孙月娥,夏文水,陈 洁
*
(江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122)
摘 要:在叔丁醇中以二十二碳六烯酸(DHA)乙酯和海藻糖为原料,通过固定化脂肪酶催化合成DHA 海藻糖酯,并对其分离纯化方法进行研究。确定DHA 海藻糖酯的薄层层析(TLC )条件:展开剂为乙酸乙酯/甲醇/水(815/1/015,v /v/v),碘蒸气显色10m i n ;硅胶柱层析条件:正己烷/异丙醇/甲醇(5/4/1和4/4/2,v/v/v)梯度洗脱,流速113mL /m in ,1管/7m i n 收集洗出液;用半制备高效液相色谱(H PLC)进一步纯化单酯收集液,经分析型HPLC 检测纯度后用核磁共振(NMR )方法进行结构鉴定,确定为DHA 藻糖单酯。
关键词:二十二碳六烯酸(DHA ),海藻糖酯,固定化脂肪酶,纯化,核磁共振(NMR)
Separati o n ,purifi c ati o n and i d entifi c ati o n
of docosahexaenoy l treha l o se
SUN Yue -e ,X I A W en -shu,i CHEN Jie
*
(S tate Key Laboratory of Food Science and Technology ,Ji angnan Un i versity ,Wuxi 214122,Ch i na)
Abstrac:t Docosahexaenoyl treha l ose(DHA)w as synthes i z ed from d ocosahexaeno i c ac i d e t hyl es t e r and treha l ose i n t e rt -bu tano lus i ng m i m ob ili z ed l i pase as b i oca ta l y s t 1The pu rifi cati on and ana l ys i s m e thod s w e r e i nves ti g ated 1The
m ob il e p hase f o r the t h i n l aye r ch rom atog rap hy(TLC )w as e thy l ace tate /m e thano l/w a ter(815/1/015,v /v /v)and i o d i ne w as used f o r d eve l opm ent 1The s ili c a ge l co l um n chrom a t og rap hy cond iti o ns w e re as f o ll ow s :g rad i en t m ob il e p hases o f hexane-i sop ropano l -m e thano l5B 4B 1(v /v /v)and 4B 4B 2(v /v /v)w ere used i n turn 1The fl o w rate w as 113m L/m i n and the e l u en t o f 1t ube /7m i n w as co ll e c t ed 1The e l uent o f m ono-docosahexaenoyl treha l ose w as p uri fi e d w it h sem i -p repa ra ti v e h i g h pe rf o r m ance li q u i d ch rom atog raphy HPLC f u rthe r and t hen w as i den tifi e d by nuc l e a rm agne ti c resonance(NMR)1Key w ords :docosahexaeno i c ac i d(DHA);docosahexaenoyl treha l o se;m i m ob ili zed l i pase;pu rifi cati on ;NMR
中图分类号:TS20112+
3 文献标识码:A 文章编号:1002-0306(2010)03-0200-04收稿日期:2009-05-05 *通讯联系人
作者简介:孙月娥(1973-),女,博士研究生,研究方向:食品脂质氧化。基金项目:国家自然科学基金课题(20401007)以及江苏省创新人才基
金课题(BK2006503)支持。
非水相酶法催化酯交换反应是一个崭新的研究领域,与传统的化学合成法相比,酶催化合成具有反应条件温和、选择性高、副产物少等优点。大量研究证实,DHA 为人体必需的多不饱和脂肪酸,具有抑制
血小板凝聚、抗血栓、防治心脑血管疾病[1]
、降低冠心病患者心肌梗塞死亡率[2]
、
促进智力发育等功能[3]
,此外,还具有抗肿瘤作用[4-5]
。海藻糖是天然双糖中较稳定的二糖,无还原性,在食品中加热不发生美拉德反应。海藻糖作为一种天然二糖,它不仅具有其它低聚糖的特性,而且还具有独特的生物活性)))对生物体和生物分子具有独特的非特异性保护作用[6]
。研究表明,许多生物在胁迫环境(如饥饿、高
温、冷冻、干燥、高渗、辐射、有毒物质等)下表现出的
抗逆耐受力与体内的海藻糖含量有直接的关系[7-8]
。因此,通过酯交换反应把海藻糖和DHA 结合成酯能同时发挥两种活性成分的生物学功能。本文主要研究了非水相脂肪酶催化合成DHA 海藻糖酯的分离纯化方法和鉴定方法,即通过薄层层析、硅胶柱层析和半制备反相HPLC 分离纯化目标产物,采用液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用系统(LC -ESI -M S)及核磁共振技术对DHA 海藻糖单酯进行鉴定。
