caspase家族蛋白酶的结构与功能
按照结构同源性的大小，可以将caspase蛋白酶分为三个组，分别以caspase-1、caspase-2和caspase-3为代表。其中最重要的是caspase-1、caspase-3 和caspase-8。
(一)caspase-1(ICE)
1. ICE的结构与生物学作用
ICE即IL-1b 转化酶(IL-1b converting enzyme)，是单核细胞合成的一种蛋白酶，可以将34kD的IL-1b 前体(pro-IL-1b )剪切为17kD的成熟IL-1b ，这种剪切对于IL-1b 活性的发挥是必须的。不表达ICE的细胞系转化IL-1b 基因后可以产生pro-IL-1b ，但不能分泌有活性的成熟IL-1b ；ICE特异性抑制剂可以阻断金黄色葡萄球菌刺激引起的IL-1b 的分泌。ICE 属于半胱氨酸蛋白酶，活性中心有高活性的巯基，对氧化剂很敏感，但对丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶的抑制剂不敏感。
(1)ICE活化时的剪切过程：ICE基因定位于11q13-23，编码的ICE前体(pro-ICE)全长404aa，约45kD，蛋白酶活性中心是位于283~287位置的Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列，其中Cys285是发挥酶切活性的关键残基。在活化过程中pro-ICE在4个位点Asp103~Ser104、Asp119~Asn120、Asp297~Ser298和Asp316~Ala317进行自我催化剪切形成两个片段P20和P10，P20和P10首先形成异源二聚体，然后两个P20/P10异源二聚体再通过P10小亚基多聚化形成同源二聚体，所以ICE的活性形式是(P20/P10)2。pro-ICE活化过程中的剪切并不是在四个酶切位点同时进行的，最先被剪切的是第三个位点(Asp297~Ser298)，形成P35和P12两个片段，P35的酶切活性比pro-ICE要高，它既可以进一步在第三个酶切位点剪切其它pro-ICE，还可以剪切其它三个酶切位点，形成P20和P10两个片段，再由P20和P10形成四聚体。四聚体形式的ICE酶切活性非常强，实验证明即使在单核细胞大量分泌IL-1b 时，细胞浆中活性形式的ICE也仅占很小的比例。从pro-ICE 上剪切下来的原结构域可以抑制ICE的进一步剪切，这可能是一种反馈机制。
(2)ICE识别的剪切位点和特异性抑制剂：ICE识别的剪切位点是一个四肽序列，除了在P1位置的Asp外，还要求在P4位置的氨基酸残基具有一个较大的疏水性集团，P2和P3位置上的氨基酸的变异则较大，P1’位置上一般是一个较小的疏水性氨基酸。根据这一研究结果，人们合成了ICE的人工特异性四肽底物YV AD，醛化的YV AD(Ac-YV AD-CHO)是ICE 的特异可逆抑制剂，醯酮化YV AD(Ac-YV AD-CMK)是特异性不可逆抑制剂。YV AD抑制剂可以抑制单核细胞中成熟IL-1b 的释放，而对其它细胞因子的释放没有作用，在体的实验也有同样的结果，说明这些特异性抑制可能具有一定的临床实用前景。
牛痘病毒产生的一种38kD的蛋白质CrmA(cytokine response modifier A)与丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)很相似，但它并不抑制丝氨酸蛋白酶的活性，反而抑制ICE的活性。研究发现这是因为CrmA的氨基酸序列中有LV AD四肽结构，与ICE的特异性抑制剂YV AD很相似，可以作为假底物结合ICE，阻断ICE对pro-IL-1b 的剪切，从而降低IL-1b 的分泌。所以CrmA在病毒感染时可以干扰宿主的炎症反应，促进病毒在体内的复制。
(3)ICE的空间构型：利用不可逆的抑制剂Ac-YV AD-CMK，Walker等于1994年获得了活性ICE的X线结晶图像。分析发现，ICE是首先由P20/P10构成一个完整的结构域，然后两个相同的结构域再通过P10结合成一个蛋白酶。在P20/P10异源二聚体中，中心位置是
由6个b 折叠股组成，其中4个来自于P20呈平行排列，另两个来自P10，其中一个与P20的4个折叠股平行排列，另一个则呈反平行排列。b 折叠股形成的核心周围是由分别来自P20和P10的a 螺旋所包围。两个P20/P10异源二聚体以反平行方式通过P10结合在一起，在外表形成一个可以容纳底物P1Asp侧链羧基基团的“口袋”。这个“口袋”由P20的Arg179、Gln283和P10的Arg341、Ser347组成，Gly238和His237也参与这种构型的维持，活性中心的Cys285通过氢键与底物结合。对ICE/CED-3家族其它成员的研究发现，在ICE中形成活性中心的氨基酸序列和形成容纳底物的“口袋”的四个氨基酸都很保守，提示它们可能具有相似的空间结构。
2. ICE在细胞凋亡中的作用
Y uan等于1993年将CED-3基因克隆出来，发现它所编码的蛋白质的与人ICE很相似，在一级结构上有28%的同源性。CED-3包含503个氨基酸残基，有100aa富含丝氨酸，与ICE的同源性主要表现在非富含丝氨酸的区域，尤其是羧基端的115aa，与ICE同源性高达43%，其中也包含活性中心QACRG(361~365)。CED-3可能象ICE一样，也是一种半胱氨酸蛋白酶，通过剪切底物蛋白来参与细胞凋亡。ICE是人体中CED-3的同源物，可以发挥与CED-3相似的作用，参与人体细胞的凋亡过程。用A TP或过量内素毒素刺激单核细胞，可以通过活化ICE增加IL-1b 的分泌，这些刺激同时也可以促进细胞凋亡。将ICE cDNA转染入大鼠成纤维细胞系中过量表达ICE可以引起细胞凋亡，这种凋亡可以被牛痘病毒蛋白CrmA或细胞凋亡拮抗蛋白BCL-2所抑制；如果在转染前将ICE基因中编码酶切活性中心的氨基酸残基(Cys285、Gly287)突变，则不能诱导细胞发生凋亡；将CrmA导入鸡背根神经节细胞可以阻断撤除神经生长因子而引起的神经元细胞的凋亡过程。
但是有些研究与上述结果不相吻合：稳定高表达IL-1b 的细胞系并不自动发生凋亡；ICE 基因剔除的小鼠虽然不能分泌成熟IL-b ，但其发育并不受影响，也不发生自身免疫性疾病，这些小鼠的胸腺细胞和巨噬细胞在受到特定信号刺激后仍能发生凋亡；在具有ICE活性的细胞中用YV AD抑制ICE活性后，细胞凋亡过程也不受影响；凋亡的鸡细胞DU249的细胞提取液不具有剪切pro-IL-1b 的能力，但凋亡的DU249细胞提取液的另一种成分prICE(proteolytic resembling ICE)则可以将不能作为ICE底物的PARP剪切成典型的凋亡片段。这些结果说明ICE本身可能不是人体细胞凋亡的真正效应剂，至少不是最主要的因素，在人体中可能有其它更重要的ICE样的蛋白酶参与细胞凋亡过程。
(二)caspase-3
1994年Fernandez-Alnemri等在BenBank表达序列标记(expression sequence tag, EST)数据库中找到一段ICE/CED-3活性中心同源的序列，用它合成探针后，筛选人Jurkat T淋巴细胞cDNA文库，从中克隆到一种新基因，因其编码分子量为32kD的半胱氨酸蛋白酶而称之为CPP32(cysteine protease protein, 32kD)。随后，其它学者独立地将这一蛋白基因克隆出来，并分别命名为prICE、apopain(凋亡素)和Y ama(印度传说中的死亡之神)。1996年这种蛋白酶被命名为caspase-3。现在一般认为caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。
1. caspase-3的结构
pro-caspase-3含有277个氨基酸残基，分子量约32kD，与ICE有30%同源性，与CED-3有35%同源，是caspase家族中与CED-3同源性最高的，不论从结构同源性还是从底物特异性来看都与CED-3很相似，所以有人认为它是CED-3在哺乳动物中的同源蛋白。caspase-3的原结构域明显短于ICE只有28个氨基酸残基，但蛋白酶活性中心和与结合底物有关的保守的氨基酸均与ICE一致。pro-caspase-3在活化过程中从Asp28~Ser29和Asp175~Ser176两处被剪切，形成P17(29~175)和P10(182~277)两个片段，相当于ICE的P20和P10，两种亚基再组成活性形式的caspase-3。pro-caspase-3本身并没有催化活性，在活化时首先由颗粒酶B(GrzB)或caspase-10在D175剪切下小片段后它才被部分活化，随后则可进行下一步的自我催化。在剪切原结构域时可能还有其它caspase如ICE的参与。
