补体实验报告
篇一：补体结合试验
第二节补体结合试验
补体结合试验（complementfixationtest，cft）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。
一、类型及原理
自身免疫性溶血，如果有补体参与时，补体通过一系列的激活，最后形成膜攻击复合物（membrane attack complex），它可以直接攻击红细胞膜，导致红细胞破裂，这就是所谓“血管内溶血”。而没有补体参与的免疫性溶血，抗体与红细胞膜上抗原结合后，没有直接把红细胞破坏，而是把红细胞“致敏”，致敏RBC在通过脾脏等网状内皮系统时，被吞噬细胞“吃掉”，这就是所谓“血管外溶血”。
该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；
②补体系统；③指示系统，即srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的
机会。
如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图14-2）。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。
图14-2补体结合试验示意图
二、试验方法
补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也
较好。以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。
（一）试剂
1．抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。
2．抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按
第十九章补体参与的反应及补体测定 Complement Mediated Reactions and Assays of Complement 第一部分目的要求和教学内容 一、目的要求 掌握：免疫溶血试验及CH，。测定的原理及意义；熟悉：补体参与的反应试验类型、补体依赖的细胞毒试验的原理、旁路途径溶血活性测定；了解：补体结合试验和免疫黏附试验的原理、C4和B因子活性测定的原理。 二、教学内容 1．补体参与的反应：免疫溶血试验，补体结合试验，补体依赖的细胞毒试验，免疫黏附试验。 2．补体的测定：补体活性的测定，补体含量的测定，补体测定的临床意义。 第二部分测试题 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1．溶血素效价滴定判定的温度和时间是 A．37℃、30min B．4℃、30min C．37℃、15min D．40℃、30min E．56℃、30min 2．在补体连锁反应中最终形成的攻膜复合体是 A．C5b6789 B．C4b2a3b C．C4b2b D．C3bBb E．C3b4b 3. 下列哪项试验没有补体参加 A．CH试验 B．CDC试验 C．溶血空斑试验 D．ADCC试验 E．Raji细胞试验 4．补体结合试验中所用补体是哪种动物血清 A．马血清 B．绵羊新鲜血清 C．豚鼠新鲜血清 D．大白鼠新鲜血清 E．山羊新鲜血清
5．下列哪项试验不能用于补体缺陷的过筛诊断 A．CDC式验 B．CH50试验 C．血清C3含量测定 D．血清Cl含量测定 E．C4溶血活性试验 6．B因子溶血活性测定中，在缓冲液中加．),．EGTA是为了螯合反应体系中的A．Mg2+离子 B．Ca2+离子 C．zn2+离子 D．Fe3+离子 E．P3+离子 7．在单个补体成分溶血活性测定中，用氨水处理是为了去除哪个补体成分A．C1 B．C2 C．C4 D．C5 E．C3 8．检测免疫小鼠脾细胞分泌到细胞外的抗SRBC抗体的试验是 A．CH50试验 B． CFT C，APH50测定 D．B因子活性测定 E．溶血空斑试验 9．利用溶血反应作为指示系统，判断抗原抗体是否相对应的试验是 A．CHs50试验 B．CFT C．APH50测定 D．B因子活性测定 E．抗补体试验 10．补体经典途径的最重要激活物是 A．特异性抗原 B．特异性抗体 C．抗原抗体复合物 D．细菌脂多糖 E、酵母多糖 11.正常血清中,补体含量最低的是 A.C1q B. C5aR C. C1rR D.Df E.C1INH 12.正常血清中,补体含量最高的是 A.C1 B.C2 C.C3
第五章补体参与的反应 内容 一、溶血试验 二、补体结合试验 一、溶血试验 当红细胞与相应抗体相结合，在电解质存在时，可使红细胞产生凝集现象；若同时加入新鲜动物血清，则血清中的补体可与红细胞及其抗体（溶血素）形成的免疫复合物结合，从而激活补体导致红细胞溶解，产生溶血现象。 【材料】 1、抗原：2%绵羊红细胞（简称SRBC）。 2、抗体：溶血素即（SRBC抗体）。 3、补体，新鲜豚鼠血清。 4、生理盐水。 5、小试管、刻度吸管、试管架、37℃水溶箱等。 【方法】 1、取小试管3支，编号后按下表加入各物（容量单位均为ml） 溶血试验加样表（表2—1）单位ml 管号2％红血球溶血素（2单位）补体（2单位）生理盐水结果 1 0.5 0.5 0.5 0.5 2 0.5 0.5 - 1.0 3 0.5 - 0.5 1.0 2、将试管摇匀后置37℃水箱内：15—30分钟，取出观察有无溶血现象； 3、结果观察：管底无血球沉淀，液体红色透明管为溶血。 注意分析结果及其意义，了解补体的性质与作用。 二、补体结合试验 凝集反应和沉淀反应分别是颗粒性抗原、可溶性抗原与特异抗体结合的结果。补体结合试验，则是基于抗原抗体复合物可以结合补体的原理，在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统来检测抗原或抗体是否发生特异性结合的一种抗原抗体反应。 补体结合试验有两个系统共五个成分参加：检测系统的已知抗原（或抗体）与持检抗体（或抗原）、补体、指示系统的绵羊红细胞和溶血素。