胶体金技术
问：检测cle ，金标记抗体扩大后，烘干后检测各项指标良好，但室温保存一天后，T 线下降很多是由什么原
因造成的？室内开除湿机，组装好的板子，在自封袋里加干燥剂。我烘干用了一整天，30 多个小时了，还有方法进行改进吗，这个抗体还能用来生产吗？经检测还是金子出了问题，我就是先少量做，找出各个值，然后才扩大的。我就是先3ml ，再10ml 。
T ：（涛哥）那可能是生产放大过程控制的问题。重新试验，先小试，逐步放大。这就不行了啊，这还算不上生产扩大呢，怀疑误操作，重复试验试试，3ml 的、10ml 的都做一下。
0 是啊，有时标记完检测后，T 线就下降（比预实验）
T :标记完检测就下降，说明你标记本身就有问题呗。你标记条件太脆弱，主要考虑你标记条件，重新优化下。
0 如果我再调整pH 值，抗体浓度，灵敏度就会达不到了
T：通过其他途径提高灵敏度。
问：请问为什么C 线包被3mg/ml 不出现条带，而2mg/ml 的就有条带出现呢？
T：正常，从蛋白固定基本原理出发，好好想想。NC 结合蛋白的能力是有限的，其结合位点是会饱和的，假
设其结合能力仅仅为2mg ，你包被3mg ，那边必然有相当一部分是结合不牢固或者压根就没固定住的，样本层析之后，金标蛋白结合了这些不牢固的蛋白，就会流走，不会显色。检测线，也会有同样的情况，不过检测线包被过量的影响不止这么简单。我主要指夹心法。
0 一般调整膜上浓度时在湿法时调整还是干法时调整啊？
问：标记好的胶体金有沉淀是什么原因？
T：常见的原因：标记条件不合适，封闭物质不纯，复溶液不合适都有可能，当然颗粒大了，也容易沉淀。
0 你们主要用什么方法摸索最佳PH 值？
1.用碳酸钾用量调整，搞一排，然后看变色和离心后现象，还有检测结果啊。
0 这样岂不是需要很多抗体？呵呵
2.标记又用不了多少抗体，又不是包膜。
0 离心后现象，怎么样的是理想的？
3.就是没有预期想要的略微蓬松有红色的沉淀，比如贴壁、黑点、离不干净等，离心速度时间也要选好。
0 是啊，之前就发现有点贴壁和黑点，我延长了离心时间也没用。
4.小号金子1ml 离心几分钟就够了。越大速度越低时间，这个速度和时间折中下自己调整。
问：不知道那些强假阳性有什么办法可以抑制？
T：你加阻断剂试过没？
0试过几种，没有效果，能阻断C线，对T线基本没阻断。
T：照这么说的话既然是同一对抗体而且胶体金法临床假阳性率这么高，我觉得你这对抗体可能对某种因素太敏感了吧，ELISA 是共价标记胶体金是物理标记是会有差异。（涛）
0 现在就是找不到原因，那强阳漏检呢？其实也有试过好几个抗体配对，基本都是那样的结果
问：请教一下各位大虾，多抗标记的时候要注意哪些细节呢？
T：尽量别标记多抗，实在是想标记多抗，把标记PH 提高点。
问：划线时的湿度条件是NC膜制备的要点之一，湿度应控制在45 %?65%，有文献支持吗？
T：文献呢是有滴，不过NC 供应商也会给你建议滴，你自己也是可以探索滴，最终都是要以产业化需要为准。
1.主要膜吸收蛋白的时候要是湿度太低会比较疏水，不利于吸收，一般在40% 以上，膜在点之前在这个环境
下放置一定时间平衡一下。
0 点完的膜烘干后的湿度呢？是不是要低一点。
2.湿度不低，你怎么烘干啊。
0 呵呵，我的意思是已经烘干的板子拿出来切条时的湿度一般在多少啊。没办法，我刚接触胶体金，现在公司在申报，委托的公司（艾伟德）给的资料很乱，前后都不对应。
问：谁知道MP 的HCV BLOT 3.0 哪有卖？
T ：找丽珠吧，不过不一定卖给你，独家代理。
问：抗体灵敏度太高，有什么思路去降低灵敏度，从而达到规定的cutoof 值呢？
1.反标，偶联抗原去标记，把抗体点T 线，同样的原料可以下降一个数量级的灵敏度。
T：THE ONE 说的对，从不公平竞争到公平竞争，灵敏度会下降比较明显的。
0 质控线没了？
2.你不会用单独的质控系统的啊？rabbit IgG 和羊抗兔的多抗。
T：楼上说的对。
问：请教一下，Fusion5 用来包被时，需要进行处理吗？
T：当然，是不可以直接使用的。WHATMAN 有相关说明资料，丁香园上也有相应的文献翻译。
0 用作金标垫行吗？成本高不高？
T ：当然高，Fusion5 有专用用途。
0 用在哪方面比较好？
T：多方面，比如同时用做样品垫和金垫，改善CV ，比如某些高附加值数显产品，因其设计的需要。这个材料有专用用途，用好了的话，效果是非常好的，小日本用的不错。
4. Fusion 5 性能非常优越，不信自己要点样品比较下。
问：各位前辈，请问你们谁知道HCV 的国家盘里面到底有哪些片段血清啊。
T：各个片段的都有一般NS3 片段的容易漏检最好单独再加上NS3 片段。
问：请教各位高手：免疫层析试纸中，PH 对信号强弱，反应特异性的影响是怎样的关系？
T ：不可一概而论啊，最好哪个产品举个实例。
问：有问题请教，试纸条想大批量生产成产品，其中标记胶体金的单克隆抗体怎么大批生产呀？都是打小鼠吗？
T ：可以外购啊。
0 但是我们做的抗体外面没有卖，我们已经做出来杂交瘤细胞株了，如果每次都打小鼠去腹水的话这其中批次
的差别是不是有啊？
T：只要细胞株一切正常的话，单位浓度下的单抗活性，批次间差异不大。每次纯化，纯度多少会有点差异，批间差肯定是有的，不过正常来讲，不会对生产产生太大影响。
0 那我再标记的时候条件是不是还得重新摸索啊？
T:不用，其实你的单抗生产岀来，肯定会做质检的。
0 就纯化好了之后，浓度测出来，然后就按摸索好的浓度标记就好了吗？
T: 满足质检要求，成品生产工艺，就不用变。你得先质检，万一细胞株有问题呢。
0 我们是大学里，好像没有做质检的啊。
T: 连质检都没有还搞什么产业化啊，想搞产业化就正儿八经来，要么跟生产企业合作，搞委托加工。就算没有正儿八经的质检，起码一
批单抗生产岀来要小试下吧，要不然直接批量生产，万一有问题损失岂不是很大。
0 一般委托加工他们可以给大量生产腹水吗，我们提供杂交瘤细胞株。
T: 干嘛不在高校做完这部分呢，花的是国家的钱，用的是免费劳动力。把单抗做好，然后委托企业做成品，岂不是更好。
0 您的意思就是我们自己大量生产岀腹水，然后委托企业吗？
T: 干脆把纯化也做了呗，提供纯化好的单抗给企业。企业会对入厂的原材料进行检验的。
0 那如果我们纯化好了之后，那么多，企业一检查原材料不行，我们也白做了呀。
T: 不行，那肯定是白做了啊。
1.关键是你抗体制备的工艺要过关，每次制备的批间差异大的话，说明单抗制备工艺不成熟，需要优化。
问: 新手请教个问题，验证的ELISA 抗体对可以直接用于胶体金研发吗？只要通过调整浓度配比即可？还是需要重新寻找、检测抗体对？
T: 这个不好说，ELISA 能用的，胶体金不一定能用，先做做试试吧，不行再换。
0 这个周期长吗？
T: 看实验技能，如果准备工作做好的话，一天以内。
0 抗体对反应，ELISA 和胶体金，除了载体不一样，还有很多差别吗？我开始觉得可以直接拿过来用呢。
T :差别很多很多很多很多，位阻亚型纯度??…都是区别。大部分都可以的。
