枯草芽孢杆菌的发酵学院：化工学院 专业：生物工程 班级：生物10-2 姓名：姜霞
摘要 枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的15种菌种之一,其已被越来越多地制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，故具有广阔的发展前景，并已在畜牧业、饲料业广泛应用，显示巨大的社会效益和生态效益。通过摇床培养筛选出较适宜于枯草芽孢杆菌发酵的培养基配方，发酵培养基配方确定后，在摇床条件下，通过对温度、初始ｐＨ值、初始接种量、装液量、摇床转速等发酵条件的摸索，确定最佳发酵条件。在摇瓶条件下优化发酵培养基和发酵工艺后，采用发酵罐进行发酵培养，对枯草芽孢杆菌在液体发酵过程中的菌体数量、ｐＨ值、总糖含量和总氮含量四个因素随时间的变化进行了观察。 枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等 关键词：枯草芽孢杆菌生长发酵活菌数
芽孢杆菌常用培养基配方 （按理说，该实验的所有培养基都在这了，后红字更为清楚些。。。摘自百度） 一、肉汤琼脂培养基：蛋白胨10g ，牛肉膏15g ，NACL15g ，蒸 馏水1000ml ，琼脂18g 。调节PH7.2,0.1MPA20min 灭菌。如果用液体做培养基，则去掉琼脂即可。100 mL/组，其中20 mL 液体培养基/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。 2、或是（J-琼脂培养基：胰蛋白胨5g,酵母膏15g,磷酸 氢二钾3g,葡萄糖2g, 琼脂20g, 蒸馏水1000ml。调节PH7.3 —7.5Mpa 30min灭菌。） 二、过氧化氢酶测定 1、试剂：3-10%过氧化氢 2、接种与培养：一般将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30度下 培养1-2天。 3、试验方法：取一干净载玻片，在上面加一滴3-10%的双氧水， 挑取1环1-2天的的菌苔，在双氧水溶液中涂抹，如有气泡出 现（O2），作为过氧化氢酶阳性，无泡为阴性。也可以将过氧 化氢液直接加入斜面上，观察气泡的产生。
三、需氧性测定 1、培养基：酪素水解物20g,葡萄糖 10g, ,NACL5g,HOCH2SO3Na1g,HSCH2COONa2g,琼脂15g,蒸馏水1L。调节PH7.2，分装试管，0.06Mpa，30min灭菌，培养基不摆斜面。 2、接种与观察：用一小环的肉汤菌液，穿刺接种到上述培养基中 （穿刺管底），一般与30 度培养3-7天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿穿刺线生长则为厌氧菌。四、酪素水解（用于检测不同种类的芽孢杆菌是否具有分解酪素的 特点） 1、培养基 （1）脱脂牛奶制备取新鲜牛奶，煮沸后去掉上层油脂，再经离心脱脂（3000r/min,10min）,除去上层油脂，即为脱脂牛奶。（2）牛奶平板的制备取50ml的脱脂牛奶放入一只三角瓶中，另外称1.5g琼脂置于含有50ml蒸馏水的另外3只三角瓶中，然后将两液分开灭菌，0.06Mpa-20min，带冷至45-50摄氏度时， 速将两液混匀倒平板，即为牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥。 2、接种与观察
枯草芽孢杆菌发酵培养基优化 作者姓名 专业 指导教师姓名 专业技术职务
目录 摘要 (1) ABSTRACT (2) 第一章绪论 (3) 1.1枯草芽孢杆菌简介 (3) 1.2枯草芽孢杆菌的应用 (3) 1.2.1枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用 (3) 1.2.2枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用 (3) 1.2.3枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用 (4) 1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药方面的应用 (4) 1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产中的应用 (4) 1.2.6枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材 料 (5) 1.2.7枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用 (5) 1.3 国内外的研究现状与发展趋势 (6) 1.4研究的思路、目的及意义 (7) 第二章材料与方法 (7) 2.1实验材料 (7) 2.1.1 菌株鉴定 (7) 2.1.2 培养基 (7)
2.1.3 主要设备 (8) 2.2 培养基的优化 (9) 2.2.1 培养方法 (9) 2.2.2实验流程 (9) 2.2.3实验方法 (10) 2.2.4正交试验 (11) 第三章结果和分析 (11) 3.1 鉴定结果如下 (11) 3.2 枯草芽孢杆菌最优化培养基正交实验结果 (16) 3.3 pH变化曲线（以G18为例） (19) 3.4 实验总结 (25) 致谢 (27)