依次加入检测系统成分与补体作用后再加指示系统，若不出现溶血，即为补体试验阳性，表示检测系统中抗原抗体相对应（待检标本中有相应抗体或抗原），形成抗原体复合物并结合了补体，指示系统因缺乏补体而不发生溶血；反之若出现溶血，则为补体试验阴性，表示检测系统的抗原抗体不对应（持检标本中无相应抗体或抗原），不能结合补体，游离的补体与后加入的指示系统结合，导致绵羊红细胞溶解。 补体结合试验敏感性和特异性均较高，可用于检测梅毒，立克次体病和病毒感染等患者体液中的抗体或抗原以辅助诊断，还可用于某些病毒的分型。但本试验操作繁琐，影响因素甚多，各种参与成分均需适量（在正式试验之前必须通过一系列预备试验来滴定补体、溶血素、抗原或抗体的单位，以确定其使用量），并需设立多种对照和使用洁净试管等，才能保证实验结果的可靠性。因此，近年来其应用日趋减少，而为其它新的免疫学方法所取代。 【材料】 1、抗原：（已知，并已经滴定调定）。 2、灭活的持检血清。阳性血清和阴性血清（56℃×30' 灭活）。 3、补体（2个使用单位）。
附录ⅨK抗补体活性测定法 本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化，测定供试品的抗补体活性。 试剂（1）镁-钙贮备液取氯化钙1.103g、氯化镁（MgCl2·6H2O）5.083g，加水溶解并稀释至25ml。 （2）巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g，加水800ml溶解。用1mol/L 盐酸溶液调pH值至7.3，加镁-钙贮备液2.5ml，加水稀释至1000ml，用0.22μm膜滤过，4℃保存备用。 （3）明胶巴比妥缓冲液（GVB）取明胶0.625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。 （4）阿氏液（Alsever’s液）取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g，加水溶解并稀释至1000ml（pH6.2左右）。根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟（灭菌后，尽快释放蒸汽）。放冷后置4℃冰箱保存备用。 （5）绵羊红细胞由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，无菌分装，4℃保存一周后方可使用。 （6）溶血素兔抗羊红细胞血清。 （7）豚鼠血清（补体）取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，-70℃保存，也可冻干保存。豚鼠血清每1ml中的补体总活性应不低于100CH50。 5%羊红细胞悬液制备取绵羊红细胞适量，用明胶巴比妥缓冲液至少洗3次后，悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。取0.2ml红细胞悬液，加至2.8ml水中，待红细胞完全溶解后照紫外-可见分光光度法（附录ⅡA）在波长541nm处测定吸光度，根据下列公式，将该溶液的吸光度调节至0.62±0.01（每1ml红细胞悬液含红细胞1×109个）。 V f = V i×A ———— 0.62 式中Vi 为稀释前红细胞悬液体积，ml； A为稀释前红细胞溶解液吸光度； V f为稀释后红细胞悬液体积，ml。 溶血素滴定按表1稀释溶血素。从1∶75稀释的溶血素开始，1.0ml不同稀释度的溶血素分别与5%羊红细胞悬液1.0ml混合，37℃放置30分钟后，取0.2ml，加明胶巴比妥缓冲液1.10ml，稀释的豚鼠补体溶液（如150倍稀释补体）0.2ml，37℃放置60分钟后，以每分钟2000转离心5分钟，吸取上清液，照紫外-可见分光光度法（附录Ⅱ A）于波长541nm处测定各管吸光度。每个稀释度做2管。同时再做3管未溶血对照管（明胶巴比妥缓冲液1.4ml，加5%羊红细胞悬液0.1ml），3管全溶血管(水1.4ml加5%羊红细胞0.1ml)，同法操作。按下式计算各管溶血率（Y），以Y值为纵坐标，以不同溶血素稀释度为横坐标作图，从而确定敏化羊红细胞所用的溶血素的稀释度。选择增加溶血素的量也不影响Y值的溶血素的稀释度，为每1ml含1个最小溶血单位（即每1ml含1MHU）。最大溶血率应在
第十九章补体检测及应用 补体是一组存在于人和脊椎动物血清、组织液或某些细胞膜上的具有酶样活性、不耐热的糖蛋白。补体不是单一成分，其在功能效应上是以连续反应的程序进行的，故又称补体系统。补体系统广泛参与机体的抗感染防御反应及免疫调节，也可介导免疫病理的损伤性反应，是体内具有重要生物学作用的效应放大系统。补体的存在与抗原性异物的刺激无关，在正常人血清中，其含量相对稳定，但在某些疾病发生时，补体的含量及其活性可发生改变。因此，补体含量与活性的检测，对机体免疫状态的评价和疾病的诊断具有重要意义。 第一节概述 一、补体成分的含量与理化特性 （一）补体成分的含量：补体大多为糖蛋白，属于β球蛋白，C1q、C8等为γ球蛋白，C1s、C9为α球蛋白。C3含量最高。 a为小片段，b为大片段，但C2a 为大片段，C2b为小片段。补体各成分活化后不参与溶细胞过程的裂解片段，同样具有其他对机体利弊兼有的生物学活性，故裂解片段的测定，一方面可反映机体补体的活性状态，另一方面也是某些疾病诊断不可或缺的指标。补体系由非均一的细胞群体产生，在排除补体消耗太多的前提下，补体缺陷也可反映这些细胞的状态。体内合成补体成分的部位和细胞有多种，以肝脏、脾脏、小肠等组织和巨噬细胞、上皮细胞、血小板等细胞为主。 （二）补体的理化特性：补体的性质不稳定，易受各种理化因素的影响，加热、紫外线照射、机械振荡、酸碱和酒精等因素均可破坏补体。在-10℃活性保持3～4天，冷冻干燥可较长时间保持其活性，加热56℃30分钟灭活（灭能），故补体活性检测应尽快进行。标本保存应置于-20℃以下。 二、补体的活化途径 补体蛋白通常以活化蛋白前体存在于体液中，在不同激活物的作用下，补体各成分可循不同的途径依次被活化，形成一系列级联反应，表现出生物活性，最终导致溶细胞效应。 