———————动物细胞培养 实验讲义——————— 实验一动物细胞培养的培养基配制灭菌与仪器操作培训
一、实验目的
1、掌握动物细胞培养相关设备、器材的使用方法。
2、掌握各类器皿、工具的清洗、包装、灭菌方法
3、掌握各类培养基及试剂溶液的配制、灭菌方法
二、实验原理
离体条件下的细胞对任何有害物质均十分敏感，极少的残留物都可能对细胞产生毒副作用，因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，以达到不含任何残留物的要求。而玻璃、橡胶、塑料、布类、纸类等不同类型的材料应采用不同的清洗和消毒、灭菌方法。
细胞培养失败的一个常见原因是微生物污染，有时是操作过中不规范造成的，有时则是相关用品本身有污染造成的，因此在培养细胞前各种用品均需要进行严格消毒或灭菌。
培养液是进行细胞体外培养最基本、最主要的条件之一，掌握常见培养液的成分、性质与配制方法是细胞培养操作者应具有的基本知识和能力。
三、实验内容
1、设备
（1）CO2培养箱
CO2培养箱要提前消毒，有些自己带有高温干热灭菌功能，大部分则宜用“纯水擦洗――95%酒精擦洗——紫外照射杀菌”的消毒方法。
初次开启仪器时要提前一天矫正CO2的浓度值。然后设定好温度等参数。
关于钢瓶的压力阀门控制：钢瓶上的阀门松紧程度不是十分重要，关键靠供气阀门控制压力在0.1（越拧紧压力越高，所以可先把供气阀门打到松弛状态，然后再开钢瓶阀门）（2）倒置显微镜
打开电源开关，确保光路杆调至“观察”状态，选择所需放大倍数的物镜，调节至适当亮度。将培养瓶放在载物台上，转动粗微调调节。如需拍照，则在电脑中打开软件，并将光路杆调至“拍照”状态。
注意不要随便误打开荧光灯，以免浪费其寿命。一旦打开荧光光源后，至少要15分钟后才能关闭，关闭后至少要5分钟才能再次开启。
（3）其他：高压蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱等。
2、器具
（1）玻璃类
细胞培养瓶（有的是塑料的）、吸管、三角烧瓶、玻璃平皿、普通玻璃瓶
方法：玻璃类一般是清水浸泡、洗衣粉液刷洗、浸酸过夜、自来水冲洗、然后依次用去离子水、一蒸水、三蒸水分别润洗5～6次。然后烘干、包扎、灭菌。
（2）塑料类
细胞培养瓶、细胞培养板等
方法：一般是一次性用品，拆包后直接使用；如果要重复使用则参照玻璃器皿的方法，最后照射紫外线消毒。
（3）金属类
剪刀、镊子、灭菌筒等
方法：清洗后用纸包扎，高压灭菌。
（3）其他
纱布、脱脂棉、酒精棉、棉绳、牛皮纸、铝箔、一次性手套、乳胶手套等
方法：主要是用于包扎灭菌上述器具等，一般不存在自身如何灭菌的问题。
3、试剂
（1）基础培养液（如1640、MEM、DMEM、199等）
干粉溶于约800ml超纯水（三蒸水），袋子内面也冲洗收集进去，搅拌助溶（不宜加热）按说明书，再补加NaHCO3(2g)、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。
用1M HCl或1M NaOH调PH至7.1
定容至1L，过滤除菌（蔡氏滤器抽滤）
（2）完全培养基
基础培养基临用前加入小牛血清（10%－20%）。（注：新买血清要先56℃灭能半小时，以杀灭其中的补体物质，消除对细胞的毒性。然后分装，－70℃～－20℃低温冻存）
加抗生素，双抗终浓度一般为青霉素100U/ml、链霉素100U/ml。（传统市售青霉素80万U/瓶，可溶于4ml体积；市售链霉素为100万U/瓶，可溶于5ml体积；用时每L
培养液各加0.5ml。另：青霉素钠1670U/mg,链霉素碱 1000U／mg,硫酸链霉素798U／mg）（3）0.25%胰蛋白酶
称取250mg胰蛋白酶干粉于无菌烧杯中，先用灭菌的D－Hanks（即不含Ca2+、Mg2+和葡萄糖）液调成糊状，然后补足至100ml，搅拌混匀，在磁力搅拌器搅拌至溶解（室温和4℃交替进行）
过滤除菌，分装入青霉素小瓶，低温冻存。
使用前可用无菌7.4% NaHCO3调PH至7.2左右。
（4）洗涤液、平衡盐溶液（Hanks、D-Hanks等）
Hanks液成分:
Na2HP04 H20 0.06 g/L
K H2P04 0.06 g/L
MgSO4 7H200.20 g/L
葡萄糖 1.00 g/L
NaCl 8.00 g/L
CaCl2 0.14 g/L
① 先单独溶解CaCl2于100ml超纯水（或三蒸水）；
② 再单独溶解MgSO4 7H20于100ml超纯水；
③ 再单独溶解其他成分于650ml超纯水(按表中顺序,每次待前一成分充分溶解再加下一种成分)；
④ 将①液和②液缓慢倒入③液中，并不时搅动，防止沉淀。
⑤ 将0.35g NaHCO3溶解于37℃ 100ml超纯水
⑥ 用数滴NaHCO3液溶解0.02g酚红
⑦ 将⑤、⑥液逐滴并搅拌加入④液
⑧ 将⑦液移入容量瓶，定容至1L，混匀。
⑨ 高压灭菌（8磅10min），4℃保存。
四、总结与讨论
1、写出自己所在的小组准备出的全部用品，并说明其处理方法。
2、写出实验室的CO2培养箱和倒置显微镜的型号和操作要领。
3、Hanks液的配制中，为什么钙盐和镁盐需单独溶解？
4、胰酶消化液为什么最好用不含Ca2+、Mg2+的BBS配制？
实验二鸡胚原代细胞的培养
一、实验目的
1、掌握鸡胚组织的取材、剪切、消化技术
2、掌握细胞计数技术
3、掌握原代动物细胞制备过程
4、为细胞传代、冻存等后续实验操作提供材料
二、实验原理
发育中的鸡胚含有大量处于活跃分裂和生长过程的细胞，尤其是其中大量的成纤维细胞，是进行细胞培养良好的取材来源。
动物组织用中均含有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，用胰蛋白酶消化法能去除间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞则容易生长。
三、实验用品
1、器材
超净台（或生物安全柜）、CO2培养箱、倒置显微镜、细胞培养瓶、小玻璃瓶（青霉素小瓶）、不锈钢灭菌筒、100目不锈钢网筛（1个）、灭菌吸管、解剖剪（中号1把；小型眼科剪1把）、镊子（中号镊子2把，弯头眼科镊1把）、吸耳球、计数板、手动计数器、酒精棉、灭菌的平皿（3个）、无菌离心管（10ml规格，2只）。
2、试剂
Hanks液（或D- Hanks液）、DMEM（须含10-20%血清）、0.25%胰蛋白酶
