蛋白纯化层析柱
2011-06-15 15:19:14 易生物仪器浏览次数：1164 网友评论0 条
从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是...
关键词：蛋白离子交换分离分子物质树脂
从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术（gel filtration，GF），离子交换层析技术（ion exchange，IEX），羟基磷灰石层析（hydroxyapatite，HAP）和疏水作用层析（hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法（high-performance liquid chromatography，HPLC）。
对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GE Healthcare（原Amersham Biosciences）的技术顾问Andrew Mitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步：捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白；
区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白；
修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。
这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。
第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量（flow rate）的填料。bead大小比较大，范围比较宽（比较于bead大小平均值）的“f
ast flow”填料比较理想，这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。
第二步则对分辨率要求更高，需要更好的从混合物中分离需要的成份。通常bead的大小与分辨率成反比，因此在这一部中比较小的bead比较合适。吸附性的技术，比如离子交换IEX和疏水作用HI通常被用在纯化的这前两个步骤，而凝胶过滤则会留到了最后的修饰那一步，用于小体积，高浓度的样品。另外要注意，进行凝胶过滤层析时，样品的体积应该保持在柱床体积的1%到4%。
选择柱料的时候有两个因素要考虑到，针对目的蛋白的选择性和有效性——这些可以由洗脱峰的宽度来说明。其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力，IEX 和HI层析方法就是指目标分子与筛分介质之间的相互作用，而GF的选择性依赖于填料的分馏范围（fractionation range）。
柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力，Mitchell表示，“如果你的峰值不集中，比较宽，那么即使是选择性很好，分辨率仍然会被消弱”。bead越大，洗脱峰就越不集中，柱子的有效性就越低。纯化洗脱相近的蛋白需要高效性，高选择性和高效性的结合就会得到高分辨率。
凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)
凝胶过滤法（gel filtration）也称为排阻层析（exclusion chromatography）、凝胶层析（gel chromatography）或分子筛层析（molecular sieve chromatofraphy），它是在1960年后发展出来的技术。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
目前常用的凝胶包括3个主要类型：
1. Polydextran
Polydextran的商品名称是Sephadex，它几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。Sep hadex依其吸水量有不同型号，如G-25、G-75、G-100或是G-200，G 后面的数字为凝胶吸水量再乘以10，以G-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml。
GE的Sephadex G-25柱就是这一系的产品，十分适合于快速处理不同体积的样品，可以用在层析纯化的前、中、后的任一阶段，即适用于实验室操作，也可以在生产上应用。达柱体积30％的样品可通过简单的一次性上柱，脱盐并转换道新的缓冲液中，一些不需要的低分子量的物质，如盐分子就被洗脱了，这种产品最大的特点就是高速和高容量，处理起样品来快速高效。
2. Polyacrylamide
Polyacrylamide是一种合成凝胶，商品名Bio-Gel P，干粉颗粒状，在溶剂中自动溶成胶体，依胶的分离范围不同，分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300，P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。Polyacrylamide的化学性质不活泼，但它在极端的pH 下会被水解，水解后产生的COOH-具有离子交换的性质，因此pH 值应尽量控制在2-10之间。
3. Agarose
商品名Separose，属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为Sepharose 2B，4 B和6B。Agarose gel 是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质，因其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以上会融化，故需于较低温的环境中进行层析。Agarose 做成beads后不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。
凝胶和管柱的选择：
凝胶的材质需为化学惰性，与分离物不能产生变性（denature）或是其它化学反应，最好具有能长期反复使用的稳定性，并可以在较大的pH和温度范围内使用。由于凝胶上的离子交换基团会吸附带电荷的物质，产生离子交换的效果，所以凝胶上最好不具有离子交换的基团。此外，凝胶要有一定的机械强度，在层析过程中才不会变形，增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行，缩短分离时间。
凝胶颗粒的粗细与分离效果有直接关系，颗粒细的分离效果好，但流速慢而费时，因此要依据实际的需要来选择。对于分子量较小的物质，一般采用polydextran或polyacrylami de材质的凝胶，大分子物质则使用agarose。
以Sephadex为例，Sephadex G-50可用于区分分子量1,500~30,000之分子，而Sep hadex G-75 凝胶可区分分子量3,000~70,000之分子，所以若要分离分子量10,000及20,00 0之分子，两种都适用。
如果要分离的分子大小相差很多，则可选用柱高：直径＝5：1~15：1的管柱，且管柱体积要大于4~15倍的样品体积；如果要分离的物质之间分子量差异不大，则要选用柱高：直径＝20：1~100：1的管柱，且管柱体积要大于25~100倍的样品体积。
凝胶的处理：
商品凝胶一般是干燥的颗粒，使用前要先泡在欲使用的冲洗液中，使它充份膨胀，否则有引起凝胶柱破裂的危险。热胀法是常用的前处理法，即把浸于冲洗液中的凝胶加热，让它膨胀并除去气泡，温度够高的话（加温至近沸腾）也可消毒杀菌。凝胶处理过程不能剧烈搅拌，如此易使颗粒破裂，影响流速。
将凝胶装入管柱的方法有很多种，实验室常用的方法是先在柱中加入约1/3 体积的冲洗液，边轻轻搅伴边将凝胶悬浮液倒入其中，等到底部沉积约1~2公分的凝胶后，打开下方出口让水流出，上面不断加入悬浮液，等到沉积到离顶部约3~5公分处停止，让3~5倍柱床体
