胶体金技术的发展原理及制
备方法
-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
胶体金技术的发展原理及制备方法
1971年Faulk和Taylor首先将胶体金应用于免疫细胞化学研究，1974年Romano建立了间接免疫金染色法，从此胶体金作为新型的免疫标记技术得到迅速发展。
由胶体金标记技术发展起来的胶体金免疫快速诊断技术主要有两种：快速斑点免疫金渗滤法和胶体金免疫层析法。后者具有操作简便（浸入液体中就行）、快速（全程5~10分钟搞定）、无需仪器设备（结果目测就OK）、试剂稳定、成品易于保存（保质期1~2年）等优点，是科学研究和临床诊断的有力工具。
胶体金（colloidal gold）即胶体状态的金单质，因为其单质粒径非常小可以分散于溶液中形成胶体，故名胶体金。胶体金的常规制备方法是用还原剂还原氯金酸（HAuCl4，橘黄色晶体，易潮解，氯金酸合成见下图）里的金元素形成金胶体颗粒。这种胶体颗粒在碱性环境下带上负电荷，可与蛋白质的正电荷基团牢固结合，对蛋白进行标记，用于后续的检测，如制成胶体金试纸条（卡）进行物质的检测。
还原氯金酸的化合物很多，通常我们选择柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）。当用1%柠檬酸三钠还原100 mL 0.01%金氯酸时，不同体积比可以得到不同粒径和颜色的胶体金哦！
制备胶体金步骤简单（见下图），重点是制备过程所用到的材料都必须是彻底清洁的。例如水至少是双蒸水，玻璃棒、玻璃容器等要酸洗后冲洗干净并且最好是硅化的，制备好的胶体金可以加入0.02％ NaN3在洁净玻璃容器内长期存放。
适合于胶体金试纸条（卡）的胶体金粒径在20~40 nm之间为宜，制备的胶体金溶液呈红色，胶体金被置于试纸条（卡）的样品垫下游。当液体样品滴加
后，液体溶解胶体金并带动其与样品中的抗原（抗体），在硝酸纤维素膜的毛细作用下从一端慢慢渗移到吸收垫一端，利用抗体/抗原特异性结合及胶休金的显色（红色）反应，可以检测抗原／抗体存在与否。
胶体金试纸条（卡）主要分为双抗夹心法和竞争法两类，前者适合检测大分子物质，后者适合检测小分子物质。两种试纸条（卡）的原理见下图：
除了这两种常规的方法，间接法也用于胶体金试纸条（卡）的制备，其原理见下图：
实验四 胶体金快速检测技术试验 一、胶体金试纸条诊断技术的原理： 以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/抗体。 二、层析法免疫胶体金检测方法的优点： ? 1.方便使用，体现在操作简单，不需经过特殊培训。 ? 2.短时间获得检测结果，一般10－15分钟即可得出结论。? 3.不同环境下的稳定性好，不需冷藏。 ? 4.相比而言，其生产成本和检测成本均较低。 ? 5.检测标本种类多：可用于查血、尿液或粪便。 ?三、应用 ?猪伪狂犬病抗体快速金标检测卡 ?原理：猪伪狂犬抗体检测试剂盒（胶体金法），系采用国际最先进的胶体金免疫层析技术检测样本（全血、血清、血浆）中抗猪伪狂犬抗体的方法。整个试验只需20分钟，操作简便、快速、准确，灵敏度高、结果直观、容易判定。 ? 1.操作方法： ?①在检测卡的加样孔内加入100μl待检血清或血液样品。
?②将检测卡平放于桌面上，在室温下静置5-20分钟内判定结果。 超过20分钟的结果只能作为参考。 ? 2.结果判定： ??阳性：在观察孔内，检测线区（T）及对照线区（C）同时出现紫红色线。猪伪狂犬抗体滴度越高，检测线（T）颜色越深。??弱阳性：在观察孔内，检测线区（T）及对照线区（C）同时出现紫红色线，但检测线区（T）出现的颜色很浅。 ??阴性：在观察孔内，只有对照线区（C）出现一条紫红色线。??失效：在观察孔内，对照线区（C）和检测线区（T）都不出现色线；或仅检测线区（T）出现色线。 ?猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病抗体快速金标检测卡原理、操作方法、结果判定与猪伪狂犬病抗体快速金标检测卡的基本相同 ? ? ? ?