3、材料
9-12日龄鸡胚（即鸡胚预先在培养箱中37℃培养9-12日，大头朝上，每天翻蛋至少2次，用水盘保证湿度）
四、实验步骤
（需提前准备：鸡胚提前9天孵化、开启CO2培养箱、器材用品包扎灭菌并烘干、培养液从冰箱中取出并融化、超净台提前开紫外灯半个小时进行消毒、37℃恒温水浴准备好）
1、取材
取9-12d的鸡胚2个，放入超净台中，大头（气室）朝上放置于蛋托上，酒精棉消毒气室部位。
用镊子敲破和剥去气室部位外壳，换一把镊子挑破尿囊膜和羊膜，再换一把镊子小心取出鸡胚，放于无菌平皿中。
用小剪刀和小镊子配合，去除头和内脏，用Hanks液清洗2-3次，用吸管洗弃清洗液，以洗去红细胞。
2、剪碎
将胚体移入另一无菌平皿中，用Hanks液清洗3次去除血污，切成小块，然后移入无菌青霉素小瓶中，在小瓶内用眼科剪反复剪成1mm3的小块。
3、消化
加入适量0.25%胰蛋白酶液（一般每10个鸡胚加20ml消化液），盖好橡皮塞，置37℃恒温水浴中消化20-30min，每隔5min摇动1次，使组织块散开。视组织块变得疏松、颜色略变白时，从水浴中取出。
4、终止
在超净台中，用吸管轻轻吸弃消化液，加入2-3ml含小牛血清的培养液，以终止消化。然后用吸管反复吹打，使大部分组织块分散成单细胞状态，静置片刻，使未能消化的大块组织自然下沉，然后将上层液通过100目不锈钢网筛，制备细胞悬液。转移入无菌离心管。
5、稀释、接种
离心（1000rpm，10min），弃上清，加入适量培养液，用吸管轻轻吹打混匀。取少量样品计数，根据结果再对拟培养的细胞稀释到浓度为1X106个/ml。将稀释好的细胞悬液接种培养瓶，培养液的量以充分覆盖瓶底为度。
6、培养
将培养瓶置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。培养时，培养瓶的盖子不要拧得太紧，以不会往下掉为度，以便CO2进入。细胞贴壁后延展成长梭形，培养7－10d后即可长成致密单层细胞。
五、结果与讨论
在倒置显微镜上观察和记录鸡胚原代细胞的形态，以及培养细胞的贴壁时间、增殖时间和完全汇合的时间，同时拍摄部分代表性的照片。
六、注意事项
1、消化培养法效率高，可得到大量的原代细胞用于培养，但操作步骤较多，操作时要特别注意无菌操作，以防微生物污染而导致培养失败。
2、对于不同的组织需用不同的消化方法，一般而言，胚胎类软组织用胰蛋白酶和EDTA即可得到理想的消化效果，而对于成体组织由于存在大量的细胞外基质，需用胶原酶，有时配合使用透明质酸酶会加速消化过程。
3、在组织消化过程中，为了防止消化过度影响细胞细胞的贴壁生长，要随时取样进行观察，发现组织已分散成细胞团或单个细胞时应立即终止消化。
4、细胞接种浓度不宜过大，否则会影响细胞贴壁和细胞生长。
5、培养后要随时观察细胞的生长状态和培养液的变化，以便发现异常情况后及时对症处理。
附：细胞计数简要步骤
1、计数板
整个计数室分成9个大方格，本实验用到四角的4个大方格，这些大方格又各自分成16个中方格。(每个大方格容纳体积为“0.1cm × 0.1 cm × 0.01cm ＝ 10－4 ml”) 中央大方格的25个中方格，每个还继续分成16小方格，主要用于红细胞计数，本实验不使用。
2、加样：
将盖玻片放在技术板正中。用毛细管轻轻吹打细胞悬液使其混合均匀后，取少许细胞悬液，在技术板与盖玻片之间加少量细胞悬液，由于毛细作用细胞悬液会充入技术室内。加样量不要过少或带气泡，也不能溢出盖玻片。如出现失败，需洗净计数室并干燥后重新操作。
3、计数
细胞培养液滴入计数室后，须静置2－3min，然后在低倍镜下计数。在显微镜下，用10X 物镜观察计数板四角的大方格中的细胞数，为降低误差，应计四个大方格的总和以求平均值。对于横跨刻度上的细胞，则一般按照“数上不数下，数左不数右”原则。
4、计算
细胞数/每ml体积 ＝ （四个大方格细胞数之和/4）X104
实验三动物细胞的传代培养
一、实验目的
1、掌握细胞培养传代技术
2、掌握判断动物细胞生长状态的要领
3、进一步巩固细胞培养中的无菌操作
二、实验原理
当原代细胞或细胞系增殖到一定密度（一般长成致密单层），则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，以适当比例转移到另一个或几个培养瓶中扩大培养，此过程为传代培养。一般所说的细胞代数即是指细胞传代培养的次数。
三、实验用品
1、器材
超净台、倒置显微镜、CO2培养箱、细胞培养瓶、吸管、三角瓶、胶头等。
2、试剂
Hanks液（或D-Hanks液）、消化液（0.25%胰蛋白酶液）、完全DMEM液（含10%胎牛血清FBS+抗生素）
3、材料
汇合的鸡胚成纤维细胞
四、实验步骤
1、清洗
取80%或接近汇合的培养细胞，使培养瓶的细胞面向上，将培养液倒入盛污物的三角瓶内（或用吸管吸出培养液），用约2ml Hanks液清洗2－3次。
2、消化
向培养瓶内加入消化液约2ml，室温（或37℃）下消化，消化的时间非常关键，须掌握好。
将培养瓶放于倒置显微镜下或靠肉眼观察，镜下当发现细胞质回缩，细胞与细胞间相互接触松散、间隙增大，细胞变圆或出现蜘蛛网状结构时即为适当时候（约3min）。肉眼观察则会发现细胞培养瓶的底面出现类似水汽的一层结构，即发雾现象，这是因为细胞与细胞间出现缝隙后，透光性变得不均匀，从而产生水汽样结构。此时应立即将培养瓶直立并进行下面操作以终止消化。
3、终止
向瓶内加入等量含有小牛血清的培养液以终止消化。拍打培养瓶，促使已松动的细胞从瓶壁脱落。然后用吸管将细胞从瓶壁吹打下来。移入离心管，1000rpm离心10min，弃上清以去除胰蛋白酶。
4、重新悬浮
离心完毕后，重新加入培养液约5ml，混匀，吹打勿用力过猛，以免伤害细胞。
5、接种
按照“1瓶传3瓶”的一般原则，细胞悬液按1：3的比例分配，接种到3个培养瓶内，再向各瓶补加培养液到5ml，作标记后进行培养。此后每3天换液1次，并注意观察细胞传代培养后的形态变化。
五、实验注意事项
初代细胞的首次传代是很重要的，它是建立细胞系的关键时期。首次传代一般应注意以下几点：
1、细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代。把握好传代时机，
在细胞生长到80%－90%汇合时传代最好，过早传代细胞产量少，过晚传代细胞健康状态不佳。