积的缓冲液流过层析柱。若用polydextran的凝胶，可放入有颜色的蛋白质（如cytochrom e c）流过管柱，看看色带是否均匀下降，不均匀或出现气泡，凝胶均需倒出重新填装。
冲洗缓冲液仅需留高于柱床2 公分左右，多余的可用滴管吸去，再将出口打开使冲洗液流到距表面1~2公厘，关闭出口，用滴管缓缓加入样品再打开出口，样品完全渗入凝胶内后，加入约4公分冲洗液，出口处接上收集瓶开始层析。
由于polydextran 和agarose都属于多醣类，一旦微生物生长过多，分泌的酶会水解凝胶使其性质改变，为了防止这种情况发生，凝胶最好采用真空或低温保存，但温度不能过低使凝胶冻结。加入抑菌剂（chlohexidine, chlorbutol, phenylmercuric salts, NaOH等）也是常用的方法。长时间不用的凝胶可用干燥保存法，也就是把使用过的凝胶用水除去碎颗粒和杂质，再用不同浓度的酒精，由70%、90%到95%逐步脱水，在摄氏60~80度下烘干，不能加热的Sepharose则用乙醚洗涤干燥。
离子交换层析（ion exchange，IEX）
离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
离子交换层析法大致分为5个步骤：
1. 离子扩散到树脂表面。
2. 离子通过树脂扩散到交换位置。
3. 在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不容易被其它离子取代。
4. 被交换的离子扩散到树脂表面。
5. 冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中。
离子交换树脂的交换反应是可逆的，遵循化学平衡的规律，定量的混合物通过管柱时，离子不断被交换，浓度逐渐降低，几乎全部都能被吸附在树脂上；在冲洗的过程中，由于连续添加新的交换溶液，所以会朝正反应方向移动，因而可以把树脂上的离子冲洗下来。
如果被纯化的物质是氨基酸类的分子，则分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值，所以当溶液的pH 值较低，氨基酸分子带正电荷，它将结合到强酸性的阳离子交换树脂上；随着通过的缓冲液pH逐渐增加，氨基酸将逐渐失去正电荷，结合力减弱，最后被洗下来。由于不同的氨基酸等电点不同，这些氨基酸将依次被洗出，最先被洗出的是酸性氨基酸，如apartic acid和glutamic acid（在约pH3~4时），随后是中性氨基酸，如glycin e和alanine。碱性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的缓冲液中仍带有正电荷，因此这些在约pH值高达10~11时才出现。
树脂材质：
最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯-苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene），它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯（divinylbenzene）聚合产生的三维网状结构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。
根据交换树脂的性能，分为阳离子与阴离子交换树脂。
1. 阳离子交换树脂
分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型树脂含有－COOH或－OH。
2. 阴离子交换树脂
分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐[ －N+(CH3)3] 为强碱型树脂，三级以下铵盐[－N(CH3)2]、[ －NHCH3]、[ －NH2] 都属弱碱型树脂；同时具有
强碱和弱碱型基团的，为中强碱型的树脂。
除了树脂以外，纤维素（cellulose）、葡聚糖凝胶（Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（S epharose）也是常用的离子交换材质，特性是具有亲水性和较大的表面积，对生物活性物质而言，是一个较为温和的环境，同时也是大分子所适用的分离纯化材质。
实验证明，纤维材质对蛋白质和核酸的分离纯化效果相当好，因为离子交换纤维的种类多，能依据不同分离目的使用，且功能团基主要在表面，对生物大分子的交换十分有利。
离子交换剂的选择：
离子交换剂的选择，首重保持欲分离物质的生物活性，以及在不同pH值环境中，此物质所带的电荷和电性强弱。
1. 阴阳离子交换剂的选择
若被分离物质带正电荷，例如polymyxin、cytochrome C这些碱性蛋白质，它们在酸性溶液中较稳定，亲和力强，故采用阳离子交换剂；其它像heparin、nucleic acid这类酸性物质，在碱性溶液中较稳定，则使用阴离子交换剂；如果欲分离的物质是两性离子，一般考虑在它稳定的pH范围带有何种电荷，作为交换剂的选择。以胰岛素（iulin）为例，它的等电点为pH 5.3，因此在pH<5.3（酸性）溶液中，采用阳离子交换剂，在pH>5.3的碱性溶液中，使用阴离子交换剂。
简而言之，已知等电点的物质，在高于等电点的pH条件下，因带有负电荷，应采用阴离子交换，在低于等电点的pH下，则采用阳离子交换。未知等电点的物质，在一定pH条件下进行电泳，向阳极移动较快的物质，在同样条件下可被阴离子交换剂吸附，向阴极移动较快的物质可被阳离子交换剂吸附。
2. 缓冲液的选择
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定性、溶解度和交换剂离子的p
K值。使用阴离子交换纤维时要选用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物等电点的pH值。
缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。
离子交换树脂的前处理：
离子交换树脂使用前，先以蒸馏水除去其内之杂质，并以NaOH和HCl处理树脂，使其上的官能基完全露出。阴离子交换树脂先以15倍于树脂量的0.5 N HCl 浸泡30~120分钟，再以水清洗至pH 7.0，之后用0.5 N NaOH浸泡30~120分钟，同样以水清洗至pH 7. 0，最后用欲使用的缓冲液浸泡。阳离子交换树脂用15倍于树脂量的0.5 N NaOH浸泡30~ 120分钟，以水清洗至pH 7.0，之后用0.5 N HCl 浸泡30~120分钟，再以水清洗至pH 7. 0，最后用欲使用的缓冲液浸泡。
亲和层析（affinity chromatograph)
亲和层析也称为功能层析（function chromatography）、生物专一吸附（bioecific ads orption）或是选择层析（selective chromatography）。所谓的亲和力，即生物大分子和其配体（ligand）之间形成可逆结合的能力，如酵素和它的底物（sutrate）、抗体和抗原、激素和受体（receptor）、RNA和其互补的DNA等，亲和层析就是根据这种亲和力发展出来的纯化方法，例如将酶的sutrate接在固体支持物上，再用此支持物填装管柱，当含有这种酶的样品溶液通过管柱时，酶便被吸附在管柱上，其它的蛋白质及杂质不被吸附，全部从层析柱流出，最后使用适当的缓冲液，将欲分离的酶从柱中洗出来，经过这些步骤便能得到纯化的酶。
材质选择：
要进行亲和层析，ligand的选择相当重要，ligand可以是辅酶、酶的抑制剂或抗体，具
备的条件如下：
1. 能与要分离的物质进行专一性的结合，亲和力愈大愈好。
2. Ligand与分子结合后，在一定的条件下又能解离，而且不会因解离破坏原本的生物活性。
3. Ligand上具有能连结到固体支持物上的团基，结合后不影响它与欲分离物质的结合专一性。