1 材料与方法
111 材料与设备
硅胶(200~300目)、硅胶板(G254) 青岛海洋化工;甲醇(色谱纯) 江苏汉邦科技有限公司;海藻糖(食品级) 日本林原公司;DHA 乙酯(含量>75%) 无锡市迅达海洋生物制品厂赠送;4!分子筛、叔丁醇及其它有机溶剂 分析纯,中国医药集团上海试剂有限公司;固定化脂肪酶Novozy m 435 诺
维信公司。
W aters 高效液相色谱-质谱联用仪、W aters 半制备型高效液相色谱仪 美国W aters 公司;LC20A 分析型高效液相色谱仪 日本岛津公司;Seastar 旋转蒸发器 无锡星海王生化设备有限公司;水浴恒温振荡器 上海精宏实验设备有限公司;B RUKER 500MH z 核磁共振仪 德国B r uker 公司。
112 实验方法
11211 非水相酶法合成DHA 海藻糖酯 在250m L 圆底烧瓶(包裹锡箔纸)中分别加入150mL 预脱水的叔丁醇、115g 海藻糖、4124g DHA 乙酯、115g 固定化脂肪酶Novozy m 435,充氮保护,在50e 恒温水浴振荡器(150r /m in)中避光反应50h 。11212 液质联用分析(H PLC -M S)1121211 色谱条件 色谱柱,YMC-P ack ODS-A,416mm @250mm,5L m;流动相A,超纯水(013%甲酸);流动相B ,甲醇;流动相C ,正己烷;梯度洗脱程序:0~15m i n ,A 20%~0%,B 80%~100%;15~30m i n ,B 90%~100%,C 0%~10%。流速,1mL /m i n ;检测波长,205n m;柱温,30e ;进样量10L L 。1121212 质谱条件(M S ) W aters P latfor m Z MD 4000,电喷雾离子化源,正离子模式ES+:毛细管电压4120k V,锥孔电压36V,离子源温度100e ,脱溶剂气温度250e ,质量范围(m /z)200~1400,光电倍增器电压650V,Analyser 真空度216e -5mBar ,气体流速413L /h 。负离子模式ES -:毛细管电压4123k V,锥孔电压36V,离子源温度100e ,脱溶剂气温度250e ,质量范围(m /z)200~1400,光电倍增器电压650V,Analyser 真空度216e -5mB ar ,气体流速413L /h 。11213 硅胶柱层析分离纯化 将反应液过滤,除去固定化脂肪酶,减压浓缩,浓缩液上硅胶层析柱(硅胶200~300目,30mm @400mm ),流动相为正己烷/异丙醇/甲醇=5/4/1、4/4/2(v /v /v )梯度洗脱,流速为113mL /m in ,按1管/7m i n 分段收集洗出液,同时进行TLC 检验。将斑点相同者用分析型H PLC 进一步检测,合并杂质较少的收集管中的流出物,将其进行减压浓缩后,用半制备液相色谱进一步分离纯化。11214 薄层色谱(TLC )分析 将经过硅胶柱层析收集的粗分离液在硅胶薄层板上点样,展开剂为乙酸乙酯/甲醇/水(815/1/015,v /v /v),展开10m i n ,碘蒸气显色。11215 半制备液相色谱纯化 色谱条件:Sunfire C 18色谱柱(150mm @19mm i 1d 1,10L m ),流动相甲醇B 水(v /v )=85B 15,流速810mL /m i n ,检测波长205n m,进样量500L L ,柱温30e 。11216 分析型HPLC 分析 岛津LC-20A 分析型H PLC 色谱条件:Sunf ire C 18反相色谱柱(150mm @416mm i 1d 1,5L m ),流动相为甲醇B 水(v /v)=85B 15,二极管阵列检测器(PDA ),流速110mL /m i n ,上样量10L L ,检测波长205n m ,柱温30e 。11217 DHA 海藻糖单酯结构鉴定 核磁共振(NM R ):样品溶解于氘代甲醇中,用B RUKER 500MH z 核磁共振仪测定产物的13
C NMR 图谱。
2 结果与分析
211 DHA 海藻糖酯的合成与HPLC -MS 分析
DHA 乙酯与海藻糖进行酯交换反应的过程见
图1,由于海藻糖是分子结构对称的二糖,6-和6c -位置的羟基较活跃,因此,有可能在6-OH 和6c -OH 上进行酯交换反应,生成相应的DHA 海藻糖的单酯和
二酯。
图1 DHA 海藻糖酯的合成路线
实验中得到的合成反应液经过滤、梯度洗脱和在线柱后质谱鉴定,结果如图2和图3所示。图2显
示,合成反应液经过液相色谱仪后出现较多的峰,但是经在线质谱检测,发现只是在保留时间为8127m i n 和17154m i n
的组分为可能的目标产物。
图2 DHA
海藻糖酯反应液的色谱分离图
图3 DHA 海藻糖酯的ES I -M S 离子流谱
电喷雾电离是通过常压电离源,使待分析样品的分子质子化而生成单电荷离子[9-11]。图3(a)为保留时间8127m i n 的组分的M S 图谱,DHA 海藻糖单酯的相对分子质量为652135,ES -图谱上出现的m /z 值为65117的峰,是[M 1-H ]的质谱信号。其它m /z 值为69718、32713、130413的峰分别为[M 1+HCOO -
]、[C 22H 31O 2]
-(D HA 酸根)、[2M 1-1]的质谱信号;而
ES+图谱上出现的m /z 值为67517、69118、132812的峰分别为[M 1+N a]、[M 1+K]、[2M 1+Na]的质谱信号,因此证明了DHA 海藻糖单酯的存在。图3(b)为