2、各种细胞对消化的反应不同，有的敏感，有的迟钝，因此应根据所用细胞特点制定适宜的消化措施。有的细胞附着瓶壁不牢，用吸管可以从瓶壁上直接吹下来，但这样容易伤害细胞，细胞大片脱落，不易计数，因此，应尽可能采用消化法分散细胞为妥。消化传代良好时，细胞受损害少，细胞悬液均匀，各分装样品中数量误差小，细胞生长速度一致，实验结果可靠性大。
3、消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。用胰蛋白酶与EDTA的混合液进行细胞消化时，要用Hanks液充分洗涤细胞以去除EDTA，因为EDTA的残留会影响细胞的贴壁生长。
六、实验结果与讨论
1、肉眼观察细胞消化时培养瓶底部的变化，并与显微镜下细胞的变化相比较，分析出现这种变化的原因。
2、观察传代培养后不同时间细胞形态变化，并与原代培养细胞进行比较。
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
《实验动物学》复习题及答案 1、小鼠的给药途径有那些？请演示一下 答：灌胃（ig）：左手将动物固定后，右手持装有灌胃针头的注射器，自口角进针，沿上腭向鼠口腔的后下方插入食管。 皮下注射（sc）：常在背部皮下注射。一手固定动物，另一只手注射给药。 腹腔注射（ip）：左手固定动物，右手持注射器，从下腹部外侧，呈45 度角刺入腹腔，进针约3～5mm。 肌内注射（im）：多注射后肢股部肌肉，如一人单独操作，以左手拇指和食指抓住小鼠头部皮肤，小指、无名指和掌部夹住鼠尾及一侧后肢，右手持注射器刺入后肢肌肉给药 尾静脉注射（iv）：将动物固定，鼠尾巴露在外面，用70%～75%的酒精棉球擦尾部，或将鼠尾浸入45～50℃温水中。待尾部左右静脉扩张后，左手拉着尾，右手进针 2、请演示一下大鼠、小鼠的捉持、固定及灌胃给药 答：（1）小鼠的捉持：捉拿时可先用右手抓住并提起鼠尾，置于实验台或鼠笼上，并稍向后拉；用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳后颈背部的皮肤，将鼠置于左手心中，拉直后肢，以无名指及小指按住鼠尾或小鼠的左后肢即可。 （2）大鼠的捉持：大鼠的捉拿时，可戴上手套。实验者可用右手捉住鼠尾，放在实验台或鼠笼上，并稍向后拉；左手掌面向鼠背，食指和中指压住鼠的头顶，拇指和无名指分别从鼠的两腋下插入，将鼠的两前肢卡住；或拽紧鼠后颈及后背皮肤即可。 （3）灌胃（ig）：左手将动物固定后，右手持装有灌胃针头的注射器，自口角进针，沿上腭向鼠口腔的后下方插入食管。 3、大鼠的给药方法有那些？请演示一下常用的给药方法 答：灌胃（ig）：左手将动物固定后，右手持装有灌胃针头的注射器，自口角进针，沿上腭向鼠口腔的后下方插入食管。 皮下注射（sc）：常在背部皮下注射。一手固定动物，另一只手注射给药。 腹腔注射（ip）：左手固定动物，右手持注射器，从下腹部外侧，呈45 度角刺入腹腔，进针约3～5mm。
组织研磨管的使用方法 1.作用：只适用于蛋白提取、RNA提取、基因组DNA提取时的组 织裂解，不做他用； 2.组织研磨管：容量为1.5ml, 里面已经提前放置了研磨珠（有时也 不放置），研磨液（Trizol或RIPA裂解液，有时也不放置）一般在取回后才加入，如果已经加入了研磨液，请离心后才拧开管盖，以免研磨液溢出，对皮肤造成伤害，所以操作时，要小心注意！ 3.组织：把收取的组织分切，用生理盐水或PBS缓冲液把分切的组 织上的血液漂洗干净，然后用医用纱布或滤纸把组织表面的水分吸干，然后放入研磨管（组织体积大小为1颗绿豆至2颗黄豆，根据实际情况决定）中，然后把放入的组织尽量剪碎； 4.存放：上述过程应尽量在最短的时间内操作完毕，立即用液氮冻 结，然后置于液氮或-80℃保存； 5.操作事项：操作时间尽可能短，做好一个，立马放置一个；
实验方法总结（3）：动物模型部分 1、研究肿瘤细胞增殖 (2) 2、研究肿瘤细胞转移 (3) 2.1. 体外(浸润模型) (3) 2.2. 体内(转移模型) (3) 3、研究肿瘤细胞耐药 (5) 3.1. 耐药细胞株的建立 (5) 3.2. 裸鼠移植瘤耐药模型的建立 (6) 从肿瘤起源分，肿瘤动物模型的分类如下： 从研究目的来分，可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析： 1、研究肿瘤细胞增殖 细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照组、阴性对照组、实验组。 取Balb/c裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行肿瘤细胞注射。
XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞，注射体积为100 μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥钠，小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一份4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一份-80℃冻存。 2、研究肿瘤细胞转移 肿瘤转移的模型包括两大类：体外(浸润模型)和体内(转移模型)。体外(浸润模型)：了解肿瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究肿瘤细胞的转移性即肿瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。 2.1. 体外(浸润模型) 例：浸润型脑胶质瘤动物模型的建立 方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种，每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口，剥离骨膜后钻孔(坐标是冠状缝后0.5 cm，矢状缝右侧2.5 cm) 。取2 μL胶质瘤干细胞以1×104 cells /只小鼠的剂量，经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内(深度是2.5 ～3 mm) 。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光( 立体荧光显微镜下) 病理证实和比较，同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以及干细胞标志物等。 2.2. 体内(转移模型)
