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第六章 补体结合反应技术
（Complement fixation reaction technique ）
一、 概况
可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂质和病毒等，与相应抗体结合后，抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相应的抗原或抗体。这个反应就是补体结合反应。
补体结合反应是一种古老的血清学技术，Bordet 和Gengou 在1901年设计这一试验，由于有敏感性高和适应性广的优点，尽管操作繁杂，目前仍被有效地应用。
（一）补体及其作用特点
补体存在于哺乳动物血清中，各种动物比较，豚鼠血清中补体含量最高，成分较全，效价稳定，采取方便，故通常将豚鼠的全血清作为补体。56℃30min 可使补体失去活性，称为“灭能”或“非动”。
补体的作用为能与抗原—抗体复合物结合，但不能与抗原单独结合，也不易与抗体单独结合；补体的作用没有特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合。它能与红细胞（抗原）和溶血素（抗体）的复合物结合，引起红细胞破坏（溶血），也能与细菌、病毒成分及其相应抗体的复合物结合。
（二）溶血反应
将红细胞多次注射于动物（如将绵羊红细胞多次免疫家兔）可使之产生相应的抗体（溶血 素），这种抗体与红细胞结合，若有补体存在时，则红细胞被溶解，这种现象称为溶血反应。红细胞和溶血素被称为溶血系统，常在补体结合反应中用作测定有无补体游离存在的指示剂。
（三）补体结合反应及其原理
可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等或者颗粒性抗原，与相应抗体结合后，其抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能觉察。如再加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相对应的抗原和抗体。此反应即为补体结合反应。
补体结合反应中的抗体主要是IgG 和IgM 。
反应的原理在于补体本身没有特异性，能与任何抗原抗体复合物结合。以检查鼻疽病为例，先向试管中加入已知的抗原（鼻疽菌的浸出液），再加入被检马匹的血清（抗体）和豚鼠血清（补体），这三种成分称为反应系统或溶菌系统。如果该马是鼻疽病马，则血清中有抗鼻疽杆菌的抗体。抗原和抗体发生结合，吸附补体。如果该马没有鼻疽病，血清中没有抗鼻疽菌的抗体，则不能形成抗原抗体复合物，不能吸附补体，则补体游离存在。
由于许多抗原是非细胞性的，而且上述抗原、抗体和补体三种成分都是用生理盐水或缓冲盐水稀释的比较透明的液体，所以补体不论是否被结合，都不能直接看到，故无法判定。
因此，在反应系统的三种成分作用一定时间之后，再向其中添加指示系统—绵羊红细胞和特异性抗体溶血素。如果抗原和病马血清中抗体特异性结合，吸附补体，没有游离补体存在，加入指示系统，因无补体参加，不发生溶血，这种情况称为补体结合反应阳性，即该马患有鼻疽病；反之，则该马未患鼻疽病。
(四) 补体结合反应的特点
补体结合反应操作繁杂，且需十分细致，反应的各个因子的量必须有恰当的
比例。特别是补体和溶血素的用量。补体的用
量必须恰如其分，例如：抗原抗体呈特异性结
合，吸附补体，本应不溶血，但因补体过多，
多余部分转向溶血系统，发生溶血现象。又如
抗原抗体为非特异性，抗原抗体不结合，不吸
附补体，补体转向溶血系统，应完全溶血，但
由于补体过少，不能全溶，影响结果判定。故
补体量必须恰如其分。溶血素量也有一定影
响，例如阴性血清，应完全溶血，但溶血素量
少，溶血不全，可被误认为弱阳性。另外，这
些因子的用量又与其活性有关：活性强，用量
少；活性弱，用量多，故在本试验之前，必须
精确测定溶血素效价、溶血系统补体价、溶菌
系统补体价等，测定其活性以确定用量。
（五）补体结合反应的应用
补体结合反应是诊断人、畜传染病常用的血清学诊断方法之一。本法不仅可用于诊断传染病，如鼻疽、牛肺疫、马传染性贫血、乙型脑炎、布氏杆菌病、钩端螺旋体病、血锥虫病等，也可用于鉴定病原体，如对马流行性乙型脑炎病毒的鉴定和口蹄疫病毒的定型等。
二、经典补体结合反应（以马鼻疽补反为例）
（一）预备试验
1．绵羊红细胞悬浮液的制备通常用公绵羊红细胞，将绵羊血液采集于带有玻璃珠的无菌容器中，充分振摇，使脱去纤维，此时血液失去凝固性，称脱纤血。
亦可用阿氏液保存血液，阿氏液配方如下：
葡萄糖24.60g
氯化钠 5.04g
柠檬酸钠（含2个分子结晶水）9.60g
蒸馏水 1 200ml
溶液配好后，高压（10磅）灭菌10min，也可通过蔡氏滤器灭菌。溶液盛于瓶内，将绵羊血直接采入瓶内，血量应大致与阿氏液量相等。摇匀，置冰箱中保存，可保存3周左右。
用时将血液移入离心管内，加3～5倍量生理盐水，离心沉淀洗涤三次，每次2 000r／min，离心10min，然后去掉上清液，血球泥用生理盐水配成2.50％液应用。
2．溶血素效价测定溶血素是用绵羊红细胞，经多次免疫家兔，抽取家兔血清，加入甘油而成。在冰箱中可保存二年以上。每隔两、三个月测定效价一次。溶血素可从生物制品厂购买。
溶血素效价测定的方法：先将溶血素稀释成100倍，即0.20ml的溶血素（溶血
? 2 ?
? 3 ?
素实量含0.10ml ）加入9.80ml 生理盐水混合即可。然后按表6—1配成稀释液：
表6-1溶血素稀释表
稀释倍数
1 000 1 200 1 500 1 800
2 000 2 500
3 000 3 500
4 000
1︰100溶血素 生理盐水
全量
0.10
0.90 1.00 0.10 1.10 1.20
0.10 1.40 1.50
0.10 1.70 1.80
0.10 1.90 2.00
0.10 2.40 2.50
0.10 2.90 3.00
0.10 3.40 3.50
0.10 3.90 4.00
另取小反应管一列，按次序从每一稀释液取0.50ml 分别加入各管中，添加时应由稀释度大的
稀释液加起，这样可不必更换吸管。然后再加入生理盐水1.00ml ，1︰20补体和2.50％红细胞悬液各0.50ml 。在37℃水浴槽中放20min 后判定结果。详细操作程序见表6-2。
表6-2 溶血素效价测定示例
试验中
发生全部溶
血的溶血素
最大稀释倍
数（即1︰2
000），微溶
血素的效
价，亦称一
个溶血单
位。做正式
试验时，溶
血素按二个
单位稀释使用。在本例中，其使用浓度应为1︰1 000。
3．补体的效价测定 取健康豚鼠3只以上，饲喂前，每只从心脏取血8ml ～15ml ，注入培养皿内，放入37℃温箱内30min ，取出置4℃冰箱内，待血清析出后，吸入离心管中，3 000r ／min 离心15min ，取上清趁新鲜稀释使用。如一次采取大量补体，可定量（1ml ～2ml ）分装于青霉素瓶内，置低温冰箱冻结保存。避免反复冻融。也可从兽药厂购买冻干补体，在冰箱内可保存三年。 测定和使用补体时，按表6-3进行。
表6-3补体效价测定表
试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 对照 1︰20补体 0.10 0.13 0.16 0.19 0.22 0.25 0.28 0.31 0.34 0.37 0.40 — 生理盐水 0.90 0.87 0.84 0.81 0.78 0.75 0.72 0.69 0.66 0.63 0.60 1.00 一个工作量抗原
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
0.50
37℃水浴20min
致敏血球 1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00
1.00 1.00
1.00
1.00 结果
部分溶血
全部溶血
不溶
补体效价测完后，按表添加各种成分。所用的致敏血球是将2单位溶血素和2.50％红细胞液等量混合后，置37℃水浴中15min ，即成为致敏血球。
在2单位溶血素的存在下，能使0.50ml 的2.50％红细胞完全溶血的最小补体量，
稀释 倍数 1 000 1 200 1 500 1 800 2 000 2 500 3 000 3 500 4 000 溶血素对照 补体 对照 血球
对照
溶血素 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
生理 盐水
1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.50 1.50
2.00
1:20 补体
0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 — 0.50 —
2.50％红细胞
0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
37℃水浴20min
结果 全部溶血 部分溶血 不溶血
即为该补体的效价。在本例中，补体效价为1:20稀释液0.25ml。
效价测完后，按下列计算原补体在使用时应稀释的倍数。
0.50／0.25×20.0＝40.00
即此补体应作1︰40稀释使用，每管加入0.50ml，此即为1个单位补体。考虑到补体性质不稳定，在操作过程中效价会降低，故此使用浓度比原效价大10.00％左右较为适宜。因此，本批补体应用1︰36稀释使用，每管加入0.50ml。
4．抗原效价测定鼻疽补体结合反应抗原是用强毒鼻疽杆菌的混悬液，经高压灭菌，并在冷处浸泡取其滤液制成的。鼻疽抗原可向兽药厂购买。使用时按出厂使用说明书或标签标明的效价稀释应用。如因保存时间过久或其它原因，抗原效价可能发生变化，使用前加以滴定。
⑴抗原稀释：用生理盐水将抗原原液作成9种稀释液，方法如表6-4。
表6-4 抗原稀释表
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 稀释倍数10 50 75 100 150 200 300 400 500
生理盐水（ml）
抗原（ml）
实存量（ml） 6.50 5.00 7.50 6.50 4.50 4.00 4.50 4.00 5.00
⑵血清稀释：取鼻疽强阳性血清和弱阳性血清各一份，用生理盐水按表6-5做成5种稀释液，在60℃水浴中灭能30min。
表6-5 鼻疽阳性血清稀释表
稀释倍数10 25 50 75 100
9.00 9.60 9.80 7.40 9.90
生理盐水
(ml)
血清（ml） 1.00 0.40 0.20 0.10 0.10
⑶操作法：按表6-6进行。摆12排反应管，由左向右加入不同稀释度的抗原0.50ml。然后再由上向下，第一排的9个试管各加入1∶10灭能的阴性马血清0.50ml。第二排的9个试管各加入生理盐水0.50ml。第三排至第七排试管分别加入不同稀释度的强阳性血清0.50ml。第八排到第十三排再分别加入不同的稀释度弱阳性血清0.50ml。所有试管加入一个单位补体0.50ml，混匀后置37℃水浴箱20min取出，每管加致敏血球1.00ml，摇匀后，置37℃水浴20min，取出，观察反应结果。
表6-6 抗原效价测定表
抗原稀
10 50 75 100 150 200 300 400 500
释倍数
抗原(ml) 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.5
0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
稀释血清
（ml）
补体（ml）0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
37℃水浴20min
? 4 ?
