警示：在我们的手册中介绍的实验可能具有潜在的危险性，要求操作人员具有相当的安全训练、特殊装备、以及相关安全部门的监督。作为实验操作员的你承担全部的责任、义务和由于实施安全步骤和措施带来的危险。麻省理工大学没有责任、义务或承担由于实施本材料中内容所引起的危险。法律声明
β-半乳糖苷酶（LAC Z）酶活测定
1. 在冰上解冻样品，同时准备裂解液（见下面关于裂解液样品的收集和准备的注意事项）。
2. 准备若干(至少每个样品3个和空白一支)透明的塑料比色皿，每支装有500μl的碳酸钠
终止液。你可以在比色皿上标明测试样品的名称和使用的时间。
3. 在微量离心试管中加入如下试剂：
400μl 磷酸钠盐缓冲液（pH 7.5）
133μl ONPG溶液
6μl 镁离子溶液
4. 把反应混合物放置在37°C的水浴中或者加热垫上预温育。
5. 一旦预热后，加入如下物质：
60μl 细胞萃取物
比较明智的做法是同时做阴性对照，即用抽提物或不表达β-半乳糖苷酶的细胞抽提物代替前述的细胞抽提物。
6. 留心观察每个反应试管里黄色（o-硝基酚）的出现，在适当的时间点，从每种反应混合
物中等量移取100μl的溶液，把它加到装有碳酸钠终止液的比色皿中。
7. 当完成所有时间点测定后，在420 nm处测光密度，记录吸光值，并且计算吸光值与时
间的斜率。斜率和β-半乳糖苷酶的活性成正比。注意：若在420nm处吸光值高于1.0，则不能采信。
8. 在计算其实际活性时，先制作o-硝基酚标准曲线图，然后根据样品的吸光值在曲线上找
出对应的浓度。一个酶活力单位是指酶在37oC每分钟可催化产生1 μmol的o-硝基酚。
收集和裂解细胞的注意事项
细胞培养物的收集
1. 在适当的培养时间，取出1.6 ml的培养物放入微量离心管中，并把它置于冰上。
2. 迅速将1.6 ml样品在涡旋混匀器上振荡，然后移出100μl放入已装有900 μL新鲜培
养基的比色皿中。离心剩下的1.5ml样品，去掉上层清液，把沉淀迅速放在-80°C冷藏。
(注意：样品要在-80°C而不是-20°C冷藏保存)
3. 测量并且记录细胞培养物1：10稀释液的OD600值。（注意：OD600值将影响下一步中lac Z
酶活力的计算）
? P. L ESSARD 2002, 保留所有权利。
细胞裂解
1. 在冰上解冻沉淀。
2. 在374 μL B-PER? 细菌蛋白抽提试剂(Pierce product 78248)中重新悬浮细胞，再加入50ul
蛋白酶和磷酸化酶抑制剂以及细菌细胞提取物（Sigma 产品P8465;按厂家说明再生），1 uL 34 mg/mL的氯霉素（用甲醇配制），6 μL 10mg/ml裂解酶（用蒸馏水现配，当使用大肠杆菌时可以省略这一步）
3. 快速涡旋振荡一分钟。
4. 在冰上培育5分钟。
5. 此时，你就得到了可以用来检测lac Z酶活性的粗制裂解液，使用前面的方法，按照酶所
形成的产物的数量/每分钟每OD600单位来测定活力。（注意：对棒状杆菌和红平红球菌，这种方法是采用裂解法时的最好测定方法）
6. 对大肠杆菌样品，离心粗制溶解产物1min后放置于冰上。
7. 你现在得到的是清亮的溶菌液（上清液中的细胞碎片已被去除）。蛋白质浓度用Bradford
方法可以测定（另见蛋白质检测方案）。在清澈溶菌液中使用前面所介绍的方法检测lacZ 酶活力，按每分钟每mg蛋白质所形成的nmol产物来测定。（注意：在测定酶活力的时候，用酶活力/mg蛋白质比用酶活力/OD600更恰当）
磷酸缓冲液（50 ml）10mg/mL裂解酶（1ml）
49.6 ml蒸馏灭菌水（若使用棒状杆菌和红平红球菌）
0.108 g NaH2PO4 10
mg
裂解酶
0.528 g Na2HPO4 加蒸馏水至1ml
过滤或高压灭菌 现配并于冰上保存
ONPG溶液(10 ml) 用于细胞抽提的蛋白磷酸化酶抑制剂
10ml磷酸钠缓冲液 Sigma 产品 P8465
0.04g o-硝基-?-D-吡喃糖苷 按厂家说明配制
过滤消毒并等份装于1ml容器中, -20oC保存 提前准备并等份装于200ul容器中，-80oC保存
镁离子溶液(1 ml) 34 mg/ml 氯霉素液 10 ml
610 ul dH2O 340 mg 氯霉素
290ul?－硫基乙醇 加甲醇到10ml
100ul1M MgCl2 提前准备上述试剂并等份装于1 ml的容器中，
保存于-20oC
0.4 M Na2CO3（终止液）500 ml
21.2g Na2CO3B-PER?细菌蛋白抽提试剂
加蒸馏水到500 ml 打开开袋即用产品78148，500ml
提前准备上述试剂,于室温贮藏
C.P. L 2002. 保留所有权利。
货号：QS2614 规格：50管/24样α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase,α-GAL）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。 测定原理： α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 第1页，共2页
Genistein protects against UVB-induced senescence-like characteristics in human dermal?broblast by p66Shc down-regulation Yi Na Wang a,1,Wei Wu b,1,Hong Chao Chen a,Hong Fang a,* a Department of Dermatology,1st Af?liated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,79#Qing Chun Road,Hangzhou310003,China b State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Disease,First Af?liated Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou310003,China 1.Introduction It has been noticed that the appearance of facial wrinkling in the Asian population is delayed for about10years