0 正常情况下，产品研发周期要多久？
1.顺利的俩月足够，不顺利的两年都不够。
T: 举个例子:比如说一个常规项目，原料成熟；质控品容易获得；标准无国标无行标，自己定标准；那么一整套工艺调试流程走下来，再做点性能评估试验，三个月吧。不考虑稳定性测试。如果是个科研课题的话，两个月足够了。
0 我现在就是有个ELISA 的盒子，有现成的抗体对，想用胶体金的方法实现检测，看看这种可能性。
T: 可能性很大。
2.酶免能用的原料，80% 在胶体金项目上会失败。
T: 九天这个说的有点绝对了吧。
3.不算绝对，这个比例已经比较乐观了。大部分问题就岀现在，活性不够上，酶免可以通过加大浓度提升活性，可是胶体金实验的活性提升范围很小。而且，涉及到前带问题，更是不好解决。
T: 我这80% 都能成功。
问: 我最近做胶体金，用标记好的金标抗体检测抗原，不识别，好着急啊。
1.不要喷到垫上，直接用标记好的抗体进行爬样，看看有无显色。
0 我标记的抗体，然后把抗原用枪点在了膜上，之后又加的金标抗体，发现没反应。我是自己制备的抗体，而且实验条件相对于公司来说比较不正规，一个人摸索。我只是想拿包被的抗原检测一下标记的抗体怎么样，看
有没有标记上。按理说，抗原应该能和标记后的抗体结合上，可是我标记后的抗体不结合。
2.包被了抗原，干燥完全了吗？没干燥，抗原就没固定在膜上，结合了也冲掉了啊。
0我加金标抗体后发现点过抗原的地方明显显白色，而周围的抹上会留下胶体金的红色痕迹。这应该能说明并
不是抗原被冲走的缘故吧。大家被标记的蛋白是怎么处理的？
3.亲水性不好，处理液改一下，多加点亲水的物质啊。抗体是老鼠还是兔子产的。
0老鼠。
4.最佳PH定过了？
0定了，最佳蛋白标记浓度也实验过。标记完后胶体金的颜色有些变化，变紫了点，这种现象正常吗？
T :颜色稍微有些加深是正常的，抗原抗体在免疫层析条件下，没有特异性反应，想找到原因是个大工程，特别是你现在的情况。你的抗原是重组的吧？分子量有多大，纯度多少，保存液是什么，浓度多大。是包涵体
抗原吗。
0抗原是购买的，具体信息不是特别清楚，但是我用抗原包板子后做酶联免疫反应，是阳性的，这说明我的抗体是可以和抗原结合的。保存液是PBS —1%BSA溶液。
T :这就是问题所在，ELISA做着效果好，胶体金不一定能用。你的单抗是怎么制备的，是用这个抗原免疫的
吗。既然很多信息都不知道，给你提供一个思路，你标记抗原，然后包被抗体吧。当然这两种方法都不太科
学，不过对于高校来讲，就做个实验而已，也就够用了。
0免疫抗原和检测抗原都是一种，用抗原免疫小鼠，培养的杂交瘤细胞，收集细胞培养上清，然后纯化的上清。保存液是PBS —
1%BSA 溶液，有问题吗。
5.如果你直接拿这个划膜的话，肯定是不行的。
T :有问题。不知道你为什么选择这个保存液，也许是供应商提供的。反正不管怎样，你标记抗原，包被抗体, 效果可能会好点。II 0不是，是自己用的，你的保存液用的什么啊。
T :直接用0.01M PB 7.4 稀释下就可以了。
问：微生物检测阴性时正常，没有死金现象，但是检测阳性菌株时有死金现象, 法。
造成死金现象的原因是什么呢？我调了样品垫
T线变浅。用的是双抗体夹心
，换过几种缓冲液, pH都调过。还是没有解决这个问题。
1.阳性菌株ph多大？阴性的ph ?垫子的
0 NC膜底部停留了。pH测过，有点酸，在
■■
多少?
阴性pH没测，用的生理盐水或培养基。垫子
5 —6左右。像这样，上面阳性，下面阴性。
ph开始用7.0，后来调过7.5、8.5，没用。
T :我给你看个图，看看眼熟不？上阳下阴（又说下面是调整之后的阳性）
0你这个金完全死了。
T :没完全死，你看吸水垫,
2. 样本稍微稀释下？
T :稀释不能从根本上解决问
题，这些金子其实没有死，不是释放问题。
0释放的很快，但是不知道为什么在膜上停留了，有没有什么物质能够改善这种情况?
3. 我奇怪了，细菌多大啊，能轻易通过 NC 膜？
T :为什么首先想到的是加什么物质呢？细菌不用裂解也可以通过，常规的
0我在测另一个菌株时，没遇到过这个问题，难道是菌的原因吗？
4. 如果胶体金和细菌形成了复合体的话，可能就过不去了，可以这样理解么？
T :说对了一半。
5. 我之前也遇过这种情况，但是加了个东西，就没有了。
6. 你用的是玻纤做金垫吗？浸金还是喷金？贴胶了吗？加点万能剂。
0聚酯膜。涂的金，什么万能剂？
T :老牛，这个真心没有用哈。
这个的根本原因，在于你选择的抗体，针对的抗原表位是多价的，也就是说这个菌体表面含有很多相同的该抗 原决定簇，进而抗原抗体
反应的时候，相互交联，形成了空间网状结构，导致复合物体积很大。当然这个过程 中，也会有一部分复合物不是很大，所以能通过
NC 孔径，至于怎么解决这个问题，方法呢不止一个，这个留
着自己思考吧。其实呢，免疫类的书籍，关于这块一般都有介绍，只不过大家一般不会留意。其实很多实验过 程中看似很复杂、难以理
解的现象，都可以用抗原抗体反应最基础的知识去解释。只不过，貌似大部分人，都 不太关注这些基础的东西，往往是眼高手低，或者
理解仅限于事物的表象。
7. 类似于凝集试验。
问：做胶体金的同盟，对 37 C 稳定性和常温稳定性是什么看法？目前我做岀来，两种环境的稳定性差异较大。 跟踪下去，不知道常温
的是不是总有一天能成为 37度的情况呢？
T :你还是说具体点好，实验方案，实验过程，实验结果，结果分析。
0确实一两句说不清楚，你觉得那个稳定性理论成立吗，
37度1天等于25度1星期？
T :当然不成立。也不知道你的
37度做岀来是啥情况。 0会一直变阳。
T :什么方法的产品啊？夹心还是竞争？
0竞争。
T :就是显色越来越弱了？
0也不是。
T :你37度跟踪了多少天 观察周期多长。 都是红色的，我这个金量多，原理都是一样的。
0样本稀释了好几个梯度 NC 膜都可以的。
问：请教一下，我有个蛋白，想富集，能用胶体金的方法吗，富集后想跑蛋白电泳看看。
1. 胶体金不能富集吧。
0 胶体金不能像磁珠一样富集蛋白吗。
2.用超滤管可以。
T: 超滤是可以的，用胶体金不一定能行，胶体金对标记条件要求还是挺苛刻的。
问: 请问如果烘NC 膜如果不用风机行不行，只是控制温度？
T: 可以。
0 只用温度烘干不会对膜有影响？
2.没啥影响，我做的是没啥影响。
0 那胶体金呢？
问: 老板让我做胶体金试纸条，现在我有大概80mL 多抗血清，要是后期做胶体金标记用正辛酸-硫酸铵沉淀纯化抗体可以么？还是得用蛋白A/G 亲和纯化？
T: 正辛酸-硫酸铵沉淀纯化可以的。
0 不会影响标记效果么？
T: 透析彻底，不会影响。
0 用PBS 4 度过夜可以么？
T: 换液三次。
0 我实验室透析袋截留分子量是7000 的可以么？
T: 嗯，可以，透析后，高速离心去掉沉淀，测下蛋白浓度，然后标记，没问题的。
0 看纯化效果跑SDS 可以么？
T: 可以。
0 我的的抗体是兔子，大概条带多大？
T: 这个不清楚，你是做还原性还是非还原性？