致敏血
球（ml）
1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
37℃水浴20min
抗原效价测定的结果根据溶血百分数来判定
表6-7 抗原效价测定结果示例
抗原稀释10 50 75 100 150 200 300 400 500
阳性血清1:10 0 0 0 0 0 10 30 30 500
1:25 0 0 0 0 0 20 40 40 100
1:50 10 0 0 0 10 30 50 50 100
1:75 50 20 10 0 20 50 70 70 100
1:100 80 80 70 60 90 100 100 100 100
表注：表中0～100均为溶血的百分比
表6-7是一份强阳性血清测定结果的一个示例。按比例，抗原1︰100稀释液与强阳性血清的
各稀释度所发生的抑制溶血现象最强。如果对弱阳性血清的各稀释液的反应亦与此相同，则此批抗原的效价为1︰100，这就是一个抗原工作量。应注意，测定抗原必须用病马阳性血清，不可使用注射鼻疽死菌免疫的兔高免血清。
5．待检血清和对照血清对照用鼻疽阳、阴性血清可于兽医生物制品厂购买，也可自送检血清中选取。
待检血清采血时，最好在早饲前或在停食后6h，以免血清混浊。采血后，趁血未凝固，将试管斜置，使其凝成斜面。凝固后将试管置于温暖处，使血清析出，经过10余小时，将血清倾入另一干净无菌试管中。如血清析出不良时，可用镍线将血凝块划破，并使之从管壁脱离，放于冷暗处，使血清充分析出。
血清采后最好于1天内送到实验室，最迟不超过3天。若3天内不能送到，应加防腐剂。通常加0.50％石炭酸防腐。试验前，用生理盐水将待检血清稀释10倍，然后在水浴槽内加温灭能30min，马血清加温到60℃。驴、骡血清为63℃～64℃。灭能不但能消除血清中的补体和抗补体作用，且能使它在反应中作用趋于稳定。
（二）本试验
预备试验完毕之后，即可进行本实验（参见表6-8）。
待检血清作1︰10稀释，分装两管，各0.50ml。其中一管加抗原，一管不加抗原，作为血清抗补体对照。对照血清用阳、阴性血清各一份。补体加一个单位0.50ml。混合后，置37℃水浴中20min。取出后，所有试管加致敏血球1.00ml，混匀、再于37℃水浴中放20min。取出后，判定结果。
表6-8鼻疽补体结合反应本试验操作程序
试验管
待检血清
阳性血清对照阴性血清对照抗原对照补体对照试验对照
1:10血清0.50 0.50 0.50 0.50 －－
抗原(一个工
作量)（ml）
0.50 －0.50 0.50 0.50 －
补体(一个工0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.5
? 5 ?
作量)（ml）
－0.50 －－0.50 1.00 生理盐水
（ml）
37℃水浴20min
致敏血球
1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
（ml）
37℃水浴20min
结果（例）＋＋＋－＋＋＋＋－－－符号记载说明：
＋＋＋＋：90％～100％抑制溶血。
＋＋＋：50％～90％抑制溶血。
＋＋：30％～50％抑制溶血。
＋：10％～30％抑制溶血。
－：0～10％抑制溶血。
试验结果：阳性血清对照管必须100％抑制溶血，方认为正确。观察反应可使试验结束后进行第一次判定，先将阴性血清判定完。其余血清，可放暗处数小时，待红细胞下沉后，再作第二次判定，较为方便。
在马鼻疽，若反应为“＋＋＋＋”或“＋＋＋”时，可判为阳性；若为“＋＋”或“＋”时判为可疑；若为“－”时判为阴性。
为了判定上的方便，可制出标准溶血管。其制法为：取在本试验中使用的2.50％红细胞混悬液5ml于离心管中，离心沉淀，去上清液，加入20ml蒸馏水，用力振摇，使红细胞完全溶解，再加入5ml 4.50％氯化钠溶液，此为100％溶血液。
取本试验用的2.50％红细胞混悬液5ml，于20ml生理盐水混合，此为100％不溶血的红细胞混悬液。
取11支反应管，其管口粗细应与所用的反应管相一致。按表6-9加入上述两种成分。
表6-9标准溶血管配制
试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
100％溶血液 2.00 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.2 －
100％不溶血混悬－0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.10
溶血％100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
相当于抑制溶血％0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
三、微量补体结合反应（以钩端螺旋体病为例）
本试验采取热法血清稀释法。每滴相当于0.02ml，总量为6滴，相当于0.12ml。
? 6 ?
1．抗原系各型菌株培养物多价抗原，按瓶签说明倍数稀释。
2．溶血素正式试验时使用2个工作单位。
3．补体系冻干补体用灭菌生理盐水作1︰5基础稀释。在溶血素效价测定和补体效价滴定时均作1︰60稀释，在正式试验时，用2个工作单位。
4．1％的红血球悬液，用灭菌生理盐水洗涤与配制。在使用时与等量含2个工作单位的溶血素液配成致敏红血球悬液。
5．阳性血清正式试验时1︰100稀释。
6．阴性血清正式试验时1︰10稀释。
7．生理盐水
（二）预实验
1．溶血素效价测定用小试管做时，单位为ml；用血清稀释板做时，单位为滴。
⑴溶血素稀释：先将溶血素做1︰1 000基础稀释。见表6-10。
表6-10溶血素稀释表（单位：滴）
稀释度1:1 000 1:2 000 1:3 000 1:4 000 1:5 000 1:6 000 1:7 000 1:8 000
生理盐水1:1 000溶血素－
1
1
1
2
1
3
1
4
1
5
1
6
1
7
1
⑵溶血素效价测定见表6-11。
表6-11溶血素效价测定表(单位：滴)
1:1 000 1:2 000 1:3 000 1:4 000 1:5 000 1:6 000 1:7 000 1:8 000 溶血素 1 1 1 1 1 1 1 1
1:60补体 2 2 2 2 2 2 2 2
生理盐水 2 2 2 2 2 2 2 2
1％红血球
悬液
1 1 1 1 1 1 1 1
置微型振荡器震荡3min~5min后，放37℃水浴10min
溶血程度举例＃＃＃＃＃＋＋＋＋－根据上述结果,溶血素效价为1︰5 000即为一个工作单位。2个工作单位溶血素为1︰2 500稀释度。
2．补体效价测定
⑴补体稀释，见表6-12。
表6-12补体稀释表（单位：ml）
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1:60补体0.05 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.05 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16
生理盐水0.25 0.22 0.20 0.18 0.16 0.14 0.25 0.22 0.20 0.18 0.16 0.14
⑵补体效价测定,见表6-13。
表6-13补体效价滴定表(单位：滴)
补体 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
?7 ?