1.经典途径：以抗原-抗体复合物结合C1q启动激活，是抗体介导的体液免疫应答的主要效应方式。 2.MBL途径：是甘露聚糖结合凝集素（MBL）结合至细菌启动的途径。其诱导物或激活剂是机体的炎症反应急性期时相性蛋白产生的MBL和C反应蛋白等，后者与病原体结合而启动绕过C1的MBL途径。 3.旁路途径：是通过微生物表面等膜性物质，从C3开始，由B因子、D因子参与激活过程，也称第二途径、旁路途径。这种激活方式不依赖于特异性抗体的形成，在感染早期可为机体提供有效的防御机制。 特异性抗体产生时，经典途径方可发挥作用。 第二节补体总活性测定 血清补体总活性的测定，是对激活后补体最终效应的检测方法，可借此反映补体的整体功能。以红细 CP-CH50 。CP-CH50是临床常规进行的补体总活性检测项目。通常述及的CH50系指CP-CH50。 一、CH50测定法的原理 补体最主要的活性是溶细胞作用。特异性抗体与红细胞结合后可激活补体，导致红细胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分渗入，引起红细胞肿胀导致溶血。补体溶血程度与补体的活性相关，但非直线关系。溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线。以溶血百分率为纵坐标，相应血清量为横坐标。S形曲线在
实验报告
4. 补体结合反应实验原理 补体结合反应是一种有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。参与本反应的五种成分可分为两个系统： 一为待检系统，即为已知抗原（或抗体）和待检抗体（或抗原）； 另一个为指示系统，即绵羊红细胞和其相应的溶血素。待检抗原、抗体和补体作用后，再加入指示系统。若待检系统中的抗原和抗体相对应，两者特异性结合后激活补体，补体被消耗。再加入的指示系统无补体结合，不出现溶血；若待检系统中的抗原与抗体不对应或缺少一方，补体不被激活，当指示系统加入后，绵羊红细胞和溶血素复合物激活补体，产生溶血现象。 5. 空斑形成实验 是一种体外检测IgM、IgG类型抗体产生细胞的实验方法，又称空斑形成细胞（PFC)测定。可作为评估药物影响抗体产生水平以及临床筛选抗肿瘤新药的重要依据。 经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与一定量的绵羊红细胞混合后，抗体形成细胞产生的抗体与绵羊红细胞结合；在补体参与下，绵羊红细胞溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
一、SRBC的制备 （一）无菌抽取绵羊血 1.手术剪减去绵羊颈部毛发备皮，止血带扎住颈部，碘酒消毒，酒精棉球再擦拭。 2.抽取一定量的绵羊血，注入无菌玻璃瓶，轻轻摇晃获得抗凝绵羊血，摇晃时不能用力过猛，防止SRBC破裂。 （二）绵羊红细胞的制备 1.在无菌实验室中，用移液枪吸取5ml抗凝绵羊血于试管中，共4支试管。 2.配平后对称放入离心机中2000rpm离心10分钟。 3.4支试管，胶头滴管吸去上清液，加入适量的灭菌生理盐水后轻轻摇晃混匀。 4.再次配平后，2000rpm离心10分钟，2-3次。 5.吸去上清液，获得绵羊红细胞。 （三）绵羊红细胞悬液制备 1.20%绵羊红细胞悬液制备 在无菌实验室中，用移液枪吸取2ml绵羊红细胞于锥形瓶中，用移液管再加入8ml灭菌生理盐水，混合均匀。 2.2%绵羊红细胞悬液制备 在无菌实验室中，用移液枪吸取1ml绵羊红细胞于锥形瓶中，量筒量取49ml无菌生理盐水加入锥形瓶，混合均匀。 二、溶血素的制备 （一）免疫接种程序
血清补体C3测定 1检验目的 指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。 2原理 样品中补体C3与试剂中相应的抗体在溶液中相结合，立即形成抗原-抗体复合物，并形成一定浊度。该浊度的高低在一定量抗体存在时与抗原的含量成正比。通过与同样处理的校准液比较，计算未知样品中的补体C3浓度。 3标本要求 3.1使用新鲜血清,不使用血浆. 3.2在采集血液后2h分离血清. 3.38h内不能及时测定血清可存放于2-80C冰箱保存,3天后测定的血清置―150C――200C 冰冻保存,但冰冻血清只能复融一次. 3.4严重溶血或脂血的标本不能作测定. 4试剂
4.1本科使用浙江伊利康生物技术限公司的试剂盒. （浙食药监械（准）字2014第2400384号 YZB/浙 2314-40-2014）4.1.1试剂盒组成如下: R1三羟甲基氨基甲烷缓冲液100mmol/L，聚乙二醇40g/L R2抗体试剂：羊抗人补体C3抗体适量，叠氮钠0.95g/L 4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。 4.1.3 试剂稳定性与贮存：在2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂盒自生产之日起有效期为12个月。 4.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。 4.1.5 注意事项：试剂中含有稳定剂，可能存在一定的刺激作用和毒性，请勿直接接触皮肤及眼睛。一旦接触，即用大量清水冲洗。请勿吞服。 4.2 校准品：使用浙江伊利康生物技术限公司提供的C3校准品对自动分析仪进行校准。 4.3 质控品：使用正常值、病理值复合控制品。
5 仪器 AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪 6 操作步骤 6.1 样品的准备：将标好号的样品离心后放到仪器规定的位置。 6.2 试剂的检测：仪器开机后，检查各种试剂的位置，体积等确认无误后方可进行测定。 6.3 项目基本参数：参见生化检验AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪项目测定参数。 6.4仪器操作步骤：参见生化检验AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪操作规程。 7 质量控制