在实际操作上，若要纯化的是某一种酶，则lignad选用此酶的竞争性抑制剂、底物、辅酶或是效应剂（effector ）；若是要纯化酶的抑制剂，就选用此酶作为ligand；纯化能与某维生素结合的蛋白质，可以使用这种维生素当ligand；纯化激素的受体（receptor），选用激素当ligand。纯化核酸可利用核酸与蛋白质的交互作用、DNA之间的互补关系、DNA 与RNA的hybridization，运用适当的ligand。
亲和层析中与ligand连接的支持物多为凝胶，凝胶应具备以下条件：
1. 不溶于水，但具有亲水性，如此ligand才容易接近水溶液中的欲分离物。
2. 化学惰性，没有（或极少）离子交换这一类非专一性的结合。
3. 具有足够的化学团基，经活化后能与大量的ligand结合。
4. 最好是均一的球状颗粒，制成的管柱才能有较佳的流速。
5. 具有多孔网状结构，方便大分子自由通过。
6. 物理及化学性质稳定，不因洗出时改变的各种pH值、离子浓度、温度或界面活性剂而改变其结构。
亲和层析法使用的支持物种类，部份与胶体过滤法重复，除了Polydextran、Polyacryl amide、Agarose以外，Ultrogel是能承受较大压力的凝胶，流速高；cellulose 主要用于亲
和免疫层析，但它有非专一性吸附的性质；Bio-gla是硼硅酸钠经高温和酸碱处理制成的多孔玻璃，质地硬、强度高、孔径均匀、不怕微生物侵袭，但缺点和cellulose一样，它的表面对蛋白质也有非专一性吸附。
样品的分离：
要使要分离的物质与ligand分离，通常采用改变pH、离子浓度或缓冲液的组成，使其亲和力降低，有时使用0.1M醋酸或0.1M 氢氧化钠冲洗，就能得到不错的效果。如果纯化对象与ligand的亲和力不强，当连续通过大量的平衡缓冲液，就能在杂质洗出后，得到所要的物质；若亲和力较强，则要使用较强的酸或碱作为冲洗液，或是添加guanidine hydro chloride，但这些溶液容易使纯化对象失去生物活性；用较高浓度的ligand溶液亦可将管柱上所吸附的物质洗出，此ligand可以与管柱上的相同或相异。
对于亲和力小的物质，上柱的样品最好是体积小而浓度高，粘度较大的溶液，可以将一定量的ligand加到待分离的溶液中，搅拌平衡一段时间，进行过滤或离心，最后进行洗出的步骤。由于生物大分子和其ligand间达到反应平衡的速度很慢，样品上柱的流速要尽量慢；通常亲和力会随温度增高而降低，其中一例是将乳酸脱氢酶从管柱上的AMP洗下来时，所需的NADH浓度随温度增高而减少，在摄氏零度到十度间的变化尤其明显，因此如果待分离的物质在摄氏4度可被紧密吸附，在摄氏25度以上容易被洗下来，则可在4度环境下进行亲和吸附，在25度以上的环境进行洗出的步骤。
说到经典的亲和层析柱，当然要提到GE公司的王牌产品Ni Sepharose High Perfor mance填料，Ni Sepharose分有许多不同的凝胶类型，主要是根据凝胶颗粒的大小来区分，这些镍琼脂糖凝胶产品受到广大科研工作者的欢迎，但基本上都是以层析系统或者散包装出售的。所以要提一下一款His inTrap，His inTrap只需使用一台标准的小型离心机就可以完成纯化步骤。过程也就是将均一、澄清的细胞裂解物加入到柱子中就可以直接进行纯化，样品无需离心或过滤处理。所以说His inTrap省去了烦杂的样品制备时间，节省了研究人员的劳动力，每10分钟就可以进行一次小型纯化。因为纯化的时间变短，使样品降解或者氧
化的可能性也变小，也就最大程度保持了样品蛋白的活性。
这个柱子的蛋白结合率达到750ug，并且与系列的添加、变性和还原试剂兼容。由于它是专门为了小体积蛋白纯化而设计，这系列产品特别适合用于摸索细菌裂解物最佳蛋白纯化条件。
在产品方面，GE还有一系列高分辨液相色谱柱：Tricorn，主要用于分析和纯化包括蛋白质、肽、核酸、质粒、生物碱、抗生素、病毒、中药活性成份等生物分子而设计的预装柱。Tricorn 已取代HR 预装柱，理论塔板数达35000，分辨率比平均塔板数为8000的HPLC柱高四倍，可直接连到HPLC/FPLC/AKTA 系统。
Tricorn 预装柱可应用于层析聚焦、离子交换、疏水层析、分子筛等四种分离技术中。其中离子交换方面，Tricorn 提供了MiniBeads(3mm) ，MonoBeads(10mm) 和SOURCE (15mm)三种填料适合从分析到小量制备的需要；而在分子筛方面，Tricorn 提供了Super dex(窄谱) 和Superose(广谱) 预装柱。
比如说Superdex 200 5/150凝胶柱就是一个Tricon的预装柱,床层高度为150毫米。当纯化的时间、样品和缓冲液的消耗显得比获得尽可能高的分辨率更为重要时，这种柱子是一个很好的选择。Superdex 200 5/150凝胶柱可被广泛应用，例如膜纯化过程中条件的筛选、蛋白质之间相互作用的研究、快速分析单克隆抗体的纯度和重组蛋白质纯化过程中需要采用少量缓冲液而不需要采用更长的柱子时。柱子的高效率保证了纯化过程极好的重复性，并可以在各种不同的纯化系统上操作使用。
除了GE以外，默克在色谱领域也是世界上首屈一指的大公司之一，这个世界上最大的色谱级硅胶和在GMP条件下生产吨级二氧化硅的制造商得到了许多顾客和代理商的认可，其产品线覆盖高效液相分析色谱HPLC领域，制备色谱领域，薄层层析色谱领域和样品前处理。
它旗下的主要色谱柱包括Lichroher色谱柱、Puroher STAR 明星家族色谱柱以及整体
化色谱柱Chromolith，其中puroherstar明星家族色谱柱采用合成硅胶为原料，填料的纯度高，将造成分析困难的金属含量降低至10m以下，而且，将硅胶表面的键合工艺进行改进，使得反相填料的酸碱耐受性提高至1.5~10.5。puroheròstar家族是采用最先进的原料和技术生产出来的色谱柱。它们融合了重现性好、压力稳定性好的典型特征以及在分离效率、柱效高和ph稳定范围宽的明显优势。
而Chromolith整体化HPLC色谱柱更是开辟了色谱行业的新纪元，这种柱子是目前世界上最快的色谱柱。其原理是基于一种全新的液溶胶技术，采用整体化的技术制得。它采用完全不含重金属离子的四烷氧基硅为原料，采用专利技术制备得到。chromolith柱中整体化硅胶棒的多孔体系是由完全创新的两种孔结构组成：大孔结构和中孔结构。其中大孔的孔径是2mm，相互交联形成了密密麻麻的多孔网络，保证流动相可以快速通过，却不会造成大的反压；填料骨架上的中孔保证了填料的比表面积，比颗粒型色谱柱的比表面积高15%(传统颗粒型色谱柱的比表面积为65~70%)，这保证了它的柱效。
蛋白纯化离子交换层析 离子交换层析技术是以离子交换剂为固定相，常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过共价键结合某种电荷基团，形成带电基质，带异性电荷的平衡离子能够通过静电力作用结合在电荷基质上，而平衡离子能够与样品流动相中的离子基团发生可逆交换而吸附在交换剂上，不同带电荷蛋白间结合吸附固定相的能力不同。离子交换技术就是根据蛋白质样品间带电性质的差别而进行分离的一种层析方法。 常见的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换树脂和离子交换葡聚糖凝胶。根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的性质不同，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，在阳离子交换剂中，带正电荷的平衡离子能够和流动相中带正电荷的离子基团进行交换。例如DEAE纤维素阳离子交换剂，当纤维素交换剂分子上结合阳离子基团二乙氨乙基（DEAE）时，形成阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，可与带负电荷的蛋白质进行结合，交换阴离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型、弱酸型三类阳离子交换剂，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型只能在较小的pH范围内完全解离，如结合羧甲基的离子交换剂在pH小于6时就失去了交换能力。 