保留时间17154m i n 组分的M S 图谱,DHA 海藻糖二酯的相对分子质量为962158,ES -图谱上出现的m /z 值为96211、100811、32713的峰分别为[M 2-H ]、[M 2+H COO -
]、掉下的DHA 酸根碎片的质谱信号,而ES +
图谱上出现的m /z 值为98610的峰为[M 2+Na]的质谱信号。因此,在酯交换反应过程中,固定化脂肪酶催化DHA 乙酯和海藻糖酯交换反应生成的产物是DHA 海藻糖单酯和二酯的混合物。由于在C 18反相色谱柱上极性大的组分先出峰,极性小的组分后出峰,DHA 海藻糖单酯、DHA 藻糖二酯的极性依次减弱,因此图2中DHA 海藻糖单酯在DHA 藻糖二酯前面出峰。
212 DHA 海藻糖酯的硅胶柱层析分离及TLC 分析
由以上实验可知,合成反应液中含有DHA 海藻糖单酯、DHA 藻糖二酯以及其它杂质,将反应液经硅
胶柱层析分离纯化,并用TLC 进行分析。图4中1、2和3分别是DHA 海藻糖单酯、二酯和酶催化合成的反应液。D HA 乙酯极性最弱,易随流动相迁移,因而出现在溶剂前沿;产物DHA 海藻糖二酯极性较弱,故R f 值较大;单酯极性相对较大,故R f 值较小,糖在该TLC 条件下不显色,由于单酯和二酯在硅胶板上分离效果较好,且均为一个点,可初步认定它们为纯
物质。
图4 DHA 海藻糖酯的TLC 图谱
213 半制备型HPLC 纯化
为了得到纯度更高的D HA 海藻糖单酯,将硅胶
柱色谱分离纯化得到的DHA 海藻糖单酯收集液真空浓缩,除去溶剂后加入色谱甲醇溶解,经0145L m 尼龙膜微滤后,用半制备型高效液相色谱进一步纯化。经过对流动相组成、洗脱速度和进样量等诸因素的优化,得出最佳色谱条件:流动相甲醇B 水(v /v)=85B 15,流速810mL /m i n ,检测波长205n m,进样量500L L ,柱温30e 。按上述半制备色谱条件洗脱,收集各峰,再经M S 分析(结果略),最终确定保留时间1810~2110m i n 的峰为单酯组分(见图5)
。
图5 样品的制备色谱分离图
214 DHA 海藻糖单酯的鉴定
将半制备液相得到的纯品减压浓缩去除溶剂后,按11216中方法用分析型H PLC 进行纯度检测,图6中t=71024m in 处是DHA 海藻糖单酯的洗脱峰,以面积归一化法测得产物纯度>97%
。
图6 DHA 海藻糖单酯的高效液相色谱图
采用NMR 仪对纯品进行分子结构鉴定:1H NMR(500MH z ,CD 3OD )D (L g /mL ):5136(12H,m ),5108(1H,d ,J=316H z),5106(1H,d ,J=316H z),4135(1H,d ,J=1119H z),4120(1H,dd ,J=1119,511H z),4102(1H,m ),3180(4H,m ),3165(1H,dd ,J=1117,511H z),3149(2H,m ),3134(2H,m ),2180(10H,m ),
2139(4H,s),2107(2H,m ),0196(3H,,t J=710H z);13
C NMR(500MH z ,C
D 3OD)D (L g /mL ):951542(C1),731476(C2),721200(C3),711699(C4),741787(C5),
641824(C6),951406(C1c ),731512(C2c ),721228(C3c ),711699(C4c ),741954(C5c ),621943(C6c ),1741993(C =O ),133109,130155,1291745,1291745,1291486,1291486,1291427,1291427,1291394,1291394,1291217,1281474(all are-C H =C H-car bon),35127,261859,261859,261802,261728,261728,24104,211776(all are -C H 2-carbon),141941(CH 3)。ESI -MS m /z 65117[M-H ]-,67517[M +Na]+
,69118[M +K ]+
。
结合M S 分析结果,可确定该产品为6-O-DHA 海藻
糖单酯。
3 结论
利用固定化脂肪酶在非水体系中对DHA 乙酯和海藻糖进行酯交换反应,经H PLC /M S 分析,合成的反应液中存在DHA 海藻糖的单酯和二酯。将反应液进行减压浓缩,以薄层层析(TLC )作为辅助检测手段,用硅胶柱层析分离各个组分,分别得到DHA 海藻糖单酯和二酯粗品,利用半制备液相对其中的单酯样品进一步纯化,得到纯度大于97%的纯品,经NMR 鉴定,确认该物质为6-O-DHA 海藻糖单酯。
参考文献
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(下转第206页)
了繁殖高峰,其代谢产生的酶旺盛,故在这期间出现了发酵力增幅高峰。第21~30d 酵母菌增幅平缓,发
酵力也随之缓慢增加。
图8 酯化曲在制曲过程中发酵力的变化
219 泸型酯化曲与中高温曲生化性能比较
通过表1对存放3个月的酯化曲和中高温曲生化性能的比较可知:酯化曲的酯化力、液化力和糖化力均明显优于中高温曲的这三个指标,但在发酵力指标方面中高温曲与酯化曲比较接近,无明显优势。微生物指标方面,酯化曲中微生物数量明显高于中高温曲。
表1 泸型酯化曲和中高温曲生化性能指标(均值)指标
泸型酯化曲
中高温曲糖化力(m g /g #h)88217665液化力(g /g #h)71054106发酵力(g /g #72h)31223106酯化力(g /g #96h)01870169细菌(105/g)1361910616芽孢杆菌(105/g)86193619霉菌(105/g)76185613酵母(105/g)
