.. 一、常规基因敲除鼠（Conventional Knockout） 常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用Neo Cassette 替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。 二、条件性基因敲除小鼠（Conditional Knockout） 条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。 条件性基因敲除鼠适用范围为：（1）该基因有胚胎致死性；（2）用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。 三、基因敲入小鼠（Knockin） 基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。 此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。 获得嵌合体及之后品系纯化详细流程： 基因敲除其他方法： 一、ZFN技术制作基因敲除鼠 ZFN能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现DNA的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而ZFN的基因敲除效率能达到10%。利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。 这项技术中设计特异性的ZFN是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的ZFN，但ZFN的脱靶（off target），也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。也正因为这个原因，利用ZFN技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。 二、TALEN技术制作基因敲除鼠 TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。然而同样因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。 ;.
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项 高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程 图2.基因敲除鼠制作过程示意图 1. Knockout载体设计与构建
1. 下面说法不正确的是：（）。（1分）[单选题] 1. 监督不是必需的 2. 每次监督活动，通常不必完全重复初始评定的所有行动 3. 监督为了确保认证产品在规定的期限内持续符合规定要求 4. 监督是确定符合性证明有效性的基础 2. GB/T27028中给出了一种常用的且被证明有效的产品认证方案模式，对应于（）的产品认证方案。（1分）[单选题] 1. 方案类型3 2. 方案类型4 3. 方案类型5 4. 方案类型6 3. 产品认证确定阶段的审核，主要是指对于（）质量管理体系的审核。（1分）[单选题] 1. 生产者 2. 生产厂 3. 受审核 4. 委托方方 4. 方案类型4，是根据需要，（）抽样进行监督检验和对产品生产过程运作的评审，适用于生产过程的工艺技术复杂和认证风险高的产品。（1分）[单选题] 1. 从公开市场上 2. 从工厂生产线 3. 从生产线或市场 4. 从生产线和/或/市场 5. 确定阶段中，审核是为了获得证据对（）进行客观评价，以确定满足审核准则的程序所进行的系统的、独立的并形成文件的过程。（1分）[单选题] 1. 管理体系 2. 质量管理体系 3. 产品质量 4. 产品技术要求 6. 确定阶段中，设计评价一般适用于产品的（）设计。（1分）[单选题] 1. 质量、性能、安全、环保 2. 性能、安全、环保 3. 质量、性能、安全 4. 质量、性能 7. 以下哪种方法不是产品认证方案类型中监督可采取的方法（）。（1分）[单选题] 1. 从公开市场上抽样检验或检查 2. 从工厂抽样检验或检查 3. 依据GB/T19001的审核 4. 对生产、服务提供或过程作业的评价 8. 方案类型5是一种典型认证方案，其包括的功能和活动有取样、检测、（）、复核、认证决定、许可和监督等。（1分）[单选题] 1. 生产过程评审 2. 质量管理体系评审 3. A+B