补体C4 含量测定 C 4 是补体传统途径（CP）活化中的一个早期成分，由α、β、γ3条肽链经二硫键连接而成，分子量200kD，为β1 球蛋白，合成于肝细胞和巨噬细胞中，经两次细胞内蛋白酶解形成分泌型C4（C4s），分泌于细胞外，再次酶解后成为血浆型C4（C 4p），二者溶血活性相等。在Mg 离子存在下，C1使C4的a链裂解成C4a 和C4b，C4a 为一弱过敏毒素，C4b 大部分游离于液相中，无活性，与免疫复合物（IC）或靶细胞膜结合的C4b则与C 2a形成了C4b2a（C3 转换酶）在C 4b2a作用下，C 3开始裂解，在激活补体，促进吞噬，防止IC 沉淀和中和病毒方面，C 4 起着一定作用。常用方法有速率散射浊度法、单向免疫扩散法（SID）、ELISA 法检测患者血清或其他体液中C4含量。 参考值： 血清：0．1～0．4g／L （速率散射浊度法）；0．553 ±0．109g／L （SID） 临床意义 传染病、组织损伤和急性炎症的早期，血清C4 含量可因合成增加而升高，可能是一种急性时相反应（参见补体C3含量测定），特别是多发性骨髓瘤C4 水平可高出正常人8 倍之多。其降低原因亦同于C3，应当注意的是在补体成分的遗传性缺损中，以C1r、C1s、C4及C2的缺损为多见，已发现由于C4的两个基因座位：C4A、C4B表现出高度的多态性，而出现了30 余种同种异型，这对于医学研究某些相关疾病的发生和发展有重要意义。临床上，C4的遗传缺损可引起全身性SLE、肾小球肾炎、反复感染以及自身免疫性慢活肝。在病程活动期时，C4水平更呈显著降低，尤其是SL E ，降低早于其他补体成分，回升晚于其他成分。对狼疮性肾炎和非狼疮性肾炎，前C 4 降低，后者多数正常。此外还见于胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、
补体C4测定试剂盒（免疫比浊法） 适用范围：本试剂盒用于体外定量测定人血清中补体C4浓度。 1.1 包装规格 试剂1：1×30ml；试剂2：1×10ml 试剂1：2×30ml；试剂2：1×20ml 试剂1：1×60ml；试剂2：1×20ml 试剂1：3×80ml；试剂2：4×20ml 试剂1：4×60ml；试剂2：4×20ml 试剂1：2×60ml；试剂2：2×20ml 试剂1：2×30ml；试剂2：2×10ml 试剂1：6×60ml；试剂2：2×60ml 2.1 外观 试剂1、试剂2应澄清、无异物。 2.2 净含量 试剂的净含量不少于标称装量。 2.3 试剂空白吸光度 用生理盐水作为样本加入试剂测试时，试剂空白吸光度应<0.40A。 2.4 分析灵敏度 C4含量为0.6g/L时，测定吸光度差值的绝对值应>0.005△A。 2.5 线性区间 试剂（盒）线性在[0.05，1.2]g/L区间内： 2.5.1 线性相关系数（r）应不小于0.990； 2.5.2 [0.05,0.3]g/L区间内，线性绝对偏差不超过±0.1g/L；(0.3,1.2]g/L 区间内，线性相对偏差不超过±10%。 2.6 精密度 2.6.1 重复性 用相同批号试剂盒测试两个水平的样本，所得结果的变异系数（CV）应<10%。 2.6.2 批间差 用3个不同批号试剂盒测试两个水平的样本，试剂（盒）批间相对极差应<10%。
2.7 准确度 与已上市的同类产品比对，用40个在[0.05,1.2]g/L区间内不同浓度的人源样本，用线性回归方法计算两组结果的相关系数（r）不小于0.990； [0.05,0.3]g/L区间内，线性绝对偏差不超过±0.1g/L；(0.3,1.2]g/L区间内，线性相对偏差不超过±10%。 2.8 稳定性 试剂盒于2℃～8℃避光环境中密封保存，有效期为12个月。取到效期后的试剂检测试剂空白吸光度、分析灵敏度、线性区间、重复性、准确度应分别符合2.3、2.4、2.5、2.6.1、2.7的要求。
补体C3 含量测定 C3是由α和β两条肽链通过二硫键连结组成，为β1球蛋白，沉降系数9．5s，分子量180kD ，含糖量约占2．2％，是血清中含量最多的补体成分，约占总补体含量的1／3以上，在补体系统激活过程中，无论是经传统途径还是旁路途径，均需C3活化后，才能推进后续补体成分（C 5～C9）的连锁反应，因此，它在两条激活途径中起关键作用。C3主要在肝实质细胞被合成分泌少量由巨噬细胞和单核细胞合成。生理情况下，体液中或组织炎症部位存在的蛋白水解酶，极为缓慢裂解着C3，持续产生少量的C3b 和C3转化酶（C3bB），一般可被I 因子、H 因子迅速灭活，故并不激活补体系统，一旦C3被激活物质（中毒素、脂多糖等）激活时，C3b又可在B 因子、D 因子作用下合成新的C3bBb 并进一步使C 3 激活，裂解、释放许多生物学活性片段，其结果可表现为增强机体的防御能力，亦可出现引起疾病的免疫病理作用。常用检测血清等其他体液的C3 含量方法有速率散射浊度法、单向免疫扩散法（SID）。 参考值： 血清：0．50 ～0．90g／L（速率散射浊度法）；0．60 ～1．64g／L（单向免疫扩散法） 临床意义 C3 的增多与减少基本与总补体活性所述相似，但更为敏感。在机体组织损伤和急性炎症时，常增高或为正常，如菌血症、肺炎、扁桃腺炎、结核、伤寒、麻疹、流脑等；肿瘤患者，尤以肝癌，血清C3 含量升高更为显著，但胰腺癌晚期与隐性淋巴细胞白血病则呈降低趋势。 C3 含量降低可见于以下原因：
①补体成分消耗增加；如血清病、链球菌感染后的肾小球肾炎、全身性SLE 、冷球蛋白血症、自身免疫性溶血性贫血、类风湿性关节炎、器官移植后的排斥反应。 ②补体大量丢失：多见于肾病综合征或大面积烧伤、外伤、手术等。 ③补体合成不足：主要为肝病患者，如肝硬化、慢性活动性肝炎和急性肝炎的重症病例。补体成分缺陷多具遗传特点，C3及C3调控因子（C3bINA）的缺损虽然少见，但是倘若发生，将可引起危及生命的感染。