复习题 1、简述动物实验中3R原则内容及其意义。 Replacement 替代1.尽量使动物一体多用2、用低等动物代替高等动物3、尽量使用高质量动物4、使用恰当的试验设计和统计学方法 Reduction 减少1、用有生命的物体代替动物进行研究2、用数理化方法模拟动物进行研究Refinement 优化1、改善实验设施条件，提高动物实验质量2、改善控制技术，减少对机体的干扰 3R研究的意义 1、作为提升突破技术壁垒能力的载体和具体体现“标尺”，在经济发展和国际贸易中发挥不可替代的重要作用。 2、为科学发展提供了新思路和新方法。 3、体现时代发展、社会进步 2、简述免疫缺陷动物的概念以及生物学特性（主要是裸鼠和联合免疫缺陷鼠）。 指由于先天性遗传突变或用人工方法造成一种或多种免疫系统组成成分缺陷的动物。 一、T淋巴细胞功能缺陷动物：1、裸小鼠（nude mice）：1）被毛生长异常，呈裸体外表。2）无胸腺，仅有胸腺残迹或异常胸腺上皮，不能使T-cell正常分化，导致细胞免疫力低下。幼龄鼠有残存的未分化的上皮细胞。3）B细胞功能正常，NK细胞活力增强。4）繁育能力差，乳腺发育缺损，以雄性纯合子与雌性杂合子繁育。5）T细胞缺陷可通过移植成熟T细胞、胸腺细胞或正常胸腺上皮得到校正。2、裸大鼠(nude rat)：基因符号为rnu，一般特征似裸小鼠。1）发育迟缓，体重为正常大鼠的70%。2）裸大鼠较裸小鼠对多种传染病更敏感。3）比裸小鼠更强壮、寿命更长。4）体型较大，对大范围的外科手术方法较有利。二、联合免疫缺陷动物1、严重联合免疫缺陷小鼠(SCID mice)：突变基因scid位于16号染色体。1）该突变基因造成编码Ig重链和TCR的基因重排异常，抑制B-cell和T-cell前体的正常分化。2）C.B-17Icr为携带来自C57BL/ka小鼠的免疫球蛋白重链Igh-1b等位基因的 BALB/cAnIcr的同源近交系。3）纯合子血清中无免疫球蛋白，淋巴结、胸腺变小，缺乏体液、细胞免疫功能。饲养于SPF环境中。4）通过移植人免疫组织或免疫细胞，可使SCID 小鼠具有人类部分免疫系统，称为SCID-hu小鼠。
实验方法总结：动物模型部分 1、研究肿瘤细胞增殖 (1) 2、研究肿瘤细胞转移 (2) 2.1. 体外(浸润模型) (2) 2.2. 体内(转移模型) (2) 3、研究肿瘤细胞耐药 (4) 3.1. 耐药细胞株的建立 (4) 3.2. 裸鼠移植瘤耐药模型的建立 (5) 从肿瘤起源分，肿瘤动物模型的分类如下： 从研究目的来分，可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析： 1、研究肿瘤细胞增殖 细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照组、阴性对照组、实验组。 取Balb/c裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行肿瘤细胞注射。
XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞，注射体积为100 μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥钠，小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一份4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一份-80℃冻存。 2、研究肿瘤细胞转移 肿瘤转移的模型包括两大类：体外(浸润模型)和体内(转移模型)。体外(浸润模型)：了解肿瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究肿瘤细胞的转移性即肿瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。 2.1. 体外(浸润模型) 例：浸润型脑胶质瘤动物模型的建立 方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种，每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口，剥离骨膜后钻孔(坐标是冠状缝后0.5 cm，矢状缝右侧2.5 cm) 。取2 μL胶质瘤干细胞以1×104 cells /只小鼠的剂量，经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内(深度是2.5 ～3 mm) 。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光( 立体荧光显微镜下) 病理证实和比较，同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以及干细胞标志物等。 2.2. 体内(转移模型)
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
