1.5 β—半乳糖苷酶粗酶液的提取
将菌株接种于产酶培养基中，30℃培养60h，过滤收集菌体，充分洗涤，加柠檬酸--磷酸氢二钠缓冲液（0.1mol/L，pH5.0）研磨，破壁菌液离心所得上清液即为粗酶液。
1.6 酶活力的测定
在试管中加入100μl邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷（ONPG），800μL 10.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，100μl酶液，混匀，50℃水浴中反应10分钟，加2ml 1mol/L终止反应，测定计算酶活力。
酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟分解ONPG，生成1μ mol邻硝基苯酚（ONP）所需的酶量为1个酶活力单位（U）。
1.2.1 酶活力的测定
以ο-NPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。酶活力单位定义为以ο-NPG为底物37℃保温酶解，每分钟释放出1μmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
β-半乳糖苷酶活测定采用Genstar 的β-半乳糖苷酶检测试剂盒法。在有β-半乳糖苷酶存在的条件下，无色的反应底物会转化生成黄色的硝基酚(o-nitrophenol)。向各管中加入一定量的反应终止液，离心测定420 nm 和550 nm 下的吸光度。
β-半乳糖苷酶活性单位数(U)=1000- (OD420 -1.7 OD550)/Time(min)×V(mL)×
1.5 酶活力测定方法
将pH6.5的磷酸缓冲液500μl和0.25%的ONPG 200μl加入比色管,在25℃的温度下温浴5min,加入适当稀释的粗酶液0.5ml,反应10min,加入800μl 5%Na2CO3终止反应,蒸馏水定容至10ml,用分光光度计420nm测定OD值,通过标准曲线方程计算酶活。
在上述条件下1ml粗酶液1min催化水解ONPG生成1μmol邻硝基苯酚(ONP)的量,定义为1U。
1.2培养基
初筛培养基：乳糖0.5%，硫酸镁0.007%，磷酸氢二钾0.01%，氯化钙0.004%，硫酸铵0.01%，琼脂1.5%，自然pH，每100mL培养基中加入20mg/mL X-gal溶液200μL；
复筛培养基：乳糖1.5%，蛋白胨1.0%，酵母浸膏0.3%，氯化钠0.1%，pH值7.0；
发酵培养基：乳糖3.0%，蛋白胨1.5%，酵母浸膏1.0%，氯化钠0.3%，pH值7.0。
货号：QS2614 规格：50管/24样α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase,α-GAL）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。 测定原理： α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 第1页，共2页
Genistein protects against UVB-induced senescence-like characteristics in human dermal?broblast by p66Shc down-regulation Yi Na Wang a,1,Wei Wu b,1,Hong Chao Chen a,Hong Fang a,* a Department of Dermatology,1st Af?liated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,79#Qing Chun Road,Hangzhou310003,China b State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Disease,First Af?liated Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou310003,China 1.Introduction It has been noticed that the appearance of facial wrinkling in the Asian population is delayed for about10years when compared to the Caucasian population.The pattern and degree of facial wrinkling is different as well.There are many factors contributing to this difference,such as lifestyle,genetic background,and nutrition.The Asian diet is well known for being rich in soy or soy- containing products and the estrogen-like compounds in soy protein,along with their antioxidant activities,are regarded as potential weapons against the aging process. Iso?avones,a group of polyphenolic compounds found in and isolated from a number of plants,with soybeans and soy products like tofu and textured vegetable protein being the primary food source,have attracted a great deal of interest,especially for possible properties in the prevention and treatment of cancer and chronic disease including cardiovascular diseases and diabetes mellitus[1,2].Recent studies further suggested that iso?avones might act as a photoprotection and inhibit the initiation and promotion of skin carcinomas[3]. One of the main iso?avones is genistein.Genistein