5316
2814
酯化曲中添加的复合功能菌改变了中高温曲以
细菌为主的状况,大大增加了霉菌和酵母菌的数量,使三者更加协调[6]
。其微生物指标对酯化曲酶活有重要影响,因发酵力的变化主要与曲坯中产酒精酵母菌的数量变化有关,因而酯化大曲和中高温大曲的发酵力指标比较接近。
3 结论
311 酯化曲的培养是人工接种和自然接种形成的霉
菌、酵母菌和细菌为主体的混合菌系,各菌系在培曲
过程中彼消此长、共栖共生,并在不同的培曲阶段占主导地位,最终经过制曲环境条件的筛选淘汰形成各种有益的大曲微生物。
312 酯化曲在制曲过程中微生物菌群的变化受到的
影响因素是多样的,如受温度、含水量、养分和复合功能菌中添加的微生物种类和数量的影响。
313 酯化曲微生物菌群的变化会直接影响其酶系活
力指标。糖化力变化趋势与霉菌数量有关,液化力的变化受到霉菌、芽孢杆菌数量变化的影响,其中酯化酶活力变化受到人工添加的和在制曲中自然接种的酯化菌的影响。发酵力变化则与酵母菌的数量变化有关系。
314 通过对泸型酯化曲与中高温曲生化性能的比
较,可以看出,加入复合功能菌强化了曲药功能菌的数量,从而提高了酯化曲的质量。其酯化力、糖化力和液化力指标优于中高温大曲,其中酯化曲酯化力超过中高温曲酯化力180m g /g #96h 。
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(上接第202页)
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蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化
关于食品添加剂“二十二碳六烯酸粉剂”申报名称的说明 我公司申报食品添加剂名称为“二十二碳六烯酸粉剂”，申报资料及检测报告中为二十二碳六烯酸微藻粉剂及DHA藻油粉剂，以“二十二碳六烯酸粉剂”为准，特此说明。 广东润科生物工程有限公司
申报资料二 添加剂的通用名称、功能分类、用量和使用范围
通用名称：二十二碳六烯酸粉剂,（Docosahexaenoic acid, DHA ）; 英文名： DHA Powder 功能分类：营养强化剂 使用量： 对于儿童和孕妇用调制乳粉：以纯DHA 计 表1 调制乳粉中的使用量 对于其他食品： 推荐使用量每人≤300毫克/天（以纯DHA 计） 使用范围： 特殊膳食用食品、婴幼儿配方食品、辅助食品、孕妇食品、儿童食品、乳制品、饮料。 食品分类号 食品类别 最大使用量 （g/kg ） 01.03.02 调制乳粉（仅限儿童用乳粉） ≤0.5％（占总脂肪酸 的百分比） 01.03.02 调制乳粉（仅限孕产妇用乳粉） 300-1000mg 13.01 婴幼儿配方食品 按国标执行 13.05 辅助食品 ≤115mg/100g
申报资料三 证明技术上确有必要和使用效果的资料
DHA是人体内一种重要的多不饱和脂肪酸，它是大脑、神经和视觉细胞中重要的脂肪酸组成成分，对人体生理功能的正常发挥及多种疾病的防治有着重要作用，特别是在婴幼儿大脑和视觉系统发育过程中占有十分重要的地位。许多发达国家都已经在孕妇、哺乳期妇女以及婴幼儿和学前儿童的配方食品中添加DHA[1]。我国卫生部也批准由裂壶藻生产的DHA油为新资源食品。但是由于DHA油的天然物理性质为油脂，而且含有多个不饱和双键，因此极易受到环境中氧、热、水分、光的影响而产生质量和气味的变化，稳定性受到极大影响, 同时还可以生成反式脂肪酸和氧化产物[2]。研究表明这些油脂的氧化产物可以引发人体内细胞程序性死亡（Programmed Cell Death, PCD），并直接诱导癌症的发生[3]。因此DHA油的氧化不单会产生酸败异味，影响产品的存储、货架期和产品质量，还会令其功能降低，进一步危害人体健康。除此, 液体的DHA藻油也对包装和物流运输有较高的要求, 相应提高了产品的附加成本, 进一步影响了产品的普及和广泛应用. 润科DHA粉剂是通过微胶囊技术而制成的。微胶囊技术是指利用成膜材料－壁材如天然高分子材料，将分散的固体、液体等物质囊于其中，形成具有半透性或密封性微小微胶囊颗粒的技术。它的研究始于20世纪30年代，到20世纪70年代，微胶囊的制备工艺已经非常成熟，应用范围进一步由医药工业扩大到食品工业。在制备微胶囊时，壁材的本身性质如稳定性，可食用性即是否适合食品安全规定等都是要着重考虑的[4]。 将DHA油微胶囊化，就是将液体油脂变为固体微粒产品的技术。通过微胶囊化，可以提高DHA微藻油的氧化稳定性, 保持产品品质, 拓宽应用范围, 具体如下: (1). 微胶囊化使得DHA与外界环境相隔绝，可以有效降低DHA油对pH值、氧气、 湿度、热、光和其他物质对外界环境因素的反应活性，可以有效地防止这些外界环境因素对DHA油的破坏等不良影响, 抑制DHA油产品中有效活性成分如DHA的损失，提高其稳定性，使品质保持持久，延缓产品变质的产生，最大限度的保持DHA原有的功能活性。 (2). 通过将油脂由液体变为微胶囊颗粒，可以有效的控制作为芯材DHA油的释放， 使包埋后的DHA粉末材料在肠道环境下进行壁材的溶解，释放出未氧化的DHA，可以使DHA的有效功能得到最大限度的发挥。（微细化淀粉作鱼油微胶囊壁材的研究） (3) DHA油微胶囊化后，可以掩盖油本身具有的微藻气味，使其‘美食味更佳’，更 符合消费者的饮食习惯，可迅速得到消费者的认可和喜爱, 有利于扩展产品的应用范围, 相比直接使用液体DHA藻油产品, DHA粉末的应用也解决了DHA藻油在其它食品如烘烤食品,含乳酸食品和饮品应用中所难以解决的稳定性和气味问题, 更容易和原材料混合，也简化了生产工艺.