免疫层析试纸包被技术简介 试纸生产 过程中一般有三种 溶液的包被处理，即 质控溶液，检测溶 液，和结合物溶液 （胶体金）。质控和 检测溶液就是C/T 线上包被的溶液。 在免疫层 析试纸硝酸纤维素 膜表面进行 C/T线的包被，是试纸生产制作的关键环节之一。免疫诊断试剂中使用的硝酸纤维素膜有两类，一种是免疫渗滤产品用的，按孔径选择一般采用0.45um-1.2um的膜，与分子生物学中用的印迹转移膜一样。Whatman Schleicher & Schuell的膜属于纯采用100%的纯硝酸纤维素，蛋白结合能力较高。另一类即免疫层析用膜，一般按侧向流动速度来划分，常用的范围一般在120-180秒/4cm。目前市场上的硝酸 纤维素膜材以带塑料底衬 为主，也有部分的膜不带 底衬。不带底衬的膜需注 意膜面的正反面，其光滑 度有适当差别。 鉴于流动封闭技 术的普及，C/T线的包被 目前流行先将膜粘贴在塑 料支持底板上，然后直接 将塑料板放入仪器上进行 划线操作，干燥后进行其 他部分的贴板组装，这种 划膜工艺可简称为划板。 但部分产品的工艺要求先直接在膜上划好C/T线，然后用特定配方的溶液将膜进行浸泡封闭处理，干燥后再贴膜及其他部分材料，这种划膜工艺可简称为划膜。 在结合物溶液（胶体金）的包被上，较多的用户倾向于用气动喷头进行定量操作。在科研及研发项目中，往往喷一条线或几条线就够用了，因此在单维往复平台上一次喷一条线也可接受。鉴于胶体金膜切条宽度一般在 3--7mm，不方便一条条依次地在移动平台上固定和取放。因此在批量生产过程中，一般建议采用成片的胶体金垫，用三维平台往复来回地间隔喷线，一次即可喷出二三十条。此后将喷好的金干燥再裁切成条，这样的操作会效率高，适合规模生产。 在某些免疫层析试纸产品生产工艺中，层析膜材或样品垫膜材需要用特定溶液进行整平面包被，要求效果均匀，如层析膜和样品垫的特定封闭处理。
附件3 食品中罗丹明B的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201703） 1范围 本方法规定了食品中罗丹明B的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于辣椒粉和辣椒酱中罗丹明B的快速测定。 2原理 本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中罗丹明B经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，罗丹明B与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中罗丹明B进行定性判定。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 3.1试剂 ，用水溶解并稀释至刻度，制成0.2mol/L溶液A；称取31.21g磷酸二氢钠(，用水溶解并稀释至刻度，制成0.2mol/L溶液B。将溶液A与溶液B按照体积比67:33混匀，制成pH7.1磷酸盐缓冲液。 3.2参考物质 罗丹明B参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥98.6% 表1 罗丹明B参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量 注：或等同可溯源物质。 3.3标准溶液配制 ，置于10mL容量瓶中，用甲醇（，摇匀，制成浓度为1mg/mL的罗丹明B标准储备液。冷藏，有效期6个月。 ，置于100mL容量瓶中，用甲醇（，摇匀，制成1μg/mL的罗丹明B标准中间液A。临用新制。，置于10mL容量瓶中，用甲醇（，摇匀，制成100ng/mL的罗丹明B标准中间液B。临用新制。 3.4材料 ，1000mg/6ml。 ，在产品有效期内使用）。 4仪器和设备
4.1移液器：200μL、1mL和10mL。 4.2涡旋混合器。 4.3离心机：转速≥4000r/min。 4.4电子天平：感量为0.01g。 4.5振荡器。 4.6样品浓缩仪：如有需要。 4.7环境条件：温度：15℃—25℃，相对湿度≤60%。 5分析步骤 5.1试样制备 取具有代表性样品约500g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。 5.2试样提取和净化 准确称取试样2g（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，依次加入20mL提取剂（，振荡提取3min，以5000r/min离心5min。上清液待净化。 吸取5mL提取剂（，流出液弃去。将上清液全部转移至固相萃取小柱中，流出液弃去。再加入20mL提取剂（，流出液弃去。用5mL甲醇洗脱小柱，收集洗脱液吹干。精密加入500μL复溶液（，涡旋混合1min，作为待测液。 5.3测定步骤 吸取200μL样品待测液于金标微孔（，抽吸5—10次使混合均匀，室温温育5min；温育结束后，将试纸条（，室温温育5—8min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，进行结果判定。 吸取全部样品待测液于金标微孔（，抽吸5—10次使混合均匀，室温温育5min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（，室温温育5—8min，进行结果判定。 5.4质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 准确称取空白样品2g或适量（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，加入100μL或适量罗丹明B标准中间液B（100ng/mL）（，使罗丹明B浓度为5μg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 6结果判定要求 通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图1所示。 6.1无效 控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。