名词解释：实验动物（laboratory animal）：指经人工培育，对其携带的微生物、寄生虫进行严格控制，遗传背景明确，可用于科学实验、药品、生物制品的生产和检定及其它科学研究的动物。 实验用动物：是指一切用于实验的动物，除了符合严格要求的实验动物外，还包括家畜和野生动物等。 实验动物与实验用动物：遗传控制不同,微生物控制等级不同,培育的形质和目标不同。 人类疾病的动物模型：是指医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关材料。 实验动物标准化：遗传质量标准化微生物质量标准化环境标准化营养标准化 按遗传控制标准，实验动物分为：近交系（CH3），突变系（裸鼠），杂交系（F1），封闭群（远交系）（KM小鼠，wister大鼠） 按基因型分：1、同基因型动物（如近交系、F1代） 2、不同基因型动物（如封闭群） 按微生物控制程度分级：普通级，清洁级，SPF级，无菌级（2001年版的国家标准中，大小鼠取消普通级动物，犬、猴只分普通级和SPF级，豚鼠、地鼠和兔仍然分4级） SPF动物定义：除清洁动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原。（屏障环境中饲养，种子群来源于无菌动物或剖腹产动物。饲养管理同清洁动物） 无菌动物的特点：形态学及生理学特点： ①形态学：盲肠肥大（增大5～6倍），肠壁薄，易发肠扭转。心脏、肝脏、脾脏相对较小。 ②生理学: 血中无抗体，巨噬细胞吞噬能力弱。体不能合成维生素B和K。无菌鸡生长较快、无菌豚鼠和无菌兔生长较慢。无菌大小鼠与普通大小鼠生长速度相同。 （3)饲养要求：隔离环境中饲养，种子群来源于剖腹产动物或无菌卵的孵化。由于肠道无菌，饲养困难，应注意添加各种维生素。每2～4周检查一次动物的生活环境和粪便标本。 悉生动物：概念：悉生动物是指在无菌动物体植入已知微生物的动物。又称已知菌动物。植入一种细菌的动物叫单菌动物；植入两种细菌的动物叫双菌动物；植入三种细菌的动物叫三菌动物；植入多种细菌的动物叫多菌动物。（由于肠道接种有利于消化吸收的细菌，故饲养较无菌动物容易，形态学和生理学方面与普通动物无异。） 近交系：经至少连续20代的全同胞兄妹交配培育而成，品系所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。 特点： 1、其基因纯合度达到98.6%，个体差异小，似同卵双生反应一致重复性好，用少量动物即可获得精确度很高的实验结果，个体相互之间可以接受皮肤、器官移植。 2、隐性基因纯合使许多病态性状得以暴露，可获得大量先天性畸形及先天性疾病的动物模型.如高血压、白障、糖尿病.动物模型。 缺点：出现近交衰退。近交衰退是近交过程中动物群体由于基因分离与纯合发生一系列不利于个体或群体发育的变化和现象。
实验动物学复习题答案（完整版改） 实验动物：指经人工培育，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确，来源清楚，用于科学研究、教学、生产、检定及其他科学实验的动物。 实验用动物：广义指一切用于科学实验的动物，也包括试验动物。 动物实验：为科研、教学、药物检定等目的，对实验动物进行物理、化学、生物等因素处理，观察其反应，获得实验数据，解决科研中问题的过程。 实验动物学：研究动物实验和实验动物的科学。以实验动物为研究对象，专门研究实验动物的饲养繁殖及育种、实验动物的标准化、实验动物的质量监测、野生动物的实验动物化及其开发应用以及动物实验技术的科学。 实验动物环境：是指人工控制的, 供实验动物繁殖、生长的特定场所及有关条件, 即围绕实验动物所有事物的总和。 实验动物设施：界定实验动物生存空间、维持其所需的建筑物和设备等。 AEIR:生物科学研究四个基本条件：animal、equipment、information、reagent（试剂） 根据对微生物、寄生虫的控制程度将实验动物划分为4个等级：普通级动物、清洁动物、无特定病原体动物、无菌动物。 普通级动物是微生物和寄生虫控制级别最低的按动物；要求不携带所规定的人兽共患病病原和动物烈性传染病病原，以及人兽共患寄生虫。 清洁动物是根据我国国情而设立的等级动物，除普通级动物应排除的病原和寄生虫外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原和寄生虫。 无特定病原体动物通常被称为SPF动物，除清洁动物应排除的病原和寄生虫外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学按干扰大的病原和寄生虫。 无菌动物指无可检出一切生命体的动物。 导致人兽共患病的主要病原体 1、病毒—淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、狂犬病病毒、猕猴疱疹病毒1型（B病毒）、汉坦病毒（流行性出血热病毒）。 2、细菌—沙门菌、布鲁杆菌、志贺菌、结核分歧杆菌、钩端螺旋体。 3、真菌—皮肤病原真菌。 4、寄生虫—弓形虫。 1988年, 原国家科委颁布了《实验动物管理条例》, 标志着我国实验动物工作走上了行政法规管理的轨道。2001年《实验动物国家标准》的颁布和实施，普通级大鼠和小鼠将被禁止使用。 “3R”原则：替代（replacement）原则、减少（reduction）原则、优化（refinement）原则。 为阐明人类疾病的发生机制或建立治疗方法而制作的、具有人类疾病模拟表现的实验动物，称人类疾病动物模型。 人类疾病动物模型发展至今具有比较完善的理论和方法。通常可分为诱发性疾病动物模型、自发性疾病动物模型、中医征候动物模型等类型。 品种是人们根据不同需要而对动物进行改良、选择，即定向培育，并具有某种特定外形和生物学特性的动物群体，其特性能较稳定的遗传。品系即“株”，指来源明确，并采用某种交配方法繁殖，而具有相似的外貌、独特的生物学特征和稳定的遗传特性，可用于不同实验目的的动物群体。 近交系；经至少连续20代的全同胞兄妹交配或亲代与子代交配培育而成。命名：由1～4个大写英文字母组成；大写英文字母开头，结合数字命名。特点：基因纯合性，遗传稳定性，遗传同源性，表型一致性，独特性，可分变性，分布广泛性，资料可查性。近交：从一个动物群体中选用血缘关系比较接近的雌雄个体，即有共同祖先的兄妹、母子、父女进行交配。 封闭群；以非近亲交配方式繁殖生产的一个实验动物种群，在不从其外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4代以上，称为一个封闭群，或叫远交群。特点：1、一定的杂合性：不引入新的基因，又不使群体内基因丢失。2、相对的稳定性：群体在一定范围内保持相对稳定的遗传特征。3、个体差异取决于祖代动物。 4、较强的繁殖力、抗病力。 5、群体易保存有模型价值的突变基因。命名：用2－4个大写英文字母命名。如:KM,ICR,LACA. N：NIH由美国国立卫生研究院保存的NIH小鼠。 应用：1、类似人群体遗传的异质性组成，在药物筛选、毒性试验方面有不可替代的作用。2、可大量供应，用于预试验、教学。3、携带突变基因，评估群体对自发或诱发突变的遗传负荷能力。 系统杂交动物；由不同品系或种群之间杂交产生的后代。