基因敲除技术 点击次数: 2605 发布日期: -5-25 来源: 本站仅供参考, 谢 绝转载, 否则责任自负 1．概述: 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术, 是经过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。一般意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理, 用设计的同源片段替代靶基因片段, 从而达到基因敲除的 目的。随着基因敲除技术的发展, 除了同源重组外, 新的原理和技术也逐渐被应用, 比较成功的有基因的插入突变和iRNA, 它们同样能够达到基因敲除的目的。2．实现基因敲除的多种原理和方法: 2．1．利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初, 胚胎干细胞( ES细胞) 分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年, 首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到 1987年, Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在, 运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的 使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1):
图1.基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤 a．基因载体的构建: 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子 都重组到带有标记基因(如neo 基因, TK 基因等)的载体上, 成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能, 因此一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得: 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞, 最常见的是鼠, 而兔, 猪, 鸡等的胚胎干细胞也有使用。常见的鼠的种系是１２９及其杂合体, 因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向, 是基因敲除的理想实验动物。而其它遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2, 3] ｃ．同源重组: 将重组载体经过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中, 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组, 将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中, 从而得以表示。一般地, 显微注射命中率较高, 但技术难度较大, 电穿孔命中率比显微注射低, 但便于使用。[4,5] ｄ．选择筛选已击中的细胞: 由于基因转移的同源重组自然发生率极低, 动物的重组概率为10－2～10-5, 植物的概率为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。当前常见的方法是正负筛选法( PNS法) , 标记基因的特异位点表示法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。[6]
基因敲除小鼠pc鉴 一、技术介绍与研究进展 敲除动物技术已经/ 基因、基因敲入转该技术从上世成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，原核显史，经典技术如DNA纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历 在小鼠模型构建方面日趋微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，制备技术一样，逐渐从完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的 催生了数以百基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，然存在一些难以计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍TALEN和费用高昂等，而ZFN克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。二、同源重组技术原理同源重组的原理发展起来的，年代中后期基于DNA基因敲除鼠技术是上世纪80）homologous recombination1987年根据同源重组（在Capecchi和Smithies），这的外源基因的定点整合（EStargeted integration的原理，首次实现了），gene knockout（基因敲除）或gene targeting（基因打靶一技术称为 利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝
尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图图制作流程 三、． 基因敲除鼠制作过程示意图图2. 载体设计与构建1. Knockout根据研究项目具体情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的的载体上，成为重
转基因小鼠的应用及其制 备法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。 转基因小鼠的应用及其制备法
（西北农林科技大学动物科技学院，凌712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验法；应用前景 Methods and Applications of Transgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@126.；Tel： *通讯作者：E-mail：mailto:zhangjianqin1356@126.
课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定
一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"
（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程
假冒伪劣商品的鉴别方法与要点 (一)几种主要鉴别方法 1．对商品商标标识及其包装、装潢等特殊标志真伪进行鉴别；2．通过感官品评或其他简易手段进行鉴别；3．按照国家标准对商品理化、卫生等各项指标进行检测；4．利用本部门的专业特长，特别是长期实践积累的经验，对本企业或行业生产或经销的商品进行鉴别。 (二)要点 1．认准商标标识商标是商品听标记。假冒伪劣商品一般都是假冒名优商品。我国名优商品都使用经国家工商行政管理局登记注册的商标。要印刷时，在商标标识周围加上标记：\“注册商标\” 、\“注\”或\“？\” 。其中\“？\”为国际通用。假冒名优商品在外包装上多数没有商标标识，或\“注册商标\” 、\“注\” 、或\“？\”等字样。真品商标为正规厂家印制，商标纸质好，印刷美观，精细考究，文字图案清晰，色泽鲜艳、纯正、光亮，烫金精细。而假冒商标是仿印真品商标，由于机器设备、印刷技术差，与真品商标相比，往往纸质较低差，印刷粗糙，线条、花纹、笔划模糊，套色不正，光泽差，色调不分明，图案、造型不协调，版面不洁，无防伪标记。已注册的商标应由公安部门所属特种行业管理的正规印刷厂印制，而假冒商标一般出自不正当渠道，这些渠道不正规的印刷技术会使所印商标上出现许多疵点特征。可以通过检验商标上是否有这些疵点特征来确定其真伪。假冒商标的印刷疵点特征有：（l）墨稿疵点特征：
字体不正、笔划偏粗、间隔不均、字迹不清晰，笔不流畅，图案细节被省略，或很粗糙，花纹粗细不一，该圆滑处不圆滑，边线棱角不明显。（2）制版疵点特征：印刷板周边有缺损，不光滑，版与版之间有差异，字迹变粗，笔划连接不清晰，粗细不均。（3）印刷疵点特征：多色图案花纹衔接不好，版面拼接处不连贯或重叠部分过多、过少，商标边缘颜色有外溢，该印的地方没有印到。（4）模切疵点特征：切边外有未切断的纤维，切边与商标边缘没有共同的起伏，切边处有缺损，不圆滑。2．查看商品标识根据《产品质量法》第十五条规定，产品或其包装上的标识应符合下列要求：（l）有产品质量检验合格证明；（2）有中文标明的产品名称，生产厂厂名和厂址；（3）根据产品的特点和使用要求，需要标明产品规格、等级、所含主要成份的名称和含量的，都应予以标明；（4）限期使用的产品，要标明生产日期和安全使用期或者失效日期；（5）使用不当，容易造成产品本身损坏或者可能危及人身、财产安全的产品，应有警示标志或者中文警示说明。假冒伪劣商品的标识一般不是正规企业生产，外包装标识或残缺不全，或乱用乱写，或假冒优质奖标记，欺骗消费者。3．检验商品特有标记部分名优商品在其特定部位还有特殊标记，如飞鸽、凤凰、．永久三大国产名牌自行车，在车把、车铃、车座、农架、车圈等处均有特殊标记。部分名优烟、酒包装上的商品名称系用凹版印刷，用手摸有凹凸感，而假冒产品名称在包装上字体较平，无凸凹感。4．检查商品生产厂名一些传统名优商品，以地名命名商品名称的，
