小鼠脚趾DNA提取以及Macf1fl/flC57BL/6-Prrx1-Cre小鼠
基因型鉴定
张茹
2016年3月15日
一．小鼠脚趾DNA提取
【原理】
1.提取过程
真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的过程是将动物组织在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的消化液中消化分解蛋白质，再用酚抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA析出来。
2.裂解液各成分作用
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质，从而使细胞裂解，并使组织蛋白与DNA分离。EDTA可以整合镁离子，这样将会抑制细胞中Dnase的活性；因为该酶必须在有镁离子存在下才会起作用。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。并且可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
3.Tris苯酚作用
酚是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚作为有机溶剂比重更大，保留在最下层。
【实验材料】
1.耗材
1.5ml离心管，水浴锅，高速冷冻离心机，1ml移液枪，200ul移液枪，通风橱，1ml移液枪枪头，200ul移液枪枪头。
2.试剂
Tris-HCl，EDTA，NaCl，SDS，灭菌水，Tris苯酚，无水乙醇，75％乙醇，1倍
TE缓冲液
【实验步骤】
1.SNET裂解液（50ml）：100mM Tris-HCl（10ml，PH8.0），
200mM EDTA（1.25ml PH8.0），
1M NaCl（20ml），
10% SDS（5ml），
水（13.75ml）。
（裂解液在常温下结晶，使用之前在55℃水浴锅中预热）
蛋白酶K（PK）：储存浓度：10mg/ml；终浓度：100ug/ml
2、操作步骤：
1)小鼠标记编号，并收集小鼠脚趾样品于1.5mlEP管中（提前高压灭菌）。
2)提前准备55℃水浴锅，并把4℃离心机打开（300rmp离心降温至4℃）。
3)往装有小鼠脚趾组织的EP管里加入400ul Snet裂解液，4ul 蛋白酶K（实验
经验，充分消化可加6-7ul），其浓度是10mg/ml，即终浓度为100ug/ml；
4)置于55℃水浴锅中裂解1h（实验经验，充分裂解需2.5-3.5h）；
5)待组织裂解完后，在通风厨中加入400ul Tris饱和酚（除去蛋白质杂质），剧
烈震荡20s（实验经验，剧烈震荡100多次），至呈乳浊液；
6)12,000g，4℃，离心10min（所有管子方向一致）；
7)吸取上清330-390ul于新的EP管中（缓慢吸取，勿吸到蛋白层），加二倍体
积的无水乙醇（即660-780ul），轻摇出现白色絮状沉淀（轻摇100多次，充分混匀）；
8)同第五步离心后，用1ml枪头一次吸取上清，留剩余刚好淹没沉淀；
9)加1ml 75%乙醇，12,000g ，4℃离心5min；
10)用1ml枪头一次吸取上清，留剩余刚好淹没沉淀；
11)12,000g ，4℃离心3min；
12)用200ul枪吸干上清（在沉淀对面吸取），通风橱中晾干；
13)根据沉淀量多少加20~50ul无菌水溶解DNA沉淀，吸吹10~15次，混匀。
二．Macf1fl/fl C57BL/6-Prrx1-Cre小鼠的基因型鉴定
1.鉴定原理
鉴定Macf1fl/flC57BL/6-Prrx1-Cre小鼠的基因型，要基于本小鼠构建的原理。
本小鼠模型构建基于Cre/LoxP系统的条件性基因敲除技术，即在组织或细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠的作用下，实现在特定细胞及特定发育阶段敲除目的基因研究其功能。
本研究在骨髓间充质干细胞的标记分子Prrx1基因中插入Cre基因，即构建为Prrx1-Cre小鼠，特异性的表达Cre酶。LoxP位点标记MACF1基因片段，即构建为MACF1-Flox小鼠。这两种小鼠交配，使得Cre基因被可诱导的Prrx1启动子控制，通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的MACF1基因切除，从而繁殖得到骨髓间充质干细胞中特异性敲除MACF1基因的小鼠。
通过设计引物，pcr扩增片段长度，判断子代小鼠是否插入LoxP位点，以及是否插入Cre位点，从而鉴定子代小鼠基因型。
Cre重组酶敲除LoxP修饰位点的过程
2. 鉴定方案及鉴定图
2.1Macf1打靶的基因型鉴定
2.1.1 引物设计位点
引物设计在LoxP插入的基因片段上，LoxP位点长34bp，野生型片段片段长700bp，含LoxP位点的片段长750bp。
2.1.2 PCR引物序列信息
2.1.3 PCR反应程序
2.1.4 鼠尾DNA的基因型鉴定结果
若只能扩增得到700bp条带，说明小鼠是野生型；若只能得到750bp条带，说明是纯合子小鼠；若能得到700bp和750bp两个条带，说明是杂合子小鼠。
2.2 Prrx1-iCre的基因型鉴定：
2.2.1 引物设计位点
鉴定是否含Cre基因。需要两种引物，一种用来扩增野生型的短片段，一种用来扩增突变型的长片段。WT-F/R设计在基因组上，用于扩增野生型产物(267bp)；Mut-R引物设计在Cre上，WT-F/Mut-R引物用来扩增突变型产物(322bp)。
Cre基因的鉴定2.2.2 PCR引物信息
2.2.3 PCR反应程序
2.2.4 鼠尾DNA的基因型鉴定结果
若只能扩增得到267bp 条带，说明小鼠是野生型；若只能得到322bp 条带，说明是纯合子小鼠；若能得到267p 和322bp 两个条带，说明是杂合子小鼠。
267bp
转基因小鼠的鉴定集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