when compared to the Caucasian population.The pattern and degree of facial wrinkling is different as well.There are many factors contributing to this difference,such as lifestyle,genetic background,and nutrition.The Asian diet is well known for being rich in soy or soy- containing products and the estrogen-like compounds in soy protein,along with their antioxidant activities,are regarded as potential weapons against the aging process. Iso?avones,a group of polyphenolic compounds found in and isolated from a number of plants,with soybeans and soy products like tofu and textured vegetable protein being the primary food source,have attracted a great deal of interest,especially for possible properties in the prevention and treatment of cancer and chronic disease including cardiovascular diseases and diabetes mellitus[1,2].Recent studies further suggested that iso?avones might act as a photoprotection and inhibit the initiation and promotion of skin carcinomas[3]. One of the main iso?avones is genistein.Genistein has been reported to modulate molecular functions mainly by acting as a tyrosine kinase inhibitor[4].Also genistein has anti-oxidation and anti-angiogenesis effects as well as estrogenic activities[5].Previous evidences have suggested that genistein down-regulates UVB- induced signal transduction cascades in carcinogenesis and confers photo-protective effect in SKH-1murine skin and in human reconstituted skin[6,7].Recent studies revealed that genistein prevent UV-induced photoaging and photodamage in human skin[8].However,although studies have been reported on the Journal of Dermatological Science58(2010)19–27 A R T I C L E I N F O Article history: Received4July2009 Received in revised form9February2010 Accepted10February2010 Keywords: Genistein Photoaging UVB p66Shc FKHRL1 A B S T R A C T Background:Genistein,as an active compound of dietary antioxidants,has shown considerable promise as an effective agent against aging process.However,the effect of genistein on skin photoaging and the associated mechanism remain unclear. Objective:To delineate the effect of genistein on UVB-induced senescence in human dermal?broblasts (HDFs)with emphasis on the mechanism of oxidative pathway regulated by p66Shc involved in the events. Methods:HDFs were induced to premature senescence by repetitive subcytotoxic doses of UVB irradiation.Cellular apoptosis and DNA cell cycle were analyzed using?ow cytometry.Intracellular levels of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)were detected by ELISA.Mutation levels of two large deletions of mitochondrial DNA,4977bp and3895bp deletion,were determined by quantitative PCR.Western blot was applied to detect the expression and activation of p66Shc(the66- kilodalton isoform of the growth