强酸型阳离子交换剂一般结合的基团有：磺酸甲基、磺酸乙基；中等酸型阳离子交换剂有：磷酸基团和亚磷酸基团；弱酸型离子交换剂有：酚羟基和羧基类； 在阴离子交换剂中，带负电荷的平衡离子能与流动相中带负电的离子基团进行交换，例如阴离子交换剂CM纤维素，当纤维素交换剂分子上结合羧甲基（CM）时，形成带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），可与带正电荷蛋白质结合，交换阳离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型、弱碱型阴离子交换剂。一般结合季胺基团基质的交换剂为强碱型离子交换剂，结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或者弱碱型离子交换剂。 蛋白质是两性电解质，当溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，蛋白质的静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，羧基电离，蛋白质带负电荷，蛋白质能够被阴离子交换剂所吸附，相反，当溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷，被阳离子交换剂所吸附，溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质带电荷越多，与交换剂的结合程度也越强，反之则越弱。 当溶液的pH值发生改变时，蛋白质与交换剂的吸附作用也发生变化，因此可以通过改变洗脱液的pH值来改变蛋白对交换剂的吸附能力，从而把不同的蛋白质逐个分离，当pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱，当pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低蛋白质对阴离子交换剂的吸附。 另外，无机盐离子（如NaCl）对交换剂也具有交换吸附的能力，当洗脱液中的离子强度增加时，无机盐离子和蛋白质竞争吸附交换剂。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。 因此，洗脱阴离子交换剂结合的蛋白时，则降低pH值，增加盐离子浓度；洗脱阳离子交换剂结合蛋白时，则升高溶液pH值，增加盐离子浓度，能够洗脱交换剂上的结合蛋白。
蛋白纯化层析 从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术（gel filtration，GF），离子交换层析技术（ion exchange，IEX），羟基磷灰石层析（hydroxyapatite，HAP）和疏水作用层析（hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法（high-performance liquid chromatography，HPLC）。 对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GE Healthcare（原Amersham Biosciences）的技术顾问Andrew Mitchell 解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步： 捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白； 区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白； 修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。 这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量（flow rate）的填料。bead大小比较大，范围比较宽（比较于bead大小平均值）的“fast flow”填料比较理想，
这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。 第二步则对分辨率要求更高，需要更好的从混合物中分离需要的成份。通常bead的大小与分辨率成反比，因此在这一部中比较小的bead 比较合适。吸附性的技术，比如离子交换IEX和疏水作用HI通常被用在纯化的这前两个步骤，而凝胶过滤则会留到了最后的修饰那一步，用于小体积，高浓度的样品。另外要注意，进行凝胶过滤层析时，样品的体积应该保持在柱床体积的1%到4%。 选择柱料的时候有两个因素要考虑到，针对目的蛋白的选择性和有效性——这些可以由洗脱峰的宽度来说明。其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力，IEX和HI层析方法就是指目标分子与筛分介质之间的相互作用，而GF的选择性依赖于填料的分馏范围（fractionation range）。 柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力，Mitchell表示，“如果你的峰值不集中，比较宽，那么即使是选择性很好，分辨率仍然会被消弱”。bead越大，洗脱峰就越不集中，柱子的有效性就越低。纯化洗脱相近的蛋白需要高效性，高选择性和高效性的结合就会得到高分辨率。 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 凝胶过滤法（gel filtration）也称为排阻层析（exclusion chromatography）、凝胶层析（gel chromatography）或分子筛层析（molecular sieve chromatofraphy），它是在1960年后发展出来的技术。
离子交换层析介质的应用 离子交换层析分离纯化生物大分子的过程，主要是利用各种分子的可离解性、离子的净电荷、表面电荷分布的电性差异而进行选择分离的。现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁的纯化技术之一。 子交换层析（Ion Exchange Chromatography 简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析是目前生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。 1.离子交换层析的基本原理： 离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。 离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。 由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立的操作单元，也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要的方法。目前，在生化分离中约有75%的工艺采用离子交换层析法。 2.离子交换层析介质： 离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。 阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可