特点：1、杂交优势，克服了近交引起的近交衰退。 2、遗传与表型上的均质性；具有相同的基因型。 3、分布广泛。应用：1、干细胞研究。2、移植免疫研究。 3、细胞动力学研究。 4、单抗研究 近交衰退；指在近交过程中动物群体由于基因分离和纯合而产生的不利于个体和群体发育的现象。包括：1.由于有害隐性基因的纯合，出现遗传缺陷或某种疾病发生率的提高2.影响繁育如产子数下降、母性不良3.个体发育不良，对环境的适应性差 亚系；育成的近交系在繁育过程中，由于残余杂合基因的分离、基因突变的产生、抽样误差导致部分遗传组成改变而形成遗传差异的近交系动物群体。 支系；由于饲养环境的改变，或对动物进行人为的技术处理，对某些动物特征产生影响，形成不同的支系。同源性；在近交系中（突变系），所有动物可追溯到原始的一对共同祖先。遗传同源性使近交系有3个重要特征：⑴品系内个体间可接受组织移植⑵品系内单个个体的监测可得知品系整体基因类型⑶从一个群体内可分离出遗传上相同的亚群体
二十种常见实验动物模型 一、缺铁性贫血动物模型 缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）是体内用来合成血红蛋白（HGB）的贮存铁缺乏，HGB合成减少而导致的小细胞低色素性贫血，主要发生于以下情况：（1）铁需求增加而摄入不足，见于饮食中缺铁的婴幼儿、青少年、孕妇和哺乳期妇女。（2）铁吸收不良，见于胃酸缺乏、小肠粘膜病变、肠道功能紊乱、胃空肠吻合术后以及服用抗酸和H2受体及抗剂等药物等情况。（3）铁丢失过多，见于反复多次小量失血，如钩虫病、月经量过多等。 IDA是一种多发性疾病，据报道，在多数发展中国家，约2/3的儿童和育龄妇女缺铁，其中1/3患IDA，因此，研究IDA的预防和治疗具有重要的意义。在这些研究中，缺铁性贫血的动物模型（Animal model of IDA），又是实施研究的基础工具。常见的IDA动物模型的构建技术如下： 实验动物：一般选用SD大鼠，4周龄，雌雄不拘，体重65g左右，HGB≥130g/L。 建模方法：低铁饲料加多次少量放血法。低铁饲料一般参照AOAC 配方配制，采用EDTA浸泡处理以去除饲料中的铁，饲料中的含铁量是诱导SD大鼠形成缺铁性贫血模型的关键，现有研究表明，饲喂含铁量<15.63mg/Kg的饲料35天，SD大鼠出现典型IDA表现，而饲喂
含铁40.30mg/Kg的饲料SD大鼠出现缺铁，但并不表现贫血症状。建模时一般采用去离子水作为动物饮水，以排除饮水中铁离子的影响。少量多次放血主要用于模拟反复多次小量失血导致的铁丢失，还可以加速贫血的形成。放血一般在低铁饲料饲喂2周后进行，常用尾静脉放血法，1～1.5ml/次，2次/周。 模型指标：（1）HGB≤100g/L；（2）血象：红细胞体积较正常红细胞偏小，大小不一，中心淡染区扩大，MCV减小、MCHC降低；（3）血清铁（SI）降低，常小于10μmol/L，血清总铁结合力（TIBC）增高，常大于60μmol/L。 需要指出的是，以上模型不能用于铁吸收不良相关IDA的防治研究。根据具体的研究需要，也可以适当调整建模方法。 二、白血病动物模型 用免疫耐受性强的人类胎儿骨片植入重症联合免疫缺陷病(SCID)小鼠皮下，出于人类造血细胞与造血微环境均植入小鼠，建立具有人类造血功能的SCID小鼠模型称为SCID－hu小鼠。再将髓系白血病患者的骨髓细胞植入SCID－hu小鼠皮下的人类胎儿骨片内，植入的髓系白血病细胞选择性生长在SCID－hu小鼠体内的人类造血微环境中，即为人类髓系白血病的小鼠模型。SCID小鼠是由于其scid所致。T、B淋巴细胞功能联合缺陷，这种小鼠能接受人类器官移植物。 造模方法：
《实验动物学》复习资料 第一课 l、实验动物：是指经人工饲养培育、来源清楚、遗传背景明确、对其携带的微生物及寄生虫实行控制、应用于科学研究、药品与生物品生产和检定的动物。 要求：遗传学要求、微生物及寄生虫要求、应用要求（主要用于科学研究） 国标实验动物:小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬和猴； 2、实验用动物：是指用于科学实验的所有动物，它包括实验动物，也包括野生动物、经济动物和家畜等。 3、实验动物学：以实验动物为对象，并将培育的实验动物应用于生命科学研究的一门综合性学科。 AEIR要素（名词）：在生命科学领域里进行实验研究有四个支撑条件，即AEIR要素。即A：Animal（实验动物）；E：Equipment（仪器设备）；I：Information（情报信息）；R：Reagent（化学试剂） 4、动物福利：是指人为提供给动物的相应物质条件和采用的行为方式，要保证动物在健康舒适的状态下生存，使动物处于生理和心理愉快的感受状态。 动物享有如下五大自由，是保障动物福利的基本原则：1、生理享有不受饥渴的自由。2、环境享有生活舒适的自由。3、卫生享有不受痛苦伤害和疾病的自由。4、心理享有生活无恐惧和悲伤感的自由。5、心理享有表达天性的自由。 5、“3R”指的是Reduction:：“减少”:在动物实验时，使用较少量的动物获取同样多的试验数据或使用一定数量的动物能获得更多的试验数据的科学方法，减少的目的不仅仅是降低成本，而是在用最少的动物达到所需要的目的，同时也是对动物的一种保护。Replacement：“替代”:指使用没有知觉的实验材料代替活体动物，或使用低等动物替代高等动物进行试验，并获得相同实验效果的科学方法。Refinement：“优化”:在必须使用动物进行有关实验时，要尽量减少非人道程序对动物的影响范围和程度，可通过改进和完善实验程序，避免减少或减轻给动物造成的疼痛和不安，或为动物提供适宜的生活条件，已保证动物的健康和康乐，保证动物实验结果可靠性和提高实验动物福利的科学方法。 6、不通过伦理审查的情况： （一）缺少动物实验项目实施或动物伤害的客观理由和必要性的； （二）不提供足够举证或申报审查的材料不全或不真实的； （三）从事直接接触实验动物的生产、运输、研究和使用的人员未经过专业培训或明显违反实验动物福利伦理原则要求的； （四）实验动物的生产、运输、实验环境达不到相应等级的实验动物环境设施国家标准的；实验动物的饲料、笼具、垫料不合格的； （五）动物实验项目的设计或实施不科学。 （六）动物实验项目的设计或实施中没有体现善待动物、关爱动物生命，没有通过改进和完善实验程序，减轻或减少动物的疼痛和痛苦，减少动物不必要的处死和处死的数量。在处死动物方法上，没有选择更有效的减少或缩短动物痛苦方法的； （七）活体解剖动物或手术时不采取麻醉方法的； （八）动物实验的方法和目的不符合我国传统的道德伦理标准或国际惯例或属于国家明令禁止的各类动物实验。动物实验目的、结果与当代社会的期望、与科学的道德伦理相违背的； （九）没有充分理由对同一实验进行重复实验的； （十）严重违反实验动物福利伦理审查原则的其它动物实验。 7、行政许可：生产许可证、使用许可证 8、国际实验动物科学委员会（ICLAS）：由联合国科教文组织、医疗科学国际组织和生命科学会联合成立，负责国际实验动物科学事业发展的指导和协调工作。