factor adapter Shc)and FKHRL1(a forkhead protein that is intimately linked with intracellular oxidation). Results:Strong activity of senescence-associated beta-galactosidase(SA-b-gal),high percent of cell apoptosis as well as cell cycle arrest in G0/G1phase,and increased intracellular oxidative stress were observed in HDFs irradiated by UVB.Genistein exerted dramatically protective effects on HDFs in a dose- dependent manner.Elevated copy numbers of large deletions in mitochondrial DNA were also inhibited by genistein.Down-regulation of total and phosphorylated p66Shc on Ser36,as well as FKHRL1and its phosphorylation on Thr32,were observed after genistein treatment. Conclusion:The results indicate that genistein protects UVB-induced senescence-like characteristics in HDFs via maintenance of antioxidant enzyme activities and modulation of mitochondrial oxidative stress through down-regulation of a p66Shc-dependent signaling pathway,which may provide potential prevention against skin aging and even photoaging. ?2010Japanese Society for Investigative Dermatology.Published by Elsevier Ireland Ltd.All rights reserved. *Corresponding author.Tel.:+8657187236340;fax:+8657187236385. E-mail addresses:hongfangzy@https://www.doczj.com/doc/df7722886.html,,tango654321@https://www.doczj.com/doc/df7722886.html, (H.Fang). 1These authors contributed equally to this work. Contents lists available at ScienceDirect Journal of Dermatological Science j o u r n a l h o m e p a g e:w ww.e l s e v i e r.c o m/j d s 0923-1811/$36.00?2010Japanese Society for Investigative Dermatology.Published by Elsevier Ireland Ltd.All rights reserved. doi:10.1016/j.jdermsci.2010.02.002
α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)使用说明 货号：G8820 规格：1g/5g 级别：BR 其他名称：α-D-葡萄糖苷酶;α-葡糖苷酶 CAS号：9001-42-7 提取来源：黑曲霉 产品简介： α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase，EC 3.2.1.20）又被称为α-葡萄糖苷水解酶或葡萄糖基转移酶（GTase），是一种α-D-葡萄糖苷酶。它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1,4-糖苷键释放出葡萄糖，或将游离的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成α-1,6-糖苷键，从而得到非发酵性的低聚糖。α-葡萄糖苷酶来源广泛，在人体糖原的降解和动植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。α-葡萄糖苷酶广泛应用于食品和发酵工业、化学工业以及医学应用等行业。 酶活定义： 每小时产生1μg葡萄糖所需的酶量定义为一个α-葡萄糖苷酶活力单位。 酶活检测方法：参见QB2525-2001。 产品特性： 酶活力：300000U/g 最适作用温度：50℃，合适的作用温度：50-55℃。 最适作用pH：5.0，合适的作用pH：4.8-5.4。
外观：淡白色粉末或淡黄色液体，分子量约为68.5KD，无臭无味，溶于水，不溶于乙醚和乙醇。 用途： 生化研究。能水解葡萄糖苷(Glucoside)成葡萄糖和其他组成物质，是一种具有生物催化剂功能的蛋白质。本产品的建议添加量为800U/g干物质，根据实际情况改变添加量。 抑制剂： 铜、钛、钴等金属离子对本品有一定的影响。铅、铝、锌等金属离子对本品有较强的抑制作用。 贮存： 建议密封储藏于干燥、低温的环境中（≤25℃），最好在冷藏条件下（4-8℃）储藏。25℃以下，液体可以储存3个月，保质期内酶活不会降低于产品标示的活力；4℃以下，可较长时间储存。
