硝酸盐还原试验
（1）原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。但硝酸盐还原的过程因细菌不同而异，有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞菌等。硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝酸。
（2）培养基：硝酸盐培养基。
（3）试剂：甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸lOOml；乙液（|á-奈胺0.5g + 5mol/L醋酸lOOml）。
（4）方法：被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35℃培养l～4d.将甲、乙液等量混合后（约0.1m1）加入培养基内，立即观察结
果。
（5）结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：①硝酸盐没有被还原，试验阴性；②硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，
如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验
为假阴性。
若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒管，如有气
泡产生，表示有氮气生成。
（6）应用：本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性
水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法
水质亚硝酸盐氮的测定分光光度法 本标准等效采用ISO 6777-1984《水质亚硝酸盐氮测定分子吸收分光光度法》。 本标准根据我国标准的格式对ISO 6777-1984标准技术上稍作修改和补充。 1 适用范围 本标准规定了用分光光度法测定饮用水、地下水、地面水及废水中亚硝酸盐氮的方法。 1．1 测定上限 当试份取最大体积(50ml)时，用本方法可以测定亚硝酸盐氮浓度高达0．20mg／L。 1．2 最低检出浓度 采用光程长为10mm的比色皿，试份体积为50ml，以吸光度0．01单位所对应的浓度值为最低检出限浓度，此值为0．003mg／L。 采用光程长为30mm的比色皿，试份体积为50ml，最低检出浓度为0．001mg／L。 1．3 灵敏度 采用光程长为10mm的比色皿，试份体积为50ml时，亚硝酸盐氮浓度cN=0．20mg／L，给出的吸光度约为0．67单位。 1．4 干扰 当试样pH≥11时，可能遇到某些干扰，遇此情况，可向试份中加入酚酞溶液(3．12)1滴，边搅拌边逐滴加入磷酸溶液(3．4)，至红色刚消失。经此处理，则在加入显色剂后，体系pH值为1．8±0．3，而不影响测定。 试样如有颜色和悬浮物，可向每100ml试样中加入2ml氢氧化铝悬浮液(3．9)，搅拌，静置，过滤，弃去25ml初滤液后，再取试份测定。 水样中常见的可能产生干扰物质的含量范围见附录A。其中氯胺、氯、硫代硫酸盐、聚磷酸钠和三价铁离子有明显干扰。 2 原理 在磷酸介质中，pH值为1．8时，试份中的亚硝酸根离子与4-氨基苯磺酰胺 (4-aminobenzenesulfonamide)反应生成重氮盐，它再与N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐 [N-(1-naphthyl-1，2-diaminoethane dihydrochlo-ride］偶联生成红色染料，在540nm波长处测定吸光度。 如果使用光程长为10mm的比色皿，亚硝酸盐氮的浓度在0．2mg／L以内其呈色符合比尔定律。 3 试剂 在测定过程中，除非另有说明，均使用符合国家标准或专业标准的分析纯试剂，实验用水均为无亚硝酸盐的二次蒸馏水。 3．1 实验用水 采用下列方法之一进行制备： 3．1．1 加入高锰酸钾结晶少许于1 L蒸馏水中，使成红色，加氢氧化钡(或氢氧化钙)结晶至溶液呈碱性，使用硬质玻璃蒸馏器进行蒸馏，弃去最初的50ml馏出液，收集约700ml不含锰盐的馏出液， 待用。 3．1．2 于1 L蒸馏水中加入硫酸(3．3)1ml、硫酸锰溶液[每100ml水中含有36．49硫酸锰(MnSO4·H2O)]0．2ml，滴加0．04％(V／V)高锰酸钾溶液至呈红色(约l～3ml)，使用硬质玻璃蒸馏器进行蒸馏，弃去最初的50ml馏出液，收集约700ml不含锰盐的馏出液，待用。 3．2 磷酸：15mol／L，ρ=1．70g／ml。 3．3 硫酸：18mol／L，ρ=l．84g／ml。 3．4 磷酸：1+9溶液(1．5mol／L)。
植物体内硝酸还原酶活力的测定 P56—59 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键美，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：NO3—＋NADH＋H+ →NO2—＋NAD++H2O产生的亚硝酸盐与对—氨基苯磺酸（或对—氨基苯磺酰胺）及α—萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度计法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即ug·g—1·h—1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性好。 一、离体法 仪器与用具： 冷冻离心机；分光光度计；天平；冰箱；恒温水浴锅；研钵；剪刀；离心管；具塞试管（10ml）；移液管（5、2、1ml）；洗耳球。 