土壤微生物生物量的测定方法
土壤微生物生物量是衡量土壤生态系统功能的重要指标之一、测定土
壤微生物生物量可以帮助我们了解土壤生态系统的活跃度和健康状况，进
而指导土壤环境修复以及农田生产管理。氯仿熏蒸法是一种常用的测定土
壤微生物生物量的方法，本文将对该方法进行详细介绍。
首先，介绍氯仿熏蒸法的原理。氯仿是一种广谱杀菌剂，可以破坏土
壤中的微生物细胞膜，使微生物失去活性。在测定土壤微生物生物量时，
将土壤样品放置在含有适量氯仿的密闭容器中，通过熏蒸的方式杀灭土壤
中的活性微生物。熏蒸时间通常为24小时。然后，通过测定氯仿熏蒸前
后土壤中可溶性氮的浓度差异，计算出土壤微生物生物量。
其次，介绍氯仿熏蒸法的操作步骤。首先，将采集到的土壤样品通过
筛网筛选除去杂质。然后，将土壤样品平均分配到已预先称量好的量筒中。每个量筒中的土壤样品重量应保持一致。为了保证测定的准确性，通常会
设置重复样品。接下来，在密闭容器的底部放置氟化钾和含有适量氯仿的
吸附剂。然后，将装有土壤样品的量筒设置在容器的顶部，将密闭容器封
闭并在室内温度下进行熏蒸。熏蒸时间通常为24小时。熏蒸结束后，取
出含有氯仿的吸附剂，并将土壤样品离心以去除残余的溶液。最后，用适
量的蒸馏水冲洗残留在土壤样品中的溶解态氮，并测定冲洗液中溶解态氮
的浓度。
最后，介绍氯仿熏蒸法的数据分析和结果解释。首先，通过测定熏蒸
前后土壤样品中可溶性氮的浓度差异，计算出土壤微生物生物量。常用的
计算公式为：
其中，溶液体积为冲洗液的体积，土壤样品质量即为放置在量筒中土壤样品的质量。
通过计算，可以得出土壤微生物生物量的结果。根据测定结果，我们能够了解土壤微生物的数量和活性程度。较高的土壤微生物生物量通常表示土壤中的微生物丰富多样且活跃，土壤生态系统功能较好。而较低的土壤微生物生物量则提示土壤中微生物数量和活性较低，土壤生态系统功能受到一定程度的抑制。因此，通过氯仿熏蒸法测定土壤微生物生物量，可以为土壤环境修复和农田生产管理提供科学依据。
总之，氯仿熏蒸法是一种常用的测定土壤微生物生物量的方法，通过破坏土壤微生物细胞膜的方式杀灭土壤中的活性微生物，并通过测定土壤中可溶性氮的浓度差异，计算出土壤微生物生物量。它能够帮助我们了解土壤生态系统的活跃度和健康状况，进而指导土壤环境修复以及农田生产管理。
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生 物生物量碳，用一定体积的LK 2SO 4 溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微 生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL 3 ）； 2）L硫酸钾溶液：称取87g K 2SO 4 溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 操作步骤 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 熏蒸 称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO 2 ，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完
全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※ 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个的滤头，一个才1元）。 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 计算 SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/ 2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法） 土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下 基本原理（茚三酮比色法）
土壤微生物生物量的测定方法 1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 1.1 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 1.2 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 1.3 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL3）； 2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸 称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理