1. 试述补体活化的三条途径。 答：1、经典激活途径： （1）激活物：主要是由IgG或IgM类抗体与相应抗原结合形成的免疫复合物。 （2）参与成分：C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9。 （3）激活过程：分为识别阶段、活化阶段、膜攻击阶段。 （4）激活顺序：依次为C1、C4、C2、C3、C5--C9。 （5）转化酶：C3转化酶：C4b2b；C5转化酶：C4b2b3b。 （6）生物学作用：可在特异性免疫的效应阶段发挥作用。C5转化酶裂解C5后形成膜攻击复合物，最终溶解靶细胞；补体裂解形成的小片段C4a、C2a、C3a 在血清等体液中可发挥多种生物学效应。 2、旁路激活途径： （1）激活物：主要是病原体胞壁成分，如脂多糖、肽聚糖、磷壁酸等。 （2）参与成分：除C3、C5、C6、C7、C8、C9外，还有B因子、D因子、P 因子等。 （3）激活过程：首先激活C3，然后完成C5--C9的活化过程。 （4）激活顺序：依次为C1、C4、C2、C3、C5--C9。 （5）转化酶：C3转化酶：C3bBb；C5转化酶：C3bBb3b或C3bnBb （6）生物学作用：参与非特异性免疫，在感染早期发挥重要作用。其生物学效应与经典途径相似。 3、MBL激活途径： （1）激活物：表面具有甘露糖、葡萄糖的病原微生物。 （2）参与成分：MBL、C反应蛋白、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9。 （3）激活过程：A、MBL：MBL激活起始于炎症急性蛋白与病原体的结合。MBL 与病原体表面的甘露糖等糖类配体结合后，激活与之相连的MBL相关的丝氨酸蛋白酶（MASP）。MASP2与C1s活性相似，其激活补体的过程与经典途径相似；MASP1具有C3转化酶活性，其激活补体过程与旁路途径相似。B、C反应蛋白：C反应蛋白与C1q结合使之活化，激活过程与经典途径相似。 （5）转化酶：C3转化酶、C5转化酶与经典途径相同。 （6）生物学作用：参与非特异性免疫，在感染早期发挥重要作用。其生物学效应与经典途径、旁路途径相似。 2. 何为MAC？ 答：MAC即膜攻击复合物，C5转化酶裂解C5形成C5b，C5b与C6、C7结合形成C5b67，该复合物插入靶细胞膜中，与C8结合形成C5b678附着与细胞表面，又与12个到19个C9结合，形成大分子C5b6789即膜攻击复合物。MAC裂解靶细胞，使靶细胞死亡。 第五章细胞因子 1.何为细胞因子和趋化因子？ 答：细胞因子（CK）是由基质细胞产生或活化免疫细胞分泌的具有一定生物活性的一类小分子蛋白质的总称。细胞因子分为：白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子和趋化因子。 趋化因子是一类由多种细胞产生的相对分子质量多为7—10KDa的促炎症细胞因子，具有激活和趋化白细胞的作用。
第十一节补体结合反应技术 （Complement fixation reaction technique） 一、概况 可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂质和病毒等，与相应抗体结合后，抗原抗 体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入红细胞和溶血素，即 可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相应的抗原或抗体。这个反应 就是补体结合反应。 补体结合反应是一种古老的血清学技术，Bordet和Gengou在1901年设计这一 试验，由于有敏感性高和适应性广的优点，尽管操作繁杂，目前仍被有效地应用。 （一）补体及其作用特点 补体存在于哺乳动物血清中，各种动物比较，豚鼠血清中补体含量最高，成分 较全，效价稳定，采取方便，故通常将豚鼠的全血清作为补体。56℃30min可使补 体失去活性，称为“灭能”或“非动”。 补体的作用为能与抗原—抗体复合物结合，但不能与抗原单独结合，也不易与 抗体单独结合；补体的作用没有特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合。它能 与红细胞（抗原）和溶血素（抗体）的复合物结合，引起红细胞破坏（溶血），也能 与细菌、病毒成分及其相应抗体的复合物结合。 （二）溶血反应 将红细胞多次注射于动物（如将绵羊红细胞多次免疫家兔）可使之产生相应的抗体（溶血 素），这种抗体与红细胞结合，若有补体存在时，则红细胞被溶解，这种现象称为溶 血反应。红细胞和溶血素被称为溶血系统，常在补体结合反应中用作测定有无补体 游离存在的指示剂。 （三）补体结合反应及其原理 可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等或者颗粒性抗原，与相应抗体结 合后，其抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能觉察。如再加入红细 胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相对应的抗原 和抗体。此反应即为补体结合反应。 补体结合反应中的抗体主要是IgG和IgM。 反应的原理在于补体本身没有特异性，能与任何抗原抗体复合物结合。以检查 鼻疽病为例，先向试管中加入已知的抗原（鼻疽菌的浸出液），再加入被检马匹的血 ? 1 ?