试剂： 亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO2 0.9857g溶于去离子水定容至1000ml，然后再吸收5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug/ml的标准溶液； 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml； 1%（W/V）溶液：1.0g对氨基苯磺酸溶于100ml 3mol/L HCl中（25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/L HCl）； 0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色瓶中； 0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液中； 0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液：8.8640g Na2HPO4·12H2O ，0.0570g K2HPO4·3H2O加去离子水溶解后定容至1000ml； 提取缓冲液：0.1211g半胱氨酸，0.0372g EDTA溶于100ml 0.025mol/L PH8.7的磷酸缓冲液中； 2mg/ml NADH溶液：2mg NADH溶于1ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液（临用前配置）。 方法： 1. 标准曲线制作
硝酸盐测定 1原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，溶液通过镉柱，或加入镉粉，使其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N－1萘基乙二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得硝酸盐含量。 2试剂 2.1氯化铵缓冲溶液(pH9.6～9.7)：同2.1。 2.2硫酸镉溶液(0.14mol/L)：称取37g硫酸镉(CdSO4·8H2O)，用水溶解，定容至1L。 2.3盐酸溶液(0.1mol/L)：吸取8.4mL盐酸，用水稀释至1L。 2.4硝酸钠标准溶液：准确称取500.0mg于110～120℃干燥恒重的硝酸钠，加水溶解，移于500mL容量瓶中，加50mL氯化铵缓冲液，用水稀释至刻度，混匀，在4℃冰箱中避光保存。此溶液每毫升相当于1mg硝酸钠。 2.5硝酸钠标准使用液：临用时吸取硝酸钠标准溶液1.0mL，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，临用时现配。此溶液每毫升相当于10μg硝酸钠。 2.6亚硝酸钠标准使用液同2.8。 2.7镉柱： 2.7.1镉粉还原效率的测定：镉粉使用前，经盐酸浸泡活化处理，再以水洗两次，用水浸没待用。用牛角勺将镉粉加入25mL带
塞刻度试管中，至5mL刻度；用少量水封住。吸取2.0mL硝酸钠标准使用液，加入5mL氯化铵缓冲液。盖上试管塞，振摇2min，静止5min，用漏斗颈部塞有少量脱脂棉的小漏斗过滤，滤液定量收集于50mL容量瓶中，用15mL水少量多次地洗涤镉粉，洗液与滤液合并。加5mL乙酸(60%)后，立即加10mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀，暗处置25min。用1cm比色杯，以标准零管调节零点，于550nm波长处测吸光度，根据亚硝酸盐标准曲线计算还原效率。 2.7.2计算 式中：X2——还原效率，%； 20——硝酸盐的质量，μg； m3——20μg硝酸盐还原后测得亚硝酸盐的质量，μg； 1.232——亚硝酸盐换算成硝酸盐的系数。 3分析步骤 3.1样品处理 称取约10.00g(粮食取5g)经绞碎混匀样品，置于打碎机中，加70mL水和12mL氢氧化钠溶液(20g/L)，混匀，用氢氧化钠溶液(20g/L)调样品pH＝8，定量转移至200mL容量瓶中加10mL硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再补加2～5mL氢氧化钠，混匀。置60℃水浴中加热10min，取出后冷至室温，加水至刻度，混匀。放置0.5h，用滤纸过滤，弃去初滤液20mL，收集滤液备用。 3.2测定(用镉粉法还原硝酸盐为亚硝酸盐)
实验肉制品中亚硝酸盐的测定 （盐酸萘乙二胺法） 一、目的与要求： 1.熟练掌握样品制备、提取的基本操作技能。 2.明确与掌握盐酸萘乙二胺比色法测定亚硝酸盐的基本原理及操作方法。 二、原理： 样品经沉淀蛋白质，除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，生成的重氮化合物，再与盐酸萘乙二氨偶合形成紫红色染料，此“染料”颜色的深浅与亚硝酸盐的含量成正比，其最大吸收波长为538nm ,可以测定吸光度并与标准比较定量。反应式如下：见教材P316 1．重氮化反应： 2．偶合反应： 三、样品、试剂与仪器 样品：品名： 厂家： 试剂： 1.蛋白质沉淀剂（公用） （1）饱和硼砂溶液：称取5克硼酸钠(Na2B07·10H20)，溶于100毫升热水中，冷却 后备用。 (2) 亚铁氰化钾溶液：称取10.6克亚铁氰化钾[K4Fe9(CN)5.3H2O]，溶于水后，稀释至 100毫升。 乙酸锌溶液：称取11g Zn(CHCOO)2 .2H2O加1.5mL冰乙酸，溶于水定容50mL。 2.显色剂 （1）0.4％对氨基苯磺酸溶液：称取0.4克对氨基苯磺酸，溶于100毫升20％的盐酸 中，避光保存。100ml/4组 （）0.2％盐酸萘乙二胺溶液：称取0.2克盐酸萘乙二胺，溶于100毫升重蒸馏水中， 避光保存。 100ml/4组 3.亚硝酸钠标准原液：精密称取0.1000克于硅胶干燥器中干燥24小时的亚硝酸钠， 加水溶解移入500毫升容量瓶中，并稀释至刻度。此溶液每毫升相当于200微克亚 硝酸钠。 4.亚硝酸钠标准使用液(5μg NaNO2/ml)：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液 5.00毫升， 置于200毫升容量瓶中，加重蒸馏水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5μg亚硝 酸钠。亚硝酸钠标准原液由教师提供。 5.1：4盐酸 配制显色剂1用，每4组100ml。 仪器： 1. 小型绞肉机。 2. 721分光光度计。 3．25ml比色管每组7支 四、操作方法： 1.样品处理： 称取5.0克经绞碎混匀的样品，置于50毫升干洁的小烧杯中，加入12.5毫升饱和硼砂溶液，以玻璃棒搅拌均匀，以70℃左右的重蒸馏水约300毫升分数次将样品全部洗入500毫升容量瓶中。（此容量瓶专用）