碱法提取小鼠总DNA及基因鉴定： 一、实验器材：加样枪（1ml、200ul、20ul、10ul）、枪头（大中小一套）、EP管（20ul、1.5ml、 10ml）、试管架、浮标、温度计、胶布、手套、记号笔、锥形瓶、称量匙、冰盒 二、实验试剂：A液、B液、引物、mix、双蒸水、三蒸水、琼脂糖、TBE（5x、1x、回收液）、 核苷酸染料、Marker 三、母液配置： 1.10M NaOH:NaOH 40g加双蒸水至90ml，待NaOH完全溶解冷却后定容至100ml 2.0.5M EDTA：EDTA.Na2盐18.61g, NaOH 1.5g, 加双蒸水至80ml,逐滴加入10M NaOH 至EDTA完全溶解后加双蒸水定容至100ml 3.1M TrisHCl（pH8.0）：Tris碱12.1g，加水至70ml，边搅拌边加入浓盐酸4ml，然后 边逐滴加入1M HCl边测PH值，直至PH升至8.0（+\-0.05），定容至100ml（pH=8.8 的TrisHCl中边加入浓盐酸边测PH值至PH=8.0（+\-0.05）为止） 四、实验步骤： 1.剪取鼠尾（约芝麻大小）储存于-20度冰箱（-20度冰箱，主要是防止DNA降解，4度不 行） 2.提取DNA： 1)配置工作液——20ml体系液：50ul 10M NaOH 加双蒸水至20ml 8ul 0.5M EDTA B液：800ul 1M TrisHCl（pH8.0）加双蒸水至20ml 2)加150ulA液（液体应完全浸没标本），95度水浴锅煮1.5h（将EP管插入浮标 中后用胶布缠好防止EP管在加热过程中爆开） 3)加150ulB液，混匀（上下颠倒3-5下） 4)12000r/min 4度离心5分钟（可储存于-20度冰箱） 3.PCR（冰上操作）：P1 0.5ul（P为AC3I，G为AAA） 1)配置PCR体系——15ul体系P2 0.5ul Mix 7.5ul 三蒸水4.5ul DNA 2ul 2)加2ul上述离心后的上清液至PCR体系，瞬离 3)PCR仪扩增，参数设定：预变性：94度——3min 变性：94度——30s 退火：55度——30s 30个循环 延伸：72度——24s 72度——5min 4度——∞ 4.琼脂糖凝胶电泳： 1)制胶——2%琼脂糖凝胶配方： 总体积（ml）20 30 40 50 60 120 琼脂糖（g）0.4 0.6 0.8 1 1.2 2.4 TBE 1x（ml）20 30 40 50 60 120 Tris-base 13.6g TBE 5x配方：硼酸 6.56g EDTA 0.73g
基因敲除小鼠的PCR鉴定 一、实验目的： 通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳方法鉴定凝血因子IX基因敲除小鼠的基因型。 二、实验原理： 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 1.PCR原理： PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 1) 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2) 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 3) 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 2.琼脂糖凝胶电泳原理： 在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度（4~30℃之间）无明显关系。一般说，同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比，与电场强度（小于5V/cm）成正比。 三、实验操作 1.获取鼠尾组织 剪鼠尾0.5cm置于试管中，加入500ul裂解液和10ul蛋白酶K(20mg/ml)，55℃水浴过夜，至鼠尾溶解 2.提取基因组DNA 1) 试管中加入300ul饱和NaCl，充分混匀，12500rpm 离心20min
产品鉴定管理办法 FTZGN.8110400.034.0-2006 农业装备事业部管理制度 制 度 要 素 1.制订 目的 使新产品顺利通过检测、鉴定，获得检测报告和鉴定证书，为产品顺利推向市场、办理产品推广鉴定、申报科技奖励及享受国家有关扶持政策做准备。 2.适用 范围 本办法适用于福田重工农业装备事业部生产的欧豹拖拉机、谷神收割机及其它产品。 主 要 内容3.职责 3.1 工程 开发部产品管 理科（以下简 称产品科） 3.1.1 负责新产品检测、鉴定并制定相应计划； 3.1.2 负责联系、协调上级主管检测、鉴定机构； 3.1.3 负责检测材料的准备； 3.1.4 负责协助检测机构进行检测并取得检测报告； 3.1.5 负责鉴定材料的准备； 3.1.6 负责联系相关专家组织召开鉴定会并取得鉴定证书； 3.1.7 负责检测报告、鉴定证书等相关材料的管理； 3.1.8 负责检测费、鉴定费、专家咨询费、招待费的预算和最终结算。 3.2 相关 研究所 3.2.1 负责协助检测机构和产品科进行检测； 3.2.2 负责相关检测材料的准备； 3.2.3 负责相关鉴定材料的准备。 3.3 工程 开发部标准化 科 3.3.1 负责提供新产品企业标准； 3.3.2 负责提供新产品标准化审查报告。 13