5.方茴说：“那时候我们不说爱，爱是多么遥远、多么沉重的字眼啊。我们只说喜欢，就算喜欢也是偷偷摸摸的。” 6.方茴说：“我觉得之所以说相见不如怀念，是因为相见只能让人在现实面前无奈地哀悼伤痛，而怀念却可以把已经注定的谎言变成童话。” 7.在村头有一截巨大的雷击木，直径十几米，此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光，变得普普通通了。 8.这些孩子都很活泼与好动，即便吃饭时也都不太老实，不少人抱着陶碗从自家出来，凑到了一起。 9.石村周围草木丰茂，猛兽众多，可守着大山，村人的食物相对来说却算不上丰盛，只是一些粗麦饼、野果以及孩子们碗中少量的肉食。 附录ⅨK抗补体活性测定法 本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化，测定供试品的抗补体活性。 试剂（1）镁-钙贮备液取氯化钙1.103g、氯化镁（MgCl2·6H2O）5.083g，加水溶解并稀释至25ml。 （2）巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g，加水800ml溶解。用1mol/L 盐酸溶液调pH值至7.3，加镁-钙贮备液2.5ml，加水稀释至1000ml，用0.22μm膜滤过，4℃保存备用。 （3）明胶巴比妥缓冲液（GVB）取明胶0.625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。 （4）阿氏液（Alsever’s液）取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g，加水溶解并稀释至1000ml（pH6.2左右）。根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟（灭菌后，尽快释放蒸汽）。放冷后置4℃冰箱保存备用。 （5）绵羊红细胞由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，无菌分装，4℃保存一周后方可使用。 （6）溶血素兔抗羊红细胞血清。 （7）豚鼠血清（补体）取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，-70℃保存，也可冻干保存。豚鼠血清每1ml中的补体总活性应不低于100CH50。 5%羊红细胞悬液制备取绵羊红细胞适量，用明胶巴比妥缓冲液至少洗3次后，悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。取0.2ml红细胞悬液，加至2.8ml水中，待红细胞完全溶解后照紫外-可见分光光度法（附录ⅡA）在波长541nm处测定吸光度，根据下列公式，将该溶液的吸光度调节至0.62±0.01（每1ml红细胞悬液含红细胞1×109个）。 V f = V i×A ———— 0.62 式中Vi 为稀释前红细胞悬液体积，ml； A为稀释前红细胞溶解液吸光度； V f为稀释后红细胞悬液体积，ml。 溶血素滴定按表1稀释溶血素。从1∶75稀释的溶血素开始，1.0ml不同稀释度的溶血素分别与5%羊红细胞悬液1.0ml混合，37℃放置30分钟后，取0.2ml，加明胶巴比妥缓冲液1.10ml，稀释的豚鼠补体溶液（如150倍稀释补体）0.2ml，37℃放置60分钟后，以每分钟2000转离心5分钟，吸取上清液，照紫外-可见分光光度法（附录Ⅱ A）于波长541nm处测定各管吸光度。每个稀释度做2管。同时再做3管未溶血对照管（明胶巴比妥缓 冲液1.4ml，加5%羊红细胞悬液0.1ml），3管全溶血管(水1.4ml加5%羊红细胞0.1ml)， 1.“噢，居然有土龙肉，给我一块！” 2.老人们都笑了，自巨石上起身。而那些身材健壮如虎的成年人则是一阵笑骂，数落着自己的孩子，拎着骨棒与阔剑也快步向自家中走去。
第二节补体结合试验 补体结合试验（complementfixationtest，cft）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。 一、类型及原理 该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图14-2）。因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。
图14-2补体结合试验示意图 二、试验方法 补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法(3ml)、半量法(1.5ml)、小量法(0.6ml)和微量法（塑板法）等。目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也较好。以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。 （一）试剂 1．抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。2．抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓
免疫球蛋白、补体检查项目及临床意义 一、免疫球蛋白检查 1. 免疫球蛋白G (IgG) 参考值：7—16 g/L 临床意义：IgG增高常见于：传染性肝炎（急性）、肝硬化、狼疮样肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、结核、亚急性细菌性心内膜炎、传染性单核细胞增多症、性淋巴肉芽肿、IgG骨髓瘤。IgG下降常见于：无γ球蛋白血症、选择性IgG IgA缺乏症、肾病综合症、IgA骨髓瘤、巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病。 2. 免疫球蛋白A (IgA) 参考值：0.7—4.0 g/L 临床意义：IgA增高常见于：传染性肝炎（急性）、肝硬化、狼疮样肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、IgA骨髓瘤。IgA降低常见于：无γ球蛋白血症、选择性IgG IgA缺乏症、抗IgA血症、肾病综合症、IgA骨髓瘤、巨球蛋白血症、急慢性淋巴细胞白血病。 3. 免疫球蛋白M (IgM) 参考值：0.4—2.3 g/L 临床意义：IgM增高常见于：传染性肝炎（急性）、肝硬化、狼疮样肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、亚急性细菌性心内膜炎、传染性单核细胞增多症、巨球蛋白血症。IgM降低常见于：无γ球蛋白血症、选择性IgM IgA缺乏症、肾病综合症、IgA IgG骨髓瘤、肝癌、慢性淋巴细胞白血病。 二、补体检查