摘要 枯草芽孢杆菌是主要的饲用益生菌菌株，本论文以两株枯草芽孢杆菌G18和G21培养的延滞期和倍增时间为评价指标，通过三角瓶摇床培养，进行了两因素三水平的正交试验，对发酵培养基主要组分进行了优化，豆粕处理的蛋白酶加量2u/g 豆粕、5u/g豆粕、10u/g豆粕和玉米浆添加量0.5%、1.0% 、1.5% 做两个因素三水平的正交实验，研究表明：G18最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.0%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量10u/g豆粕。G21的最佳培养基是：葡萄糖0.5%，淀粉3%，豆粕3%，玉米浆1.5%，破壁酵母0.5%，磷酸氢二钠0.2%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.01%，普通a淀粉酶2u/g淀粉，蛋白酶添加量5u/g豆粕。[关键词] 枯草芽孢杆菌培养基优化正交试验
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910196065.0 (22)申请日 2019.03.15 (71)申请人 河南科技大学 地址 471000 河南省洛阳市涧西区西苑路 48号 (72)发明人 吴影 田晶晶 古绍彬 孙建瑞 李长福 周艳林 周子吕 (74)专利代理机构 洛阳公信知识产权事务所 (普通合伙) 41120 代理人 时亚娟 (51)Int.Cl. C12N 1/38(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法 (57)摘要 本发明涉及一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形 成的方法，属于生物发酵技术领域，所述方法是 在凝结芽孢杆菌发酵培养的对数生长初期向培 养基中依次间隔流加葡萄糖溶液和碳酸钙，促进 芽孢的形成。与现有技术相比，所述方法碳源的 补充能够促进活菌数的增加，提高菌体密度，加 快芽孢的形成，而碳酸钙的添加能够有效地缩短 芽孢形成时间，提高芽孢数量的同时增加了芽孢 的耐受性。权利要求书1页 说明书6页CN 109880786 A 2019.06.14 C N 109880786 A
1.一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，其特征在于：在凝结芽孢杆菌发酵培养的对数生长初期向培养基中依次间隔流加碳源和碳酸钙。 2.如权利要求1所述的一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，其特征在于：所述碳源为葡萄糖。 3.如权利要求2所述的一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，其特征在于：包括以下步骤： 步骤一：将凝结芽孢杆菌原始菌种按照体积比为1:15 ~25的接种量接种于一级培养基 中进行活化培养，培养条件为：摇床转速200～220rpm、温度35～38℃、时间20～22h，培养结束得一级菌种；所述一级培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖 1.6～1.8%、蛋白胨 1.0～1.4%、酵母粉 0.6～1.0%、硫酸镁 0.4～0.6%，余量为水；pH 7.8～8.2； 步骤二、将步骤一所得一级菌种按照体积比为1:30的接种量接种于二级培养基中进行发酵培养，培养条件为：摇床转速200～240rpm、温度35～38℃，时间为40-50h；当培养至第8～10h时一次性补入葡萄糖溶液，所述葡萄糖溶液的补入量为二级培养基总体积的1.2～1.6%，所述葡萄糖溶液的浓度为1.0g/mL；继续培养发酵至第14～18h时一次性补入终浓度为40～80g/L的碳酸钙固体； 所述二级培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖 1.2～1.6%、蛋白胨 1.2～1.6%、酵母粉 0.8～1.2%、硫酸镁 0.4～0.6%，余量为水；pH 7.8～8.2。 4.如权利要求3所述的一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，其特征在于：将经步骤一活化的一级菌种接种于二级培养基中经至少一次扩大培养后再进行步骤二所述发酵培养；所述扩大培养的培养条件为：接种量体积比为1:30、摇床转速200～240rpm、温度35～38℃、时间16～20h。 权 利 要 求 书1/1页 2 CN 109880786 A
枯草芽孢杆菌表达载体 产品信息和说明 2005年11月
目录 1.简介 (3) 2. pHT 载体 (3) 2.1. pHT01载体图谱 (4) 2.2. pHT43载体图谱 (5) 2.3. pHT01衍生物中标签的定位 (5) 3. 实验方案 (6) 4. 参考文献 (6) 5. 订单信息，运输和存储 (6) 本载体系统由德国拜罗伊特大学遗传研究所的沃尔夫冈·舒曼实验室 开发。 仅用于科研！ 本手册由wy135033405翻译百度文库首发任何意见请PM