土壤微生物生物量的测定方法 土壤微生物生物量是衡量土壤生态系统功能的重要指标之一、测定土 壤微生物生物量可以帮助我们了解土壤生态系统的活跃度和健康状况，进 而指导土壤环境修复以及农田生产管理。氯仿熏蒸法是一种常用的测定土 壤微生物生物量的方法，本文将对该方法进行详细介绍。 首先，介绍氯仿熏蒸法的原理。氯仿是一种广谱杀菌剂，可以破坏土 壤中的微生物细胞膜，使微生物失去活性。在测定土壤微生物生物量时， 将土壤样品放置在含有适量氯仿的密闭容器中，通过熏蒸的方式杀灭土壤 中的活性微生物。熏蒸时间通常为24小时。然后，通过测定氯仿熏蒸前 后土壤中可溶性氮的浓度差异，计算出土壤微生物生物量。 其次，介绍氯仿熏蒸法的操作步骤。首先，将采集到的土壤样品通过 筛网筛选除去杂质。然后，将土壤样品平均分配到已预先称量好的量筒中。每个量筒中的土壤样品重量应保持一致。为了保证测定的准确性，通常会 设置重复样品。接下来，在密闭容器的底部放置氟化钾和含有适量氯仿的 吸附剂。然后，将装有土壤样品的量筒设置在容器的顶部，将密闭容器封 闭并在室内温度下进行熏蒸。熏蒸时间通常为24小时。熏蒸结束后，取 出含有氯仿的吸附剂，并将土壤样品离心以去除残余的溶液。最后，用适 量的蒸馏水冲洗残留在土壤样品中的溶解态氮，并测定冲洗液中溶解态氮 的浓度。 最后，介绍氯仿熏蒸法的数据分析和结果解释。首先，通过测定熏蒸 前后土壤样品中可溶性氮的浓度差异，计算出土壤微生物生物量。常用的 计算公式为：
其中，溶液体积为冲洗液的体积，土壤样品质量即为放置在量筒中土壤样品的质量。 通过计算，可以得出土壤微生物生物量的结果。根据测定结果，我们能够了解土壤微生物的数量和活性程度。较高的土壤微生物生物量通常表示土壤中的微生物丰富多样且活跃，土壤生态系统功能较好。而较低的土壤微生物生物量则提示土壤中微生物数量和活性较低，土壤生态系统功能受到一定程度的抑制。因此，通过氯仿熏蒸法测定土壤微生物生物量，可以为土壤环境修复和农田生产管理提供科学依据。 总之，氯仿熏蒸法是一种常用的测定土壤微生物生物量的方法，通过破坏土壤微生物细胞膜的方式杀灭土壤中的活性微生物，并通过测定土壤中可溶性氮的浓度差异，计算出土壤微生物生物量。它能够帮助我们了解土壤生态系统的活跃度和健康状况，进而指导土壤环境修复以及农田生产管理。
土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)
土壤微生物生物量的测定方法 1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 1.1 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 1.2 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 1.3 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL3）； 2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸 称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸
腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※ 1.4.4 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。 1.4.5 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 1.5 计算 SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/0.45
土壤微生物量测定方法概述 引言： 土壤微生物是土壤生态系统中重要的组成部分，对土壤生物学、化学和物理过程起着重要的调控作用。因此，准确测定土壤微生物量是评估土壤生态系统功能和健康状态的重要手段。本文将概述几种常用的土壤微生物量测定方法。 一、直接镜检法 直接镜检法是一种常用的土壤微生物量测定方法。该方法通过将土壤样品制作为薄片或悬浮液，使用显微镜观察土壤中的微生物数量和种类。直接镜检法操作简便、快速，能够直接观察微生物的形态和数量分布，但对于微生物的定量分析相对较难。 二、培养法 培养法是一种经典的土壤微生物量测定方法。该方法将土壤样品通过适当的培养基进行培养，利用培养基中微生物的生长和代谢特性来定量测定土壤中的微生物数量。培养法能够获得微生物的纯培养物，便于后续的生理生化研究，但仅能测定可培养微生物数量，不能测定土壤中的全部微生物。 三、生物标记法 生物标记法是一种基于DNA或RNA分子标记的土壤微生物量测定方法。该方法通过提取土壤中的DNA或RNA，利用分子生物学技术进