has been reported to modulate molecular functions mainly by acting as a tyrosine kinase inhibitor[4].Also genistein has anti-oxidation and anti-angiogenesis effects as well as estrogenic activities[5].Previous evidences have suggested that genistein down-regulates UVB- induced signal transduction cascades in carcinogenesis and confers photo-protective effect in SKH-1murine skin and in human reconstituted skin[6,7].Recent studies revealed that genistein prevent UV-induced photoaging and photodamage in human skin[8].However,although studies have been reported on the Journal of Dermatological Science58(2010)19–27 A R T I C L E I N F O Article history: Received4July2009 Received in revised form9February2010 Accepted10February2010 Keywords: Genistein Photoaging UVB p66Shc FKHRL1 A B S T R A C T Background:Genistein,as an active compound of dietary antioxidants,has shown considerable promise as an effective agent against aging process.However,the effect of genistein on skin photoaging and the associated mechanism remain unclear. Objective:To delineate the effect of genistein on UVB-induced senescence in human dermal?broblasts (HDFs)with emphasis on the mechanism of oxidative pathway regulated by p66Shc involved in the events. Methods:HDFs were induced to premature senescence by repetitive subcytotoxic doses of UVB irradiation.Cellular apoptosis and DNA cell cycle were analyzed using?ow cytometry.Intracellular levels of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)were detected by ELISA.Mutation levels of two large deletions of mitochondrial DNA,4977bp and3895bp deletion,were determined by quantitative PCR.Western blot was applied to detect the expression and activation of p66Shc(the66- kilodalton isoform of the growth factor adapter Shc)and FKHRL1(a forkhead protein that is intimately linked with intracellular oxidation). Results:Strong activity of senescence-associated beta-galactosidase(SA-b-gal),high percent of cell apoptosis as well as cell cycle arrest in G0/G1phase,and increased intracellular oxidative stress were observed in HDFs irradiated by UVB.Genistein exerted dramatically protective effects on HDFs in a dose- dependent manner.Elevated copy numbers of large deletions in mitochondrial DNA were also inhibited by genistein.Down-regulation of total and phosphorylated p66Shc on Ser36,as well as FKHRL1and its phosphorylation on Thr32,were observed after genistein treatment. Conclusion:The results indicate that genistein protects UVB-induced senescence-like characteristics in HDFs via maintenance of antioxidant enzyme activities and modulation of mitochondrial oxidative stress through down-regulation of a p66Shc-dependent signaling pathway,which may provide potential prevention against skin aging and even photoaging. ?2010Japanese Society for Investigative Dermatology.Published by Elsevier Ireland Ltd.All rights reserved. *Corresponding author.Tel.:+8657187236340;fax:+8657187236385. E-mail addresses:hongfangzy@https://www.doczj.com/doc/c711078210.html,,tango654321@https://www.doczj.com/doc/c711078210.html, (H.Fang). 