硝酸盐还原实验试剂 简介： 肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐，硝酸盐还原反应包括两个过程：1、在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化氨基酸和细胞内其他含氮化合物；在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。 Leagene 硝酸盐还原实验试剂主要由对氨基苯磺酸溶液和α-萘胺溶液组成，主要用于鉴别肠杆菌、假单胞菌等。大肠埃希菌等细菌仅能使硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与乙酸作用生成亚硝酸，亚硝酸盐与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者与α-萘胺结合生成红色产物；假单胞菌、沙雷菌等细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮或氧化氮，该作用被称为脱硝化或脱氮化作用，产生气泡，但无红色出现。 组成： 自备材料： 1、 硝酸盐培养基 2、 恒温培养箱 3、 试管 操作步骤(仅供参考)： 1、 被检细菌接种于硝酸盐培养基，培养1～4天。 2、 取适量的对氨基苯磺酸溶液和α-萘胺溶液等量混合后即为硝酸盐还原实验试剂。 3、 取0.1ml 硝酸盐还原实验试剂，加入培养基中，立即观察结果。 4、 如果实验呈阴性反应，在试管中加入少许锌粉，立即观察结果。 染色结果： 编号 名称 DM0085 2×50ml Storage 试剂(A): 对氨基苯磺酸溶液 50ml RT 避光 试剂(B): α-萘胺溶液 50ml RT 避光 试剂(C): 锌粉 5g RT 使用说明书 1份
未加锌粉呈红色阳性(肠杆菌科细菌、韦荣球菌) 加锌粉呈红色阴性 加锌粉不变色假阴性(假单胞菌、沙雷菌等) 注意：加入试剂无颜色反应，可能原因：1、硝酸盐没有被还原，实验确为阴性；2、硝酸盐被还原为氨和氮等其他物质，进而导致假阴性。这时可加入少许锌粉，如出现红色则说明实验确为阴性，如果未出现红色则说明实验为假阴性。 注意事项： 1、如果要检查是否有氮气产生，可在培养管内加一个小倒管，看有无气泡产生。 2、取细菌培养和实验中，应注意自我防护。 3、待检细菌培养时间也会影响染色，阳性菌培养时间过长或已死亡或细菌溶解，都常呈阴 性反应。 4、某些厌氧菌(韦荣球菌)亦呈阳性反应。 5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：12个月有效。 相关： 编号名称 DC0032 Masson三色染色液 DF0135 多聚甲醛溶液(4% PFA) DG0005 糖原PAS染色液 DM0007 瑞氏-姬姆萨复合染色液 DM0016 增强革兰氏染色液 DM0035 抗酸染色液(Kinyoun冷染法) PW0053 Western抗体洗脱液(碱性) TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)
11.硝酸盐测定（锌镉还原法） 11.1技术指标 测定范围：0.05μmol/dm3～16.0μmol/dm3。 检测下限：0.05μmol/dm3。 准确度：浓度为2.0μmol/dm3时，相对误差为±7.0%；浓度为10.0μmol/dm3时，相对误差为±4.0%。 精密度：浓度为5.0μmol/dm3时，相对标准偏差为±4.0%；浓度为10.0μmol/dm3时，相对标准偏差为±3.0%。 11.2方法原理 用镀镉的锌片将水样中的硝酸盐定量地还原为亚硝酸盐，水样中的总亚硝酸盐在用重氮-偶氮法测定，然后对原有的亚硝酸盐进行校正，计算硝酸盐含量。11.3试剂及配置 除另有说明外，本法中所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或等效纯水。 11.3.1三氯甲烷（CHCl 3 ） 11.3.2锌卷 将锌片（纯度99.99%，厚度0.1mm），裁成5.0cm×3.0cm小片，卷成内径约1.5cm 的锌卷。 11.3.2.1锌片表面应光洁明亮，无边角毛刺、残缺，无腐蚀斑点。 11.3.2.2锌片剪裁前应用纱布仔细擦净表面。 11.3.3人工海水：盐度为35 称取31.0g氯化钠（NaCl，优级纯）、10.0g硫酸镁（MgSO 4?7H 2 O，优级纯）和0.5g 碳酸氢钠（NaHCO 3 ，优级纯）溶于水中，稀释至1dm3。 11.3.4无氮海水 取低氮海水过滤后，放置陈化半年，用孔径0.45μm微孔滤膜过滤即得。 11.3.5氯化镉溶液：ρ=20.0g/dm3 称取20.0g氯化镉（CdCl 2?5/2H 2 O）溶于水中，并用水稀释至1000cm3，混匀。 警告——试剂剧毒，小心操作！ 11.3.6对氨基苯磺酰胺溶液：ρ=10g/dm3 对氨基苯磺酰胺溶液的配置方法同10.3.2。 11.3.7 1-萘替乙二胺二盐酸盐溶液：ρ=1.0g/dm3 1-萘替乙二胺二盐酸盐溶液的配置方法同10.3.3。 11.3.8硝酸盐标准贮备溶液：c（NO 3 --N）=10.0μmol/cm3 称取1.011g硝酸钾（KNO 3 ，优级纯，预先在110℃烘1h，置于干燥器中冷却至室温）用少量水溶解后，全量转移至1000cm3容量瓶中，用水稀释至标线，加1.0cm3三氯甲烷，混匀。有效期为半年。 11.3.9硝酸盐标准使用溶液：c（NO 3 --N）=0.100μmol/cm3 移取1.00cm3硝酸盐标准贮备溶液（见11.3.8）于100cm3容量瓶中，用水稀释至标线，混匀。使用前配置。 11.4仪器与设备 11.4.1分光光度计。 11.4.2往返式电动振荡器：频率1.5r/min～250r/min。 11.4.3具塞广口玻璃瓶：30cm3。 11.4.4定量加液器：1.0cm3。 11.4.5秒表。
硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒使用说明 可见分光光度法50管/24样产品简介： NR（EC1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。 NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ+NADH+H＋→NO2ˉ+NAD＋+H2O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容： 诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体20mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂五：标准储备液1mL，-20℃保存。 诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL 蒸馏水，充分混匀。
0.1umol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取0.1ml试剂五加9.9mL 蒸馏水，充分混匀。 操作步骤： 一、样品测定的前处理： 1、取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30min，取出样本，滤纸吸干。（根据需要进行诱导处理） 2、称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴研磨，4000g，4℃离心10min，取上清冰上放置待测。 二、NR测定操作： 1，分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 2，样本测定（在EP管中加入下列试剂） 试剂名称（μL）测定管对照管标准管空白管 样本100100 0.1μmol/mL NaNO2100 双蒸水500100 试剂一375375375 试剂二125125125 混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃(其他物种）水浴30min 试剂三250250250250 试剂四250250250250 混匀，显色20min，4000g常温离心10min，取上清，540nm下比色。
实验十三食品中亚硝酸盐的测定（盐酸奈乙二胺法） 16090211 李亚东 一、实验原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化以后，再与盐酸奈乙二胺偶合形成紫红色染料，其最大的吸收波长为538nm，因此可以通过测定样品液反应后的吸光度并与标准比较定量。 二、实验试剂 1、氯化铵缓冲液:在1L玻璃烧杯中，加入500mL水，准确加入20.0mL盐酸，混匀，准确加入50mL氨水，必要时用稀盐酸和稀氨水调试至PH9.6-9.7。 2、硫酸锌溶液（0.42mol/L）:称取120g硫酸锌（ZnSO 47H 2 O）用水溶解并稀 释至1000mL。 3、氢氧化钠溶液（20mol/L）:称取20g氢氧化钠用水溶解，稀释至1000mL。 4、对氨基苯磺酸溶液:称取1g对氨基苯磺酸，溶于70mL水和30mL冰乙酸中，置棕色瓶中混匀，室温保存。 5、N–1-萘基乙二胺溶液:称取0.1g N-1-萘基乙二胺，加60%乙酸溶液，并稀释至100mL，混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，一周内稳定。 6、显色剂:临用前将N-1-萘基乙二胺溶液和氨基苯磺酸溶液等体积混合。 7、亚硝酸钠标准溶液:准确称取0.2500g于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加100mL氯化铵缓冲液，加水稀释至刻度，混匀，在4℃避光保存。此溶液每毫升相当于500ug的亚硝酸钠，作储备液。 8、亚硝酸钠标准使用液:临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液1.0mL置于100mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5.0ug亚硝酸钠。 三、实验仪器 分光光度计 四、实验步骤 1、称取10g左右的火腿于研钵中，用量筒量取70mL的水，加入一部分于研钵中，将其研成肉糜状。 2、将肉糜状的火腿转移至烧杯中，用剩下的水冲洗研钵，一同倒入烧杯中。加入12mL氢氧化钠溶液，用玻璃棒搅拌均匀。 3、测量液体的pH值，若其大于8，则将烧杯中所有物质转移至250mL容量瓶中；若小于8，则再加氢氧化钠直至大于8为止。 4、加入10mL硫酸锌溶液，混匀，容量瓶中出现为乳白色的乳浊液。 5、放入60℃的水浴锅中加热10min。 6、取出，用流水冷却，加水定容。然后静置30min。 7、出去容量瓶中的上层脂肪，然后用漏斗过滤，弃去初始的20mL滤液。但