0 什么叫还原性？
T: 非还原性SDS-PAGE ，跑出来大概160KD 左右，不过肯定很多杂带。
0 要用还原性的么？
T: 不知道，我也不知道你具体要做什么用。
0 就是做胶体金试纸条啊。
T: 你做胶体金试纸条，跑胶干嘛。
0 看看抗体纯化的效果怎么样。
T: 为什么要看纯化效果呢，你知道了纯化效果之后，有啥意义呢？比如，你得到了100% 纯度的兔抗体，但是都不是针对目标抗原的，有啥用呢。
0 要是纯化效果不好，不是会影响标记。
T: 刚不是跟你说了吗，肯定很多杂带，纯度不会太高，但是可以做胶体金标记。
1. 你觉得标记下方便呢，还是跑下胶方便？
T: 嗯，就是这个道理，你直接标记下，试试就OK 了。一步到位，有说服力，间接佐证，往往是有漏洞的。
问：抗体pbs 透析还是pb 透析有影响么？
1. 常用PB 。
0 那如果用pbs 偷透析了怎么处理才能除盐呢，除了超滤。
T：透析后蛋白浓度多少？
0 蛋白浓度也就2g/l 。
T:问题不大。
0 在学校时很久以前使用pbs 透析纯化的抗体，后来就改成pb 了。
2. 我都没透析过，买来直接用。
0 以前实验室都是兔血清，肯定得透析的说。
T: 群里很多科研院校的，他们做科研原料都是自产自用，做产业化的原料，大部分都可以直接使用。
问：……（没聊天记录）527wl的，多大的我不知道。
T: 信号弱，是不好直接分析的，有对比没，之前强，还是怎么着？
0 以前也不是很强。
T：就是说，更弱了呗，你变化啥条件了没？
0 如果用比色卡的，高中低三个梯度来说的话，中等显色即使提高OD 值也没效果。
T：可能蛋白效价下降了呢。
0 只能达到低显色。
T：就是说，原来中等强度，现在低强度呗。
0 原来也是低强度。
T：就是说，你想提高强度，但是增加金标记物的量，不管用呗。
0 加样浓度我也增加了，膜浓度也是。
T：你说具体点呗，什么项目这么扯，不是说提高浓度，效果就一定会好的，有个最合适的量。
0 HIV II 型的抗原。
T：你这个测的是啥？免疫抗血清吧。
0 是的。
T：一般测免疫抗血清，显色都挺好的，自说自话嘛。用抗原做免疫原，然后再用抗原来测抗血清。免疫原是同一个抗原吗？
0 原蛋白的日期都是2012 年02 月的，真怀疑是不是已经失活了。
T：有可能额，HIV 抗原，有很强的包涵体倾向，失活也不算个事。你换个新批次的试试呗，跟供应商沟通下，再要个新批次的小样试试，要点免费的样品呗。
0 sdspage 蛋白电泳，我要怎么看蛋白条带是我要的呢。
T：抗原的分子量，供应商没在说明书写明？
0 是的，坑爹啊，没注明的话，看有没有降解的小条带？
T：额，我大概知道你用的谁家的了，别跑胶了看不出来，跑了之后，你可能会很伤心。
问：样品垫与结合垫想只用一个垫子，有没有适合的材料推荐一下，就是将胶体金喷在样品垫上。
1. 用两种吧。
2. 据说whatman 有四合一的垫子。吸水纸，nc 膜，金垫，样垫，全用一张垫子就行。不过好像使用起来有限制，具体就不清楚是什么限制了。
3. 你找俞翠萍：QQ ：2355410614 ，让他给你个玻纤套装试下。whatman 的东西，一般用不起啊。
T：WHATMAN 那个是五合一，还算上滤血膜，FUSION 5 ，这个材料不能直接使用，有限制，主要是蛋白的包被，需要特殊的固化方法。
问：casein 为啥我做的梯度为啥显示像抛物线一样。
T :抛物线的话，就对了。
0 为啥不是越来越抑制信号，浓度大了发生什么了。
T：你要从酪蛋白抑制信号的机理去理解。
0 第一类物质就是蛋白质，如常用的牛血清（BSA ）、酪蛋白（Casein ）、鱼胶冻，都可以特异性吸附杂蛋白
（非特异性蛋白），减少杂蛋白非特异性结合。
T：想想看，为什么同样是作为封闭蛋白，在相同使用浓度下，酪蛋白抑制信号的作用要远远强于BSA ；为什么，酪蛋白不容易溶解于水，酪蛋白钠盐，相对容易溶解；为什么，在水中加入酪蛋白的时候，酪蛋白粉末在液面扩散非常快。
0 我去搜搜看呢。
T：你搜不到的，自己想想先，从最基本的理化性质去考虑。
0 蛋白结构不一样吧，三级结构不一样。酪蛋白极性更大，非极性。
T：为毛酪蛋白在碱性条件下容易溶解呢；为毛在已经溶解的酪蛋白溶液中加入盐酸，酪蛋白会析出呢；为毛能迅速膨胀，而且分子不结合呢。我提示下哈，因为酪蛋白的等电点灰常低，在酸性范围，在碱性条件下，带有很强的负电。在中性条件下，也带负电。
0 干酪素是等电点为pH4.8 的两性蛋白质。
T：在水中加入酪蛋白的时候，最先溶解的那部分，因为都带负电，会相互排斥，所以会看到酪蛋白在液面很快分散开。其抑制信号的强作用力，也主要是因为其强负电荷。那么为毛这种负电荷，会抑制信号呢。
0 和金结合了吧？破坏了金结构？
T：为毛会跟金结合呢，恰恰相反啊。金是负电荷，酪蛋白也是负电荷啊，点到即止哈，自己多想想，自己想
出来，会非常兴奋的，进而，会解释很多现象，进而你会对酪蛋白的灵活运用，颇有心得。
0 对哦，我理解错了。它是特异性吸附杂蛋白的，通过强负电荷？量多了会产生神马效果。难道把真正的不是杂的蛋白也给吸附了？T：你要这么想哈，抗原抗体的特异性反应，是靠什么作用力呢，非特异性反应，一般是怎么产生的呢。
0 空间结构的互补性。
T：别想的太深奥了，用最简单的思维去理解。
0 我的Casein 都用到0.3% 了，据说会影响稳定性。
T：关键你用在哪儿了？样品垫上？酪蛋白一般不会影响产品的稳定性，合理的使用，会增强产品的稳定性。
0 照这个意思在重悬液里加点酪蛋白，标记的金探针会更加稳定？
T：我们来看这么一个现象哈，将金标记物复溶之后制作金垫，其中一种复溶液中加入少量酪蛋白，一种不加，然后干燥金垫，然后会发现，加入酪蛋白的，干燥后特别红；不加酪蛋白的，干燥后颜色要暗。通过各种现象，去理解酪蛋白抑制信号的作用机理。
0 请大神点拨下我说的对不对，作为封闭的酪蛋白，由于存在负电荷，在金探针和样本结合的时候起了排斥作用，从而削弱了信号，这个理解对么？
T：嗯，大概就是这个意思，所以，同样作为封闭蛋白，酪蛋白封闭信号的作用要远远强于BSA 。
0跟吸取杂蛋白没有关系吗。
T :先不要考虑杂蛋白的事情，绝大部分的非特异性反应，是直接发生在标记蛋白和包被蛋白之间的，而非特异性反应，相当一部分，是电荷吸附造成的。一种强电荷介质的引入，会对这种作用产生明显的干扰，就比
如我们加SDS，对信号也会有很明显的影响一样。
0从电荷角度来看的话，是不是可以理解为SDS和酪蛋白的作用类似？
T :就比如，我们在对临床样本检测的时候，如果工艺不是很成熟，遇到新鲜抗凝样本，特别是肝素钠抗凝样本的时候，对信号会有明显干扰一样。因为肝素钠就是靠其强负电荷来抗凝的，如果不对样品垫进行处理，直接检测新鲜的肝素钠抗凝的样本，会导致显色很弱，甚至不显色，甚至连C线都不显色。
0可以直接在金标垫加大缓冲液浓度啊，这样不行吗。
T :这是牵一发而动全身的事情。在金标垫上，与金标记物直接接触的成分，要考虑几点：
①首先要保证金标记物长期的稳定性；