实验动物学重点整理 1大小鼠年龄、体重、寿命的比较数据？ 成年动物的年龄、体重和寿命比较 小鼠大鼠 成年日龄（天）65-90 85-110 成年体重（克）20-28 200-280 平均寿命（年）1-2 2-3 2动物实验的对照类型？ （一）空白对照： 不给任何措施的情况下观察动物自发变化的规律。家兔白细胞数每天上下午有周期性的生物钟变化。 （二）实验对照： 采用与实验组相同操作条件下对照，如给药实验中的溶媒（Nacl），手术，注射以及观察时的抚摩等都可以对动物发生影响。有人报告，针刺犬的人中穴对休克、心脏血液动力学有改变，但采用空白对照（不针刺）不够，应该设有针刺其它部位或穴部的实验对照。 （三）有效（标准）对照： 常用于药物研究。对一新药疗效可用一已知有效药或能引起标准反应药物做对照，可考核实验方法可靠性，又可通过比较，了解新药疗效和特点（普鲁卡因---对皮肤黏膜穿透力弱，用纳塞卡因---穿透力强，作用快、持久）。（四）配对对照： 同一个体不同眼睛比较对照期和实验期差异（左眼试验，右眼对照）；同一种动物后代分成左右两部分进行对照和实验以比较差异，此法可大大减少抽样误差。实验中可用同卵双胎或同窝动物。 （五）组间对照： 将实验对象分成两组或几组比较其差异。这种对照个体差异和抽样误差比较大，可用交叉对照方法以减少误差。观察某药物疗效可用两组犬先分别做一次实验和对照，再相互交换，以原实验组做对照组，原对照组做实验组重复第一次实验，观察疗效或影响，切记检查指标和条件要等同。 （六）历史对照与正常值对照： 此种对照要慎重，similar background ---条件、背景、指标和技术方法相同才进行对比，否则得出不恰当的甚至错误结论。 3转基因动物的概念、制备过程? 转基因动物： 用物理、化学、生物手段将确定外源基因通过生殖细胞或早期胚胎导入动物染色体，其基因组内稳定整合导入外源基因，能遗传给后代的一类动物,使其获得人类需要新功能。 技术程序：
实验十五动物细胞培养技术及其应用 一．实验目的 通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。 二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。 三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液 管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。 四．实验方法与步骤 （一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。 胰蛋白酶液： 称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛 血清。 细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,
实验动物科学（Laboratory animal science）：是研究实验动物及其应用的一门科学，包括实验动物和动物实验。 实验动物：实验动物是指经人工饲养、繁育，对其携带的微生物及寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，可用于科学实验、药品、生物制品的生产和检定及其它科学研究的动物。 动物实验：为科研、教学、药品检定等目的，对动物进行物理、化学和生物因素处理，观察其反应，获得实验数据，解决科研中的问题 实验用动物：指所有以科研、实验、生产、文字教学等为目的而使用的动物。可包括有生命的和死亡的家畜家禽和野生动物, 实验动物和实验用动物的区别：遗传控制不同，微生物控制等级不同，培育的形质和目标不同。 人类疾病的动物模型：指生物医学研究中所建立的、具有人类疾病模拟性表现的动物疾病模型和相关的模型系统材料。 人类疾病动物模型的设计原则：相似性（复制的模型尽可能近似与人类疾病）；重复性；可靠性；适用性和可控性；易行性和经济性 动物模型复制方法：物理诱发，化学诱发，生物诱发，复合方法，遗传工程方法。 动物模型的优点:避免了在人类进行试验所带来的风险；临床上平时不易见到的疾病可用动物随时复制出来；可以克服人类某些疾病潜伏期长、病程长和发病率低的缺点；可以严格控制试验条件，增加试验的可比性；可以简化试验操作和样品收集；有助于更全面的认识疾病和疾病本质。
实验动物模型按产生的原因分类可分为：诱发性动物模型，自发性动物模型，阴性动物模型，孤立动物模型。 诱发性动物模型：人为地诱发动物形成类似人类疾病模型，具有能在短时间内复制出大量疾病模型，并能严格控制各种条件使复制出来的疾病模型适合研究目的需要。优点：制作方法简便，实验条件容易控制，重复性好，在短时间内可诱导出大量疾病模型.缺点：诱发性动物模型是通过人为限定方式产生的，多数情况下与临床所见自然发生的疾病有一定差异，况且许多人类疾病目前还不能用人工诱发的方法复制,因而又有一定的局限性。 诱发型动物模型有肺水肿动物模型，烧伤动物模型，肝硬化动物模型。自发性动物模型：指实验动物未经任何有意识的人工处置，在自然条件所形成的疾病模型，包括人工培育的突变系和近交系的各种疾病模型。优点:动物疾病的发生、发展和人类相应的疾病很相似，均是在自然条件下发生的疾病，其应用价值很高。缺点：这类模型的来源较困难，不可能大量应用。 基因敲除动物：指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因剔除或用其他顺序相近的基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。 转基因动物：是指用实验的方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定地整合并可以表达和传与后代的一类动物。 动物实验设计的三大基本原则：对照的原则，随机化原则，重复原则，（弹性原则，平衡原则，最经济原则）。