重组蛋白和多肽的分离纯化 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间 没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生长 没有大的影响，通常可获得高的表 达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解 具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的初期，要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质，还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素，来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（ΔG f→u）来衡量，ΔG f→u越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的ΔG f→u在5—20kcal/molX围之间，单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化，因此ΔG f→u相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋
Protocol 蛋白质纯化方法（镍柱） 柱前操作 1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min; 2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质； 3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体； 4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？ 5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）； 6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱； 平衡柱子（柱体积：V） 7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）； 8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？ 9. 3V BB; 柱层析 10.上样； 11. 10V Washing Buffer（WB）； 12. 6V Elute Buffer（EB); 13.分管收集，每管1~2ml. 各种缓冲液配方 1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.9 1000ml NaCl: 58.44×4=233.76g Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g 2. 8×CB: 400mM NiSO4 1000ml NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g 3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g 4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g 5. 6M 尿素 1000ml 尿素：60.06×6=360.36g
AKTA蛋白纯化系统操作 AKTA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。AKTA系统依据不同的配置，可以分为AKTA EXPLORER、AKTA PILOT、AKTA PURIFIER等多种型号的设备。以下以AKTA EXPLORER为例简单介绍AKTA蛋白纯化系统的一般操作。 1、认识AKTA。 AKTA explorer 是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig 1）。它们是： FIG 1、AKTA EXPLORER主机 ? Pump-900 为双通道高效梯度泵系列。在AKTAexplorer 100，流速范围0.01-100 ml/min，压力高达10 Mpa（泵名为P-901）。在AKTA explore10，流速范围0.001-10 ml/min，压力高达25 Mpa（泵名为P-903）。 ? Monitor UV-900，同时监控190－700 nm 范围内高达3 个波长的多波长紫外-可见（UV-Vis）监测器。（针对部分AKTA PURIFIER机型，尚有UPC-900监测器可供选择，光源为汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。）? Monitor pH/C-900，在线电导和pH 监测的组合监测器。 Fig 2、AKTA EXPLORER硬件模式图
AKTA EXPLORER系统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig 2）。组成部件，如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。打开装阀的门可全部看到。柱被挂在装阀的门的外侧。 分离装置由UNICORN 软件控制。软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CU950进行控制。 2、一般操作 2.1 开机 按位于底部平台前左侧的ON/OFF 按钮，打开色谱系统，然后打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU950上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上UNICORN图标，进入操作界面。UNICORN的操作界面分为四个窗口（Fig 3） Fig 3、Unicorn的操作界面 2.2准备工作溶液和样品 所有的工作溶液和样品必须经过0.45μm的滤膜过滤，样品也可高速离心后取上清备用。当缓冲液中含有有机溶剂（如乙腈、甲醇），需在使用前用低频超声脱气10min。 2.3清洗及管道准备 首先将A泵的进液管道（A1）放入缓冲液或平衡液中，将B泵的进液管道(B1)放入高盐溶液中，在system control窗口点击工具栏内的manual，选择pump→pump wash explorer，选中A1,B1管道为ON，execute。泵清洗将自动结束。(Fig 4) Fig 4、AKTA Explorer的泵清洗操作 2.4安装层析柱
蛋白纯化离子交换层析 研究生的生活，单调的科研，重复的脚印，匆匆的轨迹，踩着早上的时光一如往常的走进实验室，摊开实验记录本，写上日期，就像每天写日记一样开始计划今天的实验日记，用笔似乎要绘制一副有关实验的画面。 如果你处在这样的科研氛围里，慢慢的就会体味到科学本身就像窗外的大自然一样的美，绿色撩人，诗意陶醉…… 今天，我们写下的实验日记——蛋白纯化离子交换层析法，文章详细的总结了离子交换层析的定义、离子交换层析的原理、离子交换剂的种类，似乎要提醒一下脑子要保持清醒了，不然，看完之后，你能分清楚阴阳离子交换剂的概念，熟知它们的区别么？ ————你会创造规律科研生活的美 我，生在春天里，刚发芽的地方是实验室 知了也睡了，而我刷夜实验室 因为我在等待秋天收获的季节 虽然有可能错过成功的喜悦，却收获心灵上的成长