抗原－－－－－－ 1 1 1 1 1 1 生理
盐水
1 1 1 1 1 1 －－－－－－
置微型振荡器3min~5min后，放入37℃水浴10min
1％致敏
红血球
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
振荡3min~5min后，放37℃水浴10min
溶血程度(举例) －＋
＋
＋
＃＃＃－＋
＋
＋
＃＃＃
表注：1号~6号不加抗原，7~12号加抗原，当结果不一致时,以加抗原的结果为准。
以2个单位补体稀释度计算。按上表所示，在两列中达到完全溶血（＃）时，最小补体量1︰60稀释为0.12ml，（即为第四管与第八管）做为1个补体单位。在抗原效价测定和正式试验时，使用补体0.20ml中应含2个单位补体。所以补体的稀释度应为：60︰（0.12×2）＝x︰0.20,x=50,即取1ml补体原液加49ml生理盐水即成。
3．抗原效价测定新生产的抗原可按瓶签说明效价用，贮藏过久的抗原，应作效价测定后使用。
⑴抗原稀释：用血清稀释板做，见表6-14。
表6-14抗原稀释表（单位：滴）
抗原
稀释度
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
⑵抗原效价测定：见表6-15
表6-15抗原效价测定表（单位：滴）
抗原稀释度1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 对照抗原 1 1 1 1 1 1 1 －
阳性血清1:10
1:100
1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 －
2单位补体 2 2 2 2 2 2 2 2
生理盐水－－－－－－－ 2
振荡3min～5min，37℃水浴10min
1％致敏
红血球
2 2 2 2 2 2 2 2
振荡3～5min，37℃水浴10min，判定结果。
3．抗原效价测定见表6-16。
?8 ?
表6-16抗原效价判定表（例）
抗原稀释度1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 对照
阳性血清1:10
1:100
＃＃＃＃＃+++ +
＃＃＃＃＃＃－
阴性血清－－－－－－－
生理盐水－－－－－－－
以抗原的最高稀释度与最高稀释度的阳性血清呈完全抑制溶血者，作为抗原效价。按表6-16，抗原效价为1︰32，即在使用时将抗原以生理盐水作1︰32倍稀释。阴性血清对照应完全溶血。抗原抗补体对照应不超过1︰2稀释度，为合格。
（三）本实验
见表6-17。
表6-17微量补反试验表（单位：滴）
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
被检
血清1:10 1:20 阳性
血清
1:100
阴性
血清
1:10
抗原
抗补体
对照
1:10
被检
血清
抗补
体对照
1:10 1:20
阳性血清抗
补体对照
1:100
阴性血清抗
补体对照
1:10
血清 1 1 1 1 － 1 1 1 1
抗原 1 1 1 1 1 －－－－
2单位
补体
2 2 2 2 2 2 2 2 2
生理
盐水
－－－－ 1 1 1 1 1
振荡3min～5min，37℃水浴10min
1％致敏红血
球
2 2 2 2 2 2 2 2 2
振荡3min～5min，37℃水浴10min
抑制溶
血程度
＃＃＃－－－－－﹤±（四）注意事项
1．结果判定时，完全透明为100％溶血（＃），混浊为50％溶血（++）时，判定以后者标准为依据。
2．抗原效价低于1﹕4时，不可使用。阳性血清效价低于1﹕100（抑制溶血程度＃）者，不能用于抗原效价测定。但若抑制程度在++以上者，尚可供正式试验时阳性血清对照用。
3．V型血清板较U型血清板反应观察清晰。
4．由于血清板传热性能较差，所以感作时间应适当延长。一般以阴性血清对照孔完全溶血为止。
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四、固相补体结合反应
（以固相反向补反检测脑炎病毒为例）
（一）材料与试剂
1．pH7.2巴比妥缓冲液
氯化钠85.00g
巴比妥 5.75g
巴比妥钠 3.75g
氯化镁（MgCl2·6H2O） 1.88g
氯化钙0.28g
H2O 加至 2 000ml
配制时，先将巴比妥溶于500ml水中，然后加入氯化钠和巴比妥钠，加水至2 000ml，最后加入氯化镁和氯化钙。高压灭菌后，置4℃保存，此为原液。应用时，以蒸馏水作1：5稀释，配成使用液，并测定使用液的pH值。如pH值过高则以巴比妥调节，过低则以巴比妥钠调节。
2．1％琼脂糖，并以0.10％叠氮钠防腐。
3．绵羊红细胞
4．溶血素要求效价在1.0×104倍以上。
5．乙脑病毒P3株，其对小白鼠（8g～10g体重）的MLD（脑内）为1.00×10-9／0.03ml。
6．抗乙脑病毒抗体是采用地鼠肾细胞培养的乙脑病毒物多次腹腔接种豚鼠而获得，补体结合反应效价达256×以上为合格。应用前，需加入1／10量的新鲜补体液，37℃水浴感作1h，然后56℃感作30min以灭活补体。此过程是除去豚鼠血清中的抗补体成分。
7．正常豚鼠血清
8．塑料琼脂扩散板板长7.20cm，宽2.50cm，高0.20cm。
（二）操作方法
1．绵羊细胞的致敏取效价1.00×104倍以上的溶血素，以pH7.2的巴比妥缓冲液做100×稀释，同时加入已洗涤好的绵羊红细胞泥，配制成40％左右（V/V）的红血球，充分混合后，置37℃水浴感作30min，其间振荡2次～3次。然后4℃保存。这种致敏红细胞可在4℃内保持一周有效。
2．固相致敏血球板的制备将以上致敏红细胞悬液37℃水浴预热后，吸取0.1ml，加入已融化好并冷却至50℃～55℃的1％琼脂糖（3ml）管中，迅速倾倒混合均匀，并倾入塑料琼脂扩散板中，自然冷却后加盖，4℃保存。此板可保存2周。
3．敏感试验每批固相致敏血球板制好后，必须进行敏感性试验。选其中一板，在琼脂上打孔，直径6mm，滴入以生理盐水稀释的3倍的补体（豚鼠血清），盖上盖，放入37℃温箱中1h 后取出观察，应出现溶血圈。放置4h后溶血圈的直径达8mm以上者为合格固相致敏板。
4．打孔用直径6mm的打孔器在琼脂板上打孔两排，上下排各4个。同时在
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右上角打一小孔，以作为方位记号。
5．样品处理将乙脑感染的鼠脑和健康正常的鼠脑分别用生理盐水于研磨器研磨成均匀的10×稀释的乳剂，以3 000r／min离心20min，吸取上层液供检验用。
6．样品预处理在小管中滴加等量的（如1～2滴）10×稀释的脑乳剂离心上清液，免疫血清和补体，充分混合，置37℃感作2h～6h。同时用阴性血清同样处理。
7．加样每个样品加两个孔，上孔加阴性血清处理的样品，下孔加阳性血清处理的样品，加样必须一致，以加满为度。
8．扩散加毕后加盖，置37℃扩散，并随时观察记录结果。
（三）结果判定
37℃温箱感作1.5h～2h后初判，首先看上排孔，此时都已出现清晰但较窄的溶血圈。随即观察下排孔，有不出现溶血圈者即判为阳性，也出现溶血圈者（可能比上孔的溶血圈稍窄），判定为阴性。如果反应不清晰，可在滴样后4h再作一次终判。此时溶血圈较宽，故可测量同一病料上孔与下孔的溶血圈直径之差。以相差1.5mm以上者为阳性，相差1mm～1.5mm者为可疑，相差1mm 及以下者为阴性。溶血圈中溶血不完全时扣0.5mm，例如溶血圈直径为7mm，但溶血不完全，则以6.5mm计算。
当初判与终判结果发生矛盾时，以初判为准。
为便于观察和测量溶血圈，可在致敏血球板下置一白纸，距离20cm左右，判定时由上向下观察