枯草芽孢杆菌表达载体 通过质粒在枯草芽孢杆菌中高效表达胞内/胞外重组蛋白 1.简介 革兰氏阳性菌因其在农业，医疗和食品生物技术和重组蛋白生产等方面的贡献而广为人知。在所有革兰氏阳性菌中，枯草芽孢杆菌载体因下列原因尤为引人瞩目。（一）无致病性，且一般认为安全的有机体；（二）无明显的密码子偏好性；（三）可直接将功能性胞外蛋白分泌到培养基中（目前，大约60％的市售酶由芽孢杆菌生产）；（四）具备包含转录，翻译，蛋白质折叠、分泌机制，遗传操作和大规模发酵的大信息量机体。 但是下述两个障碍减少了枯草芽孢杆菌的使用：（一）产生一定数目的识别并降解外源蛋白的胞外蛋白酶；（二）载体质粒稳定性。第一个障碍已因蛋白酶缺失株的构建而基本解决。第二个因引入使用θ-复制模式质粒被完全克服，如由天然质粒pAMβ1和pBS72衍生的一些质粒（Jannière等，1990；Titok等，2003）。 最近，基于大肠杆菌 - 枯草杆菌穿梭质粒pMTLBS72的四种不同表达载体的构建和使用展示出全面的结构稳定性，业已出版（Nguyen等，2005）。 两个新的载体pHT01和pHT43允许在细胞质中高水平表达重组蛋白，其中pHT43载体引导重组蛋白到培养基。这两个载体基于强σA-依赖性启动子的枯草杆菌gro E操纵子通过添加lac操纵子改造成为一种高效可控的（IPTG诱导的）启动子。pHT01衍生载体可与8×His 标签（pHT08），链球菌标签（pHT9）或C - Myc的标签（pHT10）相结合。 2. pHT 载体 所有在枯草芽孢杆菌的gro ESL操纵子之前使强启动子与lac操纵子融合的载体都可通过加入IPTG进行诱导。尽管当未添加诱导物时表达组件的背景表达水平很低，还是成功从约1300种诱导因子中筛选出一种来使用bga B报道基因（Phan等，2005）。当分别将htp G 和pbp E基因融合到gro E启动子时，加入IPTG后，表达的重组蛋白可能分别占细胞总蛋白的10%和13%（Phan等，2005）。热纤梭菌的amyQα-淀粉酶和纤维素酶A、B的高水平表达实验证实。该载体还插入了一个高效SD序列以及一个多克隆位点（BamH I, Xba I, Aat II, Sma I）。编码α-淀粉酶的amyQ基因的信号肽编码区域与pHT01的SD序列融合，构成了pHT43，以此获得分泌的重组蛋白。
毕业设计(论文)课题名称枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究 2014 年5 月15 日
目录 摘要 (2) Abstract (3) 1 前言 (4) 2 材料与方法 (7) 2.1 实验试剂与材料 (7) 2.2 主要仪器与设备 (7) 2.3 试验方法 (8) 3 结果与分析 (8) 3.1枯草芽孢杆菌的标准曲 (9) 3.2单因素试验结果 (10) 3.3 正交试验结果分析 ···································错误！未定义书签。 4 结论和讨论 (15) 5参考文献 (16) 6致谢 (17)
枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究 摘要 本文通过单因素实验和正交试验研究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的发酵条件（PH、温度、时间、接种量）对枯草芽孢杆菌生长量的影响。本实验的枯草芽孢杆菌在BPG液体培养基上培养，通过单因实验及正交试验得到最佳的发酵培养条件为：初始pH 7.0；温度35℃；时间20h；接种量为5%。在此培养条件下的活菌液量为 3.785×107CFU/ml，相比在LB培养基下培养时的活菌液量3.2×106CFU/ml提高了10倍左右。 关键字：枯草芽孢杆菌；正交试验；生长量
Optimization study of bacillus subtilis culture conditions Abstract In this paper, we study Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) fermentation conditions (PH, temperature, time, quantity of) the impact on the growth of Bacillus subtilis. The experiment of bacillus subtilis in combined cultivated in liquid medium, is obtained by single for experiment and the orthogonal experiment the best fermentation culture conditions as follows: the initial PH 7.0. Temperature 35 ℃; Time 20 h; Inoculation quantity was 5%. Under the condition of the cultivation of the best amount of bacterium fluid is 3.785 x 107 cfu/ml, compared to when cultured in LB medium under the microbial quantity: 3.231 x 107 cfu/ml by about 10 times. Key words: Bacillus subtilis; Culture conditions; increment