离子交换层析技术是以离子交换剂为固定相，常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过共价键结合某种电荷基团，形成带电基质，带异性电荷的平衡离子能够通过静电力作用结合在电荷基质上，而平衡离子能够与样品流动相中的离子基团发生可逆交换而吸附在交换剂上，不同带电荷蛋白间结合吸附固定相的能力不同。离子交换技术就是根据蛋白质样品间带电性质的差别而进行分离的一种层析方法。 常见的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换树脂和离子交换葡聚糖凝胶。根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的性质不同，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，在阳离子交换剂中，带正电荷的平衡离子能够和流动相中带正电荷的离子基团进行交换。例如DEAE纤维素阳离子交换剂，当纤维素交换剂分子上结合阳离子基团二乙氨乙基（DEAE）时，形成阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，可与带负电荷的蛋白质进行结合，交换阴离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型、弱酸型三类阳离子交换剂，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型只能在较小的pH范围内完全解离，如结合羧甲基的离子交换剂在pH小于6时就失去了交换能力。 强酸型阳离子交换剂一般结合的基团有：磺酸甲基、磺酸乙基；中等酸型阳离子交换剂有：磷酸基团和亚磷酸基团；弱酸型离子交换剂有：酚羟基和羧基类； 在阴离子交换剂中，带负电荷的平衡离子能与流动相中带负电的离子基团进行交换，例如阴离子交换剂CM纤维素，当纤维素交换剂分子上结合羧甲基（CM）时，形成带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），可与带正电荷蛋白质结合，交换阳离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型、弱碱型阴离子交换剂。一般结合季胺基团基质的交换剂为强碱型离子交换剂，结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或者弱碱型离子交换剂。 蛋白质是两性电解质，当溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，蛋白质的静
蛋白纯化层析柱 2011-06-15 15:19:14 易生物仪器浏览次数:1164 网友评论 0 条 从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是... 关键词:蛋白离子交换分离分子物质树脂从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术(gel filtration，GF)，离子交换层析技术(ion exchange，IEX)，羟基磷灰石层析(hydroxyapatite，HAP)和疏水作用层析(hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法(high-performance liquid chromatography，HPLC)。 对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GE Healthcare(原Amersham Biosciences)的技术顾问Andrew Mitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步: 捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白; 区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白; 修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。 这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。
蛋白纯化系统操作流程 一、蛋白的诱导：蛋白原核表达 1、取菌种接种于含Amp LB固体培养基中（分区划线），37℃培养过夜； 2、挑取单克隆接种于5ml含Amp LB液体培养基中，37℃振摇过夜； 3、从过夜培养物中取2ml接种于100ml Amp LB液体培养基中，振摇2h（留样1ml）； 4、加入一定终浓度IPTG，37℃诱导表达4h（留样1ml），离心，弃上清收集细菌。 存入4℃。 二、蛋白表达状态分析（可溶性or包涵体表达） 取少量（1ml）诱导菌体沉淀，加入不含变性剂（如盐酸胍，尿素等）PBS（150μl），超声裂解。分离上清和沉淀，分别SDS-PAGE电泳。 三、蛋白的纯化 纯化前准备 1.推荐在中性至弱碱性条件下（pH 7-8）结合重组蛋白。磷酸盐buffer是常用的缓冲液， Tric-Cl在一般情况下可用，但要注意它会降低结合强度。 2.避免在buffer中包含EDTA或柠檬酸盐等螯合剂 3.若重组蛋白以包涵体形式表达，在所有的buffer中添加6 M 盐酸胍或8 M 尿素 注： 1.包含尿素的样品可直接进行SDS-PAGE分析，若样品中包含盐酸胍，在SDS-PAGE前则 需先用含有尿素的buffer进行透析 2.除利用咪唑洗脱蛋白，其它方法，如低pH 值法等可被应用，详见说明书 Bingding buffer 中咪唑的浓度 在洗涤时所用的Bingding buffer 中咪唑浓度越大，重组蛋白纯度越高。但过高的咪唑浓度将导致蛋白的洗脱。合适的咪唑浓度需要优化。 Buffer 的准备
所用的水及化学物质须是高纯度的。Buffer 在使用前需经0.45 μm滤膜过滤 所用高纯度的咪唑需在280nm 处无吸光度或吸光度极低 推荐buffer Bingding buffer：20 mM 磷酸盐 0.5 M NaCl 20- 40 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！）Elution buffer ：20 mM 磷酸盐 0.5 M NaCl 500 mM 咪唑pH 7.4 （咪唑浓度是蛋白依赖的，可变！） 样品准备 样品需被充分溶解。过柱前经0.45 μm滤膜过滤。样品以pH 7.4 binding buffer 溶解。勿用强酸强碱调节pH 值，否则将可能导致沉淀。 重力纯化法Ni-NTA Column 准备 1. 温和地颠倒瓶中的Ni-NTA Agarose 数次。 2. 吸取2ml的树脂加入15ml离心管中，使树脂在重力(5–10 minutes)或低速离心(5 minute at 500 × g)，轻柔的吸出上清。 3. 加入5ml的无菌蒸馏水，温和的颠倒柱子3min，离心5 minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。 4. 用bingding buffer 重复第3步。 5. 在Ni 柱中加入等体积的bingding buffer，制成50%的slurry 样品与Ni 柱结合 1.每1ml 50%的slurry中加入4ml 的样品。1ml 50%的slurry 可结合20mg His-蛋白 2.将混合物室温，低速振荡孵育1h Buffer 洗涤及洗脱 1.离心5 minute at 500 × g，轻柔的吸出上清。上清保存放在4℃for SDS-PAGE
离子交换层析技术 层析( chromatography) 也称为色谱, 就是将混合物中各种组分分离的方法, 是分离、纯化及鉴定生物大分子时最常使用的技术之一。一个层析系统都包括两相, 即固定相和移动相。当移动相流过加有样品的定相时, 由于各组分在两相之间的分配比例不同, 它们( 各组分) 就会以不同的速度移动而相互分离开来。定相能够是固体, 也能够是被固体或凝胶所支持的液体。定相能够被装入柱中或涂成薄层、薄膜, 成为层析”床”。动相能够是气体, 也能够是液体, 前者称为气相层析, 或者成为液相层析。 离子交换层析技术是以离子交换纤维素、离子交换树脂或离子交换葡聚糖凝胶为固定相, 以待分离的样品为移动相, 分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。 ( 一) 原理 在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团, 当结合阳离子基团时, 可换出阴离子, 则称为阴离子交换剂。如二乙氨乙基( Dicthylaminoethyl, DEAE) 纤维素。在纤维素上结合了DEAE, 含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H, 它的反离子为阴离子( 如Cl-等) , 可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。当结合阴离子基团时, 可置换阳离子, 称为阳离子交换剂, 如羧甲基( Carboxymethy, CM) 纤维素。纤维素分子上带有负电荷的阴离子( 纤维素－O－CH2－COO一) , 其反离子为阳离子( 如Na+等) ,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。 溶液的pH值与蛋白质等电点相同时, 静电荷为0, 当溶液pH值大于蛋白质等电点时, 则羧基游离, 蛋白质带负电荷。反之, 溶液的pH值小于蛋白质等电点时, 则氨基电离, 蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远,
捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC 分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险提示：1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。6、只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC 方法用于精制阶段。注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。 蛋白质的蛋白质特性与分离纯化技术的选择 摘要：蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。 关键词：蛋白质分离纯化 前言： 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。
蛋白纯化系统Biologic-LP使用说明 Biologic-LP是蛋白质层析纯化系统, 其原理是利用不同蛋白分子所具有的特性（如等电点、分子量及亲水或疏水性）与层析柱中的介质产生的吸附作用后，再用相应的洗脱液来对吸附在层析柱上的蛋白进行洗脱。根据目标蛋白及不同层析柱介质的特性，设计相应的洗脱程序可以使目标蛋白与其他杂蛋白先后从层析柱上洗脱下来。通过观察紫外光的吸收峰，可分别收集不同时段洗脱下来的蛋白液。蛋白混合物通过这样的程序可被分离至单个蛋白。通常分布在混合物中的目标蛋白需要通过组合而不是单一的层析路线来进行分离操作。常规的分离路线如通过疏水层析—离子交换—疏水层析的技术路线来有效分离目标蛋白。 本层析系统使用主要分为三个部分。首先在使用前确认分离的技术路线和使用的层析柱。其次根据层析柱使用的要求配制相关试剂和确定层析过程的参数。最后通过层析操作分离纯化目标蛋白，并清洗层析柱和管道以确保仪器能长期有效使用。 一设计蛋白的纯化路线及选择不同的层析柱及层析方法根据目标蛋白的特性及来源，设计纯化的路线并确定每一步操作所需要的层析柱及层析方法。根据不同层析方法的要求，准备蛋白样品及洗脱液及洗脱方式（如线形洗脱或梯度洗脱）。而后确认层析操作中的主要参数。
二层析系统的操作 以下是对所有层析操作中共同的步骤进行的描述。特别注意的是不同的分离方式如离子交换和疏水层析它们的原理和参数设置完全不同。这里仅就相同的操作进行描述，具体的参数设置见使用说明书并咨询负责本仪器的老师，切不可擅自操作，以免破坏仪器。 1、确定目标蛋白层析柱的选择，不同的分离方式选择不同的层析柱。 2、样品制备。根据层析柱介质对蛋白样品的要求，制备样品和洗脱 液。所有用于层析的溶液及样品均要通过0.45μm膜过滤，以免堵塞层析柱。 3、打开层析仪电源，按照显示屏的提示，分别设置好A液、B液、 流速、时间等相关参数，并将接样管插入接样仪。 4、打开电脑及Biologic-LP Data View软件，观察层析过程是否正常 或是否需要调整，做好接样前的准备。 三、层析系统的维护 操作结束后，按仪器使用说明，清洗层析柱及管道，将层析柱保存好，备用。特别注意不同的层析柱要求的清洗方式不同，对管道的清洗也不同，层析柱的保存方式也不同。清洗和保存时一定要按照使用说明书的要求进行操作，不能出现错误以免对层析系统造成破坏。
实验二离子交换层析纯化兔血清IgG 【原理】 DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基- 乙基- 葡萄糖凝胶A-50 ）为弱碱性阴离子交换剂。用NaOH 将Cl - 型转变为OH - 型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ 球蛋白属于中性蛋白（等电点为pH6.85 ～7.5 ），其余均属酸性蛋白。pH7.2 ～7.4 的环境中。酸性蛋白均被DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有γ 球蛋白便可在洗脱液中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG 。 【试剂与器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2.0.5mol/L HCl 和NaOH 3.0.1mol/L pH7.4 PBS 4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4)
5.0.02 ％NaN 3 6.PEG 7. 无水乙醇 8. 紫外分光光度计 9.1cm×20cm 玻璃层析柱 10. 自动部分收集器 【操作步骤】 1 ．DEAE-Sephadex A-50 预处理称DEAE-Sephadex A-50 （下称A-50 ）5g ，悬于500ml 蒸馏水内，1h 后倾去上层细粒。按每克A-50 加0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，将浸泡于0.5mol/L NaOH 液中，搅匀，静置30min ，装入布氏漏斗（垫有 2 层滤纸）中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH 呈中性；再以0.5mol/L HCl 同上操作过程处理，最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次，处理完后，将A-50 浸泡于0.1mol/L pH7.4 PBS 中过夜。
2 ．装柱 （ 1 ）将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。 （2 ）将0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至1/4 高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50 。待A-50 凝胶沉降2 ～3cm 高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min ，同时连续倒入糊状A-50 凝胶至所需高度。 （ 3 ）关闭出水口，待A-50 凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口，通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。 3 ．平衡启开出水口螺旋夹，控制流速 4 滴/min ，使约2 倍床体积的洗脱液流出。并以pH 计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之PH 值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。 4 ．加样及洗脱启开上口橡皮塞及下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品（0.5ml 血清，体积应小于床体积的2% ，蛋白浓度以＜100mg 为宜）。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面