②便于金标记物释放彻底；
③对检测信号发挥一定的积极作用。
往往是解决了一个问题，进而引起更多的问题。所以，对于胶体金产品，各组分的预处理和设计，就显得特别重要。其实我们做的大部分工作，都是解决矛盾。
0抗RBC和全血滤膜哪个好使？
T :抗RBC和滤血膜，谈不上谁更好一些，这两个本身没有太大的对比性，因为其应用领域是有针对性的。
T : 一本是分子生物学，一本是临床免疫学，一本是蛋白质组学，貌似叫这几个名字，刚入行的时候看过。还有当初丁香园翻译的那些IVD杂志，也挺不错的。
问：昨天做的复合物，4度放置一夜，沉淀。显然是有问题的。但昨天做标记条件没有问题，会不会是bsa的
原因（昨天第一次加bsa而不是peg ）。
1.为啥不两都用啊？bsa可用进口的，peg2W 用国产也可以。注意过程再试一下，这个是
没标上的节奏。结和后再分开，我认为你是标记后有标记物不稳定，再分开了。另可能杂质可能较多，不干净。
2.有可能是BSA的问题，换好点的BSA。
3.你BSA多了吧。
0 1%
4.我都是4% 的10%BSA，0.4% 的PEG。
5.每个系统不一样，项目不一样，用的浓度也会不一样的。
T :重新标记一个分成两份一份加BSA 一份不加然后过夜明天结果就岀来了，结果岀来之后原因就找到了。另外不建议用EP管直接作为标记反应容器，建议用西林瓶。
少量标记用西林瓶，大量标记用锥形瓶、烧杯。尽量选择玻璃器皿，浸泡铬酸，洗净，晾
干，备用。
如果用的是上海西宝的BSA，那么是BSA的问题的可能性比较大。买点透明西林瓶，这
个东西不贵，1-10ml标记，各种方便实用。
0昨晚做的就没事，都没敢做多，总共就1mg，我估计是标记条件的问题。
6.颗粒好小哦。
0吸收峰528。
7.为嘛我觉得颜色淡。没我的深。
0管子小，放在烧杯里看就深了。我在离心了。如果正常，再放大试一试。
8.放大了ph不对了啊。
0等比例放大啊……
9.那ph就不对了，不能放大，我觉得ph会有变化的。
问：问大家一个问题，在确定胶体金与标记蛋白浓度的时候，调好ph之后，如果放的时间为几个小时，无论
加多少标记蛋白（我用的spa），五分钟后加nacl都会变蓝色。
T:正常。
0放置多少时间最好，五到十分钟吗？
T :不放置最好。
0我静置五分钟，加1微克都不聚沉，1毫升胶体金1微克蛋白。
T :这说明什么问题？显然你的实验方案就有问题啊。
1.先饱和标记调整PH，然后再调蛋白吧。PH不合适，蛋白标不上去肯定沉淀。
0 ph调过了。
2.加NACL变色，是理论误导，还有什么等电点什么的，也不知道是谁写的。
3.我都不做NaCI实验。
0那怎么确定标记蛋白的量。
4.你确定蛋白标记量的目的是啥？标记后一圭寸闭，还担心游离金？
T:所以Mey氏显然有漏洞啊。
5.ph调到等电点加nacl会变色，我最近做实验ph调到等电点不好使，设梯度调到7点多稳定性最好，不知
道怎么回事。
T :其实之前都说过了的，氯化钠破坏实验最大的漏洞，就是没有考虑封闭剂对金标记物的稳定作用。对于lgG1亚型的单抗来讲，氯化钠破坏实验，得到的结论是正确的。但是，对于其它亚型的单抗、重组抗原、多抗来讲，这个破坏实验，就有些力不从心了。
0涛哥的稳定性就是指做岀成品之后高温烘烤？
T :显然不是啊。试想一下，我们为什么要确定胶体金标记蛋白的PH，为什么要确定标记量。如果标记PH不
合适会怎样，标记量不合适又会怎样，不断问自己，然后答案就出来，你就会找到一种适合自己工艺的实验方案。
0金和蛋白的结合力度牢固又不能岀现倒挂？
6.最实际的还是小样看性能吧？
问：刚送来1g氯金酸，要不要放4度啊？氯金酸用国药的行不行啊？
T :氯金酸干粉，尽量放在干燥的环境里，可以用国药的。
0那放不放冰箱？还是放干燥避光就可啦。
T :干燥避光，冰箱不是必需的。
问：请问怎么用分光光度计测胶体金颗粒直径啊？我知道颗粒直径和最大吸收峰有存在线性回归关系。有没有
推算公式呀？
T :分光光度计，测胶体金直径的方法，不精确，也不太科学。
0谢谢哈，知道不太准确，想知道估计值。
1. Y== 0.4271X + 514.56（其中Y 代表吸收峰波长，X 代表颗粒直径）。
问：之前有一次小分子竞争加吐温的时候，阴性强了但灵敏度不行了呢，浓度0.01 。
1.做ELISA 和胶体金这块，这两种都常用，tween-20 应该算是用的更频繁，在胶体金中部分项目有所体现为triton 对反应体
系相对tween-20 更加柔和一些，我这个说法也只是遇到过而已，不一定有说服力，其实个人觉得，这些表面活性剂，最好还是遇到了不一样的项目，条件，去做尝试对比，选择最优去使用。
T：嗯，做ELISA ，吐温用的很多，PBST 嘛。
2.现在搞得，没事就找新的表面活性剂去尝试，头大。
T：一个T 量就大了。吐温20 和曲拉通100 都是实验室常用的表面活性剂，不同的项目不同的抗原抗体对不同的表面活性剂，会有不同的表现。谈不上谁就一定更好一些。但是有些小细节需要注意，吐温和曲拉通，对信号的色调影响是有差别的，相对来说吐温对色调的影响更鲜艳一些，另外，曲拉通会导致红细胞破裂，造成溶血，所以检测全血的项目，除了疟疾，其它项目应尽量避免使用。目前胶体金项目种类繁多，常规的表面活性剂，虽然依然非常常用，但是很多项目对性能要求很高，这些表面活性剂已经满足不了要求了。
问：涛哥有空讲讲国产BSA 的质量呗？
1.国产BSA 严重影响金结合物的质量，深有体会~
2.还是买进口的BSA 吧，没什么离子，干扰性好。
T：涛哥与BSA 的故事。
咱们说说BSA 哈，话说当年我刚开始玩胶体金的时候，最开始拿早孕练手，感觉还行，觉得也没有啥太大难度。后来做了一个重组抗原的项目，标记重组抗原、包被重组抗原，不管什么标记，都不成功，开始好好的，离心就挂壁，或者管底有不溶性沉淀，经过各种方法、各种调试，都没有明显的改善，然后就不断的探索啊探索，同时做的另外几个项目，表现还不错，后来我就发现，标记单抗都没啥问题，标记重组抗原问题就很大，后来我就总结了，重组抗原的标记实在是太难了，单抗的标记相对简单很多。
我一直是用BSA 封闭的，后来就换了PEG 。然后标记重组抗原，效果还不错，然后我就又总结了下，标记单抗用BSA ，标记抗原用PEG 。然后重组抗原能标记成功了，继续做下去，各种假阳性，各种调试，各种探索，经过各种被虐之后，差不多有眉目了，能做个差不多，再后来有一天，领导给了我一瓶BSA ，说是进口的，上面写着Fraction V ，让我试一下，这一试果真不得了，最先拿重组抗原标记了下，发现上清清澈、管
壁干净、管底絮状松软沉淀，简直完美。再后来为了验证这个BSA 的性能，把所有项目都尝试了下，性能普遍性提高，包括标记单抗的项目。
后来我就否定了之前的各种结论，逐渐尝试各种BSA ，发现性能差别好大啊，有的BSA 偏酸性，加进去金标记物就完蛋了，所以这样的BSA 最好用弱碱性缓冲液溶解，比如Tris 。有的BSA 偏弱碱性或者中性，直