行扩增和测定，获得微生物的数量和种类信息。生物标记法具有高灵敏度、高精确度和高通量的特点，可以同时测定多种微生物，并能够获得微生物的遗传信息。 四、磷脂脂肪酸（PLFA）法 磷脂脂肪酸（PLFA）法是一种基于土壤微生物膜脂组分的测定方法。该方法通过提取土壤样品中的脂肪酸，利用气相色谱-质谱联用技术进行分析，测定土壤中不同类型微生物的数量和组成。PLFA法能够定量测定土壤中的细菌、真菌和放线菌等微生物群落，且对土壤微生物的群落结构和功能具有较好的指示作用。 五、荧光原位杂交法（FISH） 荧光原位杂交法（FISH）是一种利用荧光探针标记土壤微生物DNA 或RNA的方法。该方法通过将荧光标记的探针与土壤微生物的DNA 或RNA互补结合，再通过荧光显微镜观察荧光信号，从而测定土壤中不同微生物群落的数量和分布。FISH法可以直接在土壤中观察微生物的空间分布情况，对微生物的数量和种类具有较高的准确性。六、基因测序法 基因测序法是一种利用高通量测序技术对土壤微生物进行定量和定性分析的方法。该方法通过提取土壤中的DNA或RNA，利用测序仪对微生物的基因组进行测序，从而获得微生物的数量、种类和功能信息。基因测序法具有高灵敏度、高分辨率和高通量的特点，能够全面了解土壤微生物的多样性和功能。
土壤微生物数量的测定方法 土壤微生物数量的测定方法是指用来确定土壤中微生物的数量的一系列方法。微生物在土壤中的数量是影响土壤肥力、健康状态以及生物多样性的主要因素，所以对土壤微生物数量的测定十分重要。目前，有几种常用的测定土壤微生物数量的方法，包括计数法、分子生物学方法和非分子生物学方法。 一、计数法 计数法是目前最常用的测定土壤微生物数量的方法。该方法通过对样本中的细胞进行数目和形态的观察，来获得关于微生物数量的信息，然后通过计算微生物数量来估计土壤微生物总数。 1. 总体计数法总体计数法是使用显微镜观察和计数样品中的微生物，把检测到的微生物总数乘以一定的系数，就可以估算出土壤中的总微生物数量。该方法是实时性强，耗时少，易于操作，但是由于细胞大小不一，活性差异大，难以检测到的微生物会影响准确性，因此不能精确测定土壤中的微生物数量。 2. 半定量计数法半定量计数法是通过将土壤样品进行细胞悬液制备，然后用显微镜观察和计数，来估算土壤中的微生物总数。该方法也是实时性强，耗时少，易于操
作，但是由于细胞大小不一，活性差异大，难以检测到的微生物会影响准确性，因此也不能精确测定土壤中的微生物数量。 二、分子生物学方法 分子生物学方法是指使用基于DNA或RNA的技术来测定土壤中的微生物数量的方法。目前，常用的分子生物学方法有PCR方法、qPCR方法、FISH方法、DGGE方法和pyrosequencing方法。 1. PCR方法 PCR方法是使用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术来检测土壤中的微生物数量的方法。PCR方法可以快速检测出土壤中的微生物，但它不能检测出细菌的种类。 2. qPCR方法 qPCR方法是使用定量聚合酶链反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR）技术来检测土壤中的微生物数量的方法。qPCR技术可以检测出微生物的种类，并且可以准确测定土壤中的微生物数量。 3. FISH方法 FISH方法是使用荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）来检测土壤中的微生物数量的方法。FISH技术可以准确测定土壤中的微生物种类，并能准确测定土壤中的微生物数量。
土壤微生物量测定方法 常规培养法是最早也是最常用的土壤微生物量测定方法之一、该方法 是将土壤样品经过稀释后接种到含有特定培养基的培养皿中，经过一段时 间的培养，根据培养皿上的菌落数量计算土壤中微生物的数量。常用的培 养基有营养琼脂培养基、土壤细菌培养基和土壤真菌培养基等。常规培养 法的优点是简单易行，可以同时测定不同类型微生物的数量，但该方法有 一些局限性，如只能测定能够在培养基上生长的微生物，不能测定需异养 条件才能生长的微生物，而且该方法容易低估土壤中微生物的真实数量。 生物量测定法是一种利用土壤微生物的生物学过程测定微生物量的方法。该方法一般分为碳饥饿法和氮饥饿法两种。碳饥饿法是将土壤样品暴 露在低碳条件下（如0.01%葡萄糖溶液中）一段时间后，测定土壤中的微 生物的生物量。氮饥饿法是将土壤样品暴露在低氮条件下（如0.01%硝酸 铵溶液中）一段时间后，测定土壤中的微生物的生物量。这两种方法都是 利用微生物的生物学特性，通过测定微生物对不同养分的响应来估计微生 物的数量。生物量测定法的优点是准确度较高，可以测定土壤中广泛类型 的微生物，但该方法也有一些局限性，如需要较长的试验周期，测定过程 中需要严格控制温度、湿度等环境条件，且操作较为繁琐。 生物学特征法是一种通过测定土壤微生物的生物学特征来评估微生物 群体数量的方法。该方法常用的特征包括土壤酶活性、呼吸作用速率、微 生物生长速率和微生物群体的磷脂脂肪酸组成等。这些特征的测定可以通 过色谱、酶反应和分子生物学技术等手段进行。生物学特征法的优点是操 作简便，消耗土壤样品较少，时间短，结果可靠。但该方法也有一些问题，如不同微生物对环境的响应不同，结果受环境因素影响较大。