1These authors contributed equally to this work. Contents lists available at ScienceDirect Journal of Dermatological Science j o u r n a l h o m e p a g e:w ww.e l s e v i e r.c o m/j d s 0923-1811/$36.00?2010Japanese Society for Investigative Dermatology.Published by Elsevier Ireland Ltd.All rights reserved. doi:10.1016/j.jdermsci.2010.02.002
β-葡萄糖苷酶的研究 1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。 β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candida peltata)、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝和猪小肠等。鉴于β-葡萄糖苷酶的研究广泛，本文对其一些研究进展进行讨论。 1 β-葡萄糖苷酶的分类 β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为3类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。 2 β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法 2.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法 不同来源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。pH值一般选用酶的稳定pH值；提取温度适于低温，一般为4 ℃。利用微生物发酵法生产β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。对于胞外酶来讲，发酵液即为粗酶液；对于胞内酶，则需对微生物进行细胞破碎，使其释放出β-葡萄糖苷酶。 2.2 β-葡萄糖苷酶的纯化方法 粗提的β-葡萄糖苷酶可采用硫酸铵沉淀或用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀等方法初步分离。β-
叶绿体得提取 一、试剂配置 １、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用
α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)使用说明 货号：G8820 规格：1g/5g 级别：BR 其他名称：α-D-葡萄糖苷酶;α-葡糖苷酶 CAS号：9001-42-7 提取来源：黑曲霉 产品简介： α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase，EC 3.2.1.20）又被称为α-葡萄糖苷水解酶或葡萄糖基转移酶（GTase），是一种α-D-葡萄糖苷酶。它可以从低聚糖类底物的非还原末端切开α-1,4-糖苷键释放出葡萄糖，或将游离的葡萄糖残基转移到另一糖类底物形成α-1,6-糖苷键，从而得到非发酵性的低聚糖。α-葡萄糖苷酶来源广泛，在人体糖原的降解和动植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。α-葡萄糖苷酶广泛应用于食品和发酵工业、化学工业以及医学应用等行业。 酶活定义： 每小时产生1μg葡萄糖所需的酶量定义为一个α-葡萄糖苷酶活力单位。 酶活检测方法：参见QB2525-2001。 产品特性： 酶活力：300000U/g 最适作用温度：50℃，合适的作用温度：50-55℃。 最适作用pH：5.0，合适的作用pH：4.8-5.4。
外观：淡白色粉末或淡黄色液体，分子量约为68.5KD，无臭无味，溶于水，不溶于乙醚和乙醇。 用途： 生化研究。能水解葡萄糖苷(Glucoside)成葡萄糖和其他组成物质，是一种具有生物催化剂功能的蛋白质。本产品的建议添加量为800U/g干物质，根据实际情况改变添加量。 抑制剂： 铜、钛、钴等金属离子对本品有一定的影响。铅、铝、锌等金属离子对本品有较强的抑制作用。 贮存： 建议密封储藏于干燥、低温的环境中（≤25℃），最好在冷藏条件下（4-8℃）储藏。25℃以下，液体可以储存3个月，保质期内酶活不会降低于产品标示的活力；4℃以下，可较长时间储存。
β-葡萄糖苷酶测定试剂盒使用说明 分光光度法50管/24样货号：BC2560 产品简介： β-GC（EC3.2.1.21）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化β-糖苷键水解，具有多方面生理作用：在纤维素的糖化作用中，β-GC负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖；β-GC水解萜烯类香气前驱体，使糖苷键合态变成游离态。从而产生香味；β-GC能够水解植物体内野黑樱苷，释放HCN，从而防止昆虫取食。 β-GC分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GC活性。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容： 提取液：液体50ml×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入10ml双蒸水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体25ml×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体80ml×1瓶，4℃保存。 标准品：液体×1支，取1.5ml EP管加入1ml，5mol/ml的对硝基苯酚溶液。 操作步骤： 一、样品的前处理：