产品鉴定管理办法 FTZGN.8110400.034.0-2006 农业装备事业部管理制度 3.4 营销 公司销售部 负责对用户使用情况进行调查，至少准备3份有用户签字或盖章的用户使用情况反馈单。 主要 内容 3.5 财务 部 3.5.1 负责对相关费用预算的审核； 3.5.2 负责向检测机构支付相关费用。 4. 内 容与要求 4.1 组织 新产品检测、 鉴定依据 4.1.1 营销公司根据市场情况提报的产品开发建议及市场需求计划； 4.1.2 有关会议的决议要求； 4.1.3 依据行业有关新产品开发、试验、推广的规定。 4.2产品科编制新产品检测、鉴定计划。 4.3 新产 品检测 4.3.1检测部 分包括以下内容 4.3.1.1 明确样机的数量及到位时间； 4.3.1.2 检测所需的相关材料：样机主要参数、使用说明书、企业标准、样机照片等； 4.3.1.3 检测机构工作人员的接待； 4.3.1.4 确定检测机构，明确检测费用。 4.3.2 与检测机构签订《产品检测委托书》； 4.3.3 产品科、相关研究所协助检测机构完成检测试验； 4.3.4 财务部支付检测费用，产品科取得检测报告。 13
一、技术介绍与研究进展 转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。 二、同源重组技术原理 基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），
利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。 同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示： 图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图 三、制作流程
PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用 摘要目的为ApoE基因敲除鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法设计两对引物扩增野生型ApoE基因和ApoE缺陷突变基因的DNA片段，用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度，然后用PCR鉴定方案检测小鼠基因型并将所得基因型结果与已经过经典的Southern blot方法检测得到的基因型结果比较。结果野生型仅在155 bp处有一条条带，突变纯舍子仅在245 bp处有一条条带，杂合子则在155和245bp处出现两条条带。用PCR方法获得的ApoE基因分析结果与经典的Southern blot方法获得的结果完全一致。结论用PCR方法分析ApoE基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。 关键词聚合酶链反应基因型基因打靶载脂蛋白E Genotype identification of ApoE Gene Knockout Mice with Polymerase Chain Reaction Objective This study was to explore a simple and quick polymerase chain reaction（PCR）method for genotyping of ApoE knockout mice.Method Two pairs of primers were designed to amplify genomic DNA fragment of wild-type ApoE gene and the same region on ApoE targeting veceor respectively.A gradient PCR strategy was used to test the best annealing temperature. Results A 155bp band was found in wild-type ApoE mice,a 245 bp band in homozygous mutated ApoE mice and both bands in hetemzygous mice.The genotyping results were completely coincided with those from typical Southern blot. Conclusion PCR is a simple,fast and practical method for the genotyping of ApoE gene knockout mice. Key words Poiymerase Chain Reaction genotype gene targeting ApoE 载脂蛋白(apolipoprotein，ApoE)是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白的受体的配体，因此，缺乏ApoE则会导致血液循环中富含胆同醇的物质积累而更加容易引起动脉粥样硬化
