蛋白质离子交换层析技术（一篇较好的综述，转载）
已有 210 次阅读2011-9-30 10:50|个人分类:蛋白实验技术|离子交换剂, 关键词, 蛋白质, 技术
蛋白质离子交换层析技术
摘要：本文介绍了离子交换的基本理论、影响分离纯化的因素、常见的离子交换剂和树脂的处理，以及离子交换层析的基本操作方法。列举了离子交换层析技术的一些最新应用。
关键词：离子交换层析基本理论树脂处理操作方法应用进展
Protein Ion Exchange Chromatography Technique
Abstract:The basic theories of ion exchange, factors that can influence the separation and purification of proteins, common ion exchangers, ways of processing the resin and basic operating method of ion exchange chromatography are introduced. Some latest applications of this technique are enumerated.
Keywords: Ion exchange chromatography; basic theories; resin processing; operating method; advancement of application
近年来，随着基因工程和细胞融合技术的发展，利用细菌发酵和动植物细胞培养表达蛋白质成为一种常规技术。和其它生物产品的生产过程一样,蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。上、中游过程是运用生物技术生产目标产物,下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。为了生产高纯度、高活性的生物制品，生物工程技术研究经费的30％需花费在分离纯化工艺过程的研究上，调查结果显示，利用传统的分离纯化技术纯化分离阶段的平均生产费用占总生产成本的80％。
在众多的蛋白质分离纯化技术中,层析是一门关键技术, 它通常在分离工序的后部,决定着产品的纯度和收率。和其它分离技术相比,层析技术具有分离效率高、适用性广和过程易于放大、易于自动化的特点,因而得到了广泛的应用[1]。
本文将对其中的离子交换层析技术作详细介绍。
1 基本理论
1.1 离子交换的概念
离子交换是利用各带电粒子与离子交换剂之间结合理的差异进行物质分离的操作方法。
1.2 离子交换的原理
氨基酸、蛋白质、核酸等大多是两性物质，在水溶液中带有电荷。由于生物分子自身的性质差异，造成了在特定的介质中所带的电荷种类和密度不同，这就是离子交换的理论依据。
离子交换现象可用下面的方程式表示：
阳离子交换反应：
Resin-SO3H + Na+ = Resin-SO3 Na + H+
Resin-SO3Na + H+ = Resin-SO3 H + Na +
阴离子交换反应：
Resin-N(CH3) 3OH + Cl- = N(CH3) 3 Cl + OH-
图1 离子交换过程的机理
A+自溶液中扩散到树脂表面
A+从树脂表面进入树脂内部的活性中心
A+与RB在活性中心上发生复分解反应
解吸附离子B+自树脂内部扩散至树脂表面
B+离子从树脂表面扩散到溶液中
交换速度的控制步骤是扩散速度，不同的分离体系可能由内部扩散或外部扩散控制
Resin-N(CH3) 3 Cl + OH- = N(CH3) 3 OH + Cl -
1.3 离子交换的分类
1.3.1 分类
按活性基团分类，可分为阳离子交换树脂(cation exchange)（含酸性基团）和阴离子交换树脂(anion exchange)（含碱性基团）。具体又可以分为：强阳、弱阳和强阴、弱阴。
（1）强酸性阳离子交换剂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺
酸基）；
（2）弱酸性阳离子交换剂：活性基团有-COOH，-OCH2COOH，C6H5OH等弱酸性基团；
（3）强碱性阴离子交换剂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-?-羟基乙基胺基；
（4）弱碱性阴离子交换剂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；
强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽，而弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小。
1.3.2常见离子交换树脂的鉴定
在树枝的使用过程中，由于保管不善或其他的偶然因素，即将树脂搞混。而各类树脂的形状和颜色又无统一的规定，故单从外观很难识别阴阳。
彦文斌等建立了简便的方法，利用CuSO4、HCl、NaOH、NH3.H2O、酚酞和甲基红等试剂鉴定四类常见树脂[2]。（见图2）
图2 常见离子交换树脂的鉴定
1.4 常用的离子交换剂
1.4.1 离子交换树脂
离子交换树脂是一种在交联聚合物结构中含有离子交换基团的功能高分子材料。离子交换树脂不溶于酸、碱溶液及各种有机溶剂,结构上属于既不溶解、也不熔融的多孔性固体高分子物质。每个树脂颗粒都由交联的具有三维空间立体结构的网络骨架构成,在骨架上连接着许多较为活泼的功能基。这种功能基能离解出离子,可以与周围外边离子相互交换。离子交换树脂的单元结构由三部分组成:不溶性的三维空间网状骨架、连接在骨架上的功能基团和功能基团所带的相反电荷的可交换离子[3]。
1.4.2 离子交换纤维素
离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大。
特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高
常用的离子交换纤维素有：甲基磺酸纤维素、羧甲基纤维素（CMC）、二乙基氨
基乙基纤维素（DEAE）
1.4.3 离子交换葡聚糖
离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物，如sepharose、sephadex。
特点：除了具有离子交换功能以外，兼有分子筛的功能，提高了分离的效率。目前,商品化的离子交换层析介质品种很多[4]。
1.5 影响交换速度的因素
离子交换速度的影响因素很多，综合起来主要有以下几个方面：
（1）颗粒大小：愈小越快
（2）交联度：交联度小，交换速度快
（3）温度：越高越快
（4）离子化合价：化合价与高，交换越快
（5）离子大小：越小越快
（6）搅拌速度：在一定程度上，越大越快
（7）溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度越快
1.6 影响离子交换选择性的因素
（1）水合离子半径：半径越小，亲和力越大；
（2）离子化合价：高价离子易于被吸附；
（3）溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容量；
（4）离子强度：越低越好；
（5）有机溶剂：不利于吸附；
（6）交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少；