食品添加剂硝酸盐亚硝酸盐的毒性和人体健康的危害 毒理与功能评价所陈新霞奚清丽王民生 常见的硝酸盐(nitrate)为硝酸钠，为白色细小结晶状粉末，稍带淡灰色或淡黄色，无臭，味略苦咸，易潮解和溶于水，其水溶液为中性，高热时分解为亚硝酸钠。硝酸盐广泛用作于食品加工业中的发色剂和防腐剂。 亚硝酸盐(nitrite)俗称“硝盐”，外观及滋味都与食盐相似，人们通常称为“工业用盐”。亚硝酸盐主要指亚硝酸钠，它是一种白色或淡黄色结晶状颗粒或粉末，无臭，味咸稍带苦味，易潮解，易溶于水，难溶于乙醇和乙酸，其水溶液的pH为9，能缓慢吸收空气中的氧而转变为硝酸钠。亚硝酸盐主要用于生产各种染料和某些有机合成、金属表面的热处理，也常在肉类制品中允许作为发色剂限量使用。 硝酸盐和亚硝酸盐广泛分布于自然环境，主要来源是含氮肥料的大量使用。食品、燃料、炼油等工厂排入环境和水体中的大量含氮废弃物和氮氧化物，经过生物、化学转换后均形成硝酸盐，而造成地表水和地下水的硝酸盐污染，在硝酸盐还原菌的作用下，硝酸盐还原成亚硝酸盐。无机、有机含氮肥料和农药的大量使用，导致土壤中硝酸盐富集化，菜根从土壤中获取养分的同时，也摄入了大量硝酸盐，一些蔬菜如卷心菜、花椰菜、胡萝卜、芹菜、菠菜等通常含有很高的硝酸盐（1000 ～3000mg／kg），一般成年人每天摄入的硝酸盐约100mg 。蔬菜中的硝酸盐，在腌制过程中极易被还原成亚硝酸盐。在食品加工中，硝酸盐和亚硝酸盐常作为肉制品的发色剂添加于食品原料中，以增加腌肉制品的色泽和抑制微生物的繁殖及毒素的产生，来延长保质期和提高腌肉的风味。 人体主要通过饮食摄入过多的硝酸盐与亚硝酸盐，这两种物质在我国A级绿色食品中不得使用。1994年联合国粮农组织和WHO规定了硝酸盐和亚硝酸盐的每日容许摄入量（ADI 值）分别为5mg／kg和0.2mg／kg。我国食品安全国家标准食品添加剂使用标准（GB2760-2011）规定，在肉制品中硝酸盐(硝酸钠，硝酸钾)的最大使用量不得超过500mg ／kg，亚硝酸盐的最大使用量不得超过150mg／kg。在肉制品中亚硝酸盐的最终残留量不得超过30mg／kg，肉罐头中不得超过50mg／kg。婴儿对硝酸盐和亚硝酸盐敏感，因此，欧共体建议亚硝酸盐不得用于婴儿食品，硝酸盐应限制使用。 硝酸盐与亚硝酸盐主要从消化道进入人体。含有大量硝酸盐的饮水、粮食、鱼、肉制品、蔬菜、渍酸菜、隔夜炒菜等食用后，在口腔可被唾液中硝酸盐还原酶还原成亚硝酸盐进入人体。 唾液腺可以浓缩富集硝酸盐并分泌到口腔中，唾液中的硝酸盐水平是血液中的20倍。Xia等比较了Sjogren综合征、腮腺良性肥大患者和健康成人的腮腺液、混合唾液、血液和尿液中硝酸盐、亚硝酸盐含量后发现，Sjogren综合征患者混合唾液中硝酸盐、亚硝酸盐的总量均明显低于健康对照组和腮腺良性肥大组，而Sjogren综合征患者尿液中硝酸盐、亚硝酸盐的总量均明显高于健康对照组。Xia等还通过建立小型猪腮腺破坏萎缩的动物模型来进行硝酸盐负荷实验研究，结果发现当双侧腮腺破坏后混合唾液中硝酸盐、亚硝酸盐含量明显降低，给予硝酸盐负荷后腮腺破坏组混合唾液中硝酸盐、亚硝酸盐升高的幅度明显低于对照组，而尿液中的硝酸盐含量却明显高于对照组。说明腮腺是机体硝酸盐代谢的重要器官,而机体维持高浓度的唾液硝酸盐含量可能与口腔抗菌作用有关。 唾液中的硝酸盐随吞咽运动进入胃中,在正常情况下在胃和十二指肠重吸收入血，经血循环回到唾液腺，再次分泌到唾液中，经历了从十二指肠→唾液腺→口腔→十二指肠的循环过程，这种循环使硝酸盐不断地在口腔被还原成亚硝酸盐，人体内80%亚硝酸盐都是从这个循环得到的。在病理情况下，如一些疾病导致胃酸过低时，胃液中的一些硝酸盐还原菌活性增强，也可使硝酸盐还原为亚硝酸盐。Hunault的研究表明硝酸盐在胃肠道高吸收，而在
中性pH条件下化能异养硝酸盐还原菌对亚铁离子的好氧与厌氧 氧化 Arch Microbiol 1998, 169:159-165 IF= 1.975 摘要：百分之九十的厌氧富集培养都出自于一些淡水沉积物试样以及一些海洋沉积物，在pH 7.2、30℃条件下下，沉积物中的亚铁离子在硝酸盐和有机辅助物的矿物媒介中被氧化。厌氧硝化的亚铁氧化是一个生物过程。从苦咸水沉积物中分离出的一种微生物（HidR2，运动型不产芽孢的革兰氏阴性棒状菌），进一步研究在醋酸盐环境中对亚铁离子的氧化作用。在微量醋酸盐（0.2~1.1 mM）环境中，pH 7.2、30℃条件下，HidR2菌能厌氧和好氧氧化0.7~4.9 mM的亚铁离子，其用于生长的能量来自于亚铁离子的厌氧硝化氧化，铁氧化比率是一个常数，取决于醋酸盐的量的给予。中性条件下硝酸盐厌氧氧化亚铁离子的能力似乎是嗜温反硝化细菌的共有特性。由于依赖硝酸盐的铁离子氧化关闭沉积物缺氧区的铁循环、铁离子的好氧氧化促进含氧区内的二价铁再氧化为三价铁，这两个过程都增加了铁离子在自然沉积物的有机质循环转化中作为过渡电子载体的重要性。 关键词：铁氧化亚铁离子高铁离子硝酸还原作用沉积物 1 引言 铁元素是地壳中含量最丰富的元素之一，也是含量第二丰富的金属元素。由于其低水溶性，铁氧化物在水环境中通常以沉淀形式存在，如复杂的非晶形或晶体结构(Cornell and Schwertmann 1996)。 三价铁离子能够被异养菌还原为二价铁离子(Lovley 1991)，在有氧条件下，亚铁离子可以在低pH值中被嗜酸细菌如氧化亚铁硫杆菌再次氧化(Blake et al. 1993)，或者在近中性环境里，被铁锈色披毛菌氧化(Hallbeck et al. 1993)，这两种细菌都是从氧化还原反应中获取能量而生长。 Fe3+/Fe2+的标准氧化还原电位为+770 mV，但是在自然环境中其实际的氧化还原电位很大程度上取决于pH值的变化(Widdelet al. 1993)。在pH 7的碳酸氢盐环境下，FeOOH/FeCO3的氧化还原过渡电位E值约为+200 mV。 在较低的氧化还原电位下，亚铁离子也能够充当给电子体，从而在厌氧环境中发生还原反应，最近有研究者可以分离和描述能利用亚铁离子作为电子供体的不产氧光合细菌(Widdel et al. 1993; Ehrenreich and Widdel 1994)。