2. caspase-3的活化和参与细胞凋亡
caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用，caspase-3基因转染昆虫Sf9细胞后引起细胞凋亡，这个过程可以被BCL-2阻断；在发生凋亡的细胞提取液中去除caspase-3后，这些提取液就失去了诱导细胞凋亡的能力；再加入纯化的caspase-3它就又恢复了致凋亡的功能。
caspase-3可以被多种因素活化，在CTL细胞的杀伤作用中，它既可被Fas/FasL途径活化，也可以通过颗粒酶B途径活化。颗粒酶B是CTL细胞颗粒中的一种丝氨酸酯酶，是哺乳动物中caspase蛋白酶外唯一的在Asp后剪切的蛋白酶，它可以特异性剪切ICE家族蛋白酶催化亚单位C端的IxxD序列，并活化caspase 2、3、6、7、8、9、10。ICE也可以被颗粒酶剪切，但剪切后并不被活化。
3. caspase-3引起细胞凋亡的机制
caspase-3最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)，该酶与DNA修复、基因完整性监护有关。在细胞凋亡启动时，116kD的PARP在Asp216-Gly217之间被caspase-3剪切成31kD和85kD两个片段，使PARP中与DNA结合的两个锌指结构与羧基端的催化区域分离，不能发挥正常功能。结果使受PARP负调控影响的Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶的活性增高，裂解核小体间的DNA，引起细胞凋亡。这种裂解过程可被caspase-3的特异性抑制剂Ac-DEVD-CHO所抑制，但不能被CrmA抑制。caspase 3还可以剪切U1-70K、DNA-PK、PKCd 和PKCq 。PKCd 和PKCq 都属于新型PKC(novel PKC, nPKC)，当被caspase 3剪切后，可以切除调节区域，而成为活性形式的PKC，另外实验还证明，过量表达PKCd 和PKCq 均可以引起细胞凋亡，说明它们都参与了细胞凋亡的诱导。
(三)caspase-8
在caspase-8发现之前，人们虽然知道多种细胞膜外的因素可以引起细胞凋亡，而且知道caspase家族蛋白是这种细胞凋亡过程中的效应物质，但对凋亡信号如何由细胞膜外转递到细胞浆，并如何引起caspase蛋白酶活化的过程却知之甚少。含有死亡结构域的胞浆信号
蛋白的发现，证明死亡信号是通过这些蛋白质向胞浆内部传递，并最终引起caspase蛋白酶的活化的。
1995年Enari等证明CrmA可以阻断Fas与TNFRI引起的细胞凋亡，并且发现在Fas 和TNFRI活化时有caspase-3和caspase-7的活化，而CrmA在阻断细胞凋亡的同时也抑制了caspase-3和caspase-7的活化，这说明caspase-3、caspase-7等ICE家族蛋白酶参与了Fas 和TNFRI引起的细胞凋亡过程，并且提示CrmA可以通过抑制caspase-3、caspase-7的上游ICE样蛋白酶来阻断凋亡过程。之后Kischkel等发现Fas活化时可以与至少4种蛋白相连，分别称为CAP1(cytotoxicity-dependent APO-1-associated proteins 1)、CAP2、CAP3和CAP4，这4种蛋白与活化的Fas受体一起被称为死亡诱导信号复合物(death-inducing signaling complex, DISC)。随后的研究证实CAP1和CAP2是不同形式丝氨酸磷酸化的FADD蛋白，CAP3和CAP4则被证明是一种新蛋白的两种不同剪接形式，这个蛋白被命名为FLICE(FADD-like ICE)。同年，另两组研究者分别用酵母双杂交系统和根据蛋白的同源性也发现了这个蛋白，分别将其命名为MACH(MORT1-associated CED-3 homolog)和Mch5(mammalian Ced homolog 5)，这个蛋白质就是后来统一命名的caspase-8。
1. caspase-8的结构和分布
Caspase-8前体共有479aa，分子量为55kD，其显著的特点是在N端有2个70aa左右的结构域，与FADD的N端的死亡效应结构域(death effector domain, DED)同源，这种同源的结构域可以发生相互聚合，提供了caspase-8与FADD相互结合的一个部位。caspase-8的C端与ICE结构同源，它的活性中心与其它ICE家族蛋白酶活性中心有所不同，不是通常的QACRG，而是由QACQG五肽组成，但这样的结构不影响其蛋白酶活性的发挥。caspase-8一级结构中其它与结合底物有关的氨基酸残基都很保守。caspase-8分布于胎儿和成人的各种组织中，但在胎脑中没有分布。在外周血白细胞中水平较高，可能与白细胞的凋亡有关。
2. caspase-8的活化和参与细胞凋亡
caspase-8可以自我活化，也可以在颗粒酶B的剪切下活化。caspase 8特异性识别的序列是DEVD，活化的caspase-8不但可以剪切PARP，而且还参与其它ICE家族蛋白酶，如caspase-3和caspase-7的活化过程。用caspase-8基因转染MCF-7乳腺癌细胞系，可以引起细胞凋亡，出现典型的形态变化。caspase-8引起的细胞凋亡可以被广谱的ICE家族蛋白酶抑制z-V AD-fmk所阻断，也可以被CrmA阻断，提示它可能是CrmA的靶蛋白。
3. caspase-8参与细胞凋亡的机制
由于caspase-8具有FADD样DED结构域，并且能够通过DED结构域与FADD结合，所以caspase-8可以在凋亡过程中间接与细胞膜受体发生联系，从而将细胞膜事件转化为细胞浆事件。他们认为，在非活化情况下caspase-8的两个FADD样DED结构是互相结合在一起的。当细胞膜表面的Fas与其配体FasL或相应的单抗结合后，受体发生多聚化，引起FADD与受体胞浆区死亡结构域互相结合。这种结合使FADD的DED结构域发生变构，变构后的DED可以与胞浆中caspase-8的一个DED结构域结合，使caspase-8的两个DED结构域分开，同时使caspase-8的ICE同源区解放出来，恢复蛋白酶活性，通过自我催化生成活性形式的caspase-8蛋白酶，后者再作用于胞浆中其它ICE家族蛋白酶，使它们发生逐级
活化。
(四)其它caspase蛋白酶
1. caspase-2
Kumar等首先在小鼠胚脑中发现了一种称为Nedd-2(neuronally-expressed, developmentally downregulated)的蛋白酶，这种蛋白酶随着动物的成熟其表达水平逐步下降，在成年鼠脑中找不到Nedd-2的表达。Wang等利用鼠Nedd-2作为探针，筛选人胚脑cDNA 文库，获得两条与鼠Nedd-2高度同源的cDNA序列，并命名为ICH-1(ICE and CED-3 homolog 1)。由于不同剪接，ICH-1可以编码两个基因产物：ICH-1L长435aa，其中原结构域长123aa，301~305有以半胱氨酸为中心的活性位点QACRG，含有与ICE和CED-2相似的序列，分别有28%和27%同源性，高表达可引起哺乳动物细胞凋亡；另一种基因产物ICH-1S长312aa，高表达则能抑制细胞凋亡。ICH-1L促凋亡的作用可以被BCL-2所阻断，但不被CrmA所阻断。Northern Blot和反转录-PCR证实，caspase-2的表达与组织的发育阶段有关。ICH-1L和ICH-1S均表达于心脏、肾和脑，但ICH-1S在胚脑中表达最高，而ICH-1H在成年胸腺中表达最高。在细胞发生凋亡时，48kDa的caspase-2首先被一种caspase-3样蛋白酶在Asp316剪切成p33和p14，然后再缓慢地在Asp152和Asp330处剪切为p18和p12组成的活性蛋白酶，后一过程要在2~3h后才能完成。caspase-2可能参与CTL细胞的杀伤作用，但它并不能被颗粒酶B直接活化，必须被一种caspase-3样蛋白酶活化。
2. caspase-4