基因敲除技术 1．概述： 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。 2．实现基因敲除的多种原理和方法： 2．1． 利用基因同源重组进行基因敲除 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。 2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)： a． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。 b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。[2，3] ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重
三．商品检验的方法 （一）、感官检验法 指利用人体的感觉器官结合平时积累的实践经验对商品质量进行判断和鉴定的方法。 感官检验法主要包括视觉检验、嗅觉检验、味觉检验、触觉检验和听觉检验五种方法。可以判断和评定商品的外形、结构、外观疵点、色泽、声音、滋味、气味、弹性、硬度、光滑度、包装装潢等的质量情况，并可以对商品的种类、规格等进行识别。 感官检验法快速、经济、简便易行，不需要专用仪器、设备和场所，不损坏商品，成本较低，因而使用较广泛。但是，感官检验法一般不能检验商品的内在质量；检验的结果常受检验人员技术水平、工作经验以及客观环境等因素的影响，而带有主观性和片面性，且只能用专业术语或记分法表示商品质量的高低，而得不出准确的数值。为提高感官检验结果的准确性，通常是组织评审小组进行检验。 （二）、理化检验法 理化检验法是借助于各种仪器设备或化学试剂来测定和分析商品质量的方法。理化检验往往在实验室或专门场所进行，故也称实验室检验法。 理化检验法主要用于检验商品的成分、结构、物理性质、化学性质、安全性、卫生性以及对环境的污染和破坏等。 理化检验法既可对商品进行定性分析，又可进行定量分析，而且其结果比感官检验法精确而客观，它不受检验人员主观意志的影响，结果可用具体数值表示，能深入分析商品的内在质量。但是，理化检验法需要一定的仪器设备和实验场所，成本较高；检验时，往往需要破坏一定数量的商品，费用较大；检验时间较长；需要专门的技术人员进行；对于某些商品的某些感官指标，如色、香、味的检验还是无能为力的。因此，理化检验法在商业企业直接采用较少，多作为感官检验的补充检验，或委托专门的检验机构进行理化检验。 理化检验法根据其检验的原理不同，可分为物理检验法、化学检验法、生物学检验法三大类。其中物理检验法又分为一般物理检验法、力学检验法、电学检验法、光学检验法和热学检验法等；化学检验法又分为化学分析法、仪器分析法等；生物学检验法又可分为微生物学检验法和生理学检验法。 四．商品抽样方法 （一）、抽样的概念和原则 1．抽样的概念 抽样也称取样、采样、拣样，是指从被检验的商品中按照一定的方法采集样品的过程。 抽样检验是按照事先规定的抽样方案，从被检批中抽取少量样品，组成样本，再对样品逐一进行测试，将测试结果与标准或合同进行比较，最后由样本质量状况统计推断受检批商品整体质量合格与否。它检验的商品数量相对较少，节省检验费用。抽样检验适用于批量较大、价值较低、质量特性较多、且质量较稳定或具有破坏性的商品检验。 2.抽样的原则 代表性原则 要求被抽取的一部分商品必须具备有整批商品的共同特征，以使鉴定结果能成为决定此大量商品质量的主要依据。 典型性原则 指被抽取的样品能反映整批商品在某些（个）方面的重要特征，能发现某种情况对商品质量造成的重大影响。如食品的变质、污染、掺杂及假冒劣质商品的鉴别。 适时性原则 针对组分、含量、性能、质量等会随时间或容易随时间的推移而发生变化的商品要求及时适时抽样并进行鉴定。如新鲜果菜中各类维生素含量的鉴定及各类农副产品中农药或杀虫剂残
小鼠基因组提取与基因型鉴定 一．小鼠基因组提取 1．试剂与纯化柱 2.方法 2.1 剪0.4- 0.6 CM鼠尾，切成小块，装进1.5mlEP管中，加300ul 裂解 液.(自配的裂解液，配方见下表) 2.2 加入10ul蛋白酶K，充分混匀，56℃过夜(约16个小时),或加入30ul蛋白 酶K，充分混匀，56℃2h。 2.3 尾巴完全裂解后，取出，充分混匀，直至混液成均匀且无结块，向管内 加入50ul Buffer AL，充分混匀。然后加入200ul无水乙醇，充分混匀 （用手上下颠倒混匀，动作不宜过猛，防止DNA断裂）。 2.4 将上述混合液加入到装有2ml收集管的柱子中，12000rpm离心1min，倒 掉废液，将柱子放回收集管。 2.5 向柱子中加入250ul Buffer AW1，静置2-3min，12000rpm离心1min，倒 掉废液，将柱子放回收集管。 2.6 向柱子中加入250ul Buffer AW2，静置2-3min，12000rpm离心1min，倒 掉废液，空离2min。注意：此步拿柱子时不要碰到收集管中的液体。2.7 将柱子放到一个干净的1.5ml离心管中，开口放15min左右，（残留的液
体蒸发干，残留的乙醇对PCR有影响））（有条件的可放在安全柜中通风吹干10-15min） 2.8 向柱子中心慢慢滴加200ul无菌去离子水。室温静置3min，12000rpm离 心2min，为增加基因组DNA的回收率，可将离心得到的溶液再加入吸 附柱中，室温放置2min，12000prm离心2min。 小鼠基因组裂解液的配制（1000ml为例） 二．小鼠基因型鉴定 1. 基因型鉴定方法：采用PCR检测方法，以确定小鼠为纯合子/杂合子/野生型1.1引物 引物对及扩增片段大小