转基因小鼠的鉴定 一、剪鼠尾 1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好， 此时鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。 2.分辨小鼠的年龄 a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生； b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3天； c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4天； d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右； e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右； f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。 3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法 二、从鼠尾中提取DNA 采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：cw2094）提取DNA，操作如下： 1.剪取小鼠长度为的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180μL Buffer GTT。震荡混 匀。 2.加入20μL proteinase K，涡旋震荡，彻底混匀。 3.置于56℃水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡， 使样品均匀分离。 注意： 1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20μl proteinase K消化，不会影响后续操作。
2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100mg/μl的RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置5-10min。 4.14000rpm 离心 1min，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌的离心管中。 5.加入200μl Buffer GL，涡旋震荡，充分混匀，加入200μl 无水乙醇，涡旋振荡，充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 注意： 1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。 2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。 3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。 6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可分多次转入。10000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 7.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 8.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。 9.12000rpm 离心 2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾 干。
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项 高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程 图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建
1. 下面说法不正确的是：（）。（1分）[单选题] 1. 监督不是必需的 2. 每次监督活动，通常不必完全重复初始评定的所有行动 3. 监督为了确保认证产品在规定的期限内持续符合规定要求 4. 监督是确定符合性证明有效性的基础 2. GB/T27028中给出了一种常用的且被证明有效的产品认证方案模式，对应于（）的产品认证方案。（1分）[单选题] 1. 方案类型3 2. 方案类型4 3. 方案类型5 4. 方案类型6 3. 产品认证确定阶段的审核，主要是指对于（）质量管理体系的审核。（1分）[单选题] 1. 生产者 2. 生产厂 3. 受审核 4. 委托方方 4. 方案类型4，是根据需要，（）抽样进行监督检验和对产品生产过程运作的评审，适用于生产过程的工艺技术复杂和认证风险高的产品。（1分）[单选题] 1. 从公开市场上 2. 从工厂生产线 3. 从生产线或市场 4. 从生产线和/或/市场 5. 确定阶段中，审核是为了获得证据对（）进行客观评价，以确定满足审核准则的程序所进行的系统的、独立的并形成文件的过程。（1分）[单选题] 1. 管理体系 2. 质量管理体系 3. 产品质量 4. 产品技术要求 6. 确定阶段中，设计评价一般适用于产品的（）设计。（1分）[单选题] 1. 质量、性能、安全、环保 2. 性能、安全、环保 3. 质量、性能、安全 4. 质量、性能 7. 以下哪种方法不是产品认证方案类型中监督可采取的方法（）。（1分）[单选题] 1. 从公开市场上抽样检验或检查 2. 从工厂抽样检验或检查 3. 依据GB/T19001的审核 4. 对生产、服务提供或过程作业的评价 8. 方案类型5是一种典型认证方案，其包括的功能和活动有取样、检测、（）、复核、认证决定、许可和监督等。（1分）[单选题] 1. 生产过程评审 2. 质量管理体系评审 3. A+B
转基因小鼠的鉴定 、剪鼠尾 1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时鼠尾 剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。 2.分辨小鼠的年龄 a 当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生； b 当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3 天； c 当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4 天； d 当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10 天左右； e 当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12 天左右； f 当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14 天左右。 3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法 、从鼠尾中提取DNA 采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：CW2094）提取DNA操作如下： 1.剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180卩L Buffer GTT震荡 混匀。 2.加入20卩L proteinase K ，涡旋震荡，彻底混匀。 3.置于56C水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡,