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 2.2 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
二十二碳六烯酸（DHA）生产工艺简介 一、DHA背景与意义 DHA（Docosahexaenoic acid, 22:6△4.7.10.，全名二十二碳六烯酸）是一种重要的长链多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，简称PUFA），属于ω-3 系列（分子结构式中第一个双键位于-COOH基团反侧的第三个键上，即ω-3系列）。人和其它哺乳动物只有△4、△5 、△6及△9去饱和酶，缺乏△9 以上的去饱和酶,因此无法自身合成DHA，必须由食物来提供。 1、DHA的结构和性质 DHA的分子式为C22H30O2,分子量为，分子结构为： DHA通常是顺式，但在某些异构酶作用下可变成反式。含有多个“戌碳双烯”结构及5个活泼的亚甲基。这些活泼的亚甲基舍得DHA极易受光、氧、过热、金属元素（如Fe、Cu）及自由基的影响，产生氧化、酸败、聚合、双键共轭等化学反应，产生以羰基化合物为主的鱼臭物质。 纯DHA为无色、无味，常温下呈液态，且具有脂溶性，易溶于有机溶剂，不溶于水，熔点为－~－，所以在低温下仍然能保持较高的流动性。 2、DHA的来源 海洋动物 海洋鱼类[]是提取DHA的主要来源。海产鱼类特别是中上层鱼类的油脂中含有大量的DHA，如鲔鱼、秋刀鱼、远东沙丁鱼的油中DHA的含量均在10%以上。目前全世界鱼油的年产量在100万吨左右，理论上从中可提取10~25万吨鱼油。实际上由于分离技术等因素的限制，鱼油产量要低于上述数字、而且提取的鱼油有相当大的部分被氧化和渗入人造黄油或起酥油中被消耗掉，真正可用于分离DHA的鱼油仅占少部分。除此之外还有贝类和甲壳类。 真菌类 有许多低级的真菌中含有较多的DHA，其中藻状菌类的DHA含量尤为丰富，
蛋白质分离与纯化教学设计 一、教学背景分析 【教材分析】 “蛋白质的分离与纯化”实验是《高中生物》选修1生物技术实践 5.3血红蛋白的提取与分离中的容。本节课的主要容包括蛋白质的提取、分离纯化等基本知识，主要要求学生掌握凝胶电泳的实验原理以及操作方法。“血红蛋白分离与纯化”实验不仅是学习血红蛋白的提取、分离纯化方法，而且也是进一步掌握蛋白质的组成、结构和功能的基础。 【学情分析】 到目前为止，学生已经学习了蛋白质的相关知识，对蛋白质有了一定的了解，“蛋白质的分离与纯化”实验目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取和纯化生物大分子的基本原理、过程和方法，虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，学习兴趣很高。学生有必修“生命活动的主要承担者——蛋白质”的基础，在一定程度上掌握了蛋白质的组成、结构和功能等基础知识，学生在进行实验前还是能大概了解影响蛋白质分离纯化的因素的，再者经过老师的指导，实验能取得良好的结果的。 二、教学目标 【知识目标】 1.了解从血液中提取蛋白质的原理与方法。 2.说出凝胶电泳的基本原理与方法。 【能力目标】 运用凝胶电泳对蛋白质进行分离纯化。 【情感态度与价值观目标】 1.培养学生科学实验的观点。 2.初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神。 三、教学重难点
【教学重点】 从血液中提取蛋白质；凝胶电泳分离纯化蛋白质。 【教学难点】 样品预处理，色谱柱的装柱，纯化分离操作。 四、实验实施准备 【教师准备】 1.分组。学生按学科能力的强中弱平均分组，各组尽量平衡，各组自行分工，并由实验员统一安排实验过程。 2.实验材料：血液 仪器：试管、胶头滴管、烧杯、玻璃棒、离心机、研磨器、透析袋、电泳仪等。 试剂：20mmol/L磷酸缓冲液（pH为8．6）、蒸馏水、聚丙烯酸铵、生理盐水、5％醋酸水溶液等。 【学生准备】 1.预习实验“蛋白质分离纯化”，了解蛋白质的相关信息。 2.进行分组。 五、教学方法 【教法】分析评价法、任务驱动法、直观演示法 【学法】自主学习法、合作交流法 六、教学媒体 黑板、多媒体 七、课时安排 两个课时（80min） 一个课时用来讲述理论部分知识：样品处理与色谱柱分离纯化蛋白质的原理与方法； 另一课时用来进行实验。
食品中二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的测定 1 原理 油脂经皂化处理后生成游离脂肪酸，其中的长碳链不饱和脂肪酸（EPA和DHA）经甲酯化后挥发性提高。可以用色谱柱有效分离，用氢火焰离子化检测器检测，使用外标法定量。 2试剂 2.1 正己烷：分析纯，重蒸； 2.2 甲醇：优级纯； 2.3 2mol/L氢氧化钠-甲醇溶液：称取8g氢氧化钠溶于100mL甲醇中。 2.4 2mol/L盐酸-甲醇溶液：把浓硫酸小心滴加在约100g的氯化钠上，把产生的氯化氢气体通入事先量取的约470mL甲醇中，按质量增加量换算，调制成2mol/L盐酸-甲醇溶液，密闭保存在冰箱内。 2.5 二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸标准溶液：精密称取EPA、DHA各50.0mg，加入正己烷溶解并定容至100mL，此溶液每毫升含0.50mgDHA； 3仪器 3.1 气象色谱仪附有氢火焰离子化检测器（FID）。 3.2 索氏提取器。 3.3 氯化氢发生系统（启普发生器）。 3.4 刻度试管（待分刻度）：2ml、5ml、10ml。 3.5 组织捣碎机。 3.6 旋涡式震荡混合器。 3.7 旋转蒸发仪。 4试样制备 4.1海鱼类食品：用蒸馏水冲洗干净晾干，先切成碎块去除骨骼，然后用组织捣碎机捣碎、混匀，称取样品50g置于250ml具塞碘量瓶中，加100ml-200ml石油醚（沸程30℃-60℃），充分摇匀后，放置过夜，用快速滤纸过滤，减压蒸馏挥干溶剂，得到油脂后称重备用（可计算提油率）。