2010No．5Serial No．218 China Brewing FPA 分别达到7105.92U/g 和1463.97U/g 。参考文献： [1]李亚澜，张建强.纤维素高效降解菌的分离鉴定及固态发酵条件的研究[D].西南交通大学硕士论文，2005. [2]姜绪林，张星元.绿色木霉固态发酵产纤维素酶的研究[D].江南大学硕士论文， 2005.[3]马旭光，张宗舟，刘星斌.航天诱变黑曲霉菌株ZM-8产纤维素酶的固态发酵条件研究[J].中国酿造，2008（23）：37-40. [4]邬敏辰， 李江华.里氏木霉固体发酵生产纤维素的研究[J].江苏食品与发酵，1998（2）：2-6. [5]GHOSE T K.Measurement of cellulose activities[J].Pure and Apply Chem,1987,58(2):257-268. [6]范艳丽，邵林广.纤维素降解菌的筛选及特性研究[D].武汉科技大学硕士论文，2004. [7]王艳昆，张建强.纤维素高效降解混合菌的筛选及其糖化发酵条件研究[D].西南交通大学硕士论文，2007. 乳酸菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌的通称[1]。普通乳酸菌（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌等）不易存活，不能耐受强酸、强碱和高温，不是理想的微生物制剂。于是，寻找一种抗逆性强的乳酸菌便成了研究的重点。其中最突出的是凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans ），1989年美国FDA 公布的41种可用于饲料的安 全菌株及1992年再次批准42种中包括的5种芽孢杆菌中，凝结芽孢杆菌排在第一位，其是一种可以产生乳酸的芽孢杆菌，兼具芽孢杆菌和乳酸菌的优点，且抗逆性强，能调节动物肠道微生态平衡，促进动物消化和提高动物免疫力等，现已应用于饲料工业中[2-3]。由于最终制成的菌剂要有芽孢的形式才具有高抗性，芽孢没有新陈代谢，能耐热、紫外线、多种溶剂、酸、碱等，是较为理想的微生物制剂[4]。试验主要通过摇瓶液体发酵，优化培养基及培养条件来提高凝结芽孢杆菌菌液中芽孢数，为后期的加工制成高效的凝结芽孢杆菌制剂打下良好的基础。 1材料与检验方法1.1试验材料 菌种：凝结芽孢杆菌F5（华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保存）。 培养基：YPD 培养基：葡萄糖20g ，胰蛋白胨20g ，酵母粉10g ，水1000mL ；调pH 值为7.0，115℃灭菌20min 。为菌种活化时用。1.2方法1.2.1菌种活化 将保存的凝结芽孢杆菌转接到YPD 试管斜面培养基中，40℃培养24h ，备用。1.2.2活菌计数法 活菌总数测定采用稀释平板计数法[5]，芽孢计数法是把菌液80℃水浴10min 后稀释平板计数。1.2.3种子液的制备 取1环活化的菌种，接入装有50mL YPD 液体培养基 一株凝结芽孢杆菌产芽孢条件的研究 杨立华，赵述淼，冷一非，梁运祥* （华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070） 摘要：通过培养基组成正交试验及培养条件单因素试验，对一株凝结芽孢杆菌的产芽孢条件进行了优化，优化后的培养基组成 （质量分数）为酵母粉3g/L ，蛋白胨5g/L ，牛肉膏2g/L ，MnSO 40.005g/L ，NaCl 2g/L ，K 2HPO 43g/L ，MgSO 40.02g/L 。最优的培养条件为温度40℃，初始pH 值为7.0，转速210r/min ，装液量为250mL 的三角瓶装30mL ，接种量为6%（v/v ），发酵时间为48h 。最终的芽孢数为 9.1×108 cfu/mL 。关键词：凝结芽孢杆菌；芽孢形成；培养条件；优化中图分类号：Q93-335 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2010）05-0096-03 Spore-forming conditions of Bacillus coagulans YANG Lihua,ZHAO Shumiao,LENG Yifei,LIANG Yunxiang* (State Key Laboratory of Agromicrobiology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China) Abstract:The optimal conditions of spore-forming by Bacillus coagulan were investigated using the single factor and orthogonal tests in this paper.The optimal medium were as follows :yeast extract 3g/L,peptone 5g/L,beef extract 2g/L,MnSO 40.005g/L,NaCl 2g/L,K 2HPO 43g/L and MgSO 40.02g/L.The optimal culture conditions were obtained by single-factor test as follows:temperature 40℃,initial pH 7.0,rotation speed 210r/mim,volume of shaking flask 30ml/250ml,and fementation time 48h.Under these conditions,the number of spore reached 9.1×108cfu/ml.Key words ：Bacillus coagulans ;sporulation;culture conditions;optimization 收稿日期：2009-12-26 作者简介：杨立华（1985-）,女，湖北黄冈人，硕士研究生，研究方向为发酵工程；梁运祥*，教授，通讯作者。 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Research Report 96··