+200 mV下的释放电子也可以用作微生物的硝酸盐异化作用，最近报道了一种嗜温细菌(Straub et al. 1996)和一种极端嗜热的古细菌(Hafenbradl et al. 1996)都具有这种新陈代谢功能。这一过程将铁循环和氮循环联系上，因此也显示了微生物厌氧环境中铁离子作为电子受体的重要性。本文主要研究在兼性厌氧硝酸还原菌辅助作用下亚铁离子的氧化过程。 2 材料和方法 2.1 微生物的来源 由于采取加富培养，各种沉积物试样被作为接种源，有淡水源（V orsee,Mittlerer Buchensee,and Lake Constance,Germany）、海水源（Venice, Italy; Ameland and Groningen, Netherlands）、盐水源（Hiddensee,Germany）以及市政污水处理中使用的活性污泥源（Ko nstanz,Germany）。 2.2 培养介质和培养方法 对于淡水和海水中细菌的加富培养，使用在缺氧条件下的碳酸氢盐缓冲溶液作矿质媒介，且加入1mM的硫酸盐作为硫源，不需加还原剂，NaCl和MgCl2的浓度则与微生物本身
第1页，共3页 土壤亚硝酸还原酶（S-NiR）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。货号：BC2990规格：50T/24S 产品内容： 试剂一：粉剂×1支，4℃保存。加入1mL蒸馏水溶解，4℃保存2周。临用前用蒸馏水稀释400倍，现用现配。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加15mL蒸馏水溶解，4℃保存2周。试剂三：液体15mL×1瓶。此溶液为饱和溶液，取上清使用即可。试剂四：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。试剂五：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。 标准品：粉剂×1支，4℃保存。10mg亚硝酸钠，临用前加入1.45mL蒸馏水配成100μmol/mL的标准溶液。4℃保存2周。产品说明： 土壤亚硝酸还原酶（Solid-Nitrite reductase，S-NiR）是反硝化作用中的关键酶之一，它是由土壤反硝化细菌产生的一种还原酶类，可将NO 2- 还原为NO，它的活性反映了生物降解过程中氮素的转化效率，为氮素转化规律的研究提供一定的依据。 亚硝酸还原酶可将NO 2-还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO 2-减少，即540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、30目（或更大）筛、冰和蒸馏水。测定操作： 1、样本处理：新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30-50目筛。
2、操作步骤： （1）可见分光光度计预热30min，波长调至540nm。蒸馏水调零。 （2）将标准溶液用蒸馏水稀释为0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125μmol/mL的标准溶液。（3）加样表： 无机质管空白管1对照管测定管标准管空白管 风干土样（g）--0.10.1-- 蒸馏水（μL）-200200--- 试剂一（μL）200--200-- 试剂二（μL）200200200200-- 混匀后，25℃反应3h 试剂三（μL）200200200200--充分震荡30s，10000rpm，4℃，离心10min-- 上清液（μL）400400400400-- 标准品（μL）----400- 试剂四（μL）400400400400400400 试剂五（μL）400400400400400400 蒸馏水（μL）300300300300300700充分混匀，室温放置15min后测定540nm各管吸光值，分别记为A无机质管、A空白管1、A对照管、A 测定管、A标准管和A空白管2，计算ΔA测定=（A无机质管-A空白管1）-（A测定管-A对照管），ΔA标准=A标准管-A空白管2。无机质管、空白管1、空白管2只需做1-2次。 3、S-NiR计算: （1）标准曲线的绘制： 以标准溶液的浓度为x轴，以标准溶液对应的ΔA为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b,将ΔA 测定带入标准方程得到x（μmol/mL）。 （2）S-NiR的计算： ˉ的量为一个酶活力单位。 酶活单位定义：每g土样每天还原1μmol NO 2 S-NiR（U/g土样）=x×V反应÷W÷T= 4.8×x÷W T：反应时间，3h=1/8d；V反应：反应体系体积，0.6mL；W：土样质量，g。 第2页，共3页
泡菜中亚硝酸盐的检验 实验组长：陈佶 实验组员：郝吴双石行健丁逸苇吴纪轩吕志轩 实验日期：11月23日~ 12月6日 实验准备（资料查阅）： 心得体会： 这是我们第一次进行食品分析与检验实验课程。实验内容是食品中亚硝酸盐含量的测定。在这其中我学会了用盐酸萘乙二胺测量亚硝酸含量的基本操作技术，拓展了视野，无论将来我是否会从事生物方面的工作，这都将是我的一笔宝贵财富。 感谢老师耐心的讲解，使得我们对实验的各项要求目的都有了明确的掌握。但由于水平有限，实验报告中定有纰漏错误，请老师不吝赐教！