4.2添加食品：称取样品10g置于60ml分液漏斗中，用60ml正己烷分三次萃取（每次振摇萃取10min）,合并提取液，在70℃水浴上挥至近干，备用。 4.3 鱼油制品：直接进行样品前处理。 5 分析步骤 5.1 皂化 5.1.1 鱼油制品和海鱼类食品：取鱼油制品或经处理得到的海鱼油脂1g于50ml 具塞容量瓶中，加入10ml正己烷轻摇使油脂溶解，并用正己烷定容至刻度。吸取此溶液1.00-5.00ml于另一10ml具塞比色管中，再加入2mol/L氢氧化钠-甲醇溶液1ml，充分震荡10min后放入60℃水浴中加热1min-2min，皂化完成后，冷却到室温，待甲酯化用。 5.1.2 添加食品：用2ml-3ml正己烷分两次将经5.4.2处理而得的浓缩样液小心转至10ml具塞比色管中，再加入2mol/L氢氧化钠-甲醇溶液1ml，充分震荡10min 后放入60℃水浴中加热1min-2min，皂化完成后，冷却到室温，待甲酯化用。5.2 甲酯化 5.2.1 标准溶液系列：准确吸取配制的标准溶液1.0、2.0、5.0ml分别移入10ml 具塞比色管中，再加入2mol/L盐酸-甲醇溶液2ml，充分震荡10min，并于50℃的水浴中加热2min，进行甲酯化，弃去下层液体，再加约2ml蒸馏水洗净并去除水层，用滴管吸出正己烷层，移至另一装有无水硫酸钠的漏斗中脱水，将脱水后的溶液在70℃水浴上加热浓缩，定容至1ml，待上机测试用。此标准系类中DHA或EPA的浓度依次为0.5、1.0、2.5mg/mL。 5.2.2 样品溶液：在经皂化处理后的样品溶液中加入2mol/L盐酸-甲醇溶液2ml，充分震荡10min，并于50℃的水浴中加热2min，进行甲酯化，弃去下层液体，再加约2ml蒸馏水洗净并去除水层，用滴管吸出正己烷层，移至另一装有无水硫酸钠的漏斗中脱水，将脱水后的溶液在70℃水浴上加热浓缩，定容至1ml，待上机测试用。此标准系类中DHA或EPA的浓度依次为0.5、1.0、2.5mg/mL。 6 气相色谱测定 6.1色谱柱 玻璃柱1m×4mm(id)，填充涂有10%DEGS/Chromosorb W DMCS 80目-100目的担体。
（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分
蛋白质提取、纯化、鉴定的方法（二） 一、层析技术 1.离子交换层析的亲和洗脱这种技术结合了离子交换与亲和层析。如在某一pH时，目的蛋白质带正(负)电荷，用阳(阴)离子交换剂吸附，这一过程去除了很大一部分不吸附的杂蛋自。然后用该目的蛋白质的配体来洗脱，该配体特异性地结合目的蛋白质并使之洗脱，但不洗脱其他吸附的蛋白质，达到纯化的目的。注意，该配体需带有一定量的阴(阳)电荷，有效降低目的蛋白质与阳(阴)离子交换剂之间的电荷相互作用。 2.固相金属亲和层析重组蛋白质可在C-或N-端引入组氨酸标签，一般为6个组氨酸残基(His-tag)。这些组氨酸残基与过渡金属(transitionalmetals)Ni2+或Co2+形成配位键。用固相化的Ni2+或Co2+(如商品化的树脂，Ni-NTA)可吸附带有His-tag的重组蛋白质，用含有咪唑(imidazole)的缓冲液可洗脱重组蛋白质。注意，有些含有较多组氨酸的蛋白质也可与吸附剂结台，但较弱，因此可用低浓度的咪唑洗脱；在层析过程中不能引入金属螯合剂如EDTA；避免使用还原剂如DTT或DTE，但可用低浓度的巯基乙醇。 该技术也用于提取磷酸化的蛋白质。将螫合剂交联到树脂，螯合三价铁或三价镓，该亲和吸附剂可吸附混合物中的磷酸化的蛋白质。洗去不吸附的非磷酸化蛋白质后，用磷酸缓冲液即可将磷酸化蛋白质从该亲和吸附剂上洗脱。要注意的是酸性蛋白质也可被不同程度地吸附。 3.凝胶过滤该技术过去也被称为分子筛。构成凝胶的小珠(bead)中有大小不一的孔，分子量大的分子能进入较大的孔而不能进入小的孔，分子量小的则不仅能进入较大的孔也能进入小的孔，因此在层析过程中，小分子经过的路程较长而大分子经过的路程较短，如此就可分离分子量不同的蛋白质。然而，分子量相近的蛋白质非常多，因此，用这种技术得到的蛋白质是分子量相近的混合蛋白质。然而这种技术在某些研究中很有用，如丙酮酸激酶M2(PKM2)由四个相同的亚基组成，PKM2在细胞中以三种形式存在——单体、二聚体、四聚体，这三种形式的功能不同，若要鉴定细胞中PKM2的各种形式的量，先用凝胶过滤技术分离细胞裂解液中的PKM2的三种形式，之后用Western blot对每一种形式的PKM2做相对定量。 4.反相层析该技术是指用疏水固相的一种层析技术。“反相”是相对“正相”而言，正相是指亲水的固相如硅胶表面带有硅羟基(silanol group)，硅羟基可与被分离的化台物相互作用，被分离的化合物的亲水性越强，则滞留在正相
蛋白质的分离纯化方法 根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有 用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。 根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定 来源：易生物实验浏览次数：2704网友评论0 条第一部分蛋白质的表达、分离、纯化克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作 结构与功能的研究。 第二部分蛋白质的鉴定电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。 关键词：蛋白质蛋白质表达克隆基因聚丙烯酰胺凝胶电泳氯霉素酰基转移酶十二烷基硫酸钠SDS聚丙烯酰 胺凝胶 第一部分蛋白质的表达、分离、纯化 目的要求 （1）了解克隆基因表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MC AC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材
一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. [2] 氨苄青霉素：100mg/mL [3] 上样 缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 [4] Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 [5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH 8.0 [6] IPTG 易生物仪器库：.ebioe./yp/product-list-42.html 易生物试剂库：.ebioe./yp/product-list-43.html 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1′10 cm） 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.