枯草芽孢杆菌常用培养基配方： 1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂 枯草芽孢杆菌原生质体的制备 1 培养枯草芽孢杆菌 取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。 2. 收集细胞 各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜。 3. 总菌数测定 各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。 4. 脱壁 二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。 5. 剩余菌数测定 取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。 计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。
目录 第一章芽孢杆菌的简要介绍 (1) 第一节芽孢杆菌种类 (1) 第二节芽孢杆菌表达系统发展简史 (2) 第二章枯草芽孢杆菌的转化系统 (3) 第一种方法：电转化 (3) 第二种方法：Spizizen转化 (3) 第三种方法：原生质体法(Takashi) (4) 第四种方法：原生质体转化之二 (4) 第五种转化方法：质粒混合法（BGSC推荐） (5) 第三章芽孢杆菌表达系统发展简史 (6) 第一节芽孢杆菌表达系统的优点（相对于大肠杆菌） (7) 第二节芽孢杆菌的缺点 (7) 第三节助表达系统 (7) 第四节芽孢杆菌基因表达的主要特点 (7) 第四章枯草芽孢杆菌转录翻译系统 (8) 第一节：转录系统 (9) 第二节：翻译系统 (9) 第五章芽孢杆菌常用的宿主和载体 (10) 第六章芽孢杆菌表达系统应用实例 (11) 1 中国 (11) 2 日本 (12) 3 加拿大 (12) 第七章芽孢杆菌其他产品 (13) 第一节核苷类产品 (13) 第二节核黄素 (13) 第三节微生物制剂/益生菌 (13) 第八章结语 (14) 附录一. 芽孢杆菌的相关经典文章 (14) 附录二. 枯草芽孢杆菌相关数据库 (15) 致谢及参考文献 (15)
第一章芽孢杆菌的简要介绍 芽孢杆菌作为一个属，于1872年被首次提出，至今已有一百多年。目前人们对芽孢杆菌的研究几乎涉及到了革兰氏阳性可生孢细菌的各个领域。尤其是在感受态、芽孢形成及其调控、遗传操作、菌种改良、生物技术等领域进行了大量的工作。芽孢杆菌是一个泛泛的概念，而科学研究中应用最多的当属枯草芽孢杆菌，例如168菌株及其大量的衍生菌株。枯草杆菌的研究之所以领先于其他芽孢杆菌的种，主要是由于他的转化、转导方法较完善，以及大量的衍生菌株。 目前应用最多的芽孢杆菌属菌种有枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和耐碱的芽孢杆菌以及病原菌炭疽芽孢杆菌等12种。 第一节芽孢杆菌种类 目前，芽孢杆菌属很多菌株的全基因组序列已经报道，截至2011年10月，在KEGG 上公布全基因组序列的芽孢杆菌属菌种有： 简称菌种名称测序时间测序链接 bsu Bacillus subtilis1997RefSeq bss Bacillus subtilis subsp. spizizenii W232010RefSeq bst Bacillus subtilis subsp. spizizenii TU-B-102011 RefSeq bsn Bacillus subtilis BSn52011RefSeq bha Bacillus halodurans2000RefSeq ban Bacillus anthracis Ames2003RefSeq bar Bacillus anthracis Ames 05812004RefSeq bat Bacillus anthracis Sterne2004 RefSeq bah Bacillus anthracis CDC 6842009 RefSeq bai Bacillus anthracis A02482009 RefSeq bal Bacillus cereus biovar anthracis CI2010RefSeq bce Bacillus cereus ATCC 145792003RefSeq bca Bacillus cereus ATCC 109872004RefSeq bcz Bacillus cereus ZK2004RefSeq bcr Bacillus cereus AH1872008 RefSeq bcb Bacillus cereus B42642008 RefSeq bcu Bacillus cereus AH8202009 RefSeq bcg Bacillus cereus G9******* RefSeq bcq Bacillus cereus Q12009RefSeq