使样品均匀分离。 、，I ?、、+ : 注意： 1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20卩l proteinase K 消化，不会影响后续操作。 2）如需去除RNA可在上述步骤完成后，加入4卩l浓度为IOOmg/卩l的RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置5-10min 。 4.14000rpm 离心1min ，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌 的离心管中。 5.加入200卩l Buffer GL涡旋震荡，充分混匀，加入200卩l无水乙醇，涡旋振荡，充分混 匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。 2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。 3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。 6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可 分多次转入。10000rpm离心1mi n,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 7.向吸附柱中加入500卩l Buffer GW1 （使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心1min ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中 8.向吸附柱中加入500卩l Buffer GW2 （使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm
转基因小鼠的制备 【实验目的】 1.了解转基因小鼠制备的原理和方法。 2.学习转基因小鼠制备的流程。 3.掌握对转基因小鼠进行筛选的方法。 【实验原理】 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 转基因动物是指染色体基因组中整合有外源基因并能遗传给后代的一类动物。整合到动物染色体基因组的外源基因称为转基因。转基因技术则是指制备转基因动物所需的一套技术，它涉及外源基因的构建、载体和受体的筛选、基因导人技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等许多方面。 1974年，Rudolf Jaenisch通过将SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，创造了第一只携带外源基因的小鼠。后来又有研究人员把Murine leukemia病毒注射到小鼠胚胎得到了能通过生殖系统稳定遗传的小鼠，并且外源基因能在后代中稳定表达。这些能稳定遗传且表达外源基因的小鼠即我们现在一般意义上所说的转基因小鼠。 【实验步骤】 一、显微注射法 1.受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，次日从输卵管内收集受精卵备用。 2.目的基因的导入 用显微操作仪将目的基因溶液导入受精卵的细胞核内。 3.受体母鼠的准备 将雄鼠输精管结扎，然后与可育雌鼠交配，刺激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母。 4.胚胎移植 将已转入目的基因的受精卵从背部植入假孕母鼠的输卵管或子宫内（视胚胎发育的状况而定），使胚胎在养母体内发育成熟。 5.对幼鼠的鉴定 幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交鉴定外源基因是否整合到幼鼠的染色体上。 二、胚胎干细胞囊胚显微注射法 1.囊胚期受精卵的采集 可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素促使超排卵。处理后与可育雄鼠交配，交配后第四天上午从子宫中冲取受精卵备用。 2.目的基因的导入
基因敲除小鼠pc鉴 一、技术介绍与研究进展 敲除动物技术已经/ 基因、基因敲入转该技术从上世成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，原核显史，经典技术如DNA纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历 在小鼠模型构建方面日趋微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，制备技术一样，逐渐从完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的 催生了数以百基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，然存在一些难以计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍TALEN和费用高昂等，而ZFN克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。二、同源重组技术原理同源重组的原理发展起来的，年代中后期基于DNA基因敲除鼠技术是上世纪80）homologous recombination1987年根据同源重组（在Capecchi和Smithies），这的外源基因的定点整合（EStargeted integration的原理，首次实现了），gene knockout（基因敲除）或gene targeting（基因打靶一技术称为 利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝
尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图图制作流程 三、． 基因敲除鼠制作过程示意图图2. 载体设计与构建1. Knockout根据研究项目具体情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的的载体上，成为重
转基因小鼠的鉴定 一、剪鼠尾 1.剪鼠尾的时间当新生的小鼠年龄达到两到三周（耳朵已经长开）时剪鼠尾较好，此时 鼠尾剪起来比较容易且小鼠的生命力比较强。 2.分辨小鼠的年龄 a当小鼠整个身体较红且腹部无奶时，此小鼠当天出生或前一晚出生； b当小鼠腹部有奶（腹部有一小团白色物质），此小鼠出生2~3天； c当小鼠背部长出皮毛时，此小鼠出生3~4天； d当小鼠毛长全，但眼未开时，此小鼠出生10天左右； e当小鼠眼刚开，耳未开时，此小鼠出生12天左右； f当小鼠耳刚开时，此小鼠出生14天左右。 3.剪鼠尾后对小鼠的标记：打耳孔法 二、从鼠尾中提取DNA 采用鼠尾基因组DNA提取试剂盒（康为世纪：cw2094）提取DNA，操作如下： 1.剪取小鼠长度为0.4-0.6cm的尾巴，放入灭菌后的离心管中，加入180μL Buffer GTT。震 荡混匀。 2.加入20μL proteinase K，涡旋震荡，彻底混匀。 3.置于56℃水浴，直到组织溶液完全清澈，一般需消化6-8h，赋予过程中涡旋震荡，使样品 均匀分离。 注意： 1）如果赋予和涡旋震荡后仍然有胶状物质，必要时过夜消化再加入20μl proteinase K消化，不会影响后续操作。 2）如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl浓度为100mg/μl的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10min。 4.14000rpm 离心1min，以消除未消化的类似于鼠毛等组织，将上清转移到一个新的灭过菌 的离心管中。 5.加入200μl Buffer GL，涡旋震荡，充分混匀，加入200μl 无水乙醇，涡旋振荡，充分混匀， 短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。 注意： 1）加入Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。 2）如果多个样品一起操作，Buffer GL 和无水乙醇可以等比例混匀后一起加入样品。 3）加入Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续操作。 6.将步骤5中所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若以此不能加完溶液，可 分多次转入。10000rpm 离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 7.向吸附柱中加入500μl Buffer GW1（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 8.向吸附柱中加入500μl Buffer GW2（使用前检查是否已加无水乙醇），10000 rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤8。 9.12000rpm 离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCR等）。 10.将吸附柱置于一个新的灭过菌的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5min，10000rpm 离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
转基因小鼠的应用及其制 备法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。 转基因小鼠的应用及其制备法
（西北农林科技大学动物科技学院，凌712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验法；应用前景 Methods and Applications of Transgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@126.；Tel： *通讯作者：E-mail：mailto:zhangjianqin1356@126.
课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定
一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"
（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程
假冒伪劣商品的鉴别方法与要点 (一)几种主要鉴别方法 1．对商品商标标识及其包装、装潢等特殊标志真伪进行鉴别；2．通过感官品评或其他简易手段进行鉴别；3．按照国家标准对商品理化、卫生等各项指标进行检测；4．利用本部门的专业特长，特别是长期实践积累的经验，对本企业或行业生产或经销的商品进行鉴别。 (二)要点 1．认准商标标识商标是商品听标记。假冒伪劣商品一般都是假冒名优商品。我国名优商品都使用经国家工商行政管理局登记注册的商标。要印刷时，在商标标识周围加上标记：\“注册商标\” 、\“注\”或\“？\” 。其中\“？\”为国际通用。假冒名优商品在外包装上多数没有商标标识，或\“注册商标\” 、\“注\” 、或\“？\”等字样。真品商标为正规厂家印制，商标纸质好，印刷美观，精细考究，文字图案清晰，色泽鲜艳、纯正、光亮，烫金精细。而假冒商标是仿印真品商标，由于机器设备、印刷技术差，与真品商标相比，往往纸质较低差，印刷粗糙，线条、花纹、笔划模糊，套色不正，光泽差，色调不分明，图案、造型不协调，版面不洁，无防伪标记。已注册的商标应由公安部门所属特种行业管理的正规印刷厂印制，而假冒商标一般出自不正当渠道，这些渠道不正规的印刷技术会使所印商标上出现许多疵点特征。可以通过检验商标上是否有这些疵点特征来确定其真伪。假冒商标的印刷疵点特征有：（l）墨稿疵点特征：