一、前言 “亚硝酸盐”这一名词对我们来说并不陌生，这是一类无机化合物的总称。主要指亚硝酸钠，这是一种白色至淡黄色粉末或颗粒状，味微咸，易溶于水。其外观及滋味都与食盐相似，并在工业、建筑业中广为使用，肉类制品中也允许作为发色剂限量使用。由亚硝酸盐引起食物中毒的机率较高。食入0.3～0.5克的亚硝酸盐即可引起中毒甚至死亡。 我们通过实验测定了泡菜中不同时期的亚硝酸盐的含量，这不仅是一次美妙的实践，更为我们的生活提供了指南，让我真真正正的接触到了这个平时只出现在报道上的奇妙物质。 二、实验原理 泡菜的制作离不开乳酸菌，乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的情况下，将葡萄糖分解成乳酸。这其中也生成了一定量的的亚硝酸盐。 在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰色染料。将显色反应后的样品与已知浓度的标准液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。 三、设备及试剂 泡菜坛、蔬菜、三角瓶、量筒、烧杯、pH试纸、玻璃棒、微量可调移液器、试管、亚硝酸盐含量的测定试剂盒。
硝酸还原酶的测定方法 硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮简单易行，在一般条件下都能做到。红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。仪器药品721型分光光度计真空泵（或注射器）保温箱天平真空干燥器钻孔器三角烧瓶移液管烧杯0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml 蒸馏水器中。磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水器稀释至100ml。α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水器中，稀释至100ml。NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水器溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。操作步骤 1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测 3. ．绘制标准曲线与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水俗中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度—浓度曲线。实验作业1．试比较不同植物的酶活性。2．试比较取样前植物处于照光或黑暗条件下酶活性的不同。参考文献1．陈薇、张德颐：1980。植物组织中硝酸还原酶的提取测定和纯化，植物生理学通讯，1980(4)：45—49。2．周树、郑相穆：1985。硝酸还原酶体内分析方法的探讨，植物生理学通讯，1985(1)：47—49。3．Hageman,R.H.and D.P. ．Hucklesby:1971.Methods in Enzymology,23A:491—503. 4．Radin.J.W.:1973.Plant Physiology,51:332—336. 5．Snell,F.D.and C.T.Snell:1949.Colorimetric Methods of Analysis,Vol.II,802—807 （华东师范大学张志良）参考资料：硝酸还原酶活性的测定一、材料用具及仪器药品木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、
医考各种实验阳性提示的意义 1、亚硝酸盐还原实验阳性—提示大肠杆菌阳性 2、抗人蛋白（coombs）实验阳性—自身免疫性溶血性贫血 3、毛细血管脆性实验阳性—过敏性紫癜 4、显微镜凝集溶解实验（显凝实验或凝溶实验）阳性—钩端螺旋体 5、肥达实验阳性—伤寒 6、动力试验和制动试验阳性—霍乱 7、挖空细胞—尖锐湿疣 8、蜂窝状、泡沫状—动脉瘤性骨囊肿 9、Cadman三角、“日光照射”征象—骨肉瘤 10、骨疣—骨软骨瘤 11、肘后三角关系异常—肘关节脱位 12、骨盆分离试验和挤压试验阳性—骨盆骨折 13、方肩畸形、搭肩试验、杜加征阳性—肩关节脱位 14、磨砂玻璃状—骨纤维异样增殖症 15、腓肠肌压痛阳性—钩端螺旋体 16、伸肌腱牵拉试验Mills征阳性—肱骨外上髁炎 17、直腿抬高试验（Lasegue）阳性—腰椎间盘突出 18、“4”字试验阳性—髋关节脱位 19、尺神经损伤引起小指及环指尺侧半感觉消失，夹纸试验（Froment）阳性—拇内收肌瘫痪、肱骨外上髁炎
20、上肢牵拉试验、压头试验阳性—神经根型劲椎病（劲椎病中发病率最高） 21、方形手—骨关节炎，手指天鹅颈、纽扣花—类风湿性关节炎 22、拾物试验阳性—腰椎结核 23、结肠袋消失，呈“铅管样”—溃疡性结肠炎 24、回盲部粘膜粗乱，充盈不佳，呈“跳跃征”—肠结核 25、有“铺路石样”“卵石样”—克罗恩病 26、氰化物中毒—苦杏仁味；有机磷中毒—蒜臭味；一氧化碳中毒—口唇樱桃红；苯丙酮尿症（酮中毒）—烂苹果味。 27、腰大肌试验阳性—阑尾位置较深；闭孔内肌试验阳性—阑尾位置较低；结肠充气试验阳性—阑尾有炎症。 28、过氧化酶（POX）阳性—急粒方面（M3）；糖原（PAS）强阳性—急淋；NSE(+),NaF（+）—急单。 29、新斯的明试验阳性有助于诊断重症肌无力。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/d77653226.html, 催化还原法脱除水中硝酸盐的研究 作者：彭勃何绪文 来源：《科协论坛·下半月》2012年第11期 摘要：目前，我国水体中的硝酸盐污染越来越严重，硝酸盐会引起婴儿高铁血红蛋白血症，还会生成具有致癌作用的亚硝胺类物质。因此，急切需要开发去除水体中硝酸盐的方法，而化学催化还原法是目前最有前途的一种方法。从催化还原法去除硝酸盐的原理、研究进展和存在问题等几方面进行了阐述。 关键词：硝酸盐催化还原法研究进展 中图分类号：O643 文献标识码：A 文章编号：1007-3973（2012）011-060-02 1 前言 随着人口增长和经济快速发展，人类生产和生活过程中产生大量含氮污染物，如氮素化肥的使用、污水灌溉、含氮工业废水的渗漏、生活污水和大气沉降过程中都会含有大量的含氮物质，打破了自然界中氮元素的正常循环，使自然界各种水体硝酸盐大大超标。