技术标部分 仪器名称：蛋白纯化系统 数量：1套原装进口设备 用途：适用于实验室从分析、小规模制备，到中试规模的工艺摸索和制备，可通过凝胶过滤、离子交换、亲和层析、羟基磷灰石、疏水层析等层析谱技术，进行蛋白质、肽类、多糖、核酸等生物大分子和中草药与天然产物活性成分的分离、纯化和制备。 技术指标： 1.原装进口产品 2. 系统泵 *全自动柱塞泵，双泵四泵头，每个泵头都有独立除气阀 *单泵流速：0.001-10 ml/min 最大流速：20 ml/min 流速准确度：±2%，流速精度：RSD＜0.5% 梯度精度: ±＜0.8%，流速范围：0. 25-10 ml/min 具备恒压调速功能 3. 紫外检测器 *检测范围：0 - 3AU *线性：±2% 光源和流动池分开设计，避免光源过热对样品的影响 4. 电导检测 *检测范围：0.01 mS/cm－999 mS/cm 电导精确度：±0.01 mS/cm，实时自动检测 5. 温度检测 *温度范围：0 - 99 C 温度准确度：±1.5°C 6. 阀门 自动进样阀：1个，自动切换上样、进样和冲洗三个状态 出口阀组件：1个 自动柱位选择阀：1个，无需改变管路连接即可实现旁路及正反向洗脱功能 7. 组分收集器 收集方式：可根据体积、峰或时间自动收集 收集数目：≥100个 收集范围：0.1ml-50ml 具有滴感应器，防滴漏功能
流路：PEEK惰性材料（以保持蛋白活性）耐受有机溶剂 8. 软件 流路实时在现，实时监控和控制 内置层析柱和凝胶信息 具有自动积分、一键积分功能，操作简单，可打印结果报告 9. 配件 上样环：500um，1ml，5ml各一个 预装柱，包含His标签亲和介质等 PH计 10. 配套电脑参数 4核处理器、内存8 GB，独立显卡4G显存、硬盘1 TB，可刻录光驱，24寸的高清显示器 11. 技术支持 技术人员和甲方人员一起设计教学实验，并定期参与相关实验课程
离子交换层析 1、定义 2、发展 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。 3、基本信息 离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阳离子交换树脂；而带有负电荷的称之阴离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。 4、具体操作 预处理和装柱 对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。 洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
Ni柱亲和层析纯化poly-his变性重组蛋白的标准操作规程（编号：066）1、目的及适用范围 利用Ni2+鳌合层析纯化体外表达的带有His标签的包涵体重组蛋白。 2、主要仪器 超声破碎仪、冷冻离心机、Ni柱、垂直混匀仪 3、主要试剂 3.1 裂解Buffer：50mM Tris，5mM EDTA，0.8%NaCl，pH8.5 3.2 变性剂：6M盐酸胍，2mM EDTA， 50mM Tris，10mM DTT，pH8.5 3.3 Buffer B：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH8.0 3.4 Buffer C：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH6.3 3.5 Buffer D：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH5.9 3.6 Buffer E：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH 4.5 4、相关的预处理 Ni柱的预处理： 4.1用5个柱体积的无菌水冲洗柱子； 4.2用5个柱体积的0.1M NiSO4冲洗柱子，使柱子挂Ni； 4.3用5个柱体积的无菌水冲洗柱子，除去多余的Ni； 4.4用5个柱体积的酸性Buffer冲洗柱子（使柱子变得疏松）； 4.5用5个柱体积的Buffer B平衡柱子。 5、操作步骤 5.1蛋白的纯化 5.1.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白； 5.1.2 4500rpm，离心10-15min，收集菌体； 5.1.3用裂解buffer重悬菌体，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体； 5.1.4 将菌体用裂解buffer重悬，超声破碎菌体； 5.1.5 4℃，12000rpm离心15min，弃上清； 5.1.6 将沉淀用PBST洗涤，4℃，12000rpm离心10min，重复1次； 135
AKTA pure操作说明 分子筛层析操作步骤： 1. 开机： 打开AKTA pure开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音）。 2. 打开系统： 打开电脑：双击Unicorn 7.0打开系统，进入log on 界面，用户名默认为Default，输入密码：default，点ok键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。 注意：进入系统时会弹出三个界面：System Control界面，Evaluation界面和Administration界面。其中system Control界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在该界面下完成：Manual---Execute Manual instructions---......；Evaluation界面为结果数据查看及处理窗口；Administration界面为Unicorn 7.0系统设置界面。 3. 洗泵： 把A1泵头从20%乙醇中取出，用去离子水冲洗，放入分子筛缓冲液中，在System Control界面下，点击manual---Execute Manual instructions---Pumps---Pump A wash---点开inlet，选择A1---Excuse。 4. 设置系统参数： 设柱压：Alams---alam systerm pressure---high alam---设置柱压---Execute； 设流速：Pumps---System flow ---设置system flow（1mL/min）---Execute。 注意：流速和柱压设置参照“GE蛋白纯化柱表”，不要超出最高限制。 5. 装柱子(先上后下)： 接柱子的上面：拧下连接进样阀和检测器之间的线，等进样阀出口有液体流出时，拧开柱上面线头的螺帽，将它连到进样阀出口； 接柱子的下面：去掉柱下端连接的注射器，连上接头，连上一段线，待液体滴出滴出液体滴到检测器上的连接口的洞里，滴满，将接头连到检测器的连接口里。 6.平衡柱子： 分子筛buffer平衡柱子，一般要两个小时左右，盐离子浓度达到5.5%左右。 7.设置系统及收集参数： 命名：先end---Manual instructions，点击browse，弹出select result name&location 界面，点开文件夹“defaultHome”，找到文件夹“labdata”，点开，选择自己名字 首字母缩写文件夹(已创建)，在界面下方“name”指令框进行命名。 注意：命名时要标明日期，柱子型号，样品名称。 设流速：Pumps---System flow---设流速（1 mL/min）---Execute； 设柱压：Alams--- alam systerm pressure---high alam---设置柱压---点击Execute； 洗A泵：Pumps---Pump A wash---点开inlet，选择A1---Excuse； 紫外调零：Monitors---Auto zero UV---Execute；