枯草芽孢杆菌在肥料中的应用 一、枯草杆菌概述： 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多 种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机 制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。 二、枯草芽孢杆菌的作用机理： 枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料。当作用于作物或土壤时．能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料 效应。目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化 和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用。保护环境。以及提高农作物产 品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用。 三、枯草芽孢杆菌的使用说明： 特点：1.肠道定殖能力强。 2.耐氧化、耐高温、耐酸碱、耐挤压和耐温度变化，满足不同的饲料生产需求。 3.绿色、安全、高效、较少抗生素药物的使用。 贮藏：阴凉、干燥处密封保存。 三、枯草芽孢杆菌的应用范围： 枯草芽孢杆菌不仅在肥料中应用比较广泛，在污水处理及生物肥发酵或发酵床制作中应用也相当广泛，是一 种多功能的微生物。 1、市政和工业污水处理，工业循环水处理，腐化槽、化粪池等处理，畜牧养殖动物废料、臭味处理，粪便处理系统，垃圾、粪坑、粪池等处理； 2、畜牧、家禽、特种动物及宠物养殖，水产养殖； 3、可以与多种菌种混配，在农业生产中具有重要作用。
微生物技术综合实验 年级：13级生物工程（专升本）班级：2013011201 学号：1301014026 姓名：徐红贞 指导老师：刘凤霞教授 日期：二零一三十月五号
目录 1实验目的及原理 (1) 1.1实验目的 (1) 1.2实验原理 (1) 2实验材料 (1) 2.1实验仪器 (1) 2.2实验试剂 (1) 2.3培养基 (2) 2.3.1 生长培养基 (2) 2.3.2鉴定培养基 (2) 2.3.3摇瓶培养基 (2) 3试验方法 (2) 3.1仪器的准备 (2) 3.2培养基的配置 (2) 3.3初步筛选及鉴定 (2) 3.3.1采集土样 (3) 3.3.2富集培养 (3) 3.3.3稀释分离、纯化 (3) 3.3.4初筛 (3)
3.4复筛及鉴定 (4) 3.4.1革兰染色 (4) 3.5酶活力的测定 (4) 3.5.1摇瓶培养 (4) 3.5.2酶液稀释 (4) 3.5.3酶液测定 (4) 4结果分析 (5) 4.1平板涂布分离 (5) 4.2平板划线分离 (5) 4.3初筛 (5) 4.4复筛 (5) 4.5摇瓶培养 (6) 4.6酶活力测定 (6) 5参考资料 (7) 6附录 (8)
枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定 1.实验目的及原理 1.1实验目的 （1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。 （2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。 （3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。 （4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。 （5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 1.2实验原理 选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。 2. 实验材料 2.1实验仪器 无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平三角瓶烧杯试管酒精灯擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅
生物工程 Vol.32,No.10, 2011 凝结芽孢杆菌CICIM B1821发酵生产L-乳酸的研究 田康明，石贵阳，王正祥* （江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江南大学生物资源与生物能源研究中心， 江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，江苏无锡214122） 摘 要：凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans ）CICIM B1821是一株实验室前期筛选获得的产L-乳酸的嗜热菌。该菌株在 34~55℃范围内均表现出良好的生长特性和产酸特性，50℃时获得最高的比生长速率和最大的乳酸积累量。CICIM B1821能够在pH 为5.0~7.5的范围内保持高的菌体活性。