β-葡萄糖苷酶的研究 1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。 β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candida peltata)、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝和猪小肠等。鉴于β-葡萄糖苷酶的研究广泛，本文对其一些研究进展进行讨论。 1 β-葡萄糖苷酶的分类 β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为3类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。 2 β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法 2.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法 不同来源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。pH值一般选用酶的稳定pH值；提取温度适于低温，一般为4 ℃。利用微生物发酵法生产β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。对于胞外酶来讲，发酵液即为粗酶液；对于胞内酶，则需对微生物进行细胞破碎，使其释放出β-葡萄糖苷酶。 2.2 β-葡萄糖苷酶的纯化方法 粗提的β-葡萄糖苷酶可采用硫酸铵沉淀或用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀等方法初步分离。β-
β-葡萄糖苷酶测定试剂盒使用说明 分光光度法50管/24样货号：BC2560 产品简介： β-GC（EC3.2.1.21）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化β-糖苷键水解，具有多方面生理作用：在纤维素的糖化作用中，β-GC负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖；β-GC水解萜烯类香气前驱体，使糖苷键合态变成游离态。从而产生香味；β-GC能够水解植物体内野黑樱苷，释放HCN，从而防止昆虫取食。 β-GC分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GC活性。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容： 提取液：液体50ml×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入10ml双蒸水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体25ml×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体80ml×1瓶，4℃保存。 标准品：液体×1支，取1.5ml EP管加入1ml，5mol/ml的对硝基苯酚溶液。 操作步骤： 一、样品的前处理：
1.细菌或培养细胞： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2.组织： 按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml 提取液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、标准样品的准备：取100μL标准液，加入到400μL试剂三中，得到1mol/ml标准液，十倍稀释到100nmol/ml，倍比稀释：50、25、12.5、6.25nmol/ml，稀释液用试剂二。100、 50、25、12.5、6.25nmol/ml做标准液。 二、测定步骤： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2.加样表 试剂名称（μl）对照管测定管标准管试剂一400 试剂二500500 样本100100 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min后，立即放入沸水浴中煮沸5min（盖紧，以防止 水分散失），流水冷却后充分混匀（以保证浓度不变） 试剂一400 充分混匀，8000g，4℃，离心5min，取上清液
β-半乳糖苷酶（β-gal）ELISA试剂盒使用方法本试剂盒仅供研究使用。 检测范围：96T 0.8 pg/ml -35pg/ml 使用目的： 本试剂盒用于测定微生物样本中β-半乳糖苷酶（β-gal）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中β-半乳糖苷酶（β-gal）水平。用纯化的β-半乳糖苷酶（β-gal）体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入β-半乳糖苷酶（β-gal），再与HRP标记的β-半乳糖苷酶（β-gal）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的β-半乳糖苷酶（β-gal）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中β-半乳糖苷酶（β-gal）浓度。 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 10分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 操作程序总结： 计算 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 注意事项
钠测定试剂盒（半乳糖苷酶法） 适用范围：本试剂用于体外定量测定人血清中钠离子的浓度。 1.1包装规格 液体双剂型 试剂1（R1)：60mL×4 ,试剂2(R2)：30mL×4 ,校准品：3mL×2（2个浓度）； 试剂1（R1)：60mL×2 ,试剂2(R2)：30mL×2 ,校准品：3mL×2（2个浓度）； 试剂1（R1)：40mL×2 ,试剂2(R2)：20mL×2 ,校准品：1mL×2（2个浓度）。 1.2主要组成成分 1.2.1 试剂1（R1）（液体） β-半乳糖酶（pH9.0）≥0.8U/L 硫酸铵 5.4mmol/L 1.2.2 试剂2（R2）（液体） ο-硝基酚基β-D-吡喃糖苷半乳糖（ pH9.0) 5.5mmol/L 1.2.3 校准品（液体） 在水基质中添加氯化钠，目标浓度（2个水平）：水平1：120mmol/L；水平2：170mmol/L。（每批定值，值有批特异性，详见值单） 2.1 外观 试剂盒中各组件的外观应满足：