字体不正、笔划偏粗、间隔不均、字迹不清晰，笔不流畅，图案细节被省略，或很粗糙，花纹粗细不一，该圆滑处不圆滑，边线棱角不明显。（2）制版疵点特征：印刷板周边有缺损，不光滑，版与版之间有差异，字迹变粗，笔划连接不清晰，粗细不均。（3）印刷疵点特征：多色图案花纹衔接不好，版面拼接处不连贯或重叠部分过多、过少，商标边缘颜色有外溢，该印的地方没有印到。（4）模切疵点特征：切边外有未切断的纤维，切边与商标边缘没有共同的起伏，切边处有缺损，不圆滑。2．查看商品标识根据《产品质量法》第十五条规定，产品或其包装上的标识应符合下列要求：（l）有产品质量检验合格证明；（2）有中文标明的产品名称，生产厂厂名和厂址；（3）根据产品的特点和使用要求，需要标明产品规格、等级、所含主要成份的名称和含量的，都应予以标明；（4）限期使用的产品，要标明生产日期和安全使用期或者失效日期；（5）使用不当，容易造成产品本身损坏或者可能危及人身、财产安全的产品，应有警示标志或者中文警示说明。假冒伪劣商品的标识一般不是正规企业生产，外包装标识或残缺不全，或乱用乱写，或假冒优质奖标记，欺骗消费者。3．检验商品特有标记部分名优商品在其特定部位还有特殊标记，如飞鸽、凤凰、．永久三大国产名牌自行车，在车把、车铃、车座、农架、车圈等处均有特殊标记。部分名优烟、酒包装上的商品名称系用凹版印刷，用手摸有凹凸感，而假冒产品名称在包装上字体较平，无凸凹感。4．检查商品生产厂名一些传统名优商品，以地名命名商品名称的，
碱法提取小鼠总DNA及基因鉴定： 一、实验器材：加样枪（1ml、200ul、20ul、10ul）、枪头（大中小一套）、EP管（20ul、1.5ml、 10ml）、试管架、浮标、温度计、胶布、手套、记号笔、锥形瓶、称量匙、冰盒 二、实验试剂：A液、B液、引物、mix、双蒸水、三蒸水、琼脂糖、TBE（5x、1x、回收液）、 核苷酸染料、Marker 三、母液配置： 1.10M NaOH:NaOH 40g加双蒸水至90ml，待NaOH完全溶解冷却后定容至100ml 2.0.5M EDTA：EDTA.Na2盐18.61g, NaOH 1.5g, 加双蒸水至80ml,逐滴加入10M NaOH 至EDTA完全溶解后加双蒸水定容至100ml 3.1M TrisHCl（pH8.0）：Tris碱12.1g，加水至70ml，边搅拌边加入浓盐酸4ml，然后 边逐滴加入1M HCl边测PH值，直至PH升至8.0（+\-0.05），定容至100ml（pH=8.8 的TrisHCl中边加入浓盐酸边测PH值至PH=8.0（+\-0.05）为止） 四、实验步骤： 1.剪取鼠尾（约芝麻大小）储存于-20度冰箱（-20度冰箱，主要是防止DNA降解，4度不 行） 2.提取DNA： 1)配置工作液——20ml体系液：50ul 10M NaOH 加双蒸水至20ml 8ul 0.5M EDTA B液：800ul 1M TrisHCl（pH8.0）加双蒸水至20ml 2)加150ulA液（液体应完全浸没标本），95度水浴锅煮1.5h（将EP管插入浮标 中后用胶布缠好防止EP管在加热过程中爆开） 3)加150ulB液，混匀（上下颠倒3-5下） 4)12000r/min 4度离心5分钟（可储存于-20度冰箱） 3.PCR（冰上操作）：P1 0.5ul（P为AC3I，G为AAA） 1)配置PCR体系——15ul体系P2 0.5ul Mix 7.5ul 三蒸水4.5ul DNA 2ul 2)加2ul上述离心后的上清液至PCR体系，瞬离 3)PCR仪扩增，参数设定：预变性：94度——3min 变性：94度——30s 退火：55度——30s 30个循环 延伸：72度——24s 72度——5min 4度——∞ 4.琼脂糖凝胶电泳： 1)制胶——2%琼脂糖凝胶配方： 总体积（ml）20 30 40 50 60 120 琼脂糖（g）0.4 0.6 0.8 1 1.2 2.4 TBE 1x（ml）20 30 40 50 60 120 Tris-base 13.6g TBE 5x配方：硼酸 6.56g EDTA 0.73g
基因敲除小鼠的PCR鉴定 一、实验目的： 通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳方法鉴定凝血因子IX基因敲除小鼠的基因型。 二、实验原理： 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 1.PCR原理： PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 1) 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2) 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3) 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 2.琼脂糖凝胶电泳原理： 在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度（4~30℃之间）无明显关系。一般说，同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比，与电场强度（小于5V/cm）成正比。 三、实验操作 1.获取鼠尾组织 剪鼠尾0.5cm置于试管中，加入500ul裂解液和10ul蛋白酶K(20mg/ml)，55℃水浴过夜，至鼠尾溶解 2.提取基因组DNA 1) 试管中加入300ul饱和NaCl，充分混匀，12500rpm 离心20min
产品鉴定管理办法 FTZGN.8110400.034.0-2006 农业装备事业部管理制度 制 度 要 素 1.制订 目的 使新产品顺利通过检测、鉴定，获得检测报告和鉴定证书，为产品顺利推向市场、办理产品推广鉴定、申报科技奖励及享受国家有关扶持政策做准备。 2.适用 范围 本办法适用于福田重工农业装备事业部生产的欧豹拖拉机、谷神收割机及其它产品。 主 要 内容3.职责 3.1 工程 开发部产品管 理科（以下简 称产品科） 3.1.1 负责新产品检测、鉴定并制定相应计划； 3.1.2 负责联系、协调上级主管检测、鉴定机构； 3.1.3 负责检测材料的准备； 3.1.4 负责协助检测机构进行检测并取得检测报告； 3.1.5 负责鉴定材料的准备； 3.1.6 负责联系相关专家组织召开鉴定会并取得鉴定证书； 3.1.7 负责检测报告、鉴定证书等相关材料的管理； 3.1.8 负责检测费、鉴定费、专家咨询费、招待费的预算和最终结算。 3.2 相关 研究所 3.2.1 负责协助检测机构和产品科进行检测； 3.2.2 负责相关检测材料的准备； 3.2.3 负责相关鉴定材料的准备。 3.3 工程 开发部标准化 科 3.3.1 负责提供新产品企业标准； 3.3.2 负责提供新产品标准化审查报告。 13