1. 补体C3 (C3) 参考值：0.9—1.8 g/L 临床意义：C3增高常见于：各种转染病、急性炎症和组织损伤、急性肾炎、肝癌等，类风湿性关节炎患者正常或略有升高。C3降低常见于：免疫复合物引起的增殖性慢性肾小球肾炎（MPGN）、急性链球菌感染后肾小球肾炎（AGN）、狼疮性肾炎、反复性感染、皮疹、肝炎、肝硬化等严重肝脏疾患和关节疼痛等。 2. 补体C4 (C4) 参考值：0.1—0.4 g/L 临床意义：C4增高常见于：各种传染病、急性肾炎、组织损伤、多发性骨髓瘤等。C4降低常见于：免疫复合物引起的肾炎、系统性红斑狼疮、病毒性感染、狼疮性症候群、肝硬化、肝炎等。
抗核抗体与补体检测在系统性 红斑狼疮诊断中的意义 李冰,冯斐斐1,杨新周,聂广金1,张鹏2 郑州大学第一附属医院呼吸科 郑州市 450052 摘要 目的 探讨抗核抗体(ANA)和补体C3、C4检测在系统性红斑狼疮(S LE)诊断中的意义。方法 对我院52例S LE患者和40例健康体检者用间接免疫荧光法检测ANA,用散射比浊法检测C3、C4。结果 52例S LE患者的ANA阳性率为9213%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0105)。补体C3、C4值(珋x±s)分别为(0174±0134)、(0118±0109),比对照组低,差异有统计学意义(P<0105)。3个指标间相关关系为:C3与C4呈正相关关系,C4与ANA呈负相关关系,且相关有统计学意义(P<0105);而C3与ANA未呈现相关关系。判别分析得到的分类方程式为病例组:Y1=-431858+71316×性别+01425×年龄+141701×C3+571190×C4+ 101125×ANA;对照组:Y2=-361500+91520×性别+01397×年龄+191694×C3+441672×C4+41893×ANA;利用上述分类函数方程式,对病例和对照进行判断,判断S LE患者的符合率为8815%,判断正常对照的符合率为100%。结论 检测ANA、C3、C4对S LE有较高的诊断价值,其中C4的意义最大,在诊断S LE的实验室检测中是必不可少的3个指标。 关键词 系统性红斑狼疮;ANA;C3;C4;判别分析 中图分类号:R593124 文献标识码:B 文章编号:167223422(2008)0920006203 Si gn i fi cance of Anti-nucleosome Antibody and Co mplement i n D i a gnosis of System i c Lupus Erythematosus L I B ing,FEN G Feifei,YAN G X inzhou,et a l The F irst A ffiliated Hospital,Zhengzhou U niversity,Zhengzhou450052,China ABSTRACT O bjecti ve To exp l ore the r ole of anti-nucles ome antibodies(ANA)and com2 p le ment components C3、C4in the diagnosis of syste m ic lupus erythemat osus.M ethods ANA was de2 tected by indirect i m munity fluorescent method and C3、C4were detected by nephel ometry in the seru m of52S LE and40health contr ols.Results Out of52S LE,9213%were positive for ANA,there were significantly statistical differences bet w een the case gr oup and the contr ol gr oup(P<0105).The lev2 els of comp le ment C3、C4were(0174±0134)、(0118±0109)res pectively,which were l ower than those of contr ol gr oup,and there were statistical differences bet w een the t w o gr oup s(P<0105). There was the positive bivariate correlati on bet w een the seru m levels of C3and C4,negative bivariate correlati on bet w een the levels of C4and ANA in the S LE patients(P<0105).And there was not cor2 relati on bet w een C3and ANA.T wo equati ons were given by discri m inati on analysis,that were:case gr oup Y1=-431858+71316×sex+01425×age+141701×C3+571190×C4+101125×ANA; contr ol gr oup Y2=-361500+91520×sex+01397×age+191694×C3+441672×C4+41893×ANA;t o distinguish the t w o gr oup s by the t w o equati ons,the coincidence percentage was8815%in case gr oup and100%in contr ol gr oup.Conclusi on ANA、C3and C4were very valuable in the diag2 nosis of S LE,es pecially C4.they were indis pensable markers in the diagnosis of S LE. KE Y WO R D S Syste m ic lupus erythe mat osus;Anti-nucleos ome antibody(ANA);Co mp le2 ment C3、C4;D iscri m inati on analysis 1 郑州大学公共卫生学院劳动卫生教研室 郑州市 450001 2 郑州大学第一附属医院骨科 郑州市 450052 系统性红斑狼疮(S LE)是一种常见的累及多器官的自身免疫性结缔组织疾病。目前尽管S LE ? 6 ? 医药论坛杂志 2008年5月 第29卷 第9期