胶体金技术 问：检测cle ，金标记抗体扩大后，烘干后检测各项指标良好，但室温保存一天后，T 线下降很多是由什么原 因造成的？室内开除湿机，组装好的板子，在自封袋里加干燥剂。我烘干用了一整天，30 多个小时了，还有方法进行改进吗，这个抗体还能用来生产吗？经检测还是金子出了问题，我就是先少量做，找出各个值，然后才扩大的。我就是先3ml ，再10ml 。 T ：（涛哥）那可能是生产放大过程控制的问题。重新试验，先小试，逐步放大。这就不行了啊，这还算不上生产扩大呢，怀疑误操作，重复试验试试，3ml 的、10ml 的都做一下。 0 是啊，有时标记完检测后，T 线就下降（比预实验） T :标记完检测就下降，说明你标记本身就有问题呗。你标记条件太脆弱，主要考虑你标记条件，重新优化下。 0 如果我再调整pH 值，抗体浓度，灵敏度就会达不到了 T：通过其他途径提高灵敏度。 问：请问为什么C 线包被3mg/ml 不出现条带，而2mg/ml 的就有条带出现呢？ T：正常，从蛋白固定基本原理出发，好好想想。NC 结合蛋白的能力是有限的，其结合位点是会饱和的，假 设其结合能力仅仅为2mg ，你包被3mg ，那边必然有相当一部分是结合不牢固或者压根就没固定住的，样本层析之后，金标蛋白结合了这些不牢固的蛋白，就会流走，不会显色。检测线，也会有同样的情况，不过检测线包被过量的影响不止这么简单。我主要指夹心法。 0 一般调整膜上浓度时在湿法时调整还是干法时调整啊？ 问：标记好的胶体金有沉淀是什么原因？ T：常见的原因：标记条件不合适，封闭物质不纯，复溶液不合适都有可能，当然颗粒大了，也容易沉淀。 0 你们主要用什么方法摸索最佳PH 值？ 1.用碳酸钾用量调整，搞一排，然后看变色和离心后现象，还有检测结果啊。 0 这样岂不是需要很多抗体？呵呵 2.标记又用不了多少抗体，又不是包膜。 0 离心后现象，怎么样的是理想的？ 3.就是没有预期想要的略微蓬松有红色的沉淀，比如贴壁、黑点、离不干净等，离心速度时间也要选好。 0 是啊，之前就发现有点贴壁和黑点，我延长了离心时间也没用。 4.小号金子1ml 离心几分钟就够了。越大速度越低时间，这个速度和时间折中下自己调整。 问：不知道那些强假阳性有什么办法可以抑制？ T：你加阻断剂试过没？ 0试过几种，没有效果，能阻断C线，对T线基本没阻断。 T：照这么说的话既然是同一对抗体而且胶体金法临床假阳性率这么高，我觉得你这对抗体可能对某种因素太敏感了吧，ELISA 是共价标记胶体金是物理标记是会有差异。（涛） 0 现在就是找不到原因，那强阳漏检呢？其实也有试过好几个抗体配对，基本都是那样的结果 问：请教一下各位大虾，多抗标记的时候要注意哪些细节呢？ T：尽量别标记多抗，实在是想标记多抗，把标记PH 提高点。 问：划线时的湿度条件是NC膜制备的要点之一，湿度应控制在45 %?65%，有文献支持吗？ T：文献呢是有滴，不过NC 供应商也会给你建议滴，你自己也是可以探索滴，最终都是要以产业化需要为准。 1.主要膜吸收蛋白的时候要是湿度太低会比较疏水，不利于吸收，一般在40% 以上，膜在点之前在这个环境
附件2 食品中呕吐毒素的快速检测胶体金免疫层析法 1 范围 本方法规定了胶体金免疫层析法测定食品中呕吐毒素的快速检测方法。 本方法的适用范围为谷物加工品及谷物碾磨加工品中呕吐毒素的快速检测。 2 原理 试样中呕吐毒素与胶体金标记的特异性抗体发生结合后，抑制了层析过程中抗体与硝酸纤维素膜检测线上呕吐毒素-BSA偶联物的免疫反应，使检测线颜色发生变化，根据检测线颜色变化进行结果判定。 3试剂及耗材 除非另有规定，所用试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682中三级水。 3.1 试剂 3.1.1 提取液：水或胶体金免疫层析检测装置专用提取液。 3.1.2 甲醇：分析纯 3.2 参考物质 呕吐毒素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥99%。 表1 呕吐毒素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量 注：或等同可溯源物质。 3.3 标准溶液配制 准确称取适量的呕吐毒素参考物质（精确至0.0001g），用甲醇溶解，配成0.1mg/mL 的标准储备液，-20 ℃保存，有效期3个月。 3.4 材料 3.4.1 呕吐毒素胶体金免疫层析检测装置。 3.4.2 中速定性滤纸。 3.4.3 离心管。
3.4.4 滤膜：0.45 μm 水相滤膜。 4 仪器及设备 4.1 天平：感量0.01～0.0001 g。 4.2 粉碎机。 4.3 样品筛：0.9 mm。 4.4 漩涡混合器：1500 rpm/min。 4.5 移液器：100 μL，200 μL，1.0 mL。 4.6 恒温装置：（37.0±2.0）℃。 4.7 设备或方法使用环境条件：温度15 ℃～30 ℃，湿度≤80%。 5 分析步骤 5.1 扦样和分样，按GB 5491 执行。 5.2 试样制备 5.2.1 样品粉碎：将被测样品（5.1）粉碎，过0.9 mm样品筛，充分混合均匀，备用。 5.2.2 质控样品制备：选取经标准方法确认不含呕吐毒素的样品，称取2份平行样，其中一份作为阴性质控样品，另一份添加标准溶液使其样品中呕吐毒素含量为1.0 mg/kg，作为阳性质控样品。 