1.细菌或培养细胞： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2.组织： 按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml 提取液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、标准样品的准备：取100μL标准液，加入到400μL试剂三中，得到1mol/ml标准液，十倍稀释到100nmol/ml，倍比稀释：50、25、12.5、6.25nmol/ml，稀释液用试剂二。100、 50、25、12.5、6.25nmol/ml做标准液。 二、测定步骤： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2.加样表 试剂名称（μl）对照管测定管标准管试剂一400 试剂二500500 样本100100 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min后，立即放入沸水浴中煮沸5min（盖紧，以防止 水分散失），流水冷却后充分混匀（以保证浓度不变） 试剂一400 充分混匀，8000g，4℃，离心5min，取上清液
SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）
钠测定试剂盒（半乳糖苷酶法） 适用范围：本试剂用于体外定量测定人血清中钠离子的浓度。 1.1包装规格 液体双剂型 试剂1（R1)：60mL×4 ,试剂2(R2)：30mL×4 ,校准品：3mL×2（2个浓度）； 试剂1（R1)：60mL×2 ,试剂2(R2)：30mL×2 ,校准品：3mL×2（2个浓度）； 试剂1（R1)：40mL×2 ,试剂2(R2)：20mL×2 ,校准品：1mL×2（2个浓度）。 1.2主要组成成分 1.2.1 试剂1（R1）（液体） β-半乳糖酶（pH9.0）≥0.8U/L 硫酸铵 5.4mmol/L 1.2.2 试剂2（R2）（液体） ο-硝基酚基β-D-吡喃糖苷半乳糖（ pH9.0) 5.5mmol/L 1.2.3 校准品（液体） 在水基质中添加氯化钠，目标浓度（2个水平）：水平1：120mmol/L；水平2：170mmol/L。（每批定值，值有批特异性，详见值单） 2.1 外观 试剂盒中各组件的外观应满足：
2.1.1试剂1（R1)应为无色或浅黄色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损； 2.1.2试剂2(R2)应为浅黄色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损； 2.1.3校准品应为无色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损。 2.2 试剂空白吸光度 在波长405nm～420nm处（光径1cm），试剂空白吸光度（A）应≤1.000；试剂空白吸光度变化率（△A/min）≤0.150。 2.3准确度 测定锂、钠、钾、镁、钙、氯复合电解质冰冻人血清国家标准品（编号：360018），相对偏差应不超过±15%。 2.4分析灵敏度 对应于浓度为100mmol/L的Na所引起的吸光度变化率差值△A/min的绝对值应在0.200 ～0.600的范围内。 2.5重复性 重复测定高、中、低浓度样本，变异系数（CV）应≤3%。 2.6批间差 测定同一样本，批间差（R）应≤4%。 2.7线性范围 在[80,180]mmol/L检测范围内，线性相关系数（r）应≥0.9900，线性相对偏差应不超过±5%。 2.8试剂稳定性
β-半乳糖苷酶测定试剂盒使用说明 分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2580 规格：50管/24样 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体80mL×1瓶，4℃保存。 标准液：液体1ml×1支，4℃保存，10μmol/ml对硝基苯酚溶液。 产品说明： β-GAL(EC3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。 β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 自备用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤： 一、粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）； 15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织， 加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、标准液的处理：用试剂二将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml. 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管标准管 试剂一200 蒸馏水200 试剂二250250 样本5050 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min 标准液500 试剂三100010001000充分混匀，400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。
α-葡萄糖苷酶的研究综述 摘要：α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20 ) 因在淀粉加工上具有重要作用，其研究多年来一直受到重视。α-葡萄糖苷酶广泛存在于动物、植物和微生物体内，它可从非还原末端水解低聚糖和多聚糖的α-1,4-葡萄糖苷键，也能作用于淀粉的α-1,6-糖苷键，在高葡萄糖苷受体环境中还可催化转糖苷反应。研究表明α-葡萄糖苷酶在不同领域的开发和应用都具有很好的经济和社会效益。 关键词:葡萄糖苷酶淀粉水解转糖苷反应研究进展 生物技术和酶工程的飞速发展为开发淀粉水解酶提供了技术支持。淀粉水解酶( 包括转化酶) 是一类以淀粉或不同的糖源为底物，根据水解专一性不同，可将淀粉或糖原降解成不同的单糖、低聚糖和水解多糖的水解酶类。同时，有些酶还具有转化功能，通过分子内的转糖苷作用，改变低聚糖的糖苷键链接方式。淀粉酶是生物体内广泛存在的一种水解酶，主要作用于淀粉，如植物体内的淀粉消化、植物根系中淀粉积累、动物体内摄入淀粉的分解、微生物利用碳源等。特别是具有特殊性质和新的应用领域的酶在工业上具有很重要的作用，它们可广泛应用于食品和发酵工业、化学工业以及医学应用等。α-葡萄糖苷酶作为淀粉水解酶家族中的重要一员，对它的研究一直受到人们的高度重视，多年来α-葡萄糖苷酶在不同领域的应用均产生了很好的经济和社会效益。 1、α-葡萄糖苷酶的简介 α-葡萄糖苷酶(EC.3.2.1.20，α-Glucosidases) 为淀粉水解酶类中的一种，主要在细胞外起作用。