接用水溶解效果比较好，有的BSA 纯度灰常灰常高，看上去全是结晶，有的BSA 纯度不高，结晶很少，体现在性能上差别也是灰常大的。
再后来就关注BSA 方面的技术资料，老外的COA ，以及跟BSA 供应商和代理商进行各种交流，发现不光是BSA 质量的差异，对应的售后服务差异也很大。其中比较搞笑的一件事情，就是对Fraction V 的理解，很多国内BSA 的代理商一直认为这是BSA 第五组分，然后对应的杜撰出一些奇怪的概念，比如BSA 的第五组分、BSA 的全组分。然后我就想BSA 只是一个蛋白，一串氨基酸序列，哪儿来的第五组分和全组分呢。然后，就各种查询，终于搞明白了，原来fraction V 是一种纯化方式的体现，源自于血液分馏技术，牛血清通过分馏技术获得高纯度的BSA ，其中分馏的第五种组分就是BSA 。也就是说BSA 和fraction v 是一个意思，
特指通过分馏技术获得。
再后来就悲催了，国家限制牛羊源性制品的进口，但是BSA 质量比较好的供应商，绝大部分原料来源都是疯牛病疫区，然后这些供应商都慢慢退出了国内市场，想买到性能优异的BSA 已经很难了。再后来就是海筛，各种BSA 评估验证。在这个过程中发生了一些笑话，有一次我在一个群里说我也买BSA ，有供应商找我，
问我要全组分，还是第五组分，我问有什么区别吗，第一二三四组分是什么？对方说你等查清楚了再来买吧。后来按照我需要的生产厂家和货号，找了很多代理商，他们都说有，货期多久多久，交钱付款，但是收到的货各种奇葩，同一个货号的东西，什么样的BSA 都有，但是没一个是真货，然后我隐隐觉得有些人在利用供需矛盾卖假货。再后来我就放弃了从国内拿货的打算，通过各种方式直接从原
厂家拿货，虽然很麻烦，虽然周期很长，虽然通关各种困难。起码能用到靠谱的BSA ，能稳定产品质量，一切都是值得的。
我这里澄清几点哈，首先呢，对于IgG1 亚型的单抗来讲，标记是比较稳定的，常规的BSA 大部分都能满足要求；对于
IgG2a 、IgG2b 、IgG3 亚型的单抗以及相当一部分的重组抗原还有多抗，对BSA 的要求还是很高的。另外呢我的资源是有限的，不可能尝试所有的BSA ，所以，也许有的很不错，但是我没尝试过，所以这里我说过尽量含蓄点说，不是一棒子打死。这只是一个故事，仅供戏谑。另外关于BSA 的封闭机理，以及其在各种组件中的作用，以及协同作用，以后再讨论哈，今天说了不少了。
之后对BSA 做过各种探索和性能分析，包括其在试纸条不同位置的性能表现，比如样品垫处理液、复溶液，通过不同的项目，不同的方法进行尝试，得到了一些规律性的东西，发现BSA 研究起来还是挺有意思的。
Cohn 冷乙醇法最早是由哈佛大学Edwin Cohn 教授于1946 年发明的，基于战争创伤治疗对注射级别的
蛋白的大规模需求，Cohn 教授在较低的温度下改变血浆的乙醇浓度和PH 值，使其所含蛋白在不同的乙醇浓度下析出，在第五个析出的组分中主要成分即为BSA ，所以BSA 又称组分V 或Cohn V 。0 上面描述的第五组份是馏份，是不是蒸馏出来的，那BSA 里面的盐离子怎么来的，貌似继续问下去就是BSA 怎么做的了。
T：分馏，不是蒸馏吧，BSA 是怎么做的，我不是很清楚哈，我这儿只有分馏技术的介绍，供应商提供的纸质版，其它方法不清楚。
0 那为毛BSA 里有硫酸盐什么的。
T :不清楚额，我用的没有额。
0 记得有人提到过，国内BSA 有的是拿硫酸盐盐析出来的。
3.广州有一家公司是这么做的，用硫酸铵沉淀，做胶体金全是假阳。
T：国产BSA 还是很多人在批量用的，他们也没发现有什么问题。
0 是不是醇析和盐析的手法不同导致了质量的不同？
T：我觉得，你可以直接理解为纯度差异，老外的COA 上写着BSA 的纯度是100% 甚至超过100% ，当时我特别不理解，为毛纯度会超过100% ，后来才知道，是人家纯度计算方法造成。
问：涛哥啊，今天真实验证了下，发现加热套不靠谱啊，设的50度，它到50 了还继续加热……
T：正常啊，这个需要感应器进行温控，你光设置是不管用的。另外，控温是需要技巧的，不是设定温度。
0 我在编写仪器验证，涛哥，写太少会不会被药监局的鄙视啊。
T：这个怎么跟你说呢，你就光挑重点的大致写写，就够你忙活的，药监局都看不过来。
0 哦，我以为加热套，主要是受热均匀，就分不同温度测不同点。今天实际一测，觉得白写了。
T：这个，你随便编编就行了，不用太纠结。
问：第一次做胶体金，刚组装了点样试下，T线C线都没显。就抗体包被地方有点发白，大体原因是什么。
1.既然是第一次，就把细节说详细点，要不咋分析，太多因素了
T :比如说，你这是啥项目啊，用的什么方法啊，竞争法、还是夹心法、还是间接法、还是……。包被浓度多少啊，包被稀释液用的毛线啊，标记量多少啊，喷金量多少啊，样品垫处理过没有啊，咋处理的啊，等等等等。
T :为毛，有人问问题的时候，我会说可能的原因太多了，我咋知道这么多原因呢，因为我都遇到过，研究过。你说研究一个原因，需要设计多少个试验呢，做多少产品，才能遇到一个典型的问题呢。这都是无数个昼夜的积累啊，沉淀啊，思考啊?…各种的各种啊?… 问：试生产三个批次，金子批次不一样，还要什么不一样吗。
1.试生产三个批次，全都不一样。
0全都不一样？啥意思。样品垫、金标垫、吸水纸、膜，都要不一样？
2.吸水纸，随便你啦。
0金结合物标记条件换不换，别的基本变化了没什么影响的。就是这个金结合物条件，有很大影响啊。
3.试生产是对你的工艺进行验证了，不需要再换标记条件了。
T:嗯，试生产，工艺是不能变的。
0哦，那要换哪些啊。
T :哪些也不能换，就按照确定的工艺，连续生产三批就可以了。你说为毛要试生产三批呢，目的是什么
0看稳定性，工艺的稳定均一性。
4.我觉得应该是不同时间，看重现性。
T:嗯，重现性，考察的是生产过程控制，所以，你不能随便变化生产过程因素。
0查了下。。原来重现性：在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。
T :别乱套概念，我们说的是工艺的重现性，指的是生产过程控制。
问：我们来讨论个问题。为什么试纸条放在不同的卡壳里，测岀的显色会不一样（包括深浅及临界的判断）
1.不同卡，压紧程度不一样，导致层析速度不一样，多少会有影响的
0速度不一样，也会影响显色么，就是说有的深有的浅。
2.层析速度不一样，通过T线时的表观浓度就不一样，越快表观浓度越低，最终显色不一样的，一般压得紧
的卡，层析慢，表现出待测物表观浓度大，颜色会深。
T :其实，最敏感的因素，是样品垫的有效利用长度问题，当然卡壳的压紧程度，压的位置，也会影响最终的
性能，但都没有样品垫这个敏感。
3.跟加样孔位置和挡水板的设计位置相关性大？
T :是滴，加样孔位置，直接影响了样品垫的有效利用长度，还有加样孔的形状。
0涛哥的意思，是不是，加样孔不能太靠上，这样加样孔以下的样品垫就起不到作用了？
T :是滴。
0那个还有这个加样太快把膜都给泡了，这个怎么弄呢。
T :加个隐形胶带就0K 了，半透明的亚白色，隐形胶带的作用之一，就是防止样本上冲，连接NC膜、金垫、