补体C3测定试剂盒（免疫比浊法） 适用范围：本试剂用于体外定量测定人血清中补体C3的浓度。 1.1包装规格 液体双剂型 试剂1（R1）：60mL×1，试剂2（R2）：20mL×1； 试剂1（R1）：60mL×2，试剂2（R2）：20mL×2； 试剂1（R1）：40mL×1，试剂2（R2）：15mL×1。 1.2主要组成成分 1.2.1 试剂1（R1）（液体） Tris/HCl 缓冲液（pH 7.5）10mmol/L 1.2.2 试剂2（R2）（液体） 羊抗人C3抗体浓度根据效价而定 2.1 外观 试剂盒中各组件的外观应满足： 2.1.1 试剂 1(R1)应为无色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损。 2.1.2 试剂2(R2)应为淡黄色至淡粉色溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损。 2.2 净含量 液体试剂净含量应不少于标示值。 2.3试剂空白吸光度 在波长600nm处（光径1cm），试剂空白吸光度（A）应≤0.100。 2.4准确度
测定ERM-DA470k,相对偏差应不超过±10%。 2.5分析灵敏度 对应于浓度为0.5g/L的C3所引起的吸光度差值（△A）的绝对值应 0.050～ 0.250的范围内。 2.6重复性 重复测定高、中、低浓度样本，变异系数（CV）应≤ 5%。 2.7批间差 测定同一样本，批间差（R）应≤ 5%。 2.8 线性范围 在[0.3,3.50]g/L范围内，线性相关系数（r）应≥0.990； 在(1.5,3.50]g/L范围内，线性相对偏差应不超过±10%； 在[0.3,1.5]g/L范围内，线性绝对偏差应不超过±0.15g/L。 2.9 稳定性 2.9.1效期稳定性 原包装的试剂盒在2℃～8℃避光贮存，有效期为24个月。试剂有效期满后3个月以内，试剂性能应符合2.1、2.3、2.4、2.5、2.6、2.8的要求。2.9.2开盖稳定性 开盖后，在2℃～8℃避光保存，可稳定30天；开盖稳定期满后1天内，试剂性能应符合2.1、2.3、2.4、2.5、2.6、2.8的要求。
免疫学检验备考版 辛酸/硫酸铵法提纯IgG 在酸性条件下( pH4.5)，血清或腹水中非IgG的蛋白成份(包括白蛋白，部分Ig)，能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。辛酸/硫酸铵法比硫酸铵法能够获得更高纯度的IgG。 50%溶血试验（CH50）测定补体实验 绵羊红细胞（SRBC），与相应抗体（溶血素）结合后，可激活待检血清中的补体而导致SRBC 溶血。其溶血程度与血清中补体的含量和功能有关。由于补体含量与溶血程度之间呈正相关，但不是直线关系，而呈S曲线关系，故通常取反应曲线中间部位即50％溶血（CH50）为判定终点。由于抗原抗体复合物激活的是补体的经典途径，C1～9任何一种成分缺陷都可使CH50降低，所以此实验反映了总补体的活性。 补体结合试验的基本原理 抗原抗体复合物可以结合补体，这是补体结合试验的依据。绵羊红细胞和其相应抗体（溶血素）的复合物结合补体后出现溶血现象。因此，绵羊红细胞和溶血素被作为补体结合试验中判断待测系统中有无抗原抗体反应的复合物系统。如待测系统产生抗原抗体复合物，则可结合一定量补体，此时加入溶血系统则不出现溶血。如待测系统中只有抗原或抗体，不能结合补体，加入溶血系统则与游离补体结合而发生溶血，这就是补体结合试验的基本原理。 补体结合试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：①反应系统，即已知的抗原（或 抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即SRBC与相应溶血素， 试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。反应系统与指示系统争夺补体系统， 先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。 如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加 入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。 如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当 加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性。因此补体结合试验可用已知抗原 来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。 单向免疫扩散实验 (1)原理：待测抗原从局部含有定量抗体的凝胶内自由向周围扩散，抗原抗体特异性结合，在两者比例合适的部位，形成白色沉淀环，沉淀环的大小与抗原的浓度呈正相关。 (2)技术要点：将抗体和热融化琼脂(约50%)混合，倾注成平板。待凝固后在琼脂板上打孔，孔中加入已稀释的抗原液，和不同浓度的抗原标准品，置37～12℃温箱，24～48h后观察孔周围沉淀环。量取沉淀环直径，通过抗原标准品，计算待测抗原的浓度。