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
实验动物学重点
1.实验动物学绪论 2.实验动物质量控制 3.常用实验动物 4.实验动物营养与饲料 5.实验动物环境和设施 6.基因工程动物 7.“3Rs”理论及其研究进展 8.怎样才能作好动物实验 实验动物学绪论 实验动物学：以生物学、动物科学、动物医学、医学,药理学、毒理学等学科为基础，综合发展而形成的一门覆盖 面极广的边缘学科。 实验动物学包括：实验动物，实验动物医学，比较医学，动物实验 实验动物：是指经人工培育的、遗传背景清楚、对其携带微生物和寄生虫实行控制、用于科学实验、教学、检定及 药品、生物制品生产的动物。 实验用动物：实验动物、家畜、野生动物、伴侣动物 概况：实验动物科学内容：实验动物、实验动物医学、比较医学、动物实验 1988年，国家科委发布《实验动物管理条例》 1996年10月，《北京市实验动物管理条例》出台，于2005年1月1日实施 实验动物伦理：是人与实验动物关系的伦理信念、道德态度和行为规范。主要体现在尊重实验动物的价值和权利。 实验动物福利：实验动物的一种康乐状态。在此状态下，其基本需求得到满足，而痛苦被减至最小。 五项基本福利：一，提供适当的清洁饮水和保持健康和精力所需要的食物，使动物不受饥渴之苦 二，提供适当的栖息场所，能够舒适地休息
和睡眠，使动物不受困顿不适之苦 三，做好防疫，预防疾病和给患病动物及时诊治，使动物不受疼痛、伤病之苦 四，保证拥有良好的条件和处置（包括安乐死），使动物不受恐惧和精神上的痛苦 五，提供足够的空间、适当的设施以及与同类动物伙伴在一起，使动物能够自由表达正常的习性 动物实验需要考虑实验动物伦理的几个环节：实验目的确定和必要性评估、实验设计遵循3Rs原则、实验操作过程避免或减轻动物疼痛及恐惧、日常饲养及护理、安乐死 CRO：Contract Research Organization Include: Clinical trial、Preclinical research AAALAC认证（国际实验动物管理评估和认证协会）实验动物学发展趋势：基因修饰技术运用； 实验动物福利与“3Rs”原则； 实验动物商品化及SPF动物广泛应用； 人源化小鼠模型的建立。 实验动物科学发展简史：1909年，Prof. Little 采用近交方法 培育出首个近交系小鼠DBA 1943年，美国Dr. Reynier研制出第一台金属隔离器，饲养无菌 大鼠 1948年，美国成立实验动物管理小组，后又成立实验动物科 学学会（AALAS） 1966年，美国国会批准《实验动物福利法案》 1982年，第一例转基因小鼠问世 实验动物学、比较医学等专业的设立及建立相应培训制度 我国实验动物科学发展概况：1918年，原北平中央防疫处开 3
绪论实验动物科学管理练习题 1.我国第一部实验动物法规名称是《实验动物管理条例》；（P4） 2.动物福利法的核心可以概括为让动物在康乐的状态下生存（善待活着的动物）、在无痛苦的状态下死亡（减少死亡的痛苦）；（P6/百度） 3.普通动物只能用于教学实验、某些科研工作的预实验，不适用于科学研究和研究生毕业论文等实验；（P27） 4.实验动物环境因素包括物理因素、化学因素、生物因素和居住因素；（P47） 5.实验动物是指：其携带的微生物、遗传及营养环境因子实行控制，来源清楚，遗传背景明确；为满足科学研究，教学，药品，生物制品的生产和检定，及其他科学实验的需要而驯养，繁殖，育成的动物；（P2） 6.野生动物演变为实验动物的过程为：野生动物家畜化，家畜动物实验动物化和实验动物标准化；（P3） 7.《实验动物学》包含的内容可简述为：实验动物和动物实验两部分。（P1） 8.“3R”原则是指减少（Reduction）、优化（Refinement）、替代（Replacement）；（P152） 9.实验用动物包括：实验动物、经济动物、野生动物和观赏动物；（P2） 第二章实验动物遗传质量及其对动物实验的影响练习题 1.下列近交系小鼠命名书写不正确的是（B）。(P9-P10) A. 615 BALB/C C. C57BL/6 D. A 2.某小鼠毛色基因型为：A_BBC_,该小鼠毛色是（C）。（P18) A.白色 B. 黑色 C.野生色 D.棕色 3.在遗传检测中，观察皮肤移植成功与否，需要：（B）。(P17) A.60天 B.100天 C.10天 D.1年 4.下列正确书写的封闭群实验小鼠应为（B）。(P12) A．SHJTU：KM B. Shjtu:KM C.SHJTU/KM D. Shjtu/KM 5.下列不属于封闭群实验动物的遗传特性是（B）。(P12-P13) A.基因库大 B.多基因之间丧失平衡 C.个体间差异程度主要取决于其祖代起源 D.群体基因频率基本保持稳定 6.实验动物遗传质量的控制，包括和。 7.近交系动物每代近交系数上升率为19%。封闭群动物每代近交系数上升率应控制在1%以下。(PPT2/46) 8.下列不属于近交系小鼠遗传特性的是（C）。(P10-P11) A. 基因纯合性高 B.个体间均一性好 C.基因库大 D.背景资料多 9.简述“近交系动物”。 答：经至少连续20代的全同胞兄妹交配培育而成，同品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先，该品系称为近交系。经连续20代以上亲代与子代的交配，与全同胞兄妹的交配有同等效果。近交系的近交系数应大于99%。（P9） 10.简述“封闭群动物”。 答：以非近交交配方式进行繁殖生产的一个实验动物种群，在不从其外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4代以上，称为一个封闭群，或叫远交群。（P12) 11.用复隐性有色小鼠DBA（雄性，毛色基因型为：aabbCC)对某白化小鼠（雌性）进行毛色基因交配试验，它们的F1代全都是野生色小鼠： 1）用简图叙述测定过程。 2）该白化小鼠毛色基因是否纯合？