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第五章补体参与的反应 内容 一、溶血试验 二、补体结合试验 一、溶血试验 当红细胞与相应抗体相结合，在电解质存在时，可使红细胞产生凝集现象；若同时加入新鲜动物血清，则血清中的补体可与红细胞及其抗体（溶血素）形成的免疫复合物结合，从而激活补体导致红细胞溶解，产生溶血现象。 【材料】 1、抗原：2%绵羊红细胞（简称SRBC）。 2、抗体：溶血素即（SRBC抗体）。 3、补体，新鲜豚鼠血清。 4、生理盐水。 5、小试管、刻度吸管、试管架、37℃水溶箱等。 【方法】 1、取小试管3支，编号后按下表加入各物（容量单位均为ml） 溶血试验加样表（表2—1）单位ml 管号2％红血球溶血素（2单位）补体（2单位）生理盐水结果 1 0.5 0.5 0.5 0.5 2 0.5 0.5 - 1.0 3 0.5 - 0.5 1.0 2、将试管摇匀后置37℃水箱内：15—30分钟，取出观察有无溶血现象； 3、结果观察：管底无血球沉淀，液体红色透明管为溶血。 注意分析结果及其意义，了解补体的性质与作用。 二、补体结合试验 凝集反应和沉淀反应分别是颗粒性抗原、可溶性抗原与特异抗体结合的结果。补体结合试验，则是基于抗原抗体复合物可以结合补体的原理，在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统来检测抗原或抗体是否发生特异性结合的一种抗原抗体反应。 补体结合试验有两个系统共五个成分参加：检测系统的已知抗原（或抗体）与持检抗体（或抗原）、补体、指示系统的绵羊红细胞和溶血素。依次加入检测系统成分与补体作用后再加指示系统，若不出现溶血，即为补体试验阳性，表示检测系统中抗原抗体相对应（待检标本中有相应抗体或抗原），形成抗原体复合物并结合了补体，指示系统因缺乏补体而不发生溶血；反之若出现溶血，则为补体试验阴性，表示检测系统的抗原抗体不对应（持检标本中无相应抗体或抗原），不能结合补体，游离的补体与后加入的指示系统结合，导致绵羊红细胞溶解。 补体结合试验敏感性和特异性均较高，可用于检测梅毒，立克次体病和病毒感染等患者体液中的抗体或抗原以辅助诊断，还可用于某些病毒的分型。但本试验操作繁琐，影响因素甚多，各种参与成分均需适量（在正式试验之前必须通过一系列预备试验来滴定补体、溶血素、抗原或抗体的单位，以确定其使用量），并需设立多种对照和使用洁净试管等，才能保证实验结果的可靠性。因此，近年来其应用日趋减少，而为其它新的免疫学方法所取代。 【材料】 1、抗原：（已知，并已经滴定调定）。 2、灭活的持检血清。阳性血清和阴性血清（56℃×30' 灭活）。 3、补体（2个使用单位）。
一、填空题 1.补体系统由、和组成。 2. 补体三条激活途径为、和，它们的C3转化酶分别为、和。A,C123456789 3补体固有成分对热不稳定,通常加热到，作用即可灭活。 4. C1是由三个亚单位__ （识别Ig补体结合位点）、、（有酯酶活性)组成。 5. 补体的经典激活途径激活物为和类抗体与抗原结合形成的复合物。 6. 参与旁路激活途径的补体固有成分有__ 、、、和C5b~C9。 =、选择题 【A型题】 1.补体经典激活途径中,补体成分激活顺序是 A.C123456789 B.C145236789 C.C124536789 D.C142356789 E.C132456789 2.在经典激活途径中补体的识别单位是 A.C3 B. C2 C.C1 D.C9 E.C5 3.下列补体固有成分中含量最高的是 A.C3 B.C4 C.C1q D.C2 E.C5 4.具有激肽样作用的补体裂解片段是 A.C2a B.C3a C. C4a D.C3b E.C5a 5.具有免疫黏附作用、又有调理作用的补体裂解片段是 A.C2b B. C3b C. C4b D.C5b E. C5a 6.三条补体激活途径的共同点是 A.参与的补体成分相同 B.所需离子相同 C.C3转化酶的成分相同 D.激活物相同 E.膜攻击复合体的形成及其溶解细胞的作用相同 7.补体系统的三条激活途径均参与的成分是 A.C2 B.B因子 C.C1 D.C3 E.C4 8.补体 A.是一组具有酶活性的脂类物质 B.对热稳定 C.具有溶菌作用,但无炎症介质作用 D.参与免疫病理作用 E.C1在血清中含量最高 9.可刺激肥大细胞脱颗粒释放活性介质的成分是 A.C1q B.C5a C.C3b D.C4b E.C1s 10.具有过敏毒素作用的补体组分是 A.C3a、C5a B. C3a、C4a C. C3a、C4a、C5a D.C3a、C5b67 E.C3b、C4b 11.不参与C5转化酶形成的补体成分是 A.C4 B.c5 C.C3 D.C2 E.B因子 12下列哪种成分是C3转化酶? A. C234 B. c567 C. C3bBb D. C3bBbp E. C1s 13. .激活补体能力最强的Ig是
实验报告
4. 补体结合反应实验原理 补体结合反应是一种有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。参与本反应的五种成分可分为两个系统： 一为待检系统，即为已知抗原（或抗体）和待检抗体（或抗原）； 另一个为指示系统，即绵羊红细胞和其相应的溶血素。待检抗原、抗体和补体作用后，再加入指示系统。若待检系统中的抗原和抗体相对应，两者特异性结合后激活补体，补体被消耗。再加入的指示系统无补体结合，不出现溶血；若待检系统中的抗原与抗体不对应或缺少一方，补体不被激活，当指示系统加入后，绵羊红细胞和溶血素复合物激活补体，产生溶血现象。 5. 空斑形成实验 是一种体外检测IgM、IgG类型抗体产生细胞的实验方法，又称空斑形成细胞（PFC)测定。可作为评估药物影响抗体产生水平以及临床筛选抗肿瘤新药的重要依据。 经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞混合后，抗体形成细胞产生的抗体与绵羊红细胞结合；在补体参与下，绵羊红细胞溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
一、SRBC的制备 （一）无菌抽取绵羊血 1.手术剪减去绵羊颈部毛发备皮，止血带扎住颈部，碘酒消毒，酒精棉球再擦拭。 2.抽取一定量的绵羊血，注入无菌玻璃瓶，轻轻摇晃获得抗凝绵羊血，摇晃时不能用力过猛，防止SRBC破裂。 （二）绵羊红细胞的制备 1.在无菌实验室中，用移液枪吸取5ml抗凝绵羊血于试管中，共4支试管。 2.配平后对称放入离心机中2000rpm离心10分钟。 3.4支试管，胶头滴管吸去上清液，加入适量的灭菌生理盐水后轻轻摇晃混匀。 4.再次配平后，2000rpm离心10分钟，2-3次。 5.吸去上清液，获得绵羊红细胞。 （三）绵羊红细胞悬液制备 1.20%绵羊红细胞悬液制备 在无菌实验室中，用移液枪吸取2ml绵羊红细胞于锥形瓶中，用移液管再加入8ml灭菌生理盐水，混合均匀。 2.2%绵羊红细胞悬液制备 在无菌实验室中，用移液枪吸取1ml绵羊红细胞于锥形瓶中，量筒量取49ml无菌生理盐水加入锥形瓶，混合均匀。 二、溶血素的制备 （一）免疫接种程序
第十九章补体参与的反应及补体测定 Complement Mediated Reactions and Assays of Complement 第一部分目的要求和教学内容 一、目的要求 掌握：免疫溶血试验及CH，。测定的原理及意义；熟悉：补体参与的反应试验类型、补体依赖的细胞毒试验的原理、旁路途径溶血活性测定；了解：补体结合试验和免疫黏附试验的原理、C4和B因子活性测定的原理。 二、教学内容 1．补体参与的反应：免疫溶血试验，补体结合试验，补体依赖的细胞毒试验，免疫黏附试验。 2．补体的测定：补体活性的测定，补体含量的测定，补体测定的临床意义。 第二部分测试题 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1．溶血素效价滴定判定的温度和时间是 A．37℃、30min B．4℃、30min C．37℃、15min D．40℃、30min E．56℃、30min 2．在补体连锁反应中最终形成的攻膜复合体是 A．C5b6789 B．C4b2a3b C．C4b2b D．C3bBb E．C3b4b 3. 下列哪项试验没有补体参加 A．CH试验 B．CDC试验 C．溶血空斑试验 D．ADCC试验 E．Raji细胞试验 4．补体结合试验中所用补体是哪种动物血清 A．马血清 B．绵羊新鲜血清 C．豚鼠新鲜血清 D．大白鼠新鲜血清 E．山羊新鲜血清
5．下列哪项试验不能用于补体缺陷的过筛诊断 A．CDC式验 B．CH50试验 C．血清C3含量测定 D．血清Cl含量测定 E．C4溶血活性试验 6．B因子溶血活性测定中，在缓冲液中加．),．EGTA是为了螯合反应体系中的A．Mg2+离子 B．Ca2+离子 C．zn2+离子 D．Fe3+离子 E．P3+离子 7．在单个补体成分溶血活性测定中，用氨水处理是为了去除哪个补体成分A．C1 B．C2 C．C4 D．C5 E．C3 8．检测免疫小鼠脾细胞分泌到细胞外的抗SRBC抗体的试验是 A．CH50试验 B． CFT C，APH50测定 D．B因子活性测定 E．溶血空斑试验 9．利用溶血反应作为指示系统，判断抗原抗体是否相对应的试验是 A．CHs50试验 B．CFT C．APH50测定 D．B因子活性测定 E．抗补体试验 10．补体经典途径的最重要激活物是 A．特异性抗原 B．特异性抗体 C．抗原抗体复合物 D．细菌脂多糖 E、酵母多糖 11.正常血清中,补体含量最低的是 A.C1q B. C5aR C. C1rR D.Df E.C1INH 12.正常血清中,补体含量最高的是 A.C1 B.C2 C.C3