caspase-4是1995年Kamens等在松驰杂交(low stringency hybridization)的条件下用人ICE基因探针筛选人胸腺细胞cDNA文库，找到的一个与ICE和CED-3同源的基因，当时将它命名为ICH-2(ICE and CED-3 homolog 2)。同年另外两组科学家也分别独立地发现了这个基因，并分别命名为TX和ICErel-II。caspase-4基因定位于人染色体11q22.2-22.3，所编码的蛋白包含377aa，分子量约43kD，一级结构与ICE有53%的同源性，在切除104aa的原结构域后同源性更高达60%，所有与酶活性中心(QACRG)和与结合底物有关的氨基酸残基都得到了保留。caspase-4分布较广，除脑组织外在所有检测的组织中都有表达。虽然caspase 4与ICE高度同源，但它并不能催化pro-IL-1b 为成熟分子，但可以活化ICE前体及其自身的前体。caspase 4不能剪切DNA-PK，ICE敏感的抑制剂YV AD-CHO可以阻断caspase 4的活性，但其敏感性仅为ICE的1/20。caspase-4的活性形式也是由P20和P10两种亚基组成。将caspase-4基因转染Sf9昆虫细胞系可以引起典型的凋亡变化，提示caspase-4在细胞凋亡中起一定的作用。
3. caspase-5
caspase 5是Munday等发现caspase 4(ICErel-II)时同时发现的一种蛋白，当时命名为ICErel-III，另外一组研究者则命名为TY。caspase-5包含418aa，分子量47.7kD，与ICE有51%的同源性，并具有保守的活性中心QACRG。但caspase-5不能剪切pro-IL-1b ，在过量表达时可以诱导凋亡的发生。
caspase 6是通过搜索有保守的QACRG活性中心和GSWFI保守的抑制剂结合位点的方法用PCR的手段找到的，命名为Mch2，与caspase-3有38%同源性，可以在昆虫细胞中引起细胞凋亡。随后的研究证明，caspase 6可以剪切层蛋白B，而且其活性对Zn2+敏感，这是唯一一个可以剪切层蛋白的caspase。caspase识别的序列也是VEID。它不能剪切U1-70K 和DNA-PK，但可以部分剪切PARP，并可活化caspase 3。
5. caspase-7
caspase 7是通过PCR扩增caspase保守序列得到的，称为Mch3(mammalian Ced homolog 3)，另外也被称为ICE-LAP3(ICE like apoptotic protease 3)和CMH1(CPP32/Mch2 homolog 1)。caspase-7包含304aa，分子量35kD，caspase-7是与caspase-3同源性最高的成员，有58%的同源性，与其它caspase有35%的同源性。caspase-7与caspase-3的同源区主要在具有酶活性的亚单位区，它也保留了QACRG(184~188)五肽活性中心，与底物结合的氨基酸残基也都存在。caspase-7可以分别在Asp23~Ala24、Asp198~Ser199和Asp206~Ala207之间被剪切，形成P20/P12形式的caspase-7。caspase-7分布很广泛，在脑中也有少量存在。用抗caspase-7的单抗发现caspase-7在Jurkat细胞中主要分布于胞浆和近膜结构中，细胞核中未见分布。
用caspase-7基因转染乳腺癌细胞系发现全长蛋白不能引起细胞凋亡，但去除氨基端53aa (其中包括原结构域)的caspase-7则可以引起细胞凋亡。进一步研究证明去除原结构域的caspase-7具有自催化作用，可以自动催化成P10/P12形式。酶活性中心的半胱氨酸对caspase-7的这种作用十分重要，突变为Ala后就失去致凋亡作用。当Fas和TNF引起的细胞凋亡时细胞内caspase-7也被活化，CrmA可以阻断caspase-7引起的细胞凋亡。caspase 7不能剪切pro-IL-1b ，但它可以剪切PARP和固醇调节元件，caspase-7对PARP的剪切可以被DEVD-CHO所阻断，但不能被ICE敏感的YV AD-CHO所阻断。caspase- 7对DEVD-CHO 抑制剂的敏感性只有caspase-3的1/3，对CrmA则很不敏感。
6. caspase-9
通过搜索人类基因组数据库中与caspase-7同源的序列，Duan等找到一个命名为ICE-LAP6的基因序列，编码414aa，分子量46kD。序列分析表明它也属于ICE/CED-3家族，在相当于ICE活性部分的序列中，caspase-9与其它成员有30%左右的同源性，它的原结构域很长，与caspase-3相似。在caspase-9中与结合底物有关的6个氨基酸残基都得到了保留，但它的酶活性中心的五肽序列与其它ICE/CED-3蛋白酶的QACRT不同，是QACGG，这是继caspase-8的QACQG之后出现的另一种活性中心变异，这种变异也不影响蛋白酶的酶切活性。
caspase-8的分布很广泛，在许多胚胎和成人组织中都有分布。颗粒酶B可以活化caspase-8，活化后可以剪切PARP。乳腺癌细胞系MCF7转染caspase-8基因后出现凋亡，这种作用可以被z-V AD fmk所阻断。当活性中心的半胱氨酸被突变后，caspase-8失去促凋亡的作用。
Alnemri等于1996年通过在GenBank中寻找caspase-3的表达序列标记，从人Jurkat T 淋巴细胞cDNA文库中同时克隆出caspase-8和caspase-10，分别命名为Mch5和Mch4。caspase-10含有497aa，分子量55kD，与其它成员有30~50%的同源性。caspase-10分子结构的显著特点是其N端也有两个FADD氨基端样结构域，所以它也可能与caspase-8一样是将细胞膜事件转化为细胞浆事件的一个环节。caspase-10的酶活性中心也与caspase-8一样，是QACQG，而不是一般的QACRG五肽序列。caspase-10分布广泛，基因定位于2p12，基因转染昆虫细胞系Sf9中可以引起细胞凋亡，其活性可以被DEVD-CHO所抑制。
8. caspase-11
Y uan等于1996年从小鼠胸腺细胞cDNA文库中发现，命名为ICH-3。373aa，42kDa，与ICE有46%同源性，活性中心为QACRG，ICE中与催化活性有关的氨基酸残基得到了保留，包括His206、Gly207和Cys254，与P1结合有关的氨基酸残基也保守，包括Arg148、Gln252、Arg310和Ser316。caspase-11表达于许多组织，与ICE表达模式相似，并可以被LPS所诱导。在Rat-1细胞中过量表达caspase-11可以引起细胞凋亡，CrmA和BCL-2可以阻断这种凋亡。caspase-11可以被颗粒酶B剪切并活化。caspase-11虽不能剪切IL-1b 前体，但可以活化ICE，通过ICE再活化IL-1b 。所以在细胞凋亡中，caspase-11可能作用于ICE 上游，在受LPS刺激后首先活化，然后再通过活化ICE，一方面剪切IL-1b ，引起炎症反应，另一方面还可以在有些细胞中引起细胞凋亡。
9. mICH-3和mICH-4
通过松驰杂交方法也发现了另两种鼠的ICE同源蛋白，分别称为mICH-3和mICH-4。MICH-3在静止细胞表达水平很低，但LPS刺激后上调，基因剔除的小鼠可以抵抗LPS引起的致命的影响，所以推测它屯炎症过程有关。MICH-3不能剪切pro-IL-1b ，但过量表达时可以引起细胞凋亡。
https://www.doczj.com/doc/d32877067.html,/thread-50-1-1.html
根据Caspase 在级联反应上下游的位置及功能的不同,可分为3 大类：
第1 类为凋亡始动子,包括Caspase-2、8、9、10 等。
第2 类为凋亡效应子,包括Caspase-3、6、7
第3 类包括Caspase-1、4、5、13、14,主要参与细胞因子介导炎症反应。
Caspase酶原本身没有活性。必需通过活化才能导致细胞凋亡。根据起始激活的Caspase 不同，凋亡激活的途径分为3种。
外源性途径始于细胞表面死亡受体。细胞死亡受体属于肿瘤坏死因子TNF、神经生长因子NGF超家族，如Fas、TNFR1(TNF receptor-1) 。由于各种细胞凋亡信号的刺激，FasL(Fas ligand)和TNF α作用于相应的受体，使得内源性Fas相关死亡结构域(Fas associated death domain，FADD)和Fas发生直接的作用，生成FasL-Fas-FADD凋亡复合物而使细胞凋亡。而TNFR相关死亡结构域(TNFR associated death domain，TRADD)通过与死亡域间的相互作用，与TNFR1直接结合。间接使TNFR1和FADD相结合形成TNFα-TNFR1-TRADD-FADD 复合物。复合物形成后FADD的死亡效应区即和Caspase-8酶原或Caspase-10酶原结合。使Caspase酶原活化为有活性的Caspase。活化的Caspase-8或10激活下游的Caspase-3、6、7，最终导致细胞的凋亡。
