Johnnson证明内质网膜上的寡糖基转移酶的亚基Wbplp与蛋白Ostlp之间存在相互作用,而与蛋白Alg5p之间不存在相互作用。
双诱饵系统（two-bait system）
双诱饵系统用2种诱饵结构（一种编码蛋白X1与LexA BD融合蛋白，另一种编码X2与λcl融合蛋白）分别与不同的DNA结合区域结合，激活2套不同的报告基因（一套报告基因为lacZ或LEU2，另一套报告基因为LYS2或gusA）来检测蛋白相互作用。
双诱饵系统可以同时检测、区分2个蛋白，该性质已被用于检测能与较大蛋白上特定
基序相互作用的小分子及肽段。双诱饵系统还可以在1次试验中同时用2种诱饵蛋白快速筛选文库；同时还能用于筛选那些破坏蛋白之间相互作用的蛋白或其他小分子。这些性质使得双诱饵系统可以用于评价药物对蛋白质相互作用的破坏能力。
三杂交系统
两个蛋白之间通过第三者发生相互作用。第三物可以是蛋白质、小分子或RNA。
依赖于蛋白质的三杂交系统有3种情况:
①两个蛋白A和B之间的接触由于第三蛋白Z而稳定和加强。Elion等发现酵母的两个信号传递蛋白Ste7和Ste 11，均与Ste5发生相互作用。缺失实验表明，它们与SteS的不同区域结合。使用Ste5菌株，含有LexAop-LacZ基因。在Ste5菌株中，B42-Ste11和LexA-Ste7的相互作用是很弱的。然而，Ste5的超表达使Ste11和Ste7的相互作用增强了6倍。这个实验也表明在没有Ste5存在的条件下，Ste11和Ste7也可以接触。
②蛋白A和B不直接接触，而是通过另一蛋白Z相互作用，Z称作桥蛋白。Wigler等发现信号传递蛋白RAS可以与RAF (RAS基因的一个下游影响因子)的N端相互作用，MEK(MAP激酶)与RAF的C端相互作用，并且二者通过RAF形成复合物。
③第三种蛋白Z的表达使蛋白A, B之间的相互作用更易于发生，而不是形成持续的稳定的三蛋白复合物。目前，这方面唯一的例子是基于酪氨酸的磷酸化。Kochan等利用酵母三杂交系统，研究了酪氨酸磷酸化的作用。在这个系统中，除了诱饵和猎物外，还转化了表达酪氨酸蛋白激酶Lck的质粒，SHIP被磷酸化后，可以与Shc和Grb2发生作用。
通过小分子(配体)相互作用的三杂交系统，小分子与其受体的相互作用不仅是许多生物学过程的基础，而且在医学领域有重要的价值。Licitra等利用FK506与地塞米松杂合分子，将与LexA-BD融合的糖皮质激素受体及杂合分子作为诱饵，用于筛选与AD融合的Jurkat cDNA文库，分离了与FK506结合的蛋白FKBP12。
通过RNA的三杂交系统，RNA与蛋白质的相互作用是某些生命活动的基础，如转录、mRNA的剪切及RNA病毒与宿主之间的作用等。Wichens等提出了分析RNA与蛋白相互作用的方法。在这个系统中，与AD融合的蛋白是一个具有RNA结合域的蛋白(如细菌MS2)，能够与RNA分子的臂-环结构结合；RNA除具有臂-环结构外，还有诱饵序列(test)。这样RNA分子与DB-蛋白复合物构成了双杂交系统中的诱饵，它结合于报告基因的上游；第3个分子是AD-蛋白，如果该蛋白识别诱饵序列test并结合，则报告基因转录。该系统用于确定识别目的RNA的蛋白质的RNA结合域，也可以研究被已知蛋白质识别的RNA序列。利用这个系统成功地发现了许多RNA与蛋白质之间的相互作用。包括铁离子调节蛋白与铁反
应元件的结合.HIV翻译激活因子Tat与Tar反应元件RNA序列的结合等。
反向酵母双杂交系统(reverse two-hybrid system)
国外学者试图利用在同一个配偶体(如作用缺陷等位基因)中的顺式突变体，或是一些反式作用分子如解离蛋白、多肽及其它小分子等，使己存在的相互作用解离或减弱，从而对其功能进行研究。对于大规模文库的选择、等位基因的功能及一些小分子的作用等问题，可以通过一种遗传性筛选，这种筛选是基于解离蛋白质间的相互作用而产生选择优势。在这种情况下就产生了逆向双杂交系统。该系统的核心在于构建一种反向筛选的报告基因，在这一倒转的双杂交系统中，野生型BD-X/ AD-Y间的相互作用激活一种毒性标志作为报告基因，对酵母宿主是毒性或致死性的，即所谓的阴性筛选，在此情况下BD-X/ AD-Y作用的解离赋予酵母一种选择生长优势。利用这种方法能够方便地鉴定作用缺陷等位基因、解离肽或相关的小分子物质。不同的毒性报告基因均可提供阴性筛选，它们包括URA3和CYH2等。酵母URA3基因产物一方面为合成尿嘧啶所必须，同时又能催化5-FOA（5-氟乳清酸）转变为毒性物质，由于URA3即可作为阴性筛选标志(在含有5-FOA的培养基中)，又可作为阳性筛选标志(在不含，FOA的培养基中)，所以应用得更广泛。可诱导的逆向双杂交报告基因SPAL；UAR3由以下成分组成，很低水平表达的顺式抑制序列、一个Gal4p结合位点，它们被融合到同一个启动子下。另外，在同一个启动子下，含有Lex A结合位点的其它报告基因也是可以的。在含有这类报告基因的酵母中野生型相互作用赋予细胞5-FOA敏感表型。在另一体系中，GAL1启动子下游使用了CYH2选择标志。此时野生型相互作用赋予酵母细胞放线菌酮(环己酰亚胺)敏感表型。
在其他逆向双杂交策略中，双杂交产生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，从而抑制阳性筛选标志His 3的表达，此时野生型相互作用使宿主细胞表现为组氨酸营养缺陷型。上述不同的毒性报告基因各有其特点，但在应用中哪一类更具优势则有待进一步研究比较。
酵母逆向双杂交系统不但能筛选突变株和作用缺陷等位基因以获得蛋白质结合信息,而且能够发现可导致已知蛋白质之间特异相互作用发生解离的肽类或其它小分子物质。该系统大大拓宽了传统双杂交体系的应用范围, 近年来已在很多研究领域中得到了广泛应用。
单杂交系统(one-hybrid system)
最早由双杂交系统改造而来的新系统是单杂交系统。单杂交系统省略了双杂交系统中bait- BD蛋白杂交体，代之以具有蛋白重要结合位点的DNA。可利用DNA序列捕获具有与之特异结合的结构域的蛋白质。在该系统中，诱饵是报告基因一段特定的上游序列。将蛋白质Prey与AD融合后直接与基因组中DNA结合序列(如UAS)结合,从而诱导报导基因的转