第十一节补体结合反应技术 （Complement fixation reaction technique） 一、概况 可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂质和病毒等，与相应抗体结合后，抗原抗 体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入红细胞和溶血素，即 可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相应的抗原或抗体。这个反应 就是补体结合反应。 补体结合反应是一种古老的血清学技术，Bordet和Gengou在1901年设计这一 试验，由于有敏感性高和适应性广的优点，尽管操作繁杂，目前仍被有效地应用。 （一）补体及其作用特点 补体存在于哺乳动物血清中，各种动物比较，豚鼠血清中补体含量最高，成分 较全，效价稳定，采取方便，故通常将豚鼠的全血清作为补体。56℃30min可使补 体失去活性，称为“灭能”或“非动”。 补体的作用为能与抗原—抗体复合物结合，但不能与抗原单独结合，也不易与 抗体单独结合；补体的作用没有特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合。它能 与红细胞（抗原）和溶血素（抗体）的复合物结合，引起红细胞破坏（溶血），也能 与细菌、病毒成分及其相应抗体的复合物结合。 （二）溶血反应 将红细胞多次注射于动物（如将绵羊红细胞多次免疫家兔）可使之产生相应的抗体（溶血 素），这种抗体与红细胞结合，若有补体存在时，则红细胞被溶解，这种现象称为溶 血反应。红细胞和溶血素被称为溶血系统，常在补体结合反应中用作测定有无补体 游离存在的指示剂。 （三）补体结合反应及其原理 可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等或者颗粒性抗原，与相应抗体结 合后，其抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能觉察。如再加入红细 胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相对应的抗原 和抗体。此反应即为补体结合反应。 补体结合反应中的抗体主要是IgG和IgM。 反应的原理在于补体本身没有特异性，能与任何抗原抗体复合物结合。以检查 鼻疽病为例，先向试管中加入已知的抗原（鼻疽菌的浸出液），再加入被检马匹的血 ? 1 ?
安徽理工大学医学院
（教案续页） 基本内容辅助手段和时间分配备注 第一节补体系统的性质与活化途径 一、补体系统的组成与性质 补体(complement，C)是存在于人和脊椎动物血清及组织中的一组具有酶样活性、不耐热和功能上连续反应的球蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，故称为补体系统。补体并非单一成分，而是由补体及其调节因子和相关膜蛋白以及补体受体共同组成的补体系统。补体系统广泛参与机体的抗感染防御反应，具有介导细胞溶解、调理吞噬、免疫黏附以及参与炎症反应引起机体免疫损伤等作用，是体内具有重要生物学功能的免疫效应和放大系统。 补体系统由30多种活性成分组成，按其性质和功能可以分为三大类：①补体系统的固有成分；②以可溶性或膜结合形式存在的补体调节蛋白； ③结合补体片段或调节补体生物学效应的补体受体受体(complement receptor，CR)。 由于由于补体系统组成和功能的复杂性，其命名较为复杂，一般有以下规律可循：参与补体经典邀活途径的固有成份，按其被发现的先后次序命名为C1、C2、……C9，其中Cl由Clq、Clr、Cls三种亚单位组成；补体系统的其他成分以英文大写字母表示，如B因子、D因子、P因子、H因子；补体调节蛋白多以功能命名，如Cl抑制物、C4结合蛋白和膜协同因子蛋白等；补体活化后的裂解片段，以该成分的符号后面附加小写英文字母表示，如C3a、C3b等；具有酶活性的成分或复合物，在其符号上划一横线表示，如Ci、C—3bB—b等；灭活的补体片段，在其符号前加英文字母i表示，如iC3b。补体性质不稳定，易受各种理化因素影响，加热、紫外线照射、机械振荡或某些添加剂等理化因素均可能破坏补体。在0-10℃补体活性可保持3～4天，冷冻干燥可较长时间保持其活性，加热56℃30 min即被灭活，所以补体活性检测标本应尽快进行测定。 补体多为糖蛋白，且多属于B球蛋白，少数为7球蛋白或a球蛋白，其中Clq分子量最大，D因子最小。正常血清中补体各组分含量相差较大，以C3含量最多，D因子最少。 二、补体活化途径 补体系统各组分通常以非活性的酶前体形式存在，只有在某些活化物的作用下，补体各组分便产生连锁酶促反应，又称级联反应，才表现出生
第二节补体结合试验 补体结合试验（complementfixationtest，cft）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。 一、类型及原理 该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图14-2）。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。
图14-2补体结合试验示意图 二、试验方法 补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。 （一）试剂 1．抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。2．抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓
第十九章（2）补体参与的反应及补体测定Chapter 17 Complement Mediated Reactions and Assays of Complement 第一部分教学内容和要求 一、目的要求 ·掌握：免疫溶血试验及CH50测定的原理及意义；熟悉：补体参与的反应试验类型、补体依赖的细胞毒试验的原理、旁路途径溶血活性测定；了解：补体结合试验和免疫粘附试验的原理、C4和B因子活性测定的原理。 二、教学内容 1。补体参与的反应：免疫溶血试验，补体结合试验，补体依赖的细胞毒试验，免疫粘附试验。 2。补体的测定：补体活性的测定，补体含量的测定，补体测定的临床意义。 第二部分测试题 一、选择题 （一）单项选择题（A型题） 1．溶血素效价滴定判定的温度和时间 A．37℃、30min B．4℃、30min C．37℃、15min D．40℃、30min E．56℃、 30min 2.在补体连锁反应中最终形成的攻膜复合体是 A．C5b6789 B.C4b2a3b C．C4b2b D．C3bBb E．C3b4b 3.下列哪项试验没有补体参加 A. CH50试验 B. CDC试验 C.溶血空斑试验 D. ADCC试验 E.Raji细胞试验 4.补体结合试验中所用补体是哪种动物血清 A．马血清 B．绵羊新鲜血清 C．豚鼠新鲜血清 D．大白鼠新鲜血清 E．山羊新鲜血清 5.下列哪项试验不能用于补体缺陷的过筛诊断 A.CDC试验 B．CH50试验 C．血清C3含量测定 D.血清C1含量测定 E.C4溶血活性试验 6.B因子溶血活性测定中,在缓冲液中加入EGTA是为了螯合反应体系中的 A.Mg2+离子 B.Ca2+离子 C.Zn2+离子 D.Fe3+离子 E. P3+离子 7.在单个补体成分溶血活性测定中,用氨水处理是为了去除哪个补体成分 A.C1 B.C2 C.C4 D.C5 E.C3 8.检测免疫小鼠脾细胞分泌到细胞外的抗SRBC抗体的试验是 A.CH50试验 B.CFT C.APH50测定 D.B因子活性测定 E.溶血空斑试验 9.利用溶血反应作为指示系统,判断抗原抗体是否相对应的试验是 A.CH50试验 B.CFT C.APH50测定 D.B因子活性测定 E.抗补体试验 10.补体经典途径的最重要的激活物是 A.特异性抗原 B.特异性抗体 C.抗原抗体复合物 D.细菌脂多糖 E.酵母多 糖 （二）多项选择题（X型题） 1.补体参与的反应试验包括 A.免疫溶血试验 B.补体结合试验 C.补体依赖的细胞毒试验 D.免疫黏附试 验 E.白细胞趋化试验 2．补体含量的检测方法有 A．单向免疫扩散法 B．火箭免疫电泳 C．免疫比浊法 D．酶联免疫吸附试验 E．放射免疫分析法 3.检测补体经典激活途径常用的指标有 A.CH50试验 B.C4活性测定 C.APH50测定 D.B因子活性测定 E.溶血空斑试验 4.检测补体旁路激活途径常用的指标有 A.CH50试验 B.CFT C.APH50测定 D.B因子活性测定 E.溶血空斑试验 5.通过补体受体进行的试验有 A.免疫黏附试验 B.CH50试验 C.ADCC效应 D.凝集试验 E.Raji细胞试验