2.1.1试剂1（R1)应为无色或浅黄色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损； 2.1.2试剂2(R2)应为浅黄色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损； 2.1.3校准品应为无色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损。 2.2 试剂空白吸光度 在波长405nm～420nm处（光径1cm），试剂空白吸光度（A）应≤1.000；试剂空白吸光度变化率（△A/min）≤0.150。 2.3准确度 测定锂、钠、钾、镁、钙、氯复合电解质冰冻人血清国家标准品（编号：360018），相对偏差应不超过±15%。 2.4分析灵敏度 对应于浓度为100mmol/L的Na所引起的吸光度变化率差值△A/min的绝对值应在0.200 ～0.600的范围内。 2.5重复性 重复测定高、中、低浓度样本，变异系数（CV）应≤3%。 2.6批间差 测定同一样本，批间差（R）应≤4%。 2.7线性范围 在[80,180]mmol/L检测范围内，线性相关系数（r）应≥0.9900，线性相对偏差应不超过±5%。 2.8试剂稳定性
β-半乳糖苷酶测定试剂盒使用说明 分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2580 规格：50管/24样 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体80mL×1瓶，4℃保存。 标准液：液体1ml×1支，4℃保存，10μmol/ml对硝基苯酚溶液。 产品说明： β-GAL(EC3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。 β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 自备用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤： 一、粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）； 15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织， 加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、标准液的处理：用试剂二将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml. 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管标准管 试剂一200 蒸馏水200 试剂二250250 样本5050 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min 标准液500 试剂三100010001000充分混匀，400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。
α-葡萄糖苷酶的研究综述 摘要：α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20 ) 因在淀粉加工上具有重要作用，其研究多年来一直受到重视。α-葡萄糖苷酶广泛存在于动物、植物和微生物体内，它可从非还原末端水解低聚糖和多聚糖的α-1,4-葡萄糖苷键，也能作用于淀粉的α-1,6-糖苷键，在高葡萄糖苷受体环境中还可催化转糖苷反应。研究表明α-葡萄糖苷酶在不同领域的开发和应用都具有很好的经济和社会效益。 关键词:葡萄糖苷酶淀粉水解转糖苷反应研究进展 生物技术和酶工程的飞速发展为开发淀粉水解酶提供了技术支持。淀粉水解酶( 包括转化酶) 是一类以淀粉或不同的糖源为底物，根据水解专一性不同，可将淀粉或糖原降解成不同的单糖、低聚糖和水解多糖的水解酶类。同时，有些酶还具有转化功能，通过分子内的转糖苷作用，改变低聚糖的糖苷键链接方式。淀粉酶是生物体内广泛存在的一种水解酶，主要作用于淀粉，如植物体内的淀粉消化、植物根系中淀粉积累、动物体内摄入淀粉的分解、微生物利用碳源等。特别是具有特殊性质和新的应用领域的酶在工业上具有很重要的作用，它们可广泛应用于食品和发酵工业、化学工业以及医学应用等。α-葡萄糖苷酶作为淀粉水解酶家族中的重要一员，对它的研究一直受到人们的高度重视，多年来α-葡萄糖苷酶在不同领域的应用均产生了很好的经济和社会效益。 1、α-葡萄糖苷酶的简介 α-葡萄糖苷酶(EC.3.2.1.20，α-Glucosidases) 为淀粉水解酶类中的一种，主要在细胞外起作用。它从多糖的非还原末端水解底物的α-葡萄糖苷键，产生α-D-葡萄糖，通常把它们归类于水解酶第3类,主要水解二糖、低聚糖、芳香糖苷，能以蔗糖和多聚糖为底物。同时， 它还具有转糖苷作用，可将低聚糖中的，α-1，4-糖苷键转化成α-1，6-糖苷键或其他形式的链接，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等。按一级结构可将α-葡萄糖苷酶归为水解酶13类的31家族。α-葡萄糖苷酶通常按底物专一性分为3个类型。Ⅰ型α-葡萄糖苷酶水解芳基葡萄糖苷如对--硝基苯酚α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG ) ，且水解速率比低聚麦芽糖快。Ⅱ型α-葡萄糖苷酶对麦芽糖具有高活性，而对芳基葡萄糖苷活性低。Ⅲ型α-葡萄糖苷酶与Ⅱ型类似，但它水解低聚糖和淀粉的速率基本一样。 2、α-葡萄糖苷酶来源及分布 α-葡萄糖苷酶在自然界分布广泛，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生物体内。目前已经进行研究的α-葡萄糖苷酶除少数来源于植物和动物外，绝大多数均来自于微生物中。细菌、霉菌及酵母菌等一些菌株能分泌此酶，其中产酶较多的是黑曲霉，市场上销售的α-葡萄糖苷酶产品大都为黑曲霉发酵生产所