5.2.3 样品溶液制备 准确称取粉碎混匀样品 5.0 g于离心管中，加入25.0 mL 水或专用提取液（3.1.1），漩涡混合器（4.4）提取5 min，静置1 min，中速定性滤纸（3.4.2）过滤，滤液用0.45 μm水相滤膜（3.4.4）过滤，备用； 5.3 测定 5.3.1 将滤液（5.2.3）稀释至呕吐毒素胶体金免疫层析检测装置（3.4.1）检测范围内，漩涡混合器（4.4）混匀，备用。 5.3.2 取150 μL待测溶液加入呕吐毒素胶体金免疫层析检测装置内，恒温装置内反应6 min，结果判定。 6 结果判定 根据检测线（T 线）和控制线（C 线）颜色变化进行结果判定，采用目测法对结果进行判定，比色法和消线法判定原则如下： 6.1 比色法 6.1.1 无效 控制线（C 线）不显色，无论检测卡（T 线）是否显色，表示操作不正确或检测装置已失效。 6.1.2 阳性结果 控制线（C 线）显色，检测线（T 线）显色明显浅于控制线（C 线），判为阳性。 —2—
双抗体夹心法原理 以FABP 为例（检测抗原） 阳性反应 Y1=F14A （标记了胶体金） Y2=F104B （固定在NC 膜上即T 线） Y3=羊抗鼠IgG （固定在NC 膜上即C 线） 此方法较常用，主要用于较大分子量的蛋白（抗原）的检测。要求两株抗体针对一个抗原的不同位点才可以。也有个别的检测项目是双抗原夹心检测抗体的，原理类似。 样品（血清）含FABP 蛋白 金标记F14A 抗体 金-F14A-FABP 金-F14A-FABP-F14A 金-F14A-羊抗鼠IgG 金-F14A-FABP 羊抗鼠IgG 显示红色 显示红色 金标记F14A 抗体 不显色 显示红色 金-F14A-羊抗鼠IgG 阴性反应 阳性反应
竞争法原理 以吗啡为例（检测抗原） 阳性反应 Y1=胶体金标记的吗啡单抗 Y2=吗啡-BSA 偶联物 Y3=羊抗鼠 此方法主要用于小分子抗原（毒品、农药、肽链等）的检测。由于抗原分子量小不能直接固定于NC 膜上，常常用化学方法把小分子偶联到BSA 等大分子物质上再固定于NC 膜上。此结果与双抗原夹心法相反，阴性CT 两条都是红线，阳性只有C 线一条红线。 金-吗啡抗体-吗啡 吗啡-BSA 金标记吗啡抗体 显示红色 不显色 金-吗啡抗体-吗啡 羊抗鼠 样品（尿液）含吗啡 显示红色 显示红色 金标记吗啡抗体 金-吗啡抗体-羊抗鼠 阴性尿液抗体-吗 阴性反应 阳性反应
间接法原理 以HIV 为例（检测抗体） 显示红色显示红色 显示红色 不显色 此方法主要用于血清中抗体检测，纯化或者重组的抗原固定于NC膜上，标记多为蛋 白A(ProteinA或叫SPA，抗体Fc端结合而与其它蛋白质不结合)。此方法要求胶体金 过量，一般来说样品再加入前需要稀释或者加极少量后再加缓冲液。 斑点免疫渗滤法使用就是间接法。
鼠疫快速检测试剂盒（胶体金法） 鼠疫概述： 鼠疫是由鼠疫杆菌（Yersinia pestis）引起一种自然疫源性的烈性传染病。因其传播速度快、传染性强、病死率高、社会危害性大,被我国法定为甲类传染病。鼠疫主要通过鼠蚤类传播，曾在历史上有过三次大暴发流行。其临床症状主要表现为发热、严重毒血症症状、淋巴结肿大、肺炎、出血倾向等；随着现代社会交通的发展，对鼠疫快速诊断，尽早发现控制其传播的速度有着重要的意义！ 产品简介： 鼠疫抗原快速检测试剂盒采用胶体金标记技术，应用膜层析双抗体夹心法原理检测组织样本中的鼠疫菌抗原。用于疑似鼠疫病例的辅助诊断及现场筛查。 性能特点： 1、特异性：本品与假结核杆菌、布氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、土拉菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、变形杆菌的108/ml悬液及正常人血清、褐家鼠血清样品，无交叉反应。 2、最低检出量：用生理盐水配制鼠疫菌F1抗原，最低检出量为1ng/ml。 检测原理： 本试剂盒以鼠疫菌特异性抗体致敏硝酸纤维素膜和制备免疫胶体金探针，应用层析式双抗体夹心法原理，用于临床标本、污染物和环境中鼠疫菌抗原的检出，也可用于纯培养鼠疫菌的鉴定。临床标本中，淋巴液的检出率高于血清和尿液。 试剂盒组成： 1、鼠疫抗原快速检测板 2、样本稀释液 3、说明书 4、干燥剂 包装规格：10人份/盒，单人份独立包装。 储存条件：4-25℃避光保存，不得冻存。 有效日期：2年 生产企业：广州市标健生物科技有限公司 样本要求： 制备样品检测液 1、纯培养细菌：挑取疑似鼠疫菌单个菌落，于小试管中制成0.3ml生理盐水菌悬液作为样品检测液。 2、临床标本：取疑似鼠疫患者或病畜腹股沟淋巴结针刺吸出物、脑脊液、血、痰和尿液标本，或死亡动物肝脾研磨标本，加少量生理盐水(约0.3ml)充分振荡混均，自然沉降后取上清作为样品检测液。 3、环境中污染物：取疑似鼠疫菌污染的土壤、灰尘，或物体表面、动物皮毛的擦拭子，浸
胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。 1971年Faulk 和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链ＤＮＡ抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。 免疫胶体金技术的基本原理： 胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA 等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。