HBcAb-核心抗体：曾感染或感染期出现的标志。核心抗体 IGM 是新近感染或病 9.简述补体系统的生物学功能。 (1) 溶菌和溶细胞作用： 补体系统激活后， 在靶细胞表面形成 MAC 从而导致靶细胞溶解。 (2) 调理作用：补体激活过程中产生的 C3b 、C4b 、iC3b 粒细胞或巨噬细胞表面相应受体，因此，在微生物细胞表面发生的补体激活，可促进微生 物与吞噬细胞的结合，并被吞噬及杀伤。 (3)引起炎症反应：在补体活化过程中产 的炎症介质 C3a C4a 、C5a 。它们又称为过敏毒素，与相应细胞表面的受体结合，激发细胞 脱颗粒，释放组胺之类的血管活性物质，从而增强血管的通透性并刺激内脏平滑肌收缩。 C5a 还是一种有效的中性粒细胞趋化因子。 (4)清除免疫复合物：机制为：①补体与 Ig 的结合在空间上干扰 Fc 段之间的作用，抑制新的IC 形成或使已形成的IC 解离。②循环 IC 可激活补体，产生的__C3b 与抗体共价结合。IC 借助C3b 与表达CR1和CR3的细胞结合而 被肝细胞清除。 (5)免疫调节作用：① C3可参与捕捉固定抗原，使抗原易被 APC 处理与 递呈。②补体可与免疫细胞相互作用，调节细胞的增殖与分化。③参与调节多种免疫细胞 的功能。 (二) 1.微生物及其代谢产物 抗原，能诱导机体发生免疫应 答。如细菌、病毒螺旋体等对人有较强的免疫原性。刺激机体 _________________________________ 可产生抗体，临床上可通过检测抗体诊断相关的疾病 ；亦可将病原微生物制成疫苗 ，用于预 防疾病。 2. 动物免疫血清； 用微生物或其代谢产物对动物进行人工自动免疫后 ，收 获含有相应抗体的血清即为动物免疫血清。临床上用来治疗破伤风和白喉的破伤风抗毒素、 _______ 白喉抗毒素属此。是用类毒素免疫马制备的。马的免疫血清对人具有二重性 ，一方面，它含 有特异性抗体(抗毒素),可以中和相应的毒素，起到防治作用；另一方面，马血清对人而言是 异种蛋白，具有免疫原性，可引起血清病或过敏性休克。 3.异嗜性抗原； 存在于人、 动物、植物及微生物等不同物种间的共同抗原 ，称为Forssman 抗原。目前已发现多种异嗜 性抗原：大肠杆菌 086与人B 血型物质；肺炎球菌14型与人A 血型物质；大肠杆菌014型 脂多糖与人结肠粘膜；溶血性链球菌抗原与肾小球基底膜及心脏组织 ；立克次体与变形杆 菌。 4.同种异性抗原； 在同种不同个体之间，由于基因型不同，表现在组织细胞结构 如眼晶体、精子等因外伤手术等释放入血 2.自身抗原被修饰：如自身组织成分因感染、药 物、辐射而变性 6. 肿瘤抗原。指细胞癌变过程中出现的新抗原或高表达抗原物质的总 称。根据肿瘤抗原特异性概括为两大类。 (1)肿瘤特异性抗原 (tumor specific antigen,TSA) ⑵肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA) 3、临床检测HBV 抗原抗体系统包含哪些项目？ (1) HBsAg-表面抗原：为已经感染病毒的标志，并不反映病毒复制和传染性的强弱。 HBsAb-表面抗体：为中和性抗体标志，是是否康复或是否有抵抗力的主要标志。 HBeAg- e 抗原：为病毒复制标志。持续阳性 3个月以上则有慢性化倾向。 医学上重要的抗原物质有哪些 ,都是良好的 每种病原微生物都是由多种抗原组成的复合体
第五章补体系统 第一部分学习习题 一、填空题 1．补体系统由________、_______和_________组成。 2．补体三条激活途径为_________、_________和_______，它们的C3转化酶分别为______________________. 3．补体固有成分对热不稳定，通常加热到_______，作用_______分钟即可灭活。 4．C1是由三个亚单位____（识别Ig补体结合位点）、____、_____（有酯酶活性）组成。5．补体的经典激活途径激活物为____和_____类抗体与抗原结合形成的复合物。 6．参与旁路激活途径的补体固有成分有____、____、____、_____和C5-9。 7．具有免疫粘附和调理作用的补体分子片段有____和_____。 一、多选题 [A型题] 1．补体经典激活途径中，补体成分激活顺序是： ** B. C145236789 C. C124536789 ** E. C132456789 2. 在经典激活途径中补体的识别单位是： A.C3 B. C2 C. C1 ** E. C5 3.下列补体固有成分中含量最高的是： A.C3 B. C4 C. C1q ** E. C5 4.具有激肽样作用的补体裂解片段是： ** B. C3a C. C4a ** E. C5a 5. 具免疫粘附作用又有调理作用的补体裂解片段是： ** B. C3b C. C4b ** E. C567 6．三条补体激活途径的共同点是： A.参与的补体成分相同 B. 所需离子相同 **转化酶的成分相同 D.激活物相同 E.攻膜复合体的形成及其溶解细胞的作用相同 7．补体系统的三条激活途径均参与的成分是： ** B. B因子 C. C1 D.C3 E. C4 8．补体： A.是一组具有酶活性的脂类物质 B. 对热稳定 C. 具有溶菌作用，但无炎症介质作用 D.参与免疫病理作用 E．C1在血清含量最高 9．可刺激肥大细胞脱颗粒释放活性介质的成分是： A. C1q B. C5a C. C3b D．C4b E．C1s
第十七章补体参与的反应及补体测定 Complement Mediated Reactions and Assays of Complement 一、选择题 (一)单项选择题（A型题） 1、溶血素效价滴定判定的温度和时间是] A、37℃、30min B、4℃、30min C、37℃、30min D、40℃、30min E、56℃、30min 2、在补体连锁反应中最终形成的攻膜复合体是 A、C5b6789 B、C4b2a3b C、C4b2b D、C3bBb E、C3b4b 3、下列哪项试验没有补体参加 A、CH50试验 B、CDC试验 C、溶血空斑试验 D、ADCC试验 E、Raji细胞试验 4、补体结合试验中所用补人本是哪种动物血清 A、马血清 B、绵羊新鲜血清 C、豚鼠新鲜血清 D、大白鼠新鲜血清 E、山羊新鲜血清 5、下列哪项试验不能用于补体缺陷的过筛诊断 A、CDC试验 B、CH50试验 C、血清C3含量测定 D、血清C1血清测定 E、C4溶血活性试验 6、B因子溶血活性测定中，在缓冲液中加入EGTA是为了螯合反应体系中的 A、Mg2+离子 B、Ca2+离子 C、Zn2+离子 D、Fe3+离子 E、P3+离子 7、在单个补体成分溶血活性测定中，用氨水处理是为了去除哪个补体成分 A、C1 B、C2 C、C4 D、C5 E、C3 8、检测免疫小鼠脾细胞分泌到细胞外的抗SRBC抗体的试验是 A、CH50试验 B、CFT C、APH50测定 D、B因子活性测定 E、溶血空斑试验 9、利用溶血反应作为指示系统，判断抗原抗体是否相对应的试验是 A、CH50试验 B、CFT C、APH50测定 D、B因子活性测定 E、抗补体试验 10、补体经典途径的最重要激活物是 A、特异性抗原 B、特异性抗体 C、抗原抗体复合物