氧气的存在有利于CICIM B1821的快速生长，但会导致副产物的积累，而在不通氧的条件下该菌株也生长良好，同时产酸速率可高达5.63g/L ·h 。控制残糖浓度不高于10%的发酵条件下，发酵48h ，可积累乳酸107.5g/L ，副产物总和仅为1.05g/L ，葡萄糖对乳酸的得率为97.5%，所产L-乳酸光学纯度高于99%。此外，高浓度葡萄糖发酵实验显示，该菌株可在高渗透压下利用20%葡萄糖发酵生产L-乳酸，发酵100h ，可积累乳酸134g/L ，副产物总和仅为1.12g/L ，葡萄糖对乳酸的得率为92.0%。 关键词：凝结芽孢杆菌，嗜热菌，L-乳酸，发酵生产 Study on the production of L-lactate by Bacillus coagulans CICIM B1821 TIAN Kang-ming ，SHI Gui-yang ，WANG Zheng-xiang * （Culture and Information Center of Industrial Microorganisms of China Universities ，Center for Bioresource and Bioenergy ， Jiangnan University ，Wuxi 214122,China ）Abstract ：Bacillus coagulans CICIM B1821was selected for L-lactate production.Its optimal growth temperature and fermentation temperature were proved both at 50℃，and Bacillus coagulans CICIM B1821presents good growth and fermentation characteristics at temperature range from 34℃to 55℃.Bacillus coagulans CICIM B1821presented good growth and fermentation characteristics at pH range from 5.0to 7.5.The existence of oxygen was proved increasing both the biomass yield and the by-product concentration.The L-lactic acid purity was above 99%，the yield from glucose to lactate was 97.5%，and the total by-product amount was lower than 1.05g/liter ，while the lactic acid concentration was 107.5g/liter during the no oxygen flowing fermentation process with glucose concentration no more the 10%.While fermentation 20%glucose to lactate ，and the total by-product amount was lower than 1.12g/liter ，while the lactic acid concentration was 134g/liter ，and the yield from glucose to lactae was 92%. Key words ：Bacillus coagulans ；thermophile ；L-lactate ；fermentation 中图分类号：TS201.3文献标识码：A 文章编号：1002-0306（2011）10-0245-05收稿日期：2010－10－28 *通讯联系人 作者简介：田康明（1985-），男，在读博士研究生，研究方向：发酵工学。基金项目：中非国际合作重点项目（2009DFA31300）。 近年来，生物可降解聚合材料正在遍布日常生活和工业生产的方方面面。与石油来源的聚合材料相比，可降解、可再生的性能使得生物质的聚合材料需求量不断增加。而聚乳酸正是应用最广泛的生物质可降解聚合材料之一[1]。目前，90%的聚乳酸均由生物法发酵生产的乳酸加工聚合而成[2]。因此，建立高效的乳酸发酵生产工艺显得尤为重要。乳酸由L-乳酸和D-乳酸两种构型的单体组成。由于其构型不 同，两种单体及其聚合材料的应用领域也有所差异。因此，工业生产中对乳酸的构型提出了越来越高的要求，特别是在食品和医药及相关领域，高光学纯度L-乳酸的应用更为广泛。传统的L-乳酸生产菌种为米根霉，但所产L-乳酸光学纯度不高，发酵温度较低，发酵工艺不易操作等不足限制了传统方法生产L-乳酸的发展[3]。嗜热菌用于L-乳酸的发酵生产则弥补了上述不足。凝结芽孢杆菌就是典型的代表。该菌种对营养成分要求不高，可以节约发酵成本；代谢快，可以缩短发酵周期；耐受温度高，可以减少发酵过程中对冷却水的消耗，同时也减少了染菌的可能。众多研究中已经实现了不灭菌的情况下直接发酵生 DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2011.10.038