化工学院生物工程一班胡冠南 3010207234 蛋白质分离与纯化技术 蛋白质（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。所以研究蛋白质的结构与功能是研究生物科学的基础。蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。由于深入研究蛋白质的结构与功能需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业中的核心技术。然而该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。所以对该项技术的改良与创新在实际应用中具有重要意义。 一．蛋白质分离的准备 从正常生物基质中提取各种蛋白质均需要有特定的条件。如果不能满足这一条件，蛋白将很快失去生物学活性，其生物半衰期也将迅速降低。因此，在蛋白质的特性研究中，确定提取条件是一个关键问题。在不同的实验中所通到的困难各不相同，有的困难是如何抵抗外源性蛋白酶的作用而维持蛋白质的稳定，在有些实验中的困难是如何维持酶的活性。在不同的实验中要针对不同的情况来解决不同的问题。然而对蛋白质研究而言却有着一些共同的参数。缓冲液可以抗衡蛋白质溶液中pH值的改变，选择合适的缓冲液对于维持—定pH 值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要。pH和pKa是描述缓冲液的两个重要概念。pH值是指溶液中氢离子浓度的负对数，pH＝-log(H+)。 pKa值是溶液中酸解离常数的负对数值。溶液的pH值与pKa值越接近表明溶液的缓冲能力越强，离pKa值越远则缓冲能力越弱。 表1 常用缓冲液的pKa值
实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定 第一部分蛋白质的表达、分离纯化 目的要求 （1）了解重组蛋白表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离纯化对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时目的基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白N端带有6个连续的组氨酸残基，可通过固相化的镍离子（Ni2+）亲和层析介质加以分离纯化，称为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材 一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL。 [2] 氨苄青霉素：100mg/mL。 [3] 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 1 mM β-巯基乙醇, pH8.0。 [4] 清洗缓冲液(UWB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3。 [5] 洗脱液缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 500 mM 咪唑, pH8.0。 [6] IPTG 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1 10 cm），蠕动泵 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株于5mL
蛋白质的纯化原理 一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。 （三）根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 1、电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
分离纯化蛋白质的方法及原理 （一）利用分子大小 1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。 方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行 涉及的问题： 如何加快透析过程 （1）加大浓度差，及时更换透析液 （2）利用磁力搅拌器 常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成 2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上 3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。 结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来 （二）利用溶解度差别 4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析
（三）根据电荷不同 6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。 7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。 氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是： 碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。 因此洗脱顺序应该是： 酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸 为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法