补体习题 A型题 1.与抗原结合后能激活补体经典途径的Ig是： A、IgG1，IgG 2，IgG 4，IgM B、IgG1，IgG 2，IgG 3，IgM C、IgG，IgA D、IgG1，IgG 2，IgG 3，IgA E、IgA，IgD ，IgM，IgG 2.血清中含量最高的补体成分是： A、C2 B、C1 C、C3 D、C6 E、C9 3.构成膜攻击单位的补体成分是_______________。 4.补体激活过程中起关键作用的成分是： A、C1 B、C2 C、C3 D、C4 E、C5 5.关于补体分子的叙述，哪项是错误的： A、一组具有酶活性的、不耐热的球蛋白 B、存在于人或动物血清中 C、性质不稳定 D、作用是非特异性的 E、含量随抗原的刺激而增高 6.吞噬细胞膜表面的CR1对下列哪种分子的亲合力最大？ A、C3b B、C4a C、C3dg D、C5a E、C3a 7.通过经典途径激活补体的Ig是： A、IgM、IgA B、IgG 、IgA C、Ig D、IgE D、IgM E、IgG 、IgM 8.补体激后，不能产生的生物学作用是： A、溶解或杀伤靶细胞作用 B、免疫粘附作用 C、中和毒素作用 D、炎症介质作用 E、调理吞噬作用 9.既有趋化作用又可激发肥大细胞释放组胺的补体裂解产物是： A、C2a B、C3b C、C567 D、C4a E、C3a、C5a 10.增强抗体对病毒中和作用的补体成分是： A、C1q,C4 B、C1, C4, C2,C3 C、C3 D、C3,C4 E、C5—9 11.发生遗传性血管性水肿的原因是： A、C3a、C5a 过量生成 B、C4a过量生成 C、C2a过量生成 D、I因子缺乏 E、吸入过敏原 12.下述哪一种物质既有非特异性免疫作用又参与特异性免疫效应？ A、Ig B、MHC分子 C、补体 D、CD分子 E、SPA 13.有调理作用的补体裂解产物是： A、C2a B、C3a C、C3b D、C4a E、C5a 14.备解素的作用是： A、激活剂 B、稳定C3转化酶 C、趋化因子 D、增强灭活C3b E、过敏毒素 15.过敏毒素作用最强的补体裂解片段是 A、C2a B、C3a C、B a D、C4a E、C5a 16.由于补体缺少易患的疾病是 A、肿瘤 B、自身免疫性疾病 C、免疫复合物性疾病 D、化脓性细菌感染 E、免疫复合物性疾病和化脓性细菌感染 17.补体参与下列哪种反应？ A、凝集反应 B、ADCC C、细胞毒效应 D、沉淀反应 E、混合淋巴细胞反应
免疫学检验备考版 辛酸/硫酸铵法提纯IgG 在酸性条件下( pH4.5)，血清或腹水中非IgG的蛋白成份(包括白蛋白，部分Ig)，能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。辛酸/硫酸铵法比硫酸铵法能够获得更高纯度的IgG。 50%溶血试验（CH50）测定补体实验 绵羊红细胞（SRBC），与相应抗体（溶血素）结合后，可激活待检血清中的补体而导致SRBC 溶血。其溶血程度与血清中补体的含量和功能有关。由于补体含量与溶血程度之间呈正相关，但不是直线关系，而呈S曲线关系，故通常取反应曲线中间部位即50％溶血（CH50）为判定终点。由于抗原抗体复合物激活的是补体的经典途径，C1～9任何一种成分缺陷都可使CH50降低，所以此实验反映了总补体的活性。 补体结合试验的基本原理 抗原抗体复合物可以结合补体，这是补体结合试验的依据。绵羊红细胞和其相应抗体（溶血素）的复合物结合补体后出现溶血现象。因此，绵羊红细胞和溶血素被作为补体结合试验中判断待测系统中有无抗原抗体反应的复合物系统。如待测系统产生抗原抗体复合物，则可结合一定量补体，此时加入溶血系统则不出现溶血。如待测系统中只有抗原或抗体，不能结合补体，加入溶血系统则与游离补体结合而发生溶血，这就是补体结合试验的基本原理。 补体结合试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或 抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即SRBC与相应溶血素， 试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统， 先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。 如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加 入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。 如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当 加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。因此补体结合试验可用已知抗原 来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。 单向免疫扩散实验 (1)原理：待测抗原从局部含有定量抗体的凝胶内自由向周围扩散，抗原抗体特异性结合，在两者比例合适的部位，形成白色沉淀环，沉淀环的大小与抗原的浓度呈正相关。 (2)技术要点：将抗体和热融化琼脂(约50%)混合，倾注成平板。待凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入已稀释的抗原液，和不同浓度的抗原标准品，置37～12℃温箱，24～48h后观察孔周围沉淀环。量取沉淀环直径，通过抗原标准品，计算待测抗原的浓度。
补体实验报告 篇一：补体结合试验 第二节补体结合试验 补体结合试验（complementfixationtest，cft）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。 一、类型及原理 自身免疫性溶血，如果有补体参与时，补体通过一系列的激活，最后形成膜攻击复合物（membrane attack complex），它可以直接攻击红细胞膜，导致红细胞破裂，这就是所谓“血管内溶血”。而没有补体参与的免疫性溶血，抗体与红细胞膜上抗原结合后，没有直接把红细胞破坏，而是把红细胞“致敏”，致敏RBC在通过脾脏等网状内皮系统时，被吞噬细胞“吃掉”，这就是所谓“血管外溶血”。 该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）； ②补体系统；③指示系统，即srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的
机会。 如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图14-2）。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。 图14-2补体结合试验示意图 二、试验方法 补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也 较好。以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。 （一）试剂 1．抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。 2．抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按
补体结合实验 原理：补体无特异性，可与任何抗原抗体复合物结合而被激活，但不能与单独的抗原或抗体结合。 补体结合试验是一种有补体参与，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应体系。绵羊红细胞与溶血素结合后可激活补体，导致红细胞破坏，出现溶血现象。参与补体结合反应的五种成分可分为两个系统：(1)检测系统，已知抗原（或抗体）、待测抗体（或抗原）；（2）指示系统，SRBC、溶血素。待检测系统与补体作用后，加入指示系统，若不出现溶血，表示待测系统中的抗原抗体相对应；两者特异性结合形成抗原抗体复合物结合并消耗了补体，无游离的补体与指示系统结合，故不溶血，为补体结合试验阳性。反之，若出现溶血，则为补体结合试验阴性。 方法： 1.取五支试管，依次做好标记，放在试管架中。 2.按照下表加样。 结果： 结果分析： 1.羊血用前轻轻摇匀，避免剧烈正当引起溶血。 2.各种试剂的吸管不要混用。 3.补体的性质较不稳定，低温保存，加样时再从冰箱里取出。 4.水浴时避免水滴滴进试管。 5.本实验影响因素很多，对照组的反应情况是否正常是判断实验可信度的参照。 人外周血单个核细胞分离 原理：常用来分离人外周血单个核细胞的分离液是由聚蔗糖和泛影葡胺按一定比例混合制成。它分子量大又无化学活性，20摄氏度时比重约为1.077kg/L，淋巴细胞和单核细胞比重略小于分层液，为1.070kg/L左右。而粒细胞和红细胞比重大，为1.092 kg/L左右。通过离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布，淋巴细胞和单核细胞位于分离液的上层，而粒细胞和红细胞沉于离心管的管底，从而将淋巴细胞和单核细胞等单个核细胞分离出来。方法： 1.抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml Hank’s液 2.混匀后取3ml稀释液，沿试管壁缓慢加入到2ml分离液中。2000rpm,离心20min。