样品垫。
问：135的膜过期了性能会有哪些变化？
T : 135的膜，时间长了，容易降解酸化，导致产品各种性能都会发生变化，灵敏度变低、特异性变差、稳定性变差。如果做研发，使用周期很长的话，建议分开保存，不要一卷膜密封放一起，这样更容易酸化。可以裁切成单条，夹在书页里面，既可以延长保质期，也可以让NC膜平整，135的膜，背衬很薄，很容易卷曲。你可以打开包装闻一下气味，如果很浓一股酸味，说明已经降解了，虽然通过一定的方法，可以复苏，但是已经达不到原来的效果了。另外你采购NC 膜，如果用的不是很多，需要通过代理走，上海捷宁那边的NC 膜，走的比较快，所以一般都是最新批次的，质量有保证。有的代理商，货走的慢，放时间长了，你买来就是已经发生降解的，这样你做实验，工艺怎么调，都没用。
0 说的太好了，我们就遇到过这种情况，不过后面给换了。
T:嗯，遇到这种情况，大部分供应商都会给换，但是比较耽误时间。如果是第一次用这个膜的人，没有这个意识，以为就应该是这样的，然后一个劲的调工艺，就太悲催了。
1.135 的膜就算在有效期内有时候也会变质酸化，我上次有一批是这样的，找他们换的，12 年的事。
2.那是当时那一批次好像都有问题。
问: 涛哥啊，关于离心的转速，可有什么讲究，这么问是不是太宽泛了。
T: 额，这个可太讲究了。高速离心，其实本身是一个加速破坏的过程。所以，标记之后，我们为毛加过量的封闭剂，其实不光是为了封闭，也是为了给金标记物提供一个稳定的微环境，特别是大量离心的时候，由于转速比较高，离心时间长，所以，就各种讲究了，鉴于此，有人干脆就不离，而是超滤。
0 我离二十ml 就得加长时间好多，以前都半小时，得近一小时才离下来。
T: 当然，还是采用离心方法的多，操作相对简单，成本低，那么就说离心。关于金标记物的离心方法，五花
八门，各种各样的都有，比如:有人先低速离心，去掉大颗粒沉淀，再高速离心，去掉上清；有人直接一步离心，去掉上清；有人梯度分步离心，离心三次；有人梯度分步离心，离心两次。具体需要采用哪种离心方法，跟金的质量、标记物质、体积、颗粒大小都有关系。梯度分步离心，转速是逐步升高的，举个例子:比如一步离心某个金标记物，需要10000rpm 离心2 小时才能离心彻底，梯度分步离心可以这么做，6000rpm 离心
半小时，分离上清和沉淀，8000rpm 离心半小时，分离上清和沉淀，12000rpm 离心，直至上清清澈，去掉上清，将三次沉淀混合，复溶。这么做，是为了避免，最先离心下来的金标记物，被长时间高速挤压，而聚集。
0 第一种低速的作用是哈？有说是除掉没连上的金的，有说聚集金粒儿的。你是用哪一种啊？
T: 我哪种也不用，你刚问的那种，第一步低速离心，是为了去掉金标记物交联的大颗粒。如果，金子烧的质量不咋滴的话，第一步低速离心，可以去掉一些大颗粒的金子。一般来讲，如果标记的是IgG1 型的单抗，单
抗纯度95% 以上，而且金颗粒均一的话，无需第一步低速离心。如果是标记的重组抗原，一般来讲，多少都会产生一定量的交联物，可以第一步低速离心去掉，也可以，复溶之后，低速离心去掉，我一般复溶之后，再低速去掉，复溶之后体积小，方便操作。而且，第二
步高速离心的时候，仍然会离心下一部分交联物。复溶之后，再离心的话，转速一定不能高额，一般1000rpm 以内。
0 同样的多抗啥的，低速有时有、有时没有沉淀就标记操作不好哈。我有次吧低速没沉淀，高速很多，觉得标的不错。再复溶，很好溶。复溶体积小了，再高速离，离了好多沉淀，大喜！悲了个催的，再复溶，不溶了，黑片片了。想起来我的复溶液是pbs 配的！
T :恩呢，正常，离心的微环境是灰常重要滴。PH、离子强度、蛋白浓度? ?…这些微环境。那肯定沉淀不溶
了，低速！低速哈，就去掉那些不溶性沉淀和大颗粒交联物，就可以了。
0 我那次是复溶后再高速，美其名曰除掉剩的bsa ，算再清洗一次。
T: 奥，取上清的时候，取干净点，最好不要洗金，多一步，就增加一步的风险。综上，离心条件还是挺讲究的，比如，你手里有个单抗，灵敏度、特异性表现各种好，但就是比较脆弱，离心就要各种注意了，而这种单抗，是经常遇到的，比如IgG2a 。
0 不同离心机。转速不准还是离心力不准啊。
T: 奥，我都是用rpm ，离心机这么成熟，随便买个，就能用吧。
问：大神啊俺的金子有点小聚集，过膜管用不？
T :别过膜啊，你是搞科研还是搞生产呢，咋聚的，漂金？
0 没漂，就能看见一点小粒儿已经过膜了。
T：瓶底？奥，搞科研的话，无所谓了，过了就过了吧。
0 溶液里的，过的0.22 的。
T：时间长了？刚烧出来没有吧。
0 一个半月，电热套烧的。
T：额，正常来讲，不该有，不舍得扔，就过一下吧。
0 加热估计不均匀，懒得再煮。
T：反正做个试验，也无所谓的，一般来讲20nm 左右的，放五年问题不大。
0 煮的时候变颜色很慢，变黑很慢。
问：涛哥，问你几个问题：
①洗金是什么意思，是不是说吸上清的时候把复合物吸走一部分。
②多一步就增加一步的风险这句话没理解（我果然愚钝）。
③刚离心吸上清时发现，同一次做岀的复合物，用同样的离心管装，在同样的条件下离心，为什么装了5ml的两管在壁上有点沉淀（但是吸完上清又没附着在壁上），装9ml 复合物的离心管，壁上就很干净。
T :①洗金的主要目的，是弃掉上清的时候，往往取不干净，这样金标记物里面，就混合了游离蛋白，比如说，
你标记抗体的时候，如果是过量标记，这样上清中会有一些游离抗体，如果取不干净，对产品性能会有一定程度的影响，至于影响程度，要看游离抗体量。如果游离抗体量比较多，产品性能变化就会体现岀来。我一般取的比较干净，所以不洗金，如果取的不是很干净，洗一下还是有效果的。
②对于产业化来讲，为了减少CV，我们应尽量减少操作步骤，每增加一步，就增加一步的CV。另外，对于
洗金而言，本身是比较脆弱的，意味着风险比较大，这个步骤，对微环境要求比较高，如果探索不充分，万一洗坏了，损失就大了。
③管壁上有点沉淀是啥意思？
0 就是刚取岀来的时候能看到在离心管的下端有个点，我以为是死金了，然后吸完上清，那个点就木有了。
T：奥明白了，量少金标记物离心下来的快，也就是说在9ml 离心完毕之前5ml 早被离心下来了，然后就这
么跟着一起转，一直被高速挤，按说5ml 的，你早该拿岀来了，另外9ml 的，按说也可能有，只是因为离心下来的金标记物比较多，你可能没发现，如果，岀现这种情况，你就要多注意了。
0 一起离的，确实没有注意这些细节。
T：离心的时候，应尽量避免这种高速挤压，如果你的金标记物相对脆弱，很容易产生非特异性反应，或者长期稳定性较差。
0 那这么说的话，根据离心体积的不同，转速或者离心时间也不同。我有听培训班老师说，最好不要在离心的时候把上清离到透明。涛哥，你觉得呢。
T :我不同意这种观点，如果不离心彻底，每次离心得到的金标记物量肯定会有差异，客观上会增加CV，根
据离心体积，离心颗粒的不同，转速，离心时间都是不一样的。
0 什么时候过量标记啊？竟争都不饱和标记效果好吧。