免疫胶体金技术常见影响因素分析 自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程就是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响与制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1、1不同型号膜的筛选。硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物与表面活性剂的来源、类型与数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径与分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但就是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小与分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。 1、2结合垫的选择。结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物与待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1、3样品垫及吸水纸的选择。样品垫与吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫与吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸与样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收与蓄积。 2关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性与重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离与沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深与假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体金结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离,从而影响试验结果。
附件3 液体乳中黄曲霉毒素M1的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201709） 1范围 本方法规定了牛奶、羊奶、牦牛奶等液体乳中黄曲霉毒素M1的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳中黄曲霉毒素M1的快速测定。 2原理 本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的黄曲霉毒素M1与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中黄曲霉毒素M1进行定性判定。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 3.1试剂 甲醇。 3.2参考物质 黄曲霉毒素M1参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度≥90%。 表1 黄曲霉毒素M1参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量 注：或等同可溯源物质。 3.3标准溶液的配制 3.3.1黄曲霉毒素M1标准储备液（100 μg/mL）：精密称取适量黄曲霉毒素M1标准品（3.2），置于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 μg/mL的黄曲霉毒素M1标准储备液；或可直接购买黄曲霉毒素M1标准储备液。-20℃避光保存备用，有效期3个月。 —1—
3.3.2黄曲霉毒素M1标准中间液（100 ng/mL）：精密量取黄曲霉毒素M1标准储备液（100 μg/mL）（3.3.1）0.1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 ng/mL 的黄曲霉毒素M1标准中间液。临用新制。 3.4材料 黄曲霉毒素M1胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为液体乳。 3.4.1金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。 3.4.2试纸条或检测卡。 4仪器和设备 4.1移液器：100 μL、200 μL和500 μL。 4.2涡旋混合器。 4.3电子天平：感量为0.01 g。 4.4环境条件：温度15—35℃，湿度≤80%。 5分析步骤 5.1试样制备 取适量有代表性样品充分混匀。 5.2试样提取和净化 以液体乳为基质的样品可直接上样检测或根据产品说明书稀释后检测。 5.3测定步骤 5.3.1试纸条与金标微孔测定步骤 吸取100—200 μL样品待测液于金标微孔（3.4.1）中，抽吸5—10次使混合均匀，不要有气泡，室温温育3—5min（根据配套说明书进行避光操作），将检测试纸条（3.4.2）样品端垂直向下插入金标微孔中，温育5—10min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。 5.3.2检测卡与金标微孔测定步骤 吸取100—200 μL样品待测液于金标微孔（3.4.1）中，抽吸5—10次使混合均匀，不要有气泡，室温温育3—5 min（根据配套说明书进行避光操作），将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡（3.4.2）上的加样孔中，温育5—10 min，进行结果判定。 5.4质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 5.4.1空白试验 称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 5.4.2加标质控试验 —2—
乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂（胶体金法）生产工艺规程 1. 适用范围 适用于乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒（胶体金法）的生产和质量控制。 2. 职责 研发部：制定本规程。 生产管理部：执行本规程 质量管理部：按本规程执行，监督本规程的执行情况。 3. 内容 3.1.依据 《乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂（胶体金法）》产品标准 3.2.产品名称、剂型、规格 3.2.1名称： (1) 商品名：乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂（胶体金法） （2）英文名：Diagnostic Kit for Antibody to Hepatitis B Surface Antigen(Colloidal Gold Immunochromatagraphic Assay) （3）汉语拼音名：Yixing Ganyan Bingdu Biaomian Kangti Jiance Shiji（jiaotijin Fa）3.2.2.类型：三类6840体外诊断试剂。 3.2.3.规格：100T/盒(25T/筒*4筒)（无卡）；25袋/盒（1支/袋）、50袋/盒（1支/袋）3.3.产品概述 乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂（胶体金法）采用胶体金免疫层析分析原理、双抗原夹心法，在玻璃纤维纸上预包埋金标记重组乙型肝炎病毒表面抗原，在硝酸纤维素膜上检测线（T）和质控线（C）分别包被重组的乙型肝炎病毒表面抗原和羊抗兔IgG。当检测样本为阳性时，样本中的乙肝病毒表面抗体与胶体金标记的重组乙肝病毒表面抗原结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线（T）时与预包被的重组乙肝表面抗原反应，形成免疫复合物而显现红色条带，游离金标记的兔IgG则在质控线（C）与羊抗兔IgG结合显现红色条带。阴性样本则仅在质控线（C）显色。 3.4.试剂盒组成、储存、有效期
胶体金技术的发展原理及制备方法 1971年Faulk与Taylor首先将胶体金应用于免疫细胞化学研究,1974年Romano建立了间接免疫金染色法,从此胶体金作为新型的免疫标记技术得到迅速发展。 由胶体金标记技术发展起来的胶体金免疫快速诊断技术主要有两种:快速斑点免疫金渗滤法与胶体金免疫层析法。后者具有操作简便(浸入液体中就行)、快速(全程5~10分钟搞定)、无需仪器设备(结果目测就OK)、试剂稳定、成品易于保存(保质期1~2年)等优点,就是科学研究与临床诊断的有力工具。 胶体金(colloidal gold)即胶体状态的金单质,因为其单质粒径非常小可以分散于溶液中形成胶体,故名胶体金。胶体金的常规制备方法就是用还原剂还原氯金酸(HAuCl4,橘黄色晶体,易潮解,氯金酸合成见下图)里的金元素形成金胶体颗粒。这种胶体颗粒在碱性环境下带上负电荷,可与蛋白质的正电荷基团牢固结合,对蛋白进行标记,用于后续的检测,如制成胶体金试纸条(卡)进行物质的检测。 还原氯金酸的化合物很多,通常我们选择柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)。当用1%柠檬酸三钠还原100 mL 0、01%金氯酸时,不同体积比可以得到不同粒径与颜色的胶体金哦！
制备胶体金步骤简单(见下图),重点就是制备过程所用到的材料都必须就是彻底清洁的。例如水至少就是双蒸水,玻璃棒、玻璃容器等要酸洗后冲洗干净并且最好就是硅化的,制备好的胶体金可以加入0、02％ NaN3在洁净玻璃容器内长期存放。 适合于胶体金试纸条(卡)的胶体金粒径在20~40 nm之间为宜,制备的胶体金溶液呈红色,胶体金被置于试纸条(卡)的样品垫下游。当液体样品滴加后,液体溶解胶体金并带动其与样品中的抗原(抗体),在硝酸纤维素膜的毛细作用下从一端慢慢渗移到吸收垫一端,利用抗体/抗原特异性结合及胶休金的显色(红色)反应,可以检测抗原／抗体存在与否。 胶体金试纸条(卡)主要分为双抗夹心法与竞争法两类,前者适合检测大分子物质,后者适合检测小分子物质。两种试纸条(卡)的原理见下图:
一、胶体金的一般性状 (一) 胶体金的颜色 溶胶的颜色取决于分散相物质的颜色、分散相物质的分散度和入射光线的种类，是散射光线还是透射光，粒子越小，分散度越高，则散射光的波长越短。对同一种物质的水溶胶来说，粒子大小不同，呈现的颜色亦不同。如胶体金颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈红色的葡萄酒色；20～40nm之间的金溶胶主要吸收波长530nm的绿色光，溶液呈深红色；60nm的胶体金溶胶主要吸收波长600nm的橙黄色光，溶液呈蓝紫色。一般应用于免疫组织化学的胶体金颗粒为5～60nm范围内，溶液呈现红色。在相当的一段时期内保持其溶胶不变性，称为胶体金的稳定性。影响其稳定性的因素主要是电解质，其次是胶体金本身的浓度、温度及其他非电解质等。 (二) 胶体金的稳定性 溶胶的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散相之间，其颗粒作布朗运动，不易受重力影响而下沉。