第六章补体系统 Chapter 6 Complement System 第一部分教学内容和要求 一、目的要求 ·掌握：补体系统的概念和组成，补体激活途径的异同，补体的生物学作用；熟悉：补体的激活过程；了解：补体系统的命名，补体的一般理化特性，补体激活的调控。 二、教学内容 1．补体系统的概念、组成与命名。 2。补体经典途径激活途径、MBL途径和替代途径的激活过程。 3．补体激活的调控：自身调控与调节因子的作用。 4．补体受体。 5．补体的生物学活性作用：介导溶解细胞、调理和免疫粘附、炎症介质作用、清除免疫复合物和免疫调节作用。 第二部分测试题 一、选择题 （一）单项选择题（A型题） 1．血浆中的补体大部分由如下细胞产生 A．肝细胞 B．巨噬细胞 C．T细胞 D．B细胞 E．中性粒细胞 2.不能合成补体的细胞 A.巨噬细胞 B.肝细胞 C.肠上皮细胞 D.肠内皮细胞 E.肾细胞 3．灭活补体的条件是 A．58℃30min B.56℃30min C.60℃30min D.56℃20min E.55℃30min 4．补体固有成分中分子量最大 A.C1q B, C3 C. C4 D. C5 E.C8 5.在补体系统成分中分子量最小 A. C1q B.C3 C.P因子 D.D因子 E.H因子 6. 在血清中补体系统含量最高的成分 A.C1 B.C2 C.C3 D.C5 E.C8 7. 血清中补体系统含量最低的成分 A.C3 B.C5 C. P因子 D. H因子 E. D因子 8．经过旁路途径激活补体系统的物质是 A．IgG1 B．细菌脂多糖 C．Ｄ因子 D．Ｂ因子 E．Ｐ因子 9．补体参与的反应是下列哪一项？ A．中和反应 B． ADCC作用 C．凝集反应 D．细胞毒作用E．提呈抗原 10．关于补体系统，正确的叙述是 A．是由11种成分构成的复杂系统B．无先天性补体缺乏症 C．补体活性在加温至56℃时升高D．补体与吞噬作用无关 E．即使无抗体参与也可引起该系统的活化 11．经典激活途径中，补体对免疫复合物的识别成分 A．C1 B．C2 C．C3 D．C5 E．C8 12．补体系统的激活必须有下列哪种成分参与
医学免疫学实验指导 实验八补体结合实验由长沙达尔锋生物科技有限公司整理
【文章介绍】 实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。 BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。 【实验目的】 1.熟悉补体结合试验的原理和方法及其应用。 2.了解溶血素单位、补体单位、抗原单位的测定方法。 【实验原理】 补体结合试验（complement fixation text ,CFT）是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统，来检测未知的抗原或抗体的血清学试验。有五种成分参与，分为指示系统和待检系统(已知抗原和未知抗体或已知抗体和未知抗原)。补体用新鲜豚鼠血清。方法是将已知的抗原或抗体与未知标本(可能含相应抗体或抗原)充分混合，再加入补体作用一段时间，最后加入指示系统。若待检系统有相应抗体或抗原，则能形成抗原抗体复合物，从而消耗了补体不出现溶血现象，此为阳性；相反，出现溶血则为阴性。补体结合试验的影响因素较多，正式试验前需对已知成分作一系列滴定，尤其是补体，应选择适宜的量参与反应，避免假性结果。每次试验尚需同时设立多种对照，以作为判断结果可靠性的依据。 该法对颗粒性或可溶性抗原均适用，临床上常用于检测某些病毒、立克次氏体和螺旋体感染者血清内的中的抗体，亦可用于某些病毒的分型。 一、溶血素单位滴定 【材料】 1.抗体：溶血素血清。 2.抗原：2％绵羊红细胞悬液。 3.补体：（1:30）取自豚鼠新鲜血清 4.其它：生理盐水、小试管、试管架、吸管、37℃水浴锅。 【方法与结果】 1.按下表8-1于各试管分别加入不同稀释的溶血素0.2ml及其成分。 2.充分混合后置于37℃水浴锅中30分钟，然后观察结果。 3.凡最高稀释度的溶血素可呈现完全溶血者为一个单位。举例：上表结果表明，第11管（即1：9600倍稀释）0.2毫升溶血素为一个单位，在溶血反应中常用0.2毫升中含有2个溶血
第三章补体系统 学习指导 一、补体系统的组成 补体是存在于正常人或动物新鲜血清中的具有酶活性的一组球蛋白，它包括多种因子，故称为补体系统。 补体系统由补体组分的11种蛋白质、旁路途径组分、攻膜复合体及调节因子等近30多种不同的血清蛋白所组成。参与经典途径的补体组分用“C”表示，分别称为C1、C2……C9。其中Cl由C1q、C1r、C1s三个亚单位组成。参与替代途径的组分和调节因子中某些成分以大写英文字母或英文缩写符号表示，如B、D、P因子及CR等。补体激活后在其代号或数字上方加一横线，如C 1、C 3、B等。裂解后产生的碎片，用英文小写字母表示，如C3a、C3b等。血清中补体蛋白约占血清球蛋白的10％，含量相对稳定，化学成份为糖蛋白，多数是β球蛋白，少数是γ和α球蛋白。补体的性质很不稳定，许多理化因素均可破坏补体，因此在使用补体时应采用新鲜血清。 二、补体系统的活化 补体系统在体液中以非活性状态存在，当其被激活物激活后，发生连锁的酶促反应，表现出其生物活性。补体有两条激活途径：①经典途径②替代途径。经典途径的主要激活物是抗原抗体(IgG1、IgG2、IgG3、IgM)复合物。参加成分是C1到C9各组分。激活过程分识别、活化和膜攻击三个阶段。替代途径激活时没有Cl、C2、及C4参加，C3首先被活化，然后完成C5~C9激活的连锁反应，故又称旁路途径或C3途径。本途径的激活物质主要是脂多糖、酵母多糖及凝集的IgA、IgG4等。参与成分主要是C3、B因子、D因子和P因子，以及攻膜复合体组分。补体两条激活途径的比较(见表3一1)。 三、补体系统的生物学作用 补体系统是机体非特异性免疫的重要组成部分，同时也参与特异性免疫，其主要作用如下：①溶菌和溶细胞作用：细菌与相应抗体结合后可通过经典途径激活补体，在细菌表面形成膜攻击复合物而溶解细菌；另外，革兰阴性细菌脂多糖是良好的旁路途径激活物，这在机体早期抗感染免疫中具有重要意义。在某些情况下，自身抗原抗体复合物可以激活补体，导致自身细胞的溶解破坏。②促进中和溶解病毒作用：补体、抗体与病毒作用后可有效地阻止病毒对宿主细胞的吸附和穿入；另外，补体也可直接溶解灭活某些病毒，如RNA肿瘤病毒等。③调理和免疫粘附作用：以C3b／C4b为中间“桥梁”，通过其N端非稳定结合部位与细菌及其它颗粒性抗原或免疫复合物结合后，再通过其C端稳定结合部位与表面具有相应补体受体的吞噬细胞结合促进其吞噬作用，称为补体的调理作用。细菌或免疫复合物激活补体、结合C3b／C4b后，若与表面具有相应补体受体的红细胞和血小板结合，则可以形成较大的聚合物，容易被体内的吞噬细胞吞噬清除，称为免疫粘附作用。④炎症介质作用：C2a具有激肽样作用，可使小血管扩张、通透性增加；C3a、C4a、C5a,具有过敏毒素作用，可以使肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，释放血管活性介质，引起炎症反应；C3a、C5a、C5b67，有趋化作用，可以吸引炎症细胞向补体激活的炎症区域游走和聚集，增强炎症反应。 四、体液中可溶性补体调节因子及其作用(见表3—2) 补体系统激活时对机体既有保护作用，又可产生损伤作用，正常情况下体内有一系列调节机制，控制补体的激活，以防止补体过度消耗和对自身组织的损伤。 表3—2体液中可溶性补体调节因子及其作用 调节因子作用 Cl酯酶抑制物(C1INH) 抑制C1酯酶活性 C4结合蛋白(C4bP) 抑制C4b与C2b的结合 H因子(C3b灭活促进因子) 促进I因子对C3b的灭活或从C3bBb置换Bb，限制C3bBb的形