T：嗯，竞争法，一般是不饱和标记的，夹心法，需不需要过量标记，要看产品性能需要，这个就更讲究了。
关于那个过饱和标记，以标记单抗为例，单抗的FC 片段相对疏水，更容易跟胶体金颗粒结合，我画个图，中
间那个是胶体金颗粒，单抗跟胶体金颗粒结合的时候，有一定随机性，单抗跟金颗粒的结合状态，并不是完全一致的，如果单抗过量，会互相竞争位点，进而达到一定平衡状态，如果单抗过量，最终形成的平衡状态，是
这样的。
不饱和标记r1
大家都排排队，尽量多的单抗会结合到金颗粒上，大概意思就是，人少的时候，你站着，蹲着，躺着都行，但是人多的时候，就没那么多地方了，就都得站着，而且还得伸长了脖子。前后两个图，我们可以看到，第一个
图FC片段，很容易暴露岀来，第二图呢FC片段很难暴露岀来，当然，这个图只是为了说明一个机理，其实
不可能一个FC也暴露不出来。所以，体现在产品性能上，我们会发现，如果离心后上清取的都很干净的前提下，过量标记T线显色会
深一点，但是C线却不比例的减弱很多很多，而C线包被的二抗，主要是跟标记单
抗的FC结合，所以C先就会明显减弱，所以，相同的二抗，有人用着显色很好，有人用着显色很弱，岀现这个问题，过量标记是原因之
一。所以说，需要不需要过量标记，要根据产品的性能需要，有的项目，不是越灵
敏越好，如果灵敏度能满足要求，就尽量不要过饱和标记，要同时兼顾C线的显色。额，这个只是为了说明
问题，抗体跟金颗粒的结合有一定随机性，客观上，不可能形成这么理想的状态，总会有些不听话的，蹲着或者躺着，不过人多了，这样的就少。
问：怎么调整试纸条体系？
1.糖，蛋白，表面活性剂，ph，缓冲液，基本就这些了，各部分的作用知道了，按照你的需要去挑选、调节。
比如样品垫，你就用1%pvp+1吐温调就是了。不同的缓冲液做对比就能看岀来。其他成分，根据实验结果调。
2.PVP背景好一点，能增强显色，表面活性剂的基本功能PVP有。
3.据说pva效果好点，不过不好溶，就没试。
T:建立试纸条的一整套体系是必须的，上面显然思路还不太成熟啊。我大概说说我的思路。
当研发一个新产品的时候，我们首选会筛选抗原抗体这些主要的原材料，但是，每个抗原抗体性能都是有差异的，所以，对于初始工艺的选择，就比较重要了，如果初始工艺比较偏激，很可能屏蔽掉一些抗原抗体的积极的性能。那么如何确定这个初始工艺呢，这个初始工艺我们一般称之为基础工艺或者通用型工艺，顾名思义，这个初始工艺首选要力求简洁，以满足胶体金产品的基本性能为目的，另外，该工艺还应具有良好的兼容性。基于此，说的通俗点，就是这个工艺首先要保证样本能够层析流畅，金垫能够释放彻底，起码能够使抗原抗体得到有效的反应。另外，反应结果应该是客观真实的，工艺不能太脆弱，不能受到强烈的干扰，比如，基质效应问题。然后各部分分解阐述。
首先是金垫：最基本的要求是，金标记物干燥在金垫上要稳定，而且可以有效释放。如何做到这点呢，首先金标记物本身是蛋白复合物，是很容易吸附固相载体的，如果金标记物牢牢的吸附到玻纤上，肯定是不能有效释放的，所以这儿就涉及到封闭，比如，我们可以用BSA来封闭固相载体，可以用来预处理固相载体，也可
以混合到金标记物里面。然后，蛋白的长期保存，是需要一定的微环境的，比如PH，离子强度，所以，还需
要缓冲系统，蛋白复合物的干燥，不管是烘干，还是冻干，本身是一个加速破坏的过程，所以，需要一定的保护剂，比如糖，糖的存在有利于维持蛋白的结合水，使其不但能够承受干燥过程的破坏，还有利于其长期稳定性。所以，对于金垫制作的最基本工艺，就出来了，缓冲系统+保护剂+封闭物质+金标记物+固相载体。
然后是样品垫：样品垫的最基本的作用有两个，第一，缓释，让样本、金标记物按照顺序缓慢释放，以利于抗原抗体之间的反应；第二，屏蔽个体样本间差异；第三、第四?都不属于基本作用。基于其最基本的作用，
首先要有缓冲系统，并且有足够的缓冲能力，来屏蔽个体样本间PH 和离子强度的差异，然后，要有一定量的表面活性剂，有利于样本层析流畅，背景清晰，所以，样品垫最基本的工艺出来了，缓冲系统+ 表面活性剂。
然后说包被膜：包被膜，最基本的需求，就是抗原抗体跟NC 膜得到有效的结合，而抗原抗体跟NC 膜的结合，主要依靠其疏水作用力，因此，包被液应使抗原/抗体处于相对疏水的微环境中，以利于其跟NC 膜的结合，最基本的包被液，是处于接近蛋白等电点PH 和一定离子强度的缓冲系统。
0 PBS+ 糖+BSA+ 标记物+ 玻纤
T :我没说额，我不同意额，我刚说的是最基本的东西，还没拓展开说呢。关于离子强度的差异，我给你举个例子：比如，样本A 离子强度是1 个单位，样本B 离子强度是2 个单位，如果样品垫中的离子强度是0.5 个
单位，那么，对于样本A 和样本B 的检测，整个反应系统里面离子强度的差异是1.5 和2.5，差异是很明显的。如果样品垫中的离子强度是50 个单位，那么这种差异，就是51 和52 的区别，在最终的检测结果上，是体现不出来，高浓度的缓冲系统，可以做到这点。
0 那你的意思在一定范围内，离子强度越大越好。我还以为多加点氯化钠呢，刚想问问，氯化钠貌似不能多加。
高浓度，0.1M 算不算。
4.0.1M 还不高? 这浓度的氯化钠上去，免疫金直接沉了。
T：现在说的是样品垫，免疫金沉不了。高浓度的缓冲系统，不仅能纠正个体样本间PH 的差异，还可以屏蔽
离子强度的差异。当然，还有看检测样本类型，比如尿液样本，客观上个体样本间离子强度差异会非常大，那么单靠缓冲系统来屏蔽，就有些力不从心了。
5.流过去的话不就聚沉了嘛。
T：安心，沉不了，我接下来，刚想说氯化钠来着，对于，个体样本间，离子强度差异很大的样本类型，是需
要盐来辅助屏蔽这种差异的。国内的胶体金生产工艺，实在是太多太多太多了，不同厂家的，几乎都不一样，有的甚至差别非常大，甚至于某些工艺是完全相反的。
0 涛哥不是说高浓度的缓冲系统么，我就问像0.1M 的TRIS 算不算高浓度。是这个意思。涛哥，能讲讲三层样品垫的事儿么？我现在用两层样品垫，没辙啊，吸力不够。
T：这么具体的问题，就不在群里说了吧，倒不是保密啥的，我主要是怕误导大家。好吧，既然你提出了一个具体的问题，倒是可以聊聊。比如，条式的产品，直接插入样本检测的，就比如说早孕这种，客观上，该类产品对结果判读时间要求比较高，3-5min 判读结果，那么，如何做到短时间内判读结果呢，短时间判读，意味着短时间层析结束，短时间层析结束，意味着快速的层析速度和吸样速度，快速的层析，先放一边，先说吸样，如果插入尿液中，半天吸不上来，就悲催了，如何做到快速吸样呢？我们尝试不同的固相载体材质，发现，越致密的载体材质，吸样越快，越薄的材质，吸样越快，比如说，聚酯比玻纤吸样快，更薄的聚酯吸样更快。但是，当我们用很薄的聚酯做样品垫的时候，出现了一个矛盾，比如，这么薄的材质，承载能力实在有限，比如，虽然吸样快了，但是层析速度却慢了，为什么呢？我们将试纸条插入尿液中，当见到红色金标记物出现的时候，再平放，平放的时候，我们发现样本在NC 膜上的层析速度，受到诸多因素的影响，其中一个因素，就是样品垫位置的压力，也就是说，如果样品垫位置蓄积了很多的液体，那么，样本在