内源性细胞凋亡途径始于线粒体。当受到细胞凋亡信号刺激。线粒体释放细胞色素C 至细胞浆中。细胞色素C与细胞内存在的一种凋亡细胞蛋白酶激活因子(Apoptosis Protease Activating Factor-1，Apaf-1)结合，在dA TP存在的条件下，通过半胱氨酸蛋白酶募集域的作用，Apaf1和Caspase-9酶原结合。使Caspase-9酶原活化，然后激活下游的效应半胱氨酸蛋白酶如Caspase-2、3、6、7、8、10，从而启动细胞凋亡。
第3种途径是近年发现的内质网途径。内质网应激的情况下，由于Ca2+平衡紊乱而激活的钙离子依赖性蛋白激酶可以直接剪切并激活Caspase-12。另外，内质网应激也可以导致胞质Caspase-7和Bim向内质网表面移位．激活Caspase-12和级联反应的发生。
caspase家族及在细胞凋亡中的作用 admin 注:本文仅是基础知识，目前这方面进展十分快，需要更新更多的知识。如caspase家族目前发现至少14种。这里仅介绍几种常见的成员。目的是让大家了解到caspase家族的概况，以及在细胞凋亡中的作用。 一caspase家族蛋白酶的组成 未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被称为“原结构域”(pro-domain)的序列。酶原活化时不但要将原结构域切除，并且要将剩余部分剪切成一大一小两个亚基，分别称为P20和P10，活性酶就是由这两种亚基以(P20/P10) 2 的形式组成的。这种活化反应也是Asp特异的，剪切发生在酶原中保守序列的Asp与其后的氨基酸残基之间，一般是先切下羧基端的小亚基，然后再从大亚基的氨基端切去原结构域。这种剪切可以是酶原及中间活性酶自我催化，也可以是其它ICE家族蛋白酶的作用，还有其它酶类如颗粒酶B 参与。 表5. caspase家族蛋白酶的识别序列及作用底物 蛋白酶名称别名识别序 列 底物 caspase 1ICE YVAD pro-IL-1 , pro-caspase 3, pro-caspase 4 caspase 4TX, ICH-2, ICErel-II pro-caspase 1 caspase 5ICErel-III, TY mICH3 mICH4 caspase 2ICH-1PARP caspase 9ICE-LAP6, Mch6PARP
caspase 3CPP32, Yama, apopain DEVD PARP, DNA-PK, SRE/BP, rho-GDI, KCθ caspase 6Mch2VEID lamin A caspase 7Mch3, ICE-LAP3, CMH-1 DEVD PARP, pro-caspase 6 caspase 8MACH, FLICE, Mch5DEVD pro-caspase3,4,7,9,10 caspase 10Mch4YVAD caspase 11ICH3, FLICE2 CED-3 已命名的caspase家族成员均已克隆成功，它们不但在氨基酸序列上具有同源性，而且在空间结构上也很相似。目前已经获得了caspase-1(ICE)和caspase-3(CPP32)的X线结晶图像，结果显示它们具有相似的空间结构，在P20的C端和P10的N端有200多个氨基酸残基的序列尤为保守，在空间结构上组成相似的β折叠中心和相邻的α螺旋，保守的、对蛋白酶活性有特殊意义的氨基酸残基均位于这一段，并形成特定的结构。不同源的序列主要存在于P20的N 端和P20与P10交界处，这两个部位的氨基酸残基在蛋白酶活化过程中一般被全部或部分切除。 所有的成员都保守性地包含有与底物P 1 Asp作用的氨基酸残基，如在ICE中，它们是催化中心的Cys285，与酶/抑制剂复合物的巯基半缩醛以氢键结合的His237，以及可以稳定反应中间物氧 阴离子的Gly238。另外，Arg179、Arg341、Gln383和Ser347形成容纳P 1 Asp的“口袋”，Ser339靠近 Cys285的巯基，以氢键结合P 1位的酰胺。与P 2 ~P 4 作用的氨基酸残基则变异比较大，这可能是各 个成员识别不同底物的特异性之所在。在活性Cys周围的氨基酸序列也很保守，一般都有Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列，在caspase-8、caspase-10中为QACQG，在caspase-9中是QACGG，这三个成员都有一个氨基酸残基的变异，但这种变异不影响蛋白酶的剪切活性和特异性。
(一)caspase家族 Caspases是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。Caspase一词是从Cysteine aspartic acid specific protease 的字头缩写衍生而来，就反映了这个特征，而这种高度的特异性，在蛋白酶中是很少见的。由于这种特异性，使caspase能够高度选择性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数（通常只有1个）位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但从不完全降解一种蛋白质。 Caspase的研究源于线虫（C. elegans）细胞程序化死亡的研究。线虫在发育过程中，有131个细胞将进入程序化死亡；研究发现有11个基因与PCD 有关，其中ced3和ced4基因是决定细胞凋亡所必需的，ced9基因抑制PCD。线虫细胞程序化死亡的研究促进了其他动物特别是哺乳类动物中细胞凋亡的研究。人们发现哺乳类细胞中存在着Ced3的同源物ICE（interleukin-1b converting enzyme），它催化白介素-1b的活化，即从其前体上将IL-1b 切割下来。在大鼠成纤维细胞中过量表达ICE和Ced3都会引起细胞凋亡，表明了ICE和Ced3在结构和功能上的相似性；然而敲除ICE基因的小鼠其表现型正常，并未发现细胞凋亡发生明显改变。进一步的研究发现，另一个ICE成员，后来被称为apopain，CPP32或Yama的半胱氨酸蛋白酶，催化poly（ADP-ribose）Polymerase（PARP），即聚（ADP-核糖）聚合酶的裂解，结果导致细胞的凋亡，因而认为apopain执行着与线虫中的ced3相同的功能。Apopain被称为是“死亡酶”，而PARP被认为是“死亡底物”。 Apopain/CPP32/Yama是在1995年由两个实验室分别同时报导，时间上只有两周之差。Ced4的哺乳类同源物则迟迟未能发现，直到1997年，才被证明是Apaf-1（即一种细胞凋亡蛋白酶活化因子apoptosis protease activating factor）。而Ced 9的哺乳类对应物则较早地被证明是BCL-2，这一问题将在以后的部分述及。 现已确定至少存在11种caspase： 这些caspases中，caspase 1和caspase 11，以及可能还有caspase 4被认为不直接参与凋亡信号的转导，它们主要参与白介素前体的活化；而caspase 2，caspase 8，caspase 9和caspase 10参与细胞凋亡的起始；参与细胞凋亡执行的则是caspase 3，caspase 6和caspase 7，其中caspase 3和7具有相近的底物和抑制剂特异性，它们降解PARP，DFF-45（DNA fragmentation factor-45），导致DNA修复的抑制并启动DNA的降解。而
酸性蛋白酶与碱性蛋白酶生产工艺的不同之处？ 酸性蛋白酶是一种在酸性环境下（pH 2.5-4.0）催化蛋白酶水解的酶制剂，适用于酸性介质中水解动植物蛋白质。可用于毛皮软化，酒精发酵，啤酒、果酒澄清，动植物蛋白质水解营养液，羊毛染色，废胶片回收，饲料添加剂等等。本品在酸性条件下有利于皮纤维松散，且软化液可连续使用，是当前理想的毛皮软化酶制剂；在酒精发酵中，添加酸性蛋白酶，能有效水解原料中的蛋白质，破坏原料颗粒粒间细胞壁的结构，有利于糖化酶的作用，使原料中可利用碳源增加，从而可提高原料出酒率；另一方面，蛋白质的水解提高了醪液中α-氨基态氮的含量，促进酵母菌的生长与繁殖，提高发酵速度，从而缩短发酵周期和提高发酵设备的生产能力。 碱性蛋白酶碱性蛋白酶是在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,最早发现于猪胰脏。碱性蛋白酶广泛存在于动、植物及微生物中。微生物蛋白酶均为胞外酶,不仅具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,还有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、易于实现工业化生产等诸多优点。1945年瑞士M等在地衣芽孢杆菌中发现了微生物碱性蛋白酶。 碱性蛋白酶是由细菌原生质体诱变选育出的地衣芽孢杆菌2709，经深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，其主要酶成分为地衣芽孢杆菌蛋白酶，是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力，广泛应用