录。这个系统的作用在于研究蛋白质Prey与DNA序列之间是否存在相互作用。
该体系最适于研究参与基因转录和复制的蛋白质。可用于确定已知DNA-蛋白质之间相互们用；获取能与顺式们用元件结合的反式作用因子；准确定位蛋白的DNA结合结构域以及结合的核酸序列。
Li等用此方法研究酵母DNA复制起始复合物。将DNA复制起始序列ACS与报告基因LacZ连接，用来筛选杂交表达文库(即与AD融合的蛋白文库)，发现并分离了酵母ORC6, DNA复制复合物蛋白之一。
Wei等采用酵母单杂交体系确定了特异性结合于海胆胚胎孵化酶(SpHE)基因调控区域的反式作用因子SpEst4。
酵母单杂交系统灵敏性高，可直接获得与DNA特异结合的蛋白质的基因序列。与双杂交系统类似，也同样会出现假阳性和假阴性的问题，有待进一步完善。
3. 1哺乳动物双杂交系统(mammalian two-hybrid system)
由于酵母是一种较低等的生物，蛋白质的翻译后修饰(糖基化、二硫键的形成等)程度很低。因此，要进一步研究蛋白产物的生物学功能，还必须建立高等生物体系的双杂交系统。
近几年来己建立了哺乳动物双杂交系统，酵母细胞中不能完成的某些蛋白产物修饰过程得以弥补，使蛋白间作用更接近体内实际情况。该系统可选择多种细胞系研究蛋白间相互作用，蛋白质接近其自然状态，翻译后修饰，如糖基化，磷酸化，甲基化保持较好。因为此系统能更好地模拟细胞内环境，因而利于探明蛋白相互们用的机制。
目前，哺乳动物双杂交系统采用单纯疱疹病毒VPl6的AD区段。中国地鼠卵巢细胞（CHO）、非洲绿猴肾(COS)等细胞是较成熟的哺乳细胞宿主。除表型筛选外，测定放线菌酮乙酰转移酶活性来鉴定蛋白间结合程度成为常规手段。用氯霉素乙酞转移酶为报告基因，其活性可以在细胞提取物中检测。典型的实验是将编码诱饵蛋白和猎物蛋白的基因克隆到相应的载体上，采用磷酸钙共沉淀转化入Hela等哺乳动物细胞培养，当诱饵蛋白和猎物蛋白发生相互作用时，可以转录，通过对报道基因的表达产物检测，可以显示出诱饵蛋白和猎物蛋白的相互作用水平。目前，该方法主要用于检验己知蛋白的相互作用。
酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的 结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113 个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而 转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不 能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只 有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细 胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建 成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱 饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立 为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂 交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活 报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性 原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只 有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备， 并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基 的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别
目录 （一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs
酵母双杂交系统原理 https://www.doczj.com/doc/8818308076.html, 2005-6-5 16:04:32 来源：丁香园 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
酵母双杂交系统及其应用 Y east Two-hybrid System and Its Application 1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生物学特性 （1）单细胞真核生物 尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。 （2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少； 1996年已完成酵母全基因组测序（ 1.5 x 107 bp），是第一个被测序的真核生物。大约有6000个基因。目前已经建立了一个6000个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。其中5000多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。 （3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖 在指数生长期每90分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。 （4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析 酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。 有两种单倍体细胞类型，分别为a型和α型。在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/α双倍体细胞。在营养匮乏时，a/α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。 一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒 bud，芽, 蓓蕾starvation，饥饿, 饿死 ascus，n.[微生物]子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂 haploid，n.[生物]单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的 diploid，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体 ascospore，n.[植]囊孢子 rupture，v.破裂, 裂开, 断绝(关系等), 割裂。n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂 spore，n.孢子vi.长孢子germinate，v.发芽, 发育, 使生长
酵母双杂交系统的发展和应用 随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY 载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了 酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。 基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
. 酵母双杂交系统原理(Yeast Two-hybrid System) 生物谷谷友：jnulynn提供
a genetic assay for detecting protein-protein interactions X Y Suppose we have two proteins... One way of answering this question is to use the yeast two hybrid method. To understand the method we must first consider how gene expression is regulated in yeast...... and the question, do these two protein bind each other?
Regulation of gene expression in yeast g e n e U A S (u p s t r e a m a c t i v a t i o n s e q u e n c e ) t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r D N A b i n d i n g d o m a i n a c t i v a t i o n d o m a i n t r a n s c r i p t i o n m a c h i n e r y and now back to the question... a genetic assay for detecting protein-protein interactions
酵母双杂交技术的研究与应用 摘要：酵母双杂交系统是在20世纪90年代初发展起来的利用遗传学方法在酵母真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的一种高度灵敏的分子生物学技术，它可以有效分离新基因或新的能与一种已知蛋白相互作用的蛋白质及其编码基因，被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域，已成为分子生物学研究领域的重要实验手段之一，获得了许多有价值的重要发现。 关键词：酵母双杂交系统；蛋白质组学；功能基因组学Abstract:Yeast two-hybrid system is a highly sensitive molecular biology technique,which uses genetic methods to study protein-protein interaction in eukaryotic yeast cells,developed in the early 1990s.It can effectively separate new genes or new protein which has interaction with a known protein and protein-coding genes, is widely used in the field of proteomics, cellular signal transduction and functional genomics, has become one of the important experimental methods in the molecular biology areas, gained a lot of valuable important discovery. Key words:Yeast two-hybrid system;Proteomics;Functional Genomics.
酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
酵母双杂交系统及其应用 Yeast Two-hybrid System and Its Application 1. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生物学特性 （1）单细胞真核生物 尽管酵母细胞比较简单，但它们具有所有真核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的细胞核、多条线性染色质包装成染色体、细胞质包含了全部的细胞器和细胞骨架结果（如肌动蛋白纤维）。 （2）与其它真核生物相比，它们的基因组较小，基因数目也较少； 1996 年已完成酵母全基因组测序（1.5 x 10 7 bp ），是第一个被测序的真核生物。大约有6000个基因。目前已经建立了一个6000 个菌株的文库，每一个菌株中只删除了一个基因。其中5000 多株在单倍体状态时能够存活，表明大多数酵母基因时非必需的。 （3）易于培养和操作,可以在实验室快速繁殖 在指数生长期每90 分钟繁殖一代，从单个细胞可以繁殖称克隆群体。 （4）单倍体和双倍体的存在使酿酒酵母便于进行遗传分析 酿酒酵母可以以单倍体状态和双倍体状态生长。单倍体和双倍体之间的转换是通过交配和孢子形成来实现的。 有两种单倍体细胞类型，分别为a 型和α型。在一起生长时，这些细胞因交配而形成a/ α双倍体细胞。在营养匮乏时，a/ α双倍体发生减数分裂，产生一个子囊的结构，每个子囊含有4 个单倍体孢子（两个a－孢子和两个α－孢子）。但当生长条件改善时，这些孢子可以出芽并以单倍体细胞的形式生长或交配而重新形成双倍体。一个酵母细胞可同时兼容几种不同质粒bud，芽, 蓓蕾starvation ，饥饿, 饿死ascus，n.［微生物］子囊meiosis，n.减数分裂, 成熟分裂 haploid，n.［生物］单倍体, 仅有一组染色体的细胞adj.单一的diploid ，adj.双重的, 倍数的, 双倍的n.倍数染色体ascospore，n.［植］囊孢子rupture，v.破裂, 裂开, 断绝（关系等）, 割裂。n.破裂, 决裂, 敌对, 割裂 germinate，v.发芽, 发育, 使生长 spore，n.孢子vi. 长孢子
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术 1 基因组文库的构建 基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 1. 1构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb） 1.2 基因文库构建的一般步骤 1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。 1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。
噬菌体载体构建基因组文库
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建 cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 2.1高质量mRNA的制备 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
酵母双杂交 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立i 。 典型的真核生长转录因子，如GAL4 GCN4等都含有二个不同的结构域：DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。 基本原理 二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而 且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白—蛋白的相互作用。主要有二类载体：a 含DNA -binding domain 的载体；b 含DNA-activating domain 的载体。 上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读 框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱 动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequenee)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用bin di ng-doma in 基因有：GAL4(1-147); LexA (E coli 转录抑制因子)的DNA-bd 编码序列。常用的activating-domain 基因有：GAL4(768-881)和 疱疹病毒VP16的编码序列等。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点：〈1〉易于转化、便 于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。 〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA-结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd);另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活
蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4 LexA DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。cDNA 文库或DNA 与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示： 图一：酵母双杂交系统工作原理 Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA
模块七蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2. 实验原理 1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与），提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：（1）检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5）通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先，经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制，因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成，还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。 现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TA TA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地使用HIS3报告基因，一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，可以作用于相应的底物
模块七蛋白质之间的相互作用 1.实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母双 杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2.实验原理 1989 年Fields 和Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认 识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与,提出并建立了酵母双杂交系 统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平 台 ,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1 检测在真核活细 胞内进行 ,在一定程度上代表细胞内的真实情况。(2 作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3 检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互 作用。(4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库 ,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。(5 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先 , 经典的双杂交系统分析蛋白间的 相互作用定位于细胞核内,因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的 初期阶段 ,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表 达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活 转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA 结合结构域融合蛋白在 无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白
LexA酵母双杂交系统简介 一、LexA酵母双杂交系统的设计原理 报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。 质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。 质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。 根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。 如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。 二、商品化酵母双杂交系统的组成 1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库 2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株） 3. 大肠杆菌菌株： KC8株 4. 对照质粒：
20世纪80年代中、后期，真核转录因子得到大量深入的研究，这类研究促成了酵母双杂交系统的诞生。研究发现，真核转录因子的DNA结合区（BD）和转录结合区(AD)在功能上和实质上都是可分的。BD能把蛋白定位到基因组特定DNA序列上，AD能够使转录装置激活基因转录。1985年研究证明，将2种不同蛋白的BD与AD重组，仍能产生有活性的转录因子。后来，一些研究人员发现AD与BD不必在1条多肽上。当这两个区域单独存在时均没有转录激活功能，但当它们在空间上彼此联系时，则能够激活基因转录。Fields和Song证实利用这一特性建立了酵母双杂交系统。 酵母双杂交的原理：将2个目的蛋白分别与AD和BD融合产生新的融合蛋白，如果这2个目的蛋白能够互相作用，则该相互作用会促使AD和BD互相靠近而产生有活性的转录因子，进而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。 Gal4和LexA系统：Gal4和LexA系统均是依赖转录激活报告基因来检测蛋白相互作用的。 Gal4和LexA系统可用于 1、检测2个已知蛋白间的相互作用 2、从表达文库中筛选相互作用蛋白 3、用于鉴定蛋白相互作用区域 造成假阳性的原因有很多，归纳起来主要有以下几点 1、诱饵蛋白本身有激活作用； 2、靶蛋白本身就比较“黏”，不需诱饵蛋白的介导便可与报告基因的上游激活序列有直接作用，进而激活报告基因的转录；或者，靶蛋白同启动子区域上结合的其他蛋白质（而非诱饵蛋白）发生了相互作用，导致转录激活； 3、不在细胞同一时相、同一组织表达的蛋白质，相互之间也可能发生作用，尽管如此，这种相互作用是机械的而不是生理意义上的 4、还有一些假阳性结果产生的途径尚不能解释 假阴性的成因主要有： 1、Gal4和LexA系统要求被测蛋白定位于细胞核，然而有些蛋白却有强疏水结构域，还有些蛋白携带定位于细胞其他细胞器的强信号，这样，涉及后2类蛋白的相 互作用在Gal4和LexA系统中就检测不到 2、Gal4和LexA系统依赖转录激活报告基因而检测蛋白相互作用，而如果蛋白是抑制基因表达的，报告基因就不能被激活转录，双杂交系统就检测不到该蛋白相互作用了。 