土壤微生物生物量碳测定方法 一、呼吸法 通过测定土壤中微生物呼吸释放的CO2量来间接估算土壤微生物生物量碳。该方法的原理基于微生物在代谢过程中产生的CO2量与其生物量碳之间的正相关关系。常用的测定方法包括静态方法和动态方法。 1.静态方法：在采样后立即封闭土壤样品容器，然后测定一定时间内容器内CO2的累积释放量，并利用其中一种模型计算微生物生物量碳。例如，利用静态方法可以测定土壤有机碳浓度和总CO2浓度，通过两者的比值计算微生物生物量碳。 2.动态方法：将土壤样品装入氧气通气的大容器中，测定一定时间内容器中CO2的连续释放量，并通过外推法计算微生物生物量碳。例如，可以通过监测土壤样品容器中CO2的连续释放曲线，然后利用微生物呼吸速率和微生物生物量碳之间的关系计算微生物生物量碳。 二、估算法 利用土壤中微生物生物量碳与其中一种土壤性质之间的相关性来估算土壤微生物生物量碳。常用的估算法包括土壤学习法、土壤酶学法和土壤微生物生态法。 1.土壤学习法：根据不同土壤类型的土壤微生物生物量碳数据进行学习建模，然后根据土壤性质数据进行预测。常用的学习方法包括主成分分析、判别分析和回归分析等。
2.土壤酶学法：通过测定土壤中一些酶活性与微生物生物量碳之间的相关性来预测微生物生物量碳。常用的酶活性指标包括脲酶、蔗糖酶和脱氢气酶等。 3.土壤微生物生态法：通过测定土壤微生物多样性和群落结构与微生物生物量碳之间的相关性来估算微生物生物量碳。常用的方法包括 16SrRNA和ITS基因测序、脂肪酸指纹技术和磷脂脂肪酸分析等。 三、标记法 通过标记的同位素技术测定土壤微生物生物量碳。其中，最常用的标记同位素是^13C和^14C。通过给土壤样品添加同位素标记物并追踪其在土壤中的分布和转化，可以计算微生物生物量碳。 总结起来，土壤微生物生物量碳的测定方法主要包括呼吸法、估算法和标记法等。不同的方法适用于不同的土壤类型和测定目的，综合运用多种方法可以更准确地评估土壤微生物生物量碳。随着技术的不断进步，未来还会涌现出更多准确、快速、简便的土壤微生物生物量碳测定方法。
土壤微生物量及土壤酶活性测定方法 土壤中的微生物是维持土壤生态系统健康的重要组成部分，土壤酶活 性则可以作为评价土壤肥力和生物活性的重要指标。因此，在土壤微生物 量和土壤酶活性测定方面的研究非常重要。本文将介绍几种常用的土壤微 生物量和土壤酶活性的测定方法。 一、土壤微生物量测定方法 1.铺平法：将土壤样品铺平在玻璃板上，使用显微镜对土壤中的微生 物进行直接观察和计数。这种方法的优点是简单易行，但需要大量的时间 和人力。 2.累积碳法：通过测定土壤中的有机碳含量来间接估算土壤微生物量。有机碳水平与微生物量密切相关，所以可以通过测定土壤中的有机碳来推 测微生物的数量和活性。 3.培养法：将土壤样品接种到适当的培养基上进行培养，然后通过菌 落计数或直接计数来估算微生物的数量。这种方法适用于数量较多的微生物，如细菌和真菌。 4.傅里叶变换红外光谱法（FTIR）：通过测量土壤样品的傅里叶变换 红外光谱，分析土壤中的微生物量。该方法具有快速、准确、非破坏性等 优点。 1.浊液法：通过观察测定液中的混浊度来测定土壤中的脲酶、过氧化 氢酶等氧化酶的活性。这种方法简单易行，但对于不同种类的土壤酶效果 不一样。
2.比色法：采用酶底物与酶催化产物之间的化学反应，通过测定反应产物的颜色来估算土壤酶活性。比色法可以用于测定脱氢酶、脱氢酶、脱氧核苷酸酶等酶的活性。 3.荧光法：将有机物和荧光试剂一起加入土壤样品中，经过反应后，在荧光分析仪中测定产生的荧光强度来测定土壤酶的活性。荧光法适用于测定蔗糖酶、酚氧化酶和脱氢酶等酶的活性。 4.比浊法：通过加入酶底物后，观察土壤样品的混浊度来测定土壤中酶的活性。比浊法适用于黄酶、脱氢酶等酶的活性测定。 5.电导法：通过测定土壤样品溶液中的电导率变化来估算土壤中酶的活性。电导法适用于磷酸酶和脱氢酶等酶的活性测定。 总结起来，土壤微生物量和土壤酶活性的测定方法多种多样，选择合适的方法需要考虑样品特性和实验条件等因素。每种方法都有其优点和局限性，研究者应根据需要选取合适的方法进行测定。随着生物信息学和生物化学技术的快速发展，未来会出现更多高通量和高灵敏度的土壤微生物量和酶活性测定方法。
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N 、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass ，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um 3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO 2，根据释放出的CO 2:的量和微生物体矿化率常数Kc 可计算出该土样微生物中的碳量。因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 将熏蒸土壤无损地转移到200mL 聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol ·L -1K 2SO 4（图水比为1:4；w ：v ），振荡30min （300rev ·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL 塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL 聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol ·L -1K 2SO 4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL 上述土壤提取液于150mL 消化管（24mm х295mm ）中，准确加入10mL0.018mol ·L -1K 2Cr 2O 7—12mol ·L -1H 2SO 4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃磷酸浴中煮沸10min （放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL 三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL ，加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol ·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色变为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算 有机碳量（mg ·C ·kg -1）W f V -V M 10412 03）（⨯=
方法:（1）土壤培养称取风干土（高砂土）9克于培养皿，加入1克煤灰（80目），混合均匀。加入1ml新鲜土壤的浸提液作为接种菌液，再加入蒸馏水10ml，在28度恒温条件下7天。(2)氯仿熏蒸将25ml无乙醇氯仿和培养的样品放入抽气皿，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5min，关紧活塞，关闭抽气机。置于黑暗中24小时后取出氯仿，反复抽真空3～5次（每次5min）,排除氯仿。同时做不熏蒸的处理（但同时进行暗培养）。（3）浸提将上述经过氯仿熏蒸与未经过氯仿熏蒸的样品转移【注】到塑料瓶中，加入0.5mol/L K2SO4 Xml,在25度、200rpm 的水平恒温振荡机上振荡30min离心过滤，上TOC仪测定。 【注】为确定样液比，转移前称整个培养皿重(W1)，转移后再称重(W2)，二者之差再减去原来加入的样重（W3），即为转移时样品中的水分重量。样液比＝W3/（W1-W2-W3+VK2SO4）样重W3＝煤灰重＋土重 W1(g)W2(g)水分重量（g)VK2SO4(ml)W3(g) 样液比TOC结果（ppm) 全＋熏蒸41.531.05 5.454050.1100128.2 厌＋熏蒸54.0139.15 4.8640100.2229129.6 好＋熏蒸45.1134.940.1735100.284332.9全47.7242.470.253550.14188.366 厌52.2736.09 6.1835100.242820.56 好42.3532.36-0.0135100.285831.34 样品有机C含量(ppm)Ec(ppm)微生物碳Bc(ppm)全＋熏蒸1165.31106.42456.1 厌＋熏蒸581.4496.71102.7 好＋熏蒸115.7 6.113.4 全59.0 厌84.7 好109.7
土壤微生物生物量的测定方法汇总 操作步骤： 1.准备工作：采集土壤样品，并将土壤样品分为适量的小样品。 2.氯仿熏蒸：将一定量的小样品放入氯仿熏蒸瓶中，然后加入适量的氯仿，并快速将瓶口封紧。 3.震荡：用震荡器对氯仿与土壤样品进行充分的混合震荡，使氯仿充分与土壤样品接触。 4.放置：将瓶子放置在室温下静置一段时间，一般为24小时，使土壤样品中的微生物充分溶解到氯仿中。 5.分液：将上清液和沉淀物分离。上清液中含有溶解在氯仿中的微生物细胞，沉淀物中含有没有溶解的土壤颗粒和其他杂质。 6.校验：对上清液进行校验，可以采用PFLA（没有悬浮杂质时的上清液）或PFLA-Na2CO3（有悬浮杂质时的上清液）校验液。 7.测定：将校验液填入比色皿中，使用分光光度计对比色皿中的液体进行测定，并记录吸光度值。 原理： 氯仿熏蒸法通过将土壤样品与氯仿混合，可以将土壤中的微生物细胞全部溶解到氯仿中。通过将溶解在氯仿中的微生物细胞与校验液比色，在分光光度计上测定吸光度值，从而确定土壤中微生物的生物量。 氯仿熏蒸法的优点： 1.操作简单，不需要复杂的设备和技术支持。
2.适用于各种类型的土壤，包括砂土、壤土、黏土等。 3.测定结果可靠，具有较高的重复性和准确性。 氯仿熏蒸法的缺点： 1.只能测定细菌和放线菌等氧气需氧微生物，不能测定厌氧微生物的生物量。 2.氯仿对环境和人体有一定的毒性和危险性，操作时需要注意安全。总结： 氯仿熏蒸法是一种常用的测定土壤微生物生物量的方法。通过将土壤样品与氯仿混合，将微生物细胞溶解到氯仿中，然后通过比色法测定吸光度值，从而确定土壤中微生物的生物量。氯仿熏蒸法操作简单，适用于各种类型的土壤，且结果可靠。但需要注意操作时的安全性。除了氯仿熏蒸法外，还有其他一些方法也可用于测定土壤微生物生物量，如酚酸法、磷酸化氧化法等，可以根据实际需求选择合适的方法进行测定。