然而，溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总面积较大、因在胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒倾向。当胶体颗粒直径变大，超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象叫聚沉。影响其稳定性的主要原因有三点。 (1) 胶粒间的相互吸引力当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶体颗粒合并而变大。 (2) 胶粒及其溶剂化层胶粒及其溶剂化层(溶剂是水时就是水化层)的带电情况。一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。同性电荷相斥，双电子层变厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。 (3) 胶体接口的溶剂膜当二个固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。 (三) 溶胶的聚沉现象 胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，在溶胶胶粒带电及溶剂化的情况下，排斥力成为矛盾的主要方面，溶胶稳定而不聚沉。因为某种原因使溶胶粒带电量减到很小，甚至中和其所带电荷并能去溶剂化膜，胶粒之间可在更近的距离互相接近，引力成为主要矛盾，引力超过斥力时胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有。 (1)少量电解质对溶胶的聚沉作用少量电解质即可使溶胶聚沉，但各种电解质的聚沉能力可用聚沉值来表示。聚沉值是在一定时间内使1L某浓度的溶胶产生聚沉所需电解质的最小物质的量(mm01)。显然，聚沉值愈小，聚沉能力愈大。聚沉值从实验中得出如下的规则：①电解质负离子对带正电的溶胶起主要聚沉作用，正离子对带负电的溶胶起主要聚沉作用；
胶体金免疫分析技术详解 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理： 将氯金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金），标记金黄色葡萄球菌A
胶体金标记技术 胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。 用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。1971年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。近年来的研究表明，胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。由于胶体金作为标记物具有很多优点，因此自其问世以来，在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。 近年来，它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。尤其随着人们物质生活的改善，有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。从90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。 制备方法 在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。 但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例，有两种方法。 1．Frens标准方法： 1)取0.01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL。 2)约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色， 3)继续煮沸约5分钟后结束反应。 4)冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。 5)此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。 该法制备得到的金颗粒直径约为41nm，如前所述要想得到更大或更小的金颗粒，该方法依然可行，唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。另外，采用此标准方法所需反应时间最短。2．Slot标准方法： 1)取1mL1%HAuCl4溶液溶于100mL水中，2)再加入2mL1%二水柠檬酸钠溶液。 3)将该混合溶液加热煮沸约15~30min，直至溶液颜色变为亮红色， 4)冷却后，用0.1M K2CO3溶液调整PH值，该法制备的金颗粒直径约为15nm。 胶体金标记蛋白的原理是：在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。 胶体金免疫技术可大致分为液相胶体金标记技术和固相胶体金标记技术，其分类依据同酶免疫技术。最早的液相胶体金标记技术叫免疫金染色法（IGS），它仅以胶体金作为标记物和显色剂。最初的免疫金染色都采用单标记。即采用大小均一的金颗粒进行标记。后来发展到可利用不同颗粒大小的胶体金作双重标记甚至多重标记。但该方法均仅以胶体金显色，需要较高浓度的标记物，耗费抗体或抗原的量较多，而且需要较大直径的金颗粒（40-50nm），才能获得较高的灵敏度，而且当金颗粒过大时，标记物不稳定，长期贮存容易发生自动聚集。 为克服以上缺点，免疫金银染色法（IGSS）应运而生。该方法的原理是，先用胶体金标记物作免疫金染色，再加入含银的物理显影液，则银离子靠电荷吸引，大量吸附于金颗粒周围，使显色结果呈现金属银的蓝灰色，同时将显色信号进一步放大。应用时，由于本法最终显色是靠金属银的吸附沉积，因此不需要高浓度的胶体金标记物，将胶体金标记物稀释几十倍，仍可获得同免疫金染色一样的最佳效果。这样不仅可以节省大量的抗体或抗原标记物，而且可以节省大量的胶体金。本方法灵敏度的关键在于胶体金吸附银颗粒的数量。小直径的