它从多糖的非还原末端水解底物的α-葡萄糖苷键，产生α-D-葡萄糖，通常把它们归类于水解酶第3类,主要水解二糖、低聚糖、芳香糖苷，能以蔗糖和多聚糖为底物。同时， 它还具有转糖苷作用，可将低聚糖中的，α-1，4-糖苷键转化成α-1，6-糖苷键或其他形式的链接，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖或糖酯、糖肽等。按一级结构可将α-葡萄糖苷酶归为水解酶13类的31家族。α-葡萄糖苷酶通常按底物专一性分为3个类型。Ⅰ型α-葡萄糖苷酶水解芳基葡萄糖苷如对--硝基苯酚α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG ) ，且水解速率比低聚麦芽糖快。Ⅱ型α-葡萄糖苷酶对麦芽糖具有高活性，而对芳基葡萄糖苷活性低。Ⅲ型α-葡萄糖苷酶与Ⅱ型类似，但它水解低聚糖和淀粉的速率基本一样。 2、α-葡萄糖苷酶来源及分布 α-葡萄糖苷酶在自然界分布广泛，种类繁多，性质各异，几乎存在于所有生物体内。目前已经进行研究的α-葡萄糖苷酶除少数来源于植物和动物外，绝大多数均来自于微生物中。细菌、霉菌及酵母菌等一些菌株能分泌此酶，其中产酶较多的是黑曲霉，市场上销售的α-葡萄糖苷酶产品大都为黑曲霉发酵生产所
2.2实验方法 2.2.1α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法 2.2.1.1 反应溶液的制备 （1）配制底物PNPG溶液：精确称取0.3766gPNPG，加适量0.1mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶准确定容到50mL，配制成25mmol/L的母液。将母液分别稀释成0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L7个不同梯度的标准品溶液，备用。 （2）配制α-葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉（酶活力为14u/mg）用0.01mol/L 磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，配制成2u/mL的母液。再将酶液分别稀释，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/mL的酶溶液，备用。 （3）配制DNJ标准溶液（抑制剂）：精确称取0.0010g DNJ 标准品，用容量瓶准确定容到10mL，配制成1000μg/mL DNJ标准母液。将母液分别稀释成、1、5、10、20、40、60μg/mL六个不同梯度的标准品溶液，备用。 （6）0.2mol/L的Na2CO3：称取2.16g Na2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4℃下保存，备用。 2.2.1.2 PNP标准曲线的绘制 精确称取0.0278g对硝基酚（PNP），加0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶定容至10mL，即得20mmol/L母液。用蒸馏水将其母液稀释成浓度分别为1、5、10、20、40、40、80和100μmol/L的标准溶液。取100μl上述标准液，各加入150μL 0.2mol/L 的Na2CO3，混匀1 min ，再于405 nm处测定其吸光度，得标准曲线方程： y=128.13x+0.3579 (R2 =0.9998)，其中y 为浓度，x为吸光值。
β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase,β-GAL）试剂盒使用说 分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2580 规格：50管/24样 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： β-GAL(EC3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。 β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 自备用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞 数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组 织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管 试剂一200 蒸馏水200 试剂二250250 样本5050 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min 试剂三10001000 充分混匀，400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。 三、β-GAL活性计算： 标准条件下测定的回归方程为y=0.32x-0.0027；x为标准品浓度（nmol/mL），y为吸光值。 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。 β-GAL活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.32×V反总]÷(V样×Cpr)÷T =62.5×(ΔA+0.0027)÷Cpr
Advances in Microbiology 微生物前沿, 2018, 7(2), 79-86 Published Online June 2018 in Hans. https://www.doczj.com/doc/c711078210.html,/journal/amb https://https://www.doczj.com/doc/c711078210.html,/10.12677/amb.2018.72010 Progress of β-Glucosidase from Microorganisms Zhishuai Chang*, Hui Lan, Yali Bao, Zhanying Liu# Inner Mongolia University of Technology, Hohhot Inner Mongolia Received: Jun. 7th, 2018; accepted: Jun. 21st, 2018; published: Jun. 28th, 2018 Abstract β-glucosidase can effectively decrease the inhibitory effect of cellobiose on