孙月娥,夏文水,陈 洁 * (江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122) 摘 要:在叔丁醇中以二十二碳六烯酸(DHA)乙酯和海藻糖为原料,通过固定化脂肪酶催化合成DHA 海藻糖酯,并对其分离纯化方法进行研究。确定DHA 海藻糖酯的薄层层析(TLC )条件:展开剂为乙酸乙酯/甲醇/水(815/1/015,v /v/v),碘蒸气显色10m i n ;硅胶柱层析条件:正己烷/异丙醇/甲醇(5/4/1和4/4/2,v/v/v)梯度洗脱,流速113mL /m in ,1管/7m i n 收集洗出液;用半制备高效液相色谱(H PLC)进一步纯化单酯收集液,经分析型HPLC 检测纯度后用核磁共振(NMR )方法进行结构鉴定,确定为DHA 藻糖单酯。 关键词:二十二碳六烯酸(DHA ),海藻糖酯,固定化脂肪酶,纯化,核磁共振(NMR) Separati o n ,purifi c ati o n and i d entifi c ati o n of docosahexaenoy l treha l o se SUN Yue -e ,X I A W en -shu,i CHEN Jie * (S tate Key Laboratory of Food Science and Technology ,Ji angnan Un i versity ,Wuxi 214122,Ch i na) Abstrac:t Docosahexaenoyl treha l ose(DHA)w as synthes i z ed from d ocosahexaeno i c ac i d e t hyl es t e r and treha l ose i n t e rt -bu tano lus i ng m i m ob ili z ed l i pase as b i oca ta l y s t 1The pu rifi cati on and ana l ys i s m e thod s w e r e i nves ti g ated 1The m ob il e p hase f o r the t h i n l aye r ch rom atog rap hy(TLC )w as e thy l ace tate /m e thano l/w a ter(815/1/015,v /v /v)and i o d i ne w as used f o r d eve l opm ent 1The s ili c a ge l co l um n chrom a t og rap hy cond iti o ns w e re as f o ll ow s :g rad i en t m ob il e p hases o f hexane-i sop ropano l -m e thano l5B 4B 1(v /v /v)and 4B 4B 2(v /v /v)w ere used i n turn 1The fl o w rate w as 113m L/m i n and the e l u en t o f 1t ube /7m i n w as co ll e c t ed 1The e l uent o f m ono-docosahexaenoyl treha l ose w as p uri fi e d w it h sem i -p repa ra ti v e h i g h pe rf o r m ance li q u i d ch rom atog raphy HPLC f u rthe r and t hen w as i den tifi e d by nuc l e a rm agne ti c resonance(NMR)1Key w ords :docosahexaeno i c ac i d(DHA);docosahexaenoyl treha l o se;m i m ob ili zed l i pase;pu rifi cati on ;NMR 中图分类号:TS20112+ 3 文献标识码:A 文章编号:1002-0306(2010)03-0200-04收稿日期:2009-05-05 *通讯联系人 作者简介:孙月娥(1973-),女,博士研究生,研究方向:食品脂质氧化。基金项目:国家自然科学基金课题(20401007)以及江苏省创新人才基 金课题(BK2006503)支持。 非水相酶法催化酯交换反应是一个崭新的研究领域,与传统的化学合成法相比,酶催化合成具有反应条件温和、选择性高、副产物少等优点。大量研究证实,DHA 为人体必需的多不饱和脂肪酸,具有抑制 血小板凝聚、抗血栓、防治心脑血管疾病[1] 、降低冠心病患者心肌梗塞死亡率[2] 、 促进智力发育等功能[3] ,此外,还具有抗肿瘤作用[4-5] 。海藻糖是天然双糖中较稳定的二糖,无还原性,在食品中加热不发生美拉德反应。海藻糖作为一种天然二糖,它不仅具有其它低聚糖的特性,而且还具有独特的生物活性)))对生物体和生物分子具有独特的非特异性保护作用[6] 。研究表明,许多生物在胁迫环境(如饥饿、高 温、冷冻、干燥、高渗、辐射、有毒物质等)下表现出的 抗逆耐受力与体内的海藻糖含量有直接的关系[7-8] 。因此,通过酯交换反应把海藻糖和DHA 结合成酯能同时发挥两种活性成分的生物学功能。本文主要研究了非水相脂肪酶催化合成DHA 海藻糖酯的分离纯化方法和鉴定方法,即通过薄层层析、硅胶柱层析和半制备反相HPLC 分离纯化目标产物,采用液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用系统(LC -ESI -M S)及核磁共振技术对DHA 海藻糖单酯进行鉴定。 1 材料与方法 111 材料与设备 硅胶(200~300目)、硅胶板(G254) 青岛海洋化工;甲醇(色谱纯) 江苏汉邦科技有限公司;海藻糖(食品级) 日本林原公司;DHA 乙酯(含量>75%) 无锡市迅达海洋生物制品厂赠送;4!分子筛、叔丁醇及其它有机溶剂 分析纯,中国医药集团上海试剂有限公司;固定化脂肪酶Novozy m 435 诺