β-半乳糖苷酶染色（组织） 检测原理： 一般认为绝大多数正常细胞仅有有限的分裂能力，在不能分裂后就进入衰老(senescence)状态。此时细胞仍然是存活的，但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变。衰老的细胞不能在一些常规的刺激下再诱导细胞分裂，并且衰老细胞的细胞周期分布也比较特殊，不同于一些损伤诱导的细胞休眠，也不同于细胞生长接触抑制的情况。衰老细胞通常体积变大，并表达在pH6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。细胞衰老也被认为是生物体抑制肿瘤的一种方式，同时也是生物体老化(aging)的一种潜在原因。由此以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物。从而在光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞。 操作步骤： （1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。 （2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。 （3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。 注：对于冷冻切片直接按照以下步骤进行。 （4）加入适当体积的β-半乳糖苷酶染色固定液，以充分盖住组织为宜，室温固定不少于 15min。 （5）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（6）加入适当量的染色工作液。 （7）37℃孵育过夜，最好把整个切片浸泡在染色工作液中。 注：37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。 （8）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。 （9）脱水：梯度酒精（由低到高）各5min → 二甲苯I 10min→ 二甲苯 II 10min。 （10）加上封片液封片后4℃可以保存较长时间。 （11）普通光学显微镜下观察。光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞。 注：所用试剂按照β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明配制。β-半乳糖苷酶染色试剂盒市面上有很多种，但检测方法几近相同，具体还是要参照相应的试剂说明书来操作。祝实验顺利！
β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase,β-GAL）试剂盒使用说 分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2580 规格：50管/24样 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： β-GAL(EC3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。 β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 自备用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞 数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组 织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管 试剂一200 蒸馏水200 试剂二250250 样本5050 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min 试剂三10001000 充分混匀，400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。 三、β-GAL活性计算： 标准条件下测定的回归方程为y=0.32x-0.0027；x为标准品浓度（nmol/mL），y为吸光值。 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。 β-GAL活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.32×V反总]÷(V样×Cpr)÷T =62.5×(ΔA+0.0027)÷Cpr
β-葡萄糖苷酶水解银杏黄酮糖苷的研究 伍毅1,王洪新1,2* (1.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学食品学院,江苏无锡214012;2.石河子大学食品学院,新疆石河子832003) 摘要采用β-葡萄糖苷酶水解银杏叶提取物(G BE),使糖苷型黄酮转化为苷元型黄酮。通过正交试验得出水解的最佳工艺参数,即温度40℃,酶浓度5×10-3m g/m l,pH值5.0下水解6h。由H P L C图谱可得该条件下水解的苷元得率9.08%,纯度68.24%。酶解产物中还部分保留了银杏内酯等活性成分,有利于保留银杏叶提取物的综合生物活性。 关键词银杏叶提取物;黄酮苷元;β-葡萄糖苷酶;水解 中图分类号Q946文献标识码 A 文章编号0517-6611(2008)01-00030-03 S tud y on H y dro ly z in g G in k go F la v on e G ly c o s id e w ithβ-g ly c o s ida se W U Y i e t a l(S ta te K ey L abo ra to ry o f F o od S cien ce an d T e chn o lo gy,S ch oo l o f F o od S cien ce&T ech n o log y,S ou th e rn Y an g tze U n ive rsity,W u x i,J ian gsu 214012) A b s tra c tβ-g lyco sidase w a s u sed to h yd ro ly ze th e ex tract fro mg in k go lea ves to tran s fo rmflavon e g lyco side