土壤微生物量测定方法 一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法） 1、试剂 （1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。 （2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。 （3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5 mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h即可。 （4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH 2.0]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH 2.0，用高纯度去离子水定容至1 L。要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。 （5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。 （6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。 （7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（）= 1000 mg C L-1]）：取2.1254 g经105℃烘2～3 h 的分析纯邻苯二甲酸氢钾，溶于高纯度去离子水，定容至1 L。 2、仪器设备 碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100 ml）、振荡器（300 r min-1）、可调加液器（50 ml）、可调移液器（5 ml）、烧杯（盛滤液用）（50~100 ml）、聚乙烯提取瓶（100，150 ml），聚乙烯塑料桶（20 L，带螺旋盖），三角瓶（150 ml）、其它常规仪器。 3、操作步骤 （1）土样前处理 新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2 mm），彻底混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。将土壤置于密封的大塑料桶内在25℃条件下预培养7～15 d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1 mol L-1 NaOH 溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。经过预培养的土壤应立即分析。如需保留，应放置于4℃的冷藏箱中，下次使用前需要在上述条件下至少培养24 h。这些过程是为了消除土壤水分限制对微生物的影响，以及植物残体对测定的干扰。
土壤微生物计数法 土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。 1.1培养计数法 1.1.1概要 在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。 稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。 最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。 1.1.2稀释平板法 一、试剂配制 常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。凝固后的培养基可加热溶解后使用。 二、仪器设备 广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。
土壤微生物的分离鉴定及数量测定 （一）培养基的制备 Ⅰ测定微生物总量培养基： 1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 牛肉膏Beefextract5.0g 蛋白胨Peptone10.0g NaCI5.0g 蒸馏水H 2 01000m1 琼脂15～20g PH7.2~7.4 制备步骤： ⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解. ⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌. ⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL. ⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。 ⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。 ⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min. 2.放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基） 可溶性淀粉20g KNO 3 1g K 2HPO 4 0.5g MgSO 4• 7H 2 O 0.5g NaCl 0.5g原0.05g FeSO 4• 7H 2 O 0.01g pH 7.2-7.4 - -可修编.