基于胶体金技术快速检测试纸条的错误信号的处理 2008-08-22 00:00 来源： 对错误信号的处理和检测操作的优化的系统化处理方法的导言。 在近些年来，体外诊断产业（）增加了巨大的投入来开发基于膜技术的快速检测试纸条。类似的的检测已经应用在临床和非临床领域。在早期的论文中已有一篇是关于这些方法得到广泛应用的综述。 虽然基于膜技术的快速检测试纸条是相当简单的，但是此方法的实行的效果依赖于大量的关键参数，在《体外诊断技术》的早期论文中已经探讨了金标液（）的质量和与膜结合的蛋白捕捉的方式的重要性。此篇论文探讨了导致产生假阳性和假阴性信号的错误的检测操作的可能原因，并且提供了一套解决此类问题和优化检测效能的系统方法。虽然此文章是有针对性地说明了胶体金检测技术中的相关问题，但是在胶乳检测技术中也能发现类似的问题。为了避免重复，我们假定读者熟悉快速检测技术的机理和快速检测试剂的基本特性——尤其是抗体、金标粒子、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸收垫——并且熟悉检测中用于处理不同试纸条和硝酸纤维素膜的各种化学试剂。对于不熟悉这些概念的读者，在其他文章里已经对此进行了详细的解释。 假阳性结果和假阴性结果的特征 假阳性结果是样品中没有待检测物时在检测带上出现了一条彩线（对于金标而言是红线）。这条线可能在检测的初期或在一段明显的时间延迟之后出现。假阴性结果是有可检的阳性样品时在抗体捕捉点上没有出现一条可见的线。 假信号可能在许多种样品中发生，也可能仅仅发生在一种特定类型或来源的样品中。这个问题可能出现于一个单独检测批次的每个样品，也可能仅仅发生于一个样品检测中随机数量的检测带。后一种情况说明了对于整个操作而言在进行下一步前进行每个步骤时对大量检测带的处理的重要性。甚至在整个操作水平时从标准阴性样品中也可能发现假阳性结果，同样对于标准阳性样品亦是如此。由于批次检测失败后的巨大的成本损失，因此在进行达到大量产生前对假阳性和假阴性结果准确判断和产生原因的了解是必要的。 假阳性和假阴性信号的产生有许多不同的原因。这些信号可能由样品或由检测技术本身的设计缺陷和操作不当引起。我们可以通过在研制时的每个步骤进行彻底的、反复的大量的检测装置的试验可以消除产生假信号的潜在因素。
免疫胶体金技术影响因素分析 张付贤1,2,王兴龙2 (1.吉林大学农学部畜牧兽医学院,长春 130062;2.军事医学科学院军事兽医研究所,长春 130062) 摘要:免疫胶体金技术以其快速、准确、简捷的特点,受到国内外科研工作者及基层工作人员的普遍关注。笔者从耗材的选择、胶体金的制备及标记、膜包被条件、缓冲液和产品保存及验证等方面分析免疫胶体金技术的影响因素,为制备胶体金检测产品提供理论依据和技术参考。 关键词:免疫胶体金技术;影响因素;选择;检测 中图分类号:Q-33 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2009)05-0199-04 自20世纪70年代,Faulk等(1971)用胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1 耗材的选择 1.1 不同型号膜的筛选 硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响—膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高(李云等,2002)。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标 收稿日期:2008-11-28 作者简介:张付贤(1982-),男,河南人,硕士,研究方向:兽医微生物与免疫学。 通信作者:王兴龙(1959-),男,吉林人,博导,从事分子免疫学研究。E-mail:w ang xl-2006@https://www.doczj.com/doc/cb3874232.html, 基金项目:吉林省科技厅计划项目(20050549)。记物在膜上的流动速率为最佳(邓省亮等,2007)。 1.2 结合垫的选择 结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附(张美玲,2006);玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3 样品垫及吸水纸的选择 样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。 2 关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离和沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体金结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离,从而影响试验结果(Bassab等,2001)。 胶体金的制备除了保证药品的质量外,制备过程中的细节关乎胶体金制备的成败。首先是操作环境和所用容器的清洁度(翟雷等,1996)。所有进入溶胶内的污物都会干扰胶体金颗粒的生成或使生成的胶体金出现聚堆现象,容器最好经酸洗和硅化处理。操作环境应保持清洁无尘粒,最好有专用工作