in to flavon e a g lycon e.T h e op ti m umtech n o- log ica l pa ram e te rs o f h yd ro lys is w e re obta i n ed th rou gh o rth o gon a l expe r i m en t,w h ich w e re en zym e con cen tra tion o f5×10-3m g/m l an d pH v a lu e o f5.0, h ydro ly sis tem pe ra tu re o f40℃an d ti m e o f6h.It w as k n ow n from H P L C spectrog ramth a t th e ag ly con e y ie ld o f h ydro ly sis u nde r th is con d ition w a s 9.08%w ith pu r ity o f68.24%.In th e en zym o lys is p rodu cts,th e a ctive in g redien ts su ch a s g i n k go la cton e w e re a lso rese rved pa r tly,w h ich w as i nfa vo r o f re se rv in g th e syn th e sized b io activ ity o f g in k go lea ves ex tract. K e y w o rd s G in k go lea ve s ex tract;F la von e ag ly con e;β-g ly cos idase;H yd ro ly sis 银杏(G inkgo b iloba L.)属银杏科银杏属多年生落叶乔木,是冰川时期存活的孑遗植物之一,属我国特产植物,主产于河南、湖北等地,其种子、根、叶均可药用。银杏叶中含有丰富的黄酮类物质,,主要是由山奈酚、槲皮素以及异鼠李素等黄酮苷元与葡萄糖等单糖以O-糖苷键联接而成,具有广泛的药理作用,是极好的天然抗氧剂。现代研究表明,银杏黄酮被水解成苷元后清除人体氧自由基的生物活性要明显高于黄酮糖苷,黄酮苷元的效价是黄酮糖苷效价的7倍[1-2]。因此,改善黄酮的构型是提高银杏黄酮在人体内吸收率的重要途径。笔者采用生物酶法水解银杏黄酮,生成了具有更高生物活性的苷元型黄酮,而且具有环保、反应条件温和等优点。 1材料与方法 1.1材料银杏叶提取物(G BE),黄酮含量≥24%,由上海宝丰生物有限公司提供。β-葡萄糖苷酶由西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司提供。槲皮素标准品,纯度≥99.0%,由上海康九化工有限公司提供。 1.2 GBE的酶解工艺[3]称取5m gβ-葡萄糖苷酶,用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH值5.0)定容至100m l。然后,称取一定量的银杏叶提取物,适量甲醇溶解,加入缓冲溶液和酶,置于水浴锅中恒温水解,将水解液高速离心、过滤后,沉淀用无水甲醇溶解,再上旋转蒸发器以除去多余的溶剂,恒重后用10m l无水甲醇充分溶解得样液,0.45μm滤膜过滤后待测定。 1.3 总黄酮苷元的测定方法 1.3.1分析条件[4]。色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱(15 m m×6.0m m,5μm);柱温:30℃;流动相:甲醇∶水(0.5%磷酸)梯度洗脱;流速:1m l/m in;检测波长:368nm;进样量:10μl。1.3.2 计算方法。由文献可知,对照品溶液、换算因子的选用不同对测定结果的影响较小。同时,受对照品来源的限制,3种苷元的定量分析都可以用槲皮素标准物的标准工作 作者简介伍毅(1983-),女,四川通江人,硕士研究生,研究方向:食品功能性成分。*通讯作者。 收稿日期2007-08-21 曲线进行定量分析[5]。计算公式如下: C(%)=[(A1+A2+A3)×K+B]× V W ×100%(1) 式中,A 1 为槲皮素峰面积(m A u);A 2 为异鼠李素峰面积 (m A u);A 3 为山奈酚峰面积(m A u);K为槲皮素标准曲线斜率(m g/m l);B为槲皮素标准曲线截距;V为样品溶液体积(m l);W为样品重量(m g)。 1.3.3 槲皮素标准曲线的制作[6]。准确称取对照品槲皮素0.02g,置于100m l容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得槲皮素标准储备液(0.20m g/m l)。用移液管分别取槲皮素标准储备液 2.5、5、10、20、40m l,用无水甲醇定容至50m l容量瓶,得0.01、0.02、0.04、0.08、0.16m g/m l的标准溶液。分别取标准溶液和储备液进样10μl,测定峰面积。根据标准品的浓度和峰面积可得回归方程: y=7×10-5x-0.0058(2) r=0.99(n=5),线性范围为0.01～0.10m g/m l。 1.4 单因素试验影响酶解工艺效果的因素主要有时间、温度、酶浓度及pH值等[7]。该试验分别研究了不同因素对GB E酶解效率的影响。 1.5 最佳工艺参数的确定在单因素试验的基础上,为了进一步确定反应的最优条件以及影响因素的主次,采用正交试验设计方法进行优化[8]。表1为酶解试验正交试验因素水平表。 表1 酶解正交试验因素与水平 T a b le1 F a c to rs a n dle v e ls o f o rth o g on a l te s t fo r e n zym o ly s is 水平 L ev e l A(温度) T em pe ra tu re ℃ B(时间) T i m e∥h C(pH值) pHv a lu e D(酶浓度) E n zym e co n ce n tra t ion m g/m l 130540.025 240650.005 350760.010 2结果与分析 2.1 酶解单因素试验结果 2.1.1 酶解时间的选择。图1是固定酶解温度40℃,pH值 安徽农业科学,J ou rn a l o f A n h u i A g r i.S c i.2008,36(1):30-32责任编辑刘月娟责任校对马君叶