硝酸盐氮本身易被生物体吸收，也易排泄，不会构成直接危害，但它在人体低氧的环境中会还原成亚硝酸盐氮，亚硝酸盐会使血液中正常的血红蛋白氧化，不具有输送氧能力，使身体出现头晕、恶心、呼吸困难、乏力、腹泻等症状，甚至死亡。另外，水体中的硝酸盐和亚硝酸盐还可以与胺、酰胺、氰胺类含氮有机物反应，生成具有致癌作用的亚硝胺基类物质。1956年，我国华东地区 就有了地下水被硝酸盐污染的报道。另外，1995年张维理、田哲旭等对我国北方14个县市的地下水和饮用水情况进行调查，发现北方一些农村和城镇的地下水和饮用硝酸盐污染情况严重，主要是由于过度使用氮肥造成的。2000年对太湖的水质情况调查发现，太湖中硝酸盐的 污染情况严重，已对人类的身体健康情况构成了严重的威胁。鉴于水体中硝酸盐污染的情况日益严峻，因此必须采取有效措施来控制、防治水体中硝酸盐的污染。目前去除水体中硝酸盐氮的方法大致可以分为物理法、生物法和化学法，其中化学催化方法去除硝酸盐技术反应速度快，能适应不同反应条件，易于运行管理。 2 催化还原法去除水体中硝酸盐的原理 水体中硝酸盐氮主要通过催化加氢来去除的，其反应机理主要是由Prusse等人提出的双金属催化还原机理。Prusse等人认为，催化还原硝酸盐是一个多步反应，以钯铜双金属体系为例，其反应步骤如下：首先，氢气等还原剂在钯的作用下形成活性氢，由于氢溢流效应，在微晶钯内传递，并将吸附在钯铜双金属上的硝酸盐氮还原成为一氧化二氮；然后，在钯元素表面一氧化二氮生成中间产物氧化氮，氧化氮不稳定，两个氧化氮分子相互结合生成氮气。同时，在上述过程中，在钯表面若氧化氮和活性氢相遇会生成形成N-H键，与活性氢多次结合会生 成NH4+副产物。近来，随着研究的进一步发展对其机理有了更多的解释。Epron等认为在硝
货号：MS2922 规格：100管/48样土壤亚硝酸还原酶（Solid-Nitrite reductase ，S-NiR） 试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 土壤亚硝酸还原酶是反硝化作用中的关键酶之一，参与亚硝酸盐至NO的还原反应，它的活性反映了生物降解过程中氮素的转化效率，为氮素转化规律的研究提供一定的依据。 测定原理： 亚硝酸还原酶可将NO 2—还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO 2 —减 少，即540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。 自备实验用品及仪器： 天平、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、低温离心机。 试剂的组成和配制： 试剂一：液体4mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加4mL蒸馏水溶解。 试剂三：液体4mL×1瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解） 试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）试剂五：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以1:1的比例混合。 样品处理： 新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30~50目筛。 测定操作表： 计算公式： 第1页，共2页
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 标准曲线：y = 1.5562x+ 0.0088，R2 = 0.996；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A 标准管-A空白管）。 ˉ的量为一个酶活力单位。 酶活单位定义：每g土样每天还原1μmol NO 2 S-NiR（μmol /d /g土样）=[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷1.5562×V标÷W÷T = 0.617×[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷W T：反应时间，1h=1/24d；V标：标准液体积，0.04mL；W：样本质量，g。 b. 使用96孔板测定的计算公式如下 标准曲线：y = 0.7781x+ 0.0088，R2 = 0.996；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A 标准管-A空白管）。 ˉ的量为一个酶活力单位。 酶活单位定义：每g土样每天还原1μmol NO 2 S-NiR（μmol /d /g土样）=[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷0.7781×V标÷W÷T = 1.234×[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷W T：反应时间，1h=1/24d；V标：标准液体积，0.04mL； W：样本质量，g。 注意事项： 1.配制好的工作液3天内使用完。 2.若吸光值超过 1.5，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以 稀释倍数。 3.严格控制显色时间，否则会对结果有影响。 4.标准曲线线性范围为0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。 5.A空白管-（A测定管-A对照管）线性范围为0.02-1.5。 第2页，共2页