于食品、医疗、酿造、洗涤、丝绸、制革等行业。 1、碱性蛋白酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，属于丝氨酸型内切蛋白酶，应用在食品行业可水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，形成具有独特风味的蛋白质水解液。 2、碱性蛋白酶成功应用于洗涤剂用酶工业，可添加在普通洗衣粉、浓缩洗衣粉和液体洗涤剂当中，既可用于家庭洗衣，也可用于工业洗衣，可以有效的去除血渍、蛋类、乳制品、或肉汁、菜汁等蛋白类的污渍，另外也可作为医用试剂酶清洗生化仪器等。 3、在生物技术领域，碱性蛋白酶可作为工具酶用于核酸纯化过程中的蛋白质（包括核酸酶类）去除，而对DNA无降解作用，避免对DNA 完整性的破坏。 酸性蛋白酶如何灭活第一种方法几乎所有酶都适用，就是加热。第二种，既然是酸性酶，加入强碱应该也是可以的。 酸性蛋白酶产生菌的筛选方法？酸性蛋白酶是一种能在酸性环境下水解蛋白质的酶类，其最适作用pH值为2.5-5.0。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。目前用于工业化生产的酸性蛋白酶大多为霉菌酸性蛋白酶，此类酶的最适作用pH值为3.0左右，当pH值升高时，酸性蛋白酶的酶活会明显降低，且此类酶不耐热，当温度达到50℃以上时很不稳定，从而限制了酸性蛋白酶的应用范围。因此，本研究以开发耐温偏酸性蛋白酶为目标，进行了以下几方面的研究：(1)偏酸性蛋白酶产生菌的分离筛选。(2)偏酸性蛋白酶粗酶酶学性质的
caspase家族蛋白酶的组成 已命名的caspase家族成员均已克隆成功，它们不但在氨基酸序列上具有同源性，而且在空间结构上也很相似。目前已经获得了caspase-1(ICE)和caspase-3(CPP32)的X线结晶图像，结果显示它们具有相似的空间结构，在P20的C端和P10的N端有200多个氨基酸残基的序列尤为保守，在空间结构上组成相似的β折叠中心和相邻的α螺旋，保守的、对蛋白酶活性有特殊意义的氨基酸残基均位于这一段，并形成特定的结构。不同源的序列主要存在于P20的N端和P20与P10交界处，这两个部位的氨基酸残基在蛋白酶活化过程中一般被全部或部分切除。 所有的成员都保守性地包含有与底物P1Asp作用的氨基酸残基，如在ICE中，它们是催化中心的Cys285，与酶/抑制剂复合物的巯基半缩醛以氢键结合的His237，以及可以稳定反应中间物氧阴离子的Gly238。另外，Arg179、Arg341、Gln383和Ser347形成容纳P1Asp的“口袋”，Ser339靠近Cys285的巯基，以氢键结合P1位的酰
胺。与P2~P4作用的氨基酸残基则变异比较大，这可能是各个成员识别不同底物的特异性之所在。在活性Cys周围的氨基酸序列也很保守，一般都有Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列，在caspase-8、caspase-10中为QACQG，在caspase-9中是QACGG，这三个成员都有一个氨基酸残基的变异，但这种变异不影响蛋白酶的剪切活性和特异性。 未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被称为“原结构域”(pro-domain)的序列。酶原活化时不但要将原结构域切除，并且要将剩余部分剪切成一大一小两个亚基，分别称为P20和P10，活性酶就是由这两种亚基以(P20/P10)2的形式组成的。这种活化反应也是Asp特异的，剪切发生在酶原中保守序列的Asp与其后的氨基酸残基之间，一般是先切下羧基端的小亚基，然后再从大亚基的氨基端切去原结构域。这种剪切可以是酶原及中间活性酶自我催化，也可以是其它ICE家族蛋白酶的作用，还有其它酶类如颗粒酶B参与。二caspase家族蛋白酶的结构与功能 按照结构同源性的大小，可以将caspase蛋白酶分为三个组，分别以caspase-1、caspase-2和caspase-3为代表。其中最重要的是caspase-1、caspase-3 和caspase-8。
Caspase家族 Caspases是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。Caspase一词是从Cysteine aspartic acid specific protease 的字头缩写衍生而来，就反映了这个特征，而这种高度的特异性，在蛋白酶中是很少见的。 由于这种特异性，使caspase能够高度选择性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数（通常只有1个）位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但从不完全降解一种蛋白质。 Caspase的研究源于线虫（C. elegans）细胞程序化死亡的研究。线虫在发育过程中，有131个细胞将进入程序化死亡；研究发现有11个基因与PCD有关，其中ced3和ced4基因是决定细胞凋亡所必需的，ced9基因抑制PCD。线虫细胞程序化死亡的研究促进了其他动物特别是哺乳类动物中细胞凋亡的研究。人们发现哺乳类细胞中存在着Ced3的同源物ICE （interleukin-1b converting enzyme），它催化白介素-1b的活化，即从其前体上将IL-1b切割下来。在大鼠成纤维细胞中过量表达ICE和Ced3都会引起细胞凋亡，表明了ICE和Ced3在结构和功能上的相似性；然而敲除ICE基因的小鼠其表现型正常，并未发现细胞凋亡发生明显改变。进一步的研究发现，另一个ICE成员，后来被称为apopain，CPP32或Yama的半胱氨酸蛋白酶，催化poly（ADP-ribose）Polymerase（PARP），即聚（ADP-核糖）聚合酶的裂解，结果导致细胞的凋亡，因而认为apopain执行着与线虫中的ced3相同的功能。Apopain被称为是“死亡酶”，而PARP被认为是“死亡底物”。 Apopain/CPP32/Yama是在1995年由两个实验室分别同时报导，时间上只有两周之差。Ced4的哺乳类同源物则迟迟未能发现，直到1997年，才被证明是Apaf-1（即一种细胞凋亡蛋白酶活化因子apoptosis protease activating factor）。而Ced 9的哺乳类对应物则较早地被证明是BCL-2，这一问题将在以后的部分述及。 现已确定至少存在11种caspase： 这些caspases中，caspase 1和caspase 11，以及可能还有caspase 4被认为不直接参与凋亡信号的转导，它们主要参与白介素前体的活化；而caspase 2，caspase 8，caspase 9和caspase 10参与细胞凋亡的起始；参与细胞凋亡执行的则是caspase 3，caspase 6和caspase 7，其中caspase