（7）树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；
2离子交换剂的处理、再生和转型
2.1 处理
由于新树脂在生产和运输途中会引入一些中间体和一些杂质,所以应用前要处理。首先要去杂、过筛，粒度过大时可稍加粉碎，对于粉碎后或粒度不均匀的树脂应进行筛选和浮选处理，以保证树脂粒度均匀。用蒸馏水、乙醇浸泡（去除残存的少量有机杂质）后,再用约1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl反复冲洗。可用十倍树脂量的液体,各3次,每次酸和碱处理转换时用水洗至中性,最后用水洗至中性，经缓冲液平衡后即可使用或装柱[5]。
2.2 再生
树脂可以重复使用,使用其吸附有效成分后,将有效成分洗脱下来,可以再利用,需要用酸碱转型,用水洗至中性,但是用的次数多了,会有一些杂质在上面影响效率,需要彻底再生或换新树脂,一般树脂可以使用20次以上。再生方法:用氢氧化钠处理、浸泡(阴树脂),或用盐酸处理、浸泡(阳树脂),也可以用饱和盐水浸泡。动态再生方法比一般再生方法优越。被铁离子污染的阴离子交换树脂用亚硫酸钠去除较彻底。[5]
近年，清华大学报道了利用水代替酸碱作为再生剂再生失效离子交换树脂的体外电再生工艺,使离子交换水处理变为一种绿色环保水处理技术[6]。
2.3 转型
转型是为了发挥树脂的交换性能，按照使用要求人为地赋予平衡离子的过程。对于弱酸或弱碱型树脂须用碱（NaOH）或酸（HCl）转型，对于强酸或强碱型树脂除使用酸碱外还可以用相应的盐溶液转型。
总之，对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，即要求其带上使用时所期望的离子或基团。
3 离子交换层析基本操作方法
3.1 树脂的选择
选择离子交换树脂的主要依据是被分离物质的性质和分离目的。最重要的一条是根据分离要求和分离环境保证分离目的物与主要杂质对树脂的吸附力有足够的差异。一般而言：酸性物质用阴离子交换剂分离，碱性物质用阳离子交换剂分离，氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化曲线来选择。
当目的物具有较强的碱性或酸性时，宜选用弱酸或弱碱性的树脂，这样有助于提高选择性并便于洗脱。如目的物是弱酸性或弱碱性的小分子物质，往往选用强碱或强酸树脂。对于大多数蛋白质、酶和其他生物大分子的分离多采用弱酸
或弱碱性树脂，以减少生物大分子的变性，有利于洗脱，并提高选择性。
3.2 层析柱
离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1：10～1：50之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。
3.3 装柱
先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤压海绵，赶尽气泡并把柱子垂直固定；将交换剂用起始缓冲液调稀搅匀后加入，柱内的交换剂应非常均匀地分布，不应出现节面和气泡，不能干柱，床面要平整，床高距柱顶2～3cm为宜。
3.4 平衡缓冲液
平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH值的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。
3.5 上样
离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1%-5%(体积分数)为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。将柱中的缓冲液逐渐放出，使顶部液面达到近于柱床面时开始加样。用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样，待样液达一定高度后再在柱中间小心加样。待样液刚好全部进入床内后用足够量的起始缓冲液流过层析柱，洗出未被吸附的物质。
3.6 洗脱缓冲液
在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH值两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH值的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH 值从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是 pH 值从高到低。由于pH值可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。
3.7 洗脱速度
洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度
来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。
3.8 样品的浓缩、脱盐
离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较高，而且体积较大，样品质量分数较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。
另外在层析分离过程中还要注意操作手段和溶液环境，如温度、压力和缓冲系统对欲分离物质稳定性的影响，避免被分离物质失活[7]。
4应用进展
离子交换树脂不溶于一般的酸、碱溶液及许多有机溶剂。它以交换、选择、吸收和催化等功能来实现除盐、分离、精制、脱色和催化等应用效果。它广泛应用于电力、化工、冶金、医药、食品和原子能等部门,主要是制取软水和纯水三废处理及分离精制药品等[8]。
许多研究者不断尝试将该技术应用于多种物质的分离纯化。如府静燕等[9]研究了丝胶蛋白质对阴离子交换纤维的吸附性能以及从阴离子交换纤维上解析丝胶蛋白质的最佳条件。喇文军等[10]离子交换层析法对玉米蛋白酶解液进行了分离纯化，得到降血压肽并研究了离子强度、离子强度梯度以及上样量对分离效果的影响,得到最佳分离条件。
新型离子交换剂也是研究开发的重点，如施扬等[11]以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，三聚异氰尿酸三烯丙酯和二乙烯基苯为交联剂，甲苯和正庚烷为有机致孔剂，用原位聚合的方法合成亲水性高分子载体。胺化反应后，得到含二乙胺基羟丙基的阴离子交换剂新型双孔蛋白质离子交换剂的制备及性能研究。在此基础上，采用固体颗粒与有机溶剂联合致孔模式，以硫酸钠颗粒为固体致孔剂，制备新型双孔离子交换剂并比较了两种树脂的孔结构及其对牛血清白蛋白的吸附行为。
此外，离子交换层析与其他技术的联合应用也在发展之中。马晓轩等[12]研究了利用批量离子交换层析与凝胶过滤层析相结合的方法纯化类人胶原蛋白I的最佳条件并分别考察了不同离子交换树脂、缓冲溶液pH、离子强度、进料蛋白浓度对批量离子交换的影响，以及不同凝胶过滤介质对凝胶过滤层析的影响。赵荣乐等[13]以离子交换层析和凝胶过滤成功地从盐源山蛭头部分离纯化了抗凝血多肽。
参考文献
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