芽孢杆菌分离纯化及保种 一、实验目的：从海参池底泥中分离提纯芽孢杆菌并对其进行鉴定保种 二、实验材料：底泥样品，刺激芽抱生长培养基，芽抱菌分离培养基，琼脂培养基，斜面培养基，生理盐水等其他常见微生物实验常用器材 培养基配方： 1.刺激芽抱生长培养基：蛋白胨l0g，酵母膏3g，淀粉3g,MgS040.lg,KHZP04 1.5g,Na2HP042g，水1000mL，琼脂15g，pH7.8 2.芽抱菌分离培养基：蛋白胨3g,葡萄糖5g，酵母膏5g,KZHP044g, 3.08%MnS04 1mL，琼脂18g，水1000mL,pH自然(加热煮好后加3.08%MnS04) 3.琼脂培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g,NaCl5g，18g的琼脂，水1000mI,pH 7.2^-7.4 4.斜面培养基即琼脂培养基 三、实验步骤： 1、配制刺激芽孢杆菌生长的培养基、芽抱菌分离培养基、琼脂培养基、生理盐水 2、对各种实验所需仪器进行灭菌 3、将底泥样品1g放入9ml生理盐水中，震荡，充分混匀分散样品，最后取上清液1ml涂布于刺激芽孢杆菌生长的培养基（液体）上，30℃培养24h 4、将培养好的菌悬液置于80℃水浴锅中加热10---20min，杀死不能形成芽抱的其它菌体，平板涂布法接种于芽抱菌分离培养基，30℃培养24--48h，挑取疑似菌落，30℃培养24h后观察并记录 5、将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 四、实验结果： 芽孢杆菌菌落形态特征:菌落为圆形，直径多在3-10mm之间，淡黄色，中间颜色较深，表面平整不光滑，无光泽，边缘不整齐 配制刺激芽孢杆菌生长的培养基：芽抱菌分离培养基：
土壤中枯草芽孢杆菌的分离和筛选 2013023123刘倩倩 一、实验目的 1. 掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。 2. 了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。 二、实验原理 枯草芽抱杆菌属革兰氏阳性菌，芽抱0.6?0.9 X 1.0?1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。有的菌株是a -淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。广泛分布在土壤及腐败的有机物中。选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80 度的水浴处理样品1 小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。 利用稀释涂布法，在淀粉的培养基培养，培养1-3 天后，观察。然后，进行初筛与纯化，利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽抱杆菌。再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。 三、实验材料 （1）选择培养基 本次实验进行产淀粉酶的枯草芽抱杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。 配方：牛肉膏5.0g 蛋白胨10.0g 氯化钠5.0g 可溶性淀粉10.0g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 调整pH 至7.2 配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。 2）溶液或试剂
牛肉膏1.25g 蛋白胨2.5g 氯化钠1.25g 可溶性淀粉2.5g 琼脂5g 碘11 克，碘原液2 毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2 克，磷酸氢二钠45.23 克，柠檬酸8.068 克，氯化钴25 克，重铬酸钾3.34 克，100 毫升0.01NHCL。（3）仪器或其他用品 平板培养皿10 个、试管15 支、三角瓶2 个、烧杯3 个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。 四、实验步骤 倒平板f制备梯度稀释液f涂布f培养f初筛f复筛f纯化f保存 （1）实验前准备 制备淀粉培养基，无菌水，在121摄氏度下灭菌20min。倒平板。把接种工具，培养基，和其他用品全部在超净工作台上摆好，进行紫外线灭菌30min。 （2）制备土壤稀释液 取土样时最好选取如花坛等地方的土样，选好采样地点，产去表层5cm去 5-15cm处。用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。振摇约二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散。放入盛有99ml 无菌水三角瓶中，常压80 度的水浴处理样品1 小时后，取出。 用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10-2 、10-3、10-4、10-5 不同稀释度的土壤溶液。 （3）涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5 三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-3 、10-4、10-5 三管土壤稀释液中各吸取0.2ml ，小