Caspases are a family of cysteine proteases that act in concert in a cascade triggered by apoptosis signaling. The culmination of this cascade is the cleavage of a number of proteins in the cell, followed by cell disassembly, cell death, and, ultimately, the phagocytosis and removal of the cell debris. The Caspase cascade is activated by two distinct routes: one from cell surface and the other from mitochondria (Ref.1). The pathway leading to Caspase activation varies according to the apoptotic stimulus. Initiator Caspases (including 8, 9, 10 and 12) are closely coupled to pro-apototic signals. Pro-apoptotic stimuli include the FasL (Fas Ligand), TNF (Tumor Necrosis Factor), Granzyme-B, GRB (Growth Factor Receptor-Bound Protein), DNA damage, Ca2+ (Calcium) channels and ER (Endoplasmic Reticulum) stress. Once activated, these Caspases cleave and activate downstream effector Caspases (including 3, 6 and 7). Caspase8 cleaves BID (BH3 Interacting Death Domain). tBID (Truncated BID) disrupts the outer mitochondrial membrane to cause release of the pro-apoptotic factors CytoC (Cytochrome-C) which is crucial for activating pro-Caspase9. CytoC that is released from the intermembrane space binds to APAF1 (Apoptotic Protease Activating Factor-1), which recruits Caspase9 and in turn can proteolytically activate Caspase3. SMAC (Second Mitochondria-Derived Activator of Caspase)/DIABLO is also released from the mitochondria along with CytoC during apoptosis, and it functions to promote caspase activation by inhibiting IAP (Inhibitor of Apoptosis) family proteins. ER stress leads to the Ca2+-mediated activation of Caspase12 (Ref.2). Fas and the TNFR (TNF Receptor) activate Caspases8 and 10. Cell death caused by activation of the TNFR or Fas receptors is brought about by the recruitment of the adaptor protein FADD (Fas Associated Death Domain). In the case of the TNFR1, FADD recruitment requires prior binding of TRADD (TNFR-Associated Death Domain Protein). FADD in turn recruits ProCaspase8. The TNFR1 receptor can also mediate activation of Caspase2 via the recruitment of a death-inducing signaling complex. In this case RIP (Receptor-Interacting Protein) acts as an adaptor for the recruitment of RAIDD (RIP-Associated ICH-1/CED-3-homologous protein with a Death Domain), which subsequently binds to ProCaspase2. TNFR also activates Caspase3, 6,7 via TRADD, TRAF2 (TNF Receptor-Associated Factor-2) and RICK (RIP-like Interacting Clarp Kinase). TNF not only induces apoptosis by activating Caspase8 and 10, but can also inhibit apoptosis signaling via NF-KappaB (Nuclear Factor-KappaB), which induces the expression of IAP, an inhibitor of Caspases3, 7 and 9 (Ref.3). GRB (Growth Factor Receptor-Bound Protein), Granzyme B and perforin proteins released by cytotoxic T-Cells induce apoptosis in target cells, forming transmembrane pores, and triggering apoptosis, perhaps through cleavage of Caspases, although Caspase-independent mechanisms of Granzyme-B mediated apoptosis have been suggested (Ref.4). After activation, down stream Caspases cleave cytoskeletal and nuclear proteins (structural, signaling proteins or kinases) like PARP (Poly ADP-Ribose Polymerase), DNA-PK (DNA-Dependent Protein Kinase), Rb (Retino Blastoma Tumor Supressor Protein), PAK1 (p21-Activated Kinase-1), GDID4, Fodrin, Lamin-A, Lamin-B1, Lamin-B2, thus inducing apoptosis. Caspase3 cleaves ICAD (Inhibitor of CAD) to free CAD (Caspase-Activated DNase) to cause DNA fragmentation. The events culminating in Caspase activation and the subsequent disassembly of the cell are the subject of intense study because of their role in many neurodegenerative disorders such as Parkinson's and Alzheimer’s diseases, autoimmune disorders, and tumorigenesis. References: 1. Srinivasula SM,Ahmad M,Fernandes-Alnemri T,Alnemri ES. Autoactivation of procaspase-9 by Apaf-1-mediated oligomerization. Mol Cell. 1998 Jun;1(7):949-57. 2. Pirnia F,Schneider E,Betticher DC,Borner MM. Mitomycin C induces apoptosis and caspase-8 and -9 processing through a caspase-3 and Fas-independent pathway. Cell Death Differ. 2002 Sep;9(9):905-14.