基因敲除小鼠的制备流程 基因敲除小鼠已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的实验动物模型，在生命科学、人类医药和健康研究领域中发挥着重要的作用。基于胚胎干细胞的基因打靶技术、EGE技术（基于Crispr cas9技术）是当下比较火热的基因敲除小鼠制备技术。利用这两种技术制备基因敲除小鼠的流程是什么样的？ 一、基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠的流程： 1.课题设计，订购课题BAC菌； 2.按照课题设计，完成打靶载体设计和构建； 3.将重组载体电转到胚胎干细胞中，用G418筛选转染后的胚胎干细胞， 得到阳性克隆； 4.进一步通过PCR和southern blot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标 准）对上一步得到的阳性克隆进行筛选，得到稳定整合外源基因的胚 胎干细胞阳性克隆； 5.将胚胎干细胞阳性克隆注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宫 内； 6.得到嵌合鼠，并获得F1阳性杂合子小鼠。 基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠是目前为止唯一一个 可以满足几乎所有基因组修饰要求的打靶技术，但目前只应用在小鼠的基因敲除上，而且其周期长工作量大。 二、利用EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠的流程 1.设计构建识别靶序列的sgRNA;
2.设计构建致靶基因切割的EGE系统载体质粒； 3.利用百奥赛图自主开发的UCA试剂盒对sgRNA/Cas9进行活性检测； 4.设计构建打靶载体； 5.体外转录sgRNA/Cas9 mRNA; 6.小鼠受精卵原核注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶载体； 7.获得Fo代小鼠，利用PCR对Fo代小鼠进行基因型鉴定； 8.获得F1代小鼠，利用PCR和southern blot杂交技术（基因敲除小 鼠检测金标准）对F1代小鼠进行基因型鉴定。 虽然EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠看似比基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠流程繁琐，其实不然，EGE技术（基于Crispr cas9技术）系统构建简单，基因敲除/敲入效率高，速度快，可实现多基因、多物种基因敲除/敲入，最快2个月即可得到F0代阳性鼠，5个月得到F1F1代杂合子小鼠。
实验七中药商品的鉴定（三） 中药商品的性状鉴别 实验目的 1、学习中药商品性状观察与描述方法； 2、掌握陈列中药商品的性状特征和外观质量标准。 基本原理 ●中药商品的性状鉴别，是经营管理活动中最常用的宏观鉴别方法，即用感官系统对中药商品进行鉴别的方法。 ●中药商品的性状特征可从形状、大小、颜色、表面特征、质地、断面、气味等7个方面进行观察和描述，其中观察重点是形状、表面特征、断面和气味。 ●采用眼观、口尝、鼻闻、手摸等简便方法，可以对中药商品进行鉴别，比较相似药材、完整药材、中药饮片及其炮制品的商品特征。 ●通过观察，分析中药商品的主要商品特征、鉴别要点，检查其是否与有关标准相符，制定出中药商品的外观质量标准，为中药商品的经营管理提供依据。 ●中药商品特征的描述，通常采用形态学、矿物学、中成药学和经验鉴别术语相结合的方法 仪器与材料 仪器解剖镜、刀片、小烧杯、培养皿、镊子、放大镜等。 材料陈列的各类中药商品 实验内容与操作方法 1、根及根茎类：观察形状、大小、颜色、表面特征、质地、横折断面（或横斜、切面）、气味等。 商品：牛膝、白芍、大黄、甘草、黄芪、黄连、延胡索、白芷、当归、川芎、防风、黄芩、丹参、党参、桔梗、麦冬、白术片、苍术、半夏、川贝母、浙贝母、天麻及其饮片和炮制品。 2、茎木类：观察形状、大小、粗细、表面（或周边）、颜色、质地、折断面（或横斜、切面）、气味等。 商品：鸡血藤、石斛、川木通、沉香、钩藤饮片及其炮制品。 3、皮类：首先区分是茎皮、枝皮还是根皮，再观察形状、外表面、内表面、厚薄、质地、断面（或切面）、气味等。 商品：牡丹皮、厚朴、肉桂、杜仲、黄柏饮片及其炮制品。 4、叶类：观察类型、状态、叶片、叶柄等特征。叶片的形状、大小、颜色、表面特征、质地、叶缘、叶端、叶基、叶脉、叶柄等。 商品：大青叶、番泻叶、枇杷叶。 5、花类：观察花萼、花冠、雄蕊群、雌蕊群等特征。花序观察类型、形状、苞片、小花数目等；还要观察形状、大小、颜色、表面特征、质地、气味等。必要时可浸软后观察。 商品：金银花、菊花、红花、辛夷、丁香