正是为了解决，Gal4和LexA系统这些固有的问题，以下系统才得以发展： 酵母双杂交系统常用的DNA结合结构域有GAL4和LexA，常用的转录激活结构域有GAL4、VP16或B42。 酵母菌株：为双杂交系统而改造的酵母菌株包含不同拷贝的上游激活序列。菌株L40多用于Lex40系统，该菌株lacZ报告基因（编码B-半乳糖苷酶）上游包括8拷贝的上游激活序列。菌株HF7c一般用于基于GAL4的酵母双杂交分析，在lacZ报告基因的上游只有3拷贝的GAL4上游激活序列。 酵母双杂交系统的报告基因通常由一些营养选择标记（如HIS3基因的转录激活能使酵母在缺乏组氨酸的培养基上生长）或编码酶的基因（MEL1基因的转录激活能使酵母产生a-半乳糖苷酶）组成。 目前, 酵母双杂交系统及其衍生方法广泛用于研究蛋白- 蛋白之间的相互作用、蛋白与其它分子相互作用, 筛选未知蛋白, 研究蛋白的功能等领域。利用它已揭示了大量未知蛋白质的相互作用。现在该系统已经尝试在药物机理研究方面的应用, 且有望用于研究蛋白质多复合
?技术与方法? 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期 生物大分子间的相互作用是有机体细胞活动的基础，在蛋白质层面上揭示生命活动本质是现代生物学的一个主要目标。1989年诞生的酵母双杂交（Yeast two -hybrid，Y2H）系统以及随后出现的各种衍生系统是研究蛋白质之间以及蛋白质和RNA、小分子化合物之间相互作用的最重要的工具，已成功揭示了大量的蛋白相互作用，在细胞信号转导、蛋白质组学、病理学、药物研发等方面有着广泛应用［1］。本文对Y2H 系统的基本原理、衍生系统和应用进展等方面进行介绍。 1 酵母双杂交系统的原理 酵母GAL4转录因子由两个可以分开的结构域组成：DNA 结合域（DNA binding domain，BD）负责结合基因的上游激活序列，将转录激活域（Transcriptional activation domain，AD）募集到启动 收稿日期：2013-08-03基金项目：特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室开放基金项目（2013K04）作者简介：黄欣媛，女，博士，研究方向：生物化学与分子生物学；E -mail ：huangxycn@https://www.doczj.com/doc/8818308076.html, 酵母双杂交及其衍生系统 黄欣媛1 范红波2 （1.湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，孝感 432000；2.湖北职业技术学院，孝感 432000） 摘 要： 酵母双杂交系统是一种研究蛋白质相互作用的分子生物学方法，过去20多年里，大量衍生系统的出现使得这套双杂交技术体系更加完善和高效，成为研究蛋白质-配体相互作用的重要技术手段，广泛应用于功能基因组学、蛋白质组学、病理学等研究领域。对酵母双杂交及其衍生系统的基本原理和应用进展进行综述。 关键词： 酵母双杂交系统 蛋白质相互作用 双杂交技术体系 The Yeast Two -Hybrid System and Its Several Derived Systems Huang Xinyuan 1 Fan Hongbo 2 （1. Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables ，Hubei Engineering University ，Xiaogan 432000；2.Hubei Polytechnic Institute ，Xiaogan 432000） Abstract: The Yeast two -hybrid（Y2H）system is a molecular biology approach to detect protein -protein interactions. A diverse series of technologies derived from it have emerged in the past 20 years, which makes this two -hybrid methodology system more complete and efficient. They have been among the most important and powerful tools to study ptotein -ligand interactions that widely used in functional genomics, proteomics and pathology study. This article provides an overview on the basic principles and application progress of Y2H system and some derived techniques. Key words: Yeast two -hybrid（Y2H）system Protein -protein interaction Two -hybrid methodology system 子区域从而激活基因的转录。两者分开时不能激活基因转录，只有BD 和AD 通过一定方式在空间上足够靠近，才能发挥完整的GAL4转录因子活性。基于此特点，Fields 和Song ［2］设想以一对能相互作用的蛋白质为桥梁，将空间上分开的BD 和AD 彼此拉近，从而重建出具有活性的转录因子，以此创立了Y2H 系统。在该系统中，将BD 和AD 基因分别和诱饵蛋白（Bait）和猎物蛋白（Prey）基因构建成融合蛋白表达载体，使其在酵母中共表达出BD -Bait 和AD -Prey，借助Bait 和Prey 的物理性相互作用使BD 和AD 相互靠近而产生具有功能的转录因子，进而激活1个或多个报告基因（如lacZ 、HIS3和URA3等）的转录。 2 酵母双杂交系统的衍生系统 Y2H 系统是在酵母菌这种真核细胞环境中研究