金属基质蛋白酶9与疾病的研究进展 摘要：金属基质蛋白酶（MMPs）是一组可以选择性降解细胞外基质（ECM）的内肽酶，金属基质蛋白酶9（MMP-9）又名明胶酶B，它是MMPs家族中一个重要成员，能水解弹性蛋白、胶原蛋白、明胶、纤维蛋白等多种细胞外基质成分，在生理情况下参与人体的正常发育，是ECM降解的生理性调节因子。所有MMPs都受金属基质蛋白酶抑制剂所抑制，两者的不平衡导致许多疾病的发生。金属基质蛋白酶抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）为MMP-9特异性抑制剂，目前认为MMP-9与TIMP-1是调节ECM降解、合成的主要酶类，MMP-9/TIMP-1比值失衡是多种疾病发生、发展的重要机制之一。近年研究发现MMP-9还与全身多系统疾病的发生、发展有关，现就MMP-9与多种疾病的相关研究进展进行综述。 关键词：金属基质蛋白酶9；疾病；研究进展金属基质蛋白酶（matrix metalloteinases，MMPs）是一组锌离子依赖的肽链内肽酶，因含金属离子（锌、钙）而得名，现至少已发现26种MMPs，称为MMPs家族，是构成细胞外基质降解最重要的蛋白水解系统。其抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）是调节MMPs的重要因素。MMPs
与TIMPs在维持ECM的动态平衡中起重要作用。细胞外基质（extracellullar matrix，ECM）是一类由胶原、蛋白聚糖及糖蛋白等大分子物质组成的动态网状结构，ECM不仅起细胞与细胞之间机械支持和连接作用，也是细胞与细胞之间信号传递的桥梁，现已识别丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶均能降解ECM[1]。金属基质蛋白酶9（matrix metalloteinases-9，MMP-9）是MMPs家族分子量最大的明胶酶。TIMP-1是MMP-9的重要的生理性抑制剂，二者在维持ECM的动态平衡中起重要作用。MMP-9/TIMP-1比值失衡是多种疾病发生、发展的重要机制之一。近年许多研究发现MMP-9与多种疾病的发生发展密切相关。 1 MMP-9概述 MMP-9是1974年从人中性粒细胞中首次提纯得到，于1989年的金属蛋白酶学会上被正式命名。MMP-9的分子量为92KD，MMP-9基因长7.7kb，含13个外显子，其长度不一，位于染色体的20q11.2-13.1[2]。MMP-9起源于角质形成细胞、单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和成纤维细胞。在生理PH值时，在金属锌离子的作用下，能够切断任何ECM 成分，调节细胞黏附、作用于细胞外成分或其他蛋白成分而启动潜在生物学功能，直接或间接参与胚胎发育、组织模型重建和场上恢复等正常生理功能。MMP-9其作用底物包括明
蛋白酶的论述 摘要：蛋白酶（英语：Protease）是生物体内的一类酵素（酶），它们能够分解蛋白质。分解方法是打断那些将氨基酸连结成多肽链的肽键。抑制蛋白酶活性的小分子化合物被称蛋白酶抑制剂。许多病毒蛋白酶的抑制剂是很有效的抗病毒药。 1．木瓜蛋白酶 1.1木瓜蛋白酶简介 木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。 1.2木瓜蛋白酶的特点 木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI)为8.75；最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。木瓜蛋白酶由212个氨基酸残基组成，当用氨基肽酶从N末端水解掉分子中的2/3肽链后，剩下的1/3肽链仍保持99%的活性，说明木瓜蛋白酶的生物活性集中表现在C末端的少数氨基酸残基及其所构成的空间结构区域。 木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。EC3．4．22．2。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。 酪蛋白被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰。1.3木瓜蛋白酶物理化学性质 本品为乳白色至微黄色粉末，具有木瓜特有的气味,稍具有吸湿性。水解蛋白质能力强,但几乎不能分解蛋白胨，易溶于水,甘油,不溶于一般的有机溶剂,耐热性强。由木瓜制得的商品酶制剂中，含有如下三种酶：(1)木瓜蛋白酶，分
收稿日期:20060726 基金项目:广西大学科学技术研究基金重点资助项目(2003ZD 01);广西科技攻关项目(桂科攻0480001) 作者简介:李军(1971),男,广东梅州人,助理研究员,博士研究生,研究方向为动物传染病防治与分子病毒学。*为通讯作者。 猪Caspase -3基因的克隆及序列分析 李 军, 刘 兵, 曾 兰, 罗廷荣 * (广西大学动物科学技术学院, 南宁 530005) 摘要:天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是与细胞凋亡有关的一类蛋白酶,其中Caspase-3是细胞凋亡的最终执行者。为了进一步研究Caspase-3的生物学功能,从P K-15细胞中提取总RN A ,用RT -PCR 方法扩增出猪Caspase-3基因,序列分析表明克隆的Caspase-3基因与GenBank 上登录的猪Caspase-3基因核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为98.9%和98.6%,与人和鼠的Ca spase -3基因核苷酸、氨基酸序列同源性分别为88.6%、83.5%和87.8%、86.7%,而且猪、人、鼠的Caspase-3上的催化和剪切位点都极为保守。 关键词:Caspase-3;克隆;序列分析中图分类号:S 813.1 文献标识码:A 文章编号:1002—8161(2006)05-0584-05 Cloning and sequence analysis of Caspase -3gene of pig LI Jun ,LIU Bing ,ZENG Lan ,LU O Ting -r ong * (A nimal Science and T echnology College ,Guang x i Univers ity ,N anning 530005,China ) Abstract :Caspase is a kind of pr ot eases which is r elated to apopto sis ,and Caspase -3is the ultimate ex ecute in apoptosis.In or der to st udy t he bio log ical functio n o f Caspase-3,t he Caspase-3gene of pig wa s amplified by RT -PCR w it h the ex tr actio n o f RN A fr om P K -15cells.Aft er clo ning and sequencing ,the results show ed that t he nu-cleo tide a nd the deduced amino acid sequences of clo ned Caspase -3sha red 98.9%and 98.6%homo log y w ith those of Caspase -3published in GenBank .A s co mpar ed with that of human a nd mouse ,the Caspase -3gene homo lo gy of the nucleotide and the deduced amino acid sequences w er e 88.6%,83.5%and 87.8%,86.7%,respect ively.T he activ e sites cor responding catalysis and cleav ag e o n Caspase-3amo ng the pig ,human and mo use w ere conser vative ver y much . Key words :Caspase -3;cloning ;sequence a nalysis 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(aspartate-specific cy steinyl pro teinase,Caspase)家族是执行 细胞凋亡的一类重要蛋白酶。Caspase 通常以单一的蛋白酶原前体形式存在,被激活后引起一系列酶级联效应,特异性地在特定的氨基酸序列中将肽链从天冬氨酸(Asp )之后切断,还可引起染色体DNA 的降解及细胞的解体[1,2]。在细胞凋亡信号传导的Caspase 级联反应中,Caspase-3是凋亡信号传导途径下游的一个关键效应因子,它可以被Fas /FasL 途径活化,也可经颗粒酶B 途径活化。研究表明,Caspase-3可以导致所有类型的细胞发生染色质浓缩和形成DNA 片段化[3,4]。此外,Caspase -3可以抑 制白细胞介素18的生物学活性[5],因此Caspase-3在细胞凋亡和炎症反应中起到关键的作用。 猪的许多病毒病都涉及到细胞凋亡[6～9],有的病毒既能促进细胞凋亡又能抑制细胞凋亡;有的只能诱导细胞凋亡;而有的只能抑制细胞凋亡。但是Caspase-3在其中的分子作用机制尚未完全清楚,本研究通过克隆猪的Caspase-3基因,以便进一步研究在病毒感染过程中Caspase -3对细胞凋亡的影响。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 RNA 抽提试剂Tr izol Reag ent 、T aq DNA 聚合酶,购自上海生工生物工程技术服务