产品鉴定管理办法 FTZGN.8110400.034.0-2006 农业装备事业部管理制度 3.4 营销 公司销售部 负责对用户使用情况进行调查，至少准备3份有用户签字或盖章的用户使用情况反馈单。 主要 内容 3.5 财务 部 3.5.1 负责对相关费用预算的审核； 3.5.2 负责向检测机构支付相关费用。 4. 内 容与要求 4.1 组织 新产品检测、 鉴定依据 4.1.1 营销公司根据市场情况提报的产品开发建议及市场需求计划； 4.1.2 有关会议的决议要求； 4.1.3 依据行业有关新产品开发、试验、推广的规定。 4.2产品科编制新产品检测、鉴定计划。 4.3 新产 品检测 4.3.1检测部 分包括以下内容 4.3.1.1 明确样机的数量及到位时间； 4.3.1.2 检测所需的相关材料：样机主要参数、使用说明书、企业标准、样机照片等； 4.3.1.3 检测机构工作人员的接待； 4.3.1.4 确定检测机构，明确检测费用。 4.3.2 与检测机构签订《产品检测委托书》； 4.3.3 产品科、相关研究所协助检测机构完成检测试验； 4.3.4 财务部支付检测费用，产品科取得检测报告。 13
一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），
利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程
PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用 摘要目的为ApoE基因敲除鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法设计两对引物扩增野生型ApoE基因和ApoE缺陷突变基因的DNA片段，用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度，然后用PCR鉴定方案检测小鼠基因型并将所得基因型结果与已经过经典的Southern blot方法检测得到的基因型结果比较。结果野生型仅在155 bp处有一条条带，突变纯舍子仅在245 bp处有一条条带，杂合子则在155和245bp处出现两条条带。用PCR方法获得的ApoE基因分析结果与经典的Southern blot方法获得的结果完全一致。结论用PCR方法分析ApoE基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。 关键词聚合酶链反应基因型基因打靶载脂蛋白E Genotype identification of ApoE Gene Knockout Mice with Polymerase Chain Reaction Objective This study was to explore a simple and quick polymerase chain reaction（PCR）method for genotyping of ApoE knockout mice.Method Two pairs of primers were designed to amplify genomic DNA fragment of wild-type ApoE gene and the same region on ApoE targeting veceor respectively.A gradient PCR strategy was used to test the best annealing temperature. Results A 155bp band was found in wild-type ApoE mice,a 245 bp band in homozygous mutated ApoE mice and both bands in hetemzygous mice.The genotyping results were completely coincided with those from typical Southern blot. Conclusion PCR is a simple,fast and practical method for the genotyping of ApoE gene knockout mice. Key words Poiymerase Chain Reaction genotype gene targeting ApoE 载脂蛋白(apolipoprotein，ApoE)是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白的受体的配体，因此，缺乏ApoE则会导致血液循环中富含胆同醇的物质积累而更加容易引起动脉粥样硬化
转基因小鼠的应用及其制 备方法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。
转基因小鼠的应用及其制备方法 （西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验方法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验方法；应用前景 Methods and Applications ofTransgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@https://www.doczj.com/doc/d59297114.html,；Tel： *通讯作者：E-mail： 兴的最有效的动物实验模型。小鼠是最早建立的转基因动物模型，利用转基因小鼠进行生物学或生物医
转基因小鼠制备实验方法 1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。 2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。 3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。 5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。 6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。 7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。 8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。 9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。 10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。 (一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)