cellulase activity, which is a bottleneck on the complete hydrolysis of cellulose. Because of its low activity and high cost, the β-glucosidase, which is highly resistant to acid and alkali, is more suitable for industrial production and application by means of genetic engineering technology and expressing in hetero-logous hosts. In this paper, there is a detailed summary about β-glucosidase in the classification and cloning about different sources of β-glucosidase gene, enzyme activity determination and so on, which provides theoretical support for enzyme researches. Keywords β-Glucosidase, Gene Cloning, Enzyme Activity Determination 微生物产β-葡萄糖苷酶研究进展 常治帅*，兰辉，包亚莉，刘占英# 内蒙古工业大学，内蒙古呼和浩特 收稿日期：2018年6月7日；录用日期：2018年6月21日；发布日期：2018年6月28日 摘要 β-葡萄糖苷酶能有效解除纤维二糖对纤维素酶活性的抑制，是限制纤维素彻底水解的重要因素。由于β-葡萄糖苷酶酶活相对较低、成本高等因素，通过基因工程手段对其定向改造，异源表达获得高酶活、耐*第一作者。 #通讯作者。
货号：QS2613 规格：50管/24样β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase, β-GC）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： β-GC（EC 3.2.1.21）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化β-糖苷键水解，具有多方面生理作用：在纤维素的糖化作用中，β-GC负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖；β-GC水解萜烯类香气前驱体，使糖苷键合态变成游离态。从而产生香味；β-GC能够水解植物体内野黑樱苷，释放HCN，从而防止昆虫取食。 测定原理： β-GC分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GC活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入10mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、培养液、血清（浆）等液体样本：直接检测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 ， 第1页，共2页
葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法 α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类以延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。其作用机制为：竞争性抑制位于小肠的各种α-葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。 α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选的原理是：对-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反应底物；该底物是无色的。经α-葡萄糖苷酶水解后可以释放出对-硝基苯酚(pNP)，pNP在碱性条件下是黄色的，因此可以通过测定410nm处的吸光度反应出pNP的浓度(吸光度与pNP浓度成正比关系)。吸光度越小，说明pNP的浓度越小，即酶被抑制的程度越大。 设不加样品时，测得的吸光度为c0, 加样品后测的吸光度为c1. 那么酶的抑制率可通过1-c1/c0计算出来。 一实验试剂： α-Glucosidase(α-葡萄糖苷酶)、4Nitrphtnylα-D-glucopyranoside(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)（PNPG）、Acarbose(阿卡波糖) 均购自Sigma公司，无水Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等, 均为分析纯。水为超纯水。苦瓜提取物。 二实验器材： Bio Tek酶标仪、电子天平、Eppendorf的移液器、pH计、酶标板、恒温水浴器 三实验方法： （一） 试剂配制 （1）pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液 分别配制0.1 mol/L Na2HPO4和KH2PO4(13.6 g配成1L)，用这两种溶液混匀互调pH 值至6.8即得0.1 mol/L磷酸缓冲液 （2）用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制0.26 U/mlα-Glucosidase （3）底物(PNPG)用pH值6.8的0.1 mol/L磷酸缓冲液配制成浓度为5 mmol/L (1.505mg/ml) （4）反应终止液：0.2 mol/L Na2CO3。 （5）阳性药的配制：精密称取阿波卡糖样品，以磷酸缓冲液为溶剂溶解，配成10 mg/ml 的浓度。 （二） 实验方法 1. 各浓度药液按每孔50 μL加入酶标板，每浓度设三复孔。另设一药物对照孔、空白反应孔及空白对照孔。然后向药物反应孔和空白反应孔加入50 μL 0.26 U/mL的 -葡萄糖苷酶，其他组加50 μL 磷酸缓冲液，经此步骤后，各孔的组成为： 药物反应孔：50 μL药液+ 50 μL酶 药物对照孔：50 μL药液+ 50 μL磷酸缓冲液 空白反应孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL酶 空白对照孔：50 μL磷酸缓冲液+ 50 μL磷酸缓冲液 上述反应体系在微型振荡器上震荡30秒，置于恒温37 o C水浴中孵育10min。