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs) 基质金属蛋白酶是一个大家族，因其需要Ca++、Zn++等金属离子作为辅助因子而得名，其家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成:（1）疏水信号肽序列;（2）前肽区，主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后，MMPs酶原被激活;（3）催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要;（4）富含脯氨酸的铰链区;（5）羧基末端区，与酶的底物特异性有关。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。MMPs成员上述结构的基础上各有特点。各种MMP间具有一定的底物特异性，但不是绝对的。同一种MMP可降解多种细胞外基质成份，而某一种细胞外基质成分又可被多种MMP 降解，但不同酶的降解效率可不同。 MMPs几乎能降解ECM中的各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。目前MMPs家族已分离鉴别出26个成员，编号分别为MMP1～26。根据作用底物以及片断同源性，将MMPs分为4类。 Ⅳ型胶原酶为其中重要的一类，它主要有两种形式，一种被糖化，分子量为92kD，命名为MMP-9;另一种非糖化，分子量为72kD，被称为MMP-2。当前对MMP-2，MMP-9的研究较深入。 MMP-2基因位于人类染色体16q21，由13个外显子和12个内含子所组成，结构基因总长度为27kb，与其他金属蛋白酶不同，MMP-2基因5’旁侧序列促进子区域含有2个GC盒而不是TATA盒。活化的MMP-2定位于细胞穿透基质的突出部位，估计其在酶解细胞间基质成分及基底膜的主要成分Ⅳ型胶原中有“钻头”的作用。 此外，已证实MMP-3 和MMP-10能作用于PG、LN、FN、Ⅲ型和Ⅳ型胶原及明胶。MMP-7能作用于明胶和FN。MMP-1的产生范围较广，可由基质纤维母
蛋白酶的种类 1．木瓜蛋白酶 木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。 木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。 木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI)为8.75；最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
2．胃蛋白酶 胃蛋白酶（英文名称：Pepsin）是一种消化性蛋白酶，由胃部中的胃粘膜主细胞所分泌，功能是将食物中的蛋白质分解为小的肽片段。胃蛋白酶原由胃底主细胞分泌，在pH1.5～5.0条件下，被活化成胃蛋白酶，将蛋白质分解为胨，而且一部分被分解为酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸。可分解蛋白质中苯丙氨酸或酪氨酸与其他氨基酸形成的肽键，产物为蛋白胨及少量的多肽和氨基酸，该酶的最适pH为2左右。 3．中性蛋白酶 中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定温度、PH值下，本品能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。可广泛应用于动植物蛋白的水解，制取生产高级调味品和食品营养强化剂的HAP和HVP，此外还可用于皮革脱毛、软化、羊毛丝绸脱胶等加工。 利用中性蛋白酶的酶促反应，可把动植物的大分子蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，以利于蛋白质的有效吸收和利用，其水解液AN%高，水解度高，风味佳，已广泛用于生产高级调味品和食品营养强化剂，各种动物来源性抽提物生产功能性骨、肉提取物（骨素）、水产提取物、蛋白胨、肽等及研究开发一些高附加值的功能食品。
中国法医学杂志CH I N J FO R EN S I C M ED 2006年第21卷第2期 【基金项目】国家自然科学基金资助项目(30271347);教育部留学归国基金资助项目(教外留司[2000]367号) 【作者简介】韩阳(1980-),男,山东省德州人,硕士研究生,主要从事皮肤损伤愈合机制的研究。 【通讯作者】官大威(1963-),男,教授,博士生导师,主要从事皮肤损伤愈合机制及钝力性心脏外伤研究。综 述 cas pase-8及其研究进展 韩 阳,官大威,侯震寰,赵 锐,路 斌 (中国医科大学法医学院法医病理学教研室,辽宁沈阳110001) 【摘要】细胞凋亡是细胞生理性自主死亡的过程,一组被称为cas pase的蛋白酶蛋白水解系统是该过程的核心。Fas(AP O-1/C D95)是一种跨细胞膜受体,其活化后会引发细胞凋亡。在Fas引发的凋亡过程中一系列cas pase级联式地活化,其中cas pase-8的活化是其第一步反应。活化后的cas pase-8会引发包括cas pase-9在内的下游cas pase活化,进而诱导细胞凋亡。cas pase-8与人类的诸多疾病及损伤的病理变化有关,如癌症、神经退化性疾病、寄生虫病及创伤等。随着对cas pase-8的结构、功能和调控等方面研究的不断深入,将会发现更多有关cas pase-8的生物学作用。 【关键词】法医病理学;cas pase-8;凋亡;死亡受体;损伤 【文献标识码】A 【文章编号】100125728(2006)02-0094-03 Ca spa se-8and its advances i n rel a ted stud i es/(△HAN Yang,G UAN Da2wei,HOU Zhen2huan,et al./△D epart m ent of Forensic Pathology,China M edical U niversity School of Forensic M edicine,Shenyang 110001,China) 【Abstract】Apop t osis is a physi ol ogical p r ocess of cellular aut odestructi on.The central component of this machinery is a p r oteolytic syste m involving a fa m ily of p r oteases called cas pases.Fas(AP O-1/CD95) is a trans me recep t or p r otein which induces apop t osis upon activati on.I n apop t osis triggered by Fas, a subset of cas pases is activated.Among the m,cas pases-8(F L I CE/MACH)is the first step in the cas2 cade of apop t otic events induced by Fas.Cleavaged cas pase-8then activates other downstrea m cas pases including cas pase-9,thereby comm iting the cell t o undergo apop t osis.Many studies show that cas pase-8 is related t o the pathogenesis of certain diseases and injuries such as cancers,neur odegenerative diseases, parasit osis,trau ma and s o on in hu man beings. W ith the continuous researches in the structure,functi on and regulati on of cas pase-8,more as pects on cas pase-8and its bi ol ogical functi ons will be underst ood. 【Key words】Forensic pathol ogy;Cas pase-8;Apop t osis;Death recep t or;I njury 细胞凋亡(apop t osis)是基因控制的细胞自主性死亡。cas pase(cystine containing as parate s pecific p r otease)意为含半胱氨酸的天冬氨酸特异水解酶,是凋亡的主要执行者。已发现的14种cas pase均以酶原(p r ocas pase)形式合成并定位于细胞内不同的亚细胞部位。cas pase分为3大类型:启动型、效应型和炎症型。启动型cas pase包括cas pase-2、-8、-9、-10,通过自身活化启动凋亡并调节效应型cas pase;效应型cas pase 包括cas pase-3、-6、-7,能分解细胞蛋白,执行凋亡;炎症型cas pase包括cas pase-1、-4、-5等。cas pase的结构可分为前结构域(p r odomain)、大亚基和小亚基[后二者统称为催化域(catalytic domain)][1]三部分。在p r ocas pase被切割为大、小两个片段(约20k Da和10k Da,分别为p20和p10)及一个N-端前区后,两大两小共4个片段聚合成为含有两个位点活化了的cas pase。 1 cas pase-8参与细胞凋亡的机制 cas pase-8也称MACH、F L I CE、Mch5,1996年被克隆成功。cas pase-8基因C ASP8与c-F L I P(cellular F L I CE inhibi2 t ory p r otein)基因及cas pase-10基因C ASP10共同位于染色体2q33-34。cas pase-8以无活性的酶原(p r ocas pase-8)形式存在于成人及除胎儿脑组织外的各种组织中,在外周血白细胞中分布较高。p r ocas pase-8有479个氨基酸,分子量为55k D,其8种异构体(is of or m s)中2种有完整的酶活性,能启动死亡受体介导的凋亡。这2种p r ocas pase-8的N-端的两个前后串联的70个氨基酸左右死亡效应结构域(death effect domain,DE D)与适配蛋白(adap ter p r otein,如fas-ass ociated death domain,F ADD)N-端的DE D同源,所以p r ocas pase-8可与F ADD结合。C-端的大小两个亚基是蛋白水解酶区域, ? 4 9 ?