NC 膜上层析速度，就会很快，
然后我们就想到了，混搭，薄的聚酯，是很容易吸样的，而玻纤材质是很容易蓄积液体的，由此，出现了，多层样品垫的组合，多层样品垫的出现，是为了解决一个矛盾，而解决了这个矛盾，可以得到双赢的效果，最终满足产品对某些性能指标的要求。
0 市场上还是有不少两层玻纤的产品，但是生产又多了一点工艺啊。
X：大批量工业化不建议，产品要遵循简单原则，上了量你们就知道打布丁的工艺的缺陷了，很害人。简单的工艺，抛弃聚酯膜，样品垫金垫用玻纤，更甚，用一张玻纤。做研发一定要考虑后续的生产工艺（谢）
T :不要纠结这些细节，我刚说了，我建议大家就玩一层就可以了，说的太多，会误导大家的。老谢，我觉得
你说的有些片面，你所阐述的观点，是立足于自动化生产，而跟大批量不是直接相关的。当市场对某些产品的性能提出了更严格的要求的时候，技术人员是需要倾注智慧的，多层样品垫，算是表达方式之一，我个人是持肯定态度的，当然，由此必然带来一些其它的问题，但是万事万物皆不完美，我之所以不想说的太详细，就是怕误导新人，因为新人对解决某些问题，采取的方式，往往缺乏深思熟虑。比如今天我说，多层样品垫怎么好，能解决什么问题，各种的各种，必然就会有人去模仿，但是，这么复杂的工艺，对过程控制要求是比较高的，各种的细节控制，另外，就是刚老谢说的，大批量生产的问题。
问：天使大神想起来个问题，以前做一个抗生素类竞争条，elisa 显示包被原和抗体结合的，可阴性显色时，t
线在两分钟内可好看，慢慢就没了，三五分钟时，毛都没了。金垫处理了，样品垫没处理好就没处理，后来莫名其妙好了。
T：你这个问题，很多人都遇到过，抗原抗体结合不牢固啊，不过既然是你以前做的，很多问题就没法深究了。
0 我还往包被液加了甲醇，那会年轻，归结原因就是夏天到了，不好做条。可这原因就是抗原抗体结合不好么，为啥elisa 就可以尼，那也会洗板啊，没洗掉？
T：夏天，从来不是理由啊。工艺的不成熟，一直是大部分异常现象的原因。70%以上的湿度，35 摄氏度的高
温，我这都不会产生明显的性能差异。ELISA 跟胶体金的工艺差别还是蛮大的，比如蛋白的吸附作用不同，比如充分的反应时间，比如反复洗脱，可以屏蔽掉很多干扰因素，比如…各种比如。
0 这个湿度样品垫不会受潮吗？
T：你这个问题，让我想起了样品垫优化的原则之一啊，这说起来，可就有的聊了。
0 那抗原抗体做条要求更高？
T：从某种意义上说，从某个角度来理解，胶体金产品，是各种常规产业化方法学里面最复杂的，因为，要在一个纸条上，实现某个目标物的快速检测，还要屏蔽掉各种干扰因素，还要达到各种要求的性能，还要通过最简单的检测手段来实现，所以说，做试纸条，对抗原抗体的要求更高，这么说也无可厚非啊。比如，ELISA 用
腹水做产品，都可以达到很好的效果，哪怕抗原抗体里面含有，各种杂蛋白，各种干扰物质，比如甘油，比如咪唑，比如各种的各种，只要这个抗原抗体本身靠谱，最终都会得到不错的结果，但是，如果做试纸条，最终的结果将会无法分析啊。好马配好鞍，好抗体，对工艺的依赖性相对不高，但是好的工艺，才能对得起你的好抗体啊。很多时候，我们没得选择，比如某个抗原抗体，是自己做的，比如有的项目，商品化的原料太少了，比如你只是要点科研，那么对工艺的依赖就高了去了，而经验的积累以及研发习惯的养成，往往是这么玩过来的。我总赶脚高校玩这个，比较嫩，不过话又说回来，高校跟企业的产学研结合，确实是比较有杀伤力的，而且不能否认，IVD 最初的原材料来源，基本都是科研机构。当然再怎么有杀伤力，也玩不过资本运作，想到这儿莫名的消极啊，突然赶脚，玩技术好凄凉啊，想起西瓜兄的一句话，技术永远是下策，最多成就一个匠才。
0 那像我刚才那种现象原因有哪些，大体解决方案从哪入手呢，处理包被液？样品垫？
T：小蝶，你那个问题，不好直接分析，因为可能的原因是比较多的，必须通过一些实验方案的设计，来分析出原因，然后才好下手。
0 话说金标的这种玻纤咋这么扎人呢。
T：介个，问题就在这儿，因为玻纤这种东西，胶体金行业用量太少太少太少了，没人会为这个行业定做玻纤
的。
0 在公司的那种就不扎手。
T：不扎手的玻纤，不是纯玻纤。
0 也都金标家的，不纯？也没影响啊，层析挺好的呀。
T :只要是纯玻纤，都扎手，不过纤维的大小，决定了玻纤的扎手程度，我说不纯，没说不好额，纯的不一定就好额，玻璃微纤维，相对来说，不容易扎手，如果在玻纤里面加入聚酯成分，各种性能，往往会有积极的作用。
0 扎手咋办，手套不方便。
T：奥，换不扎手的呗，乳胶手套，还可以吧。另外捏，裸手操作的话，各种需要注意额，如果你在处理液中加入了防腐剂，比如加了叠氮钠，然后裸手操作，然后再接着拿东西吃，好怕怕啊。突然想起一个恐怖的故事，一个高校，两个学生，操作离心机，换转头，没拧紧，然后，一死一重伤。良好的实验习惯，是灰常灰常重要的。
0 哈哈。涛哥，我还真见过离心机乱跳，还冒烟，转轴断了。
T：好吧，这都被你遇到了，以前的时候，离心机是没有防爆装置的，现在还好。
问：（涛哥提问）谁知道双抗原夹心检测抗体，是如何实现的，我觉得这个问题，比较适合拓展思维。
1.抗体有两个位点。
T：说说看，具体点，两个位点怎么了。
2.然后用空间位阻效应，把同样的抗原决定簇放在了不同的载体上。
T：好吧换个话题，这明显不符合我说话的套路啊，知道了结果的剧情，显然味道不足啊。
3.我随口说的，这就是结果啊，我怎么觉得才刚刚开始啊。
T：其实，我本来就是想拓展到空间位阻上。
4.行吧，我先抖点自己知道的，双抗原夹心法测抗体这种方法一开始我也觉得奇怪，自己做的是hiv 检测，初
入刚，懂的不多，在想检测抗体为毛不和检测普通蛋白一样，针对这个要检测的抗体做两个二抗，然后弄成单抗不就完了嘛，当时比较小白，比较天真，后来想想，这东西完全不现实啊。简单来说，抗原进去免疫系统后，免疫系统会表达出抗体，但是，抗原表面有好多好多抗原决定簇，即便同一个决定簇，也可以激发产生不同的抗体，所以检测某一个型号的抗体不可能，抗原如果有100 个位点，每个位点产生10 种抗体，那么你检测某
一种抗体的概率就是千分之一，还不考虑人个体间的差异，不同人产生的理论上相同的抗体，可能还有差异，所以双抗体夹心测抗体理论上就不现实。然后就产生了双抗原，就是截取抗原上的一个决定簇，这样的话就可以检测针对这个决定簇产生的所有抗体，夹心原理就是因为抗体的树叉结构，fab 两个位点可以结合两个抗原
决定簇，这个方法中比较大的问题就是位阻，因为抗体的两个活性位点完全相同，那么理论上如果直接标记决定簇的话，就会直接覆盖抗体两个位点，就夹心不了了。然后说位阻，如果说抗体的结构是食指和中指，那么如果决定簇是米粒那么大的话，标记的决定簇就会覆盖位点。如何解决这个问题呢，就是把其中一个做大，另外一个做小，比如一个像桃子那么大，一个像李子那么大，当然，核心，也就是决定簇是一样的，这样的话就可以避免标记的抗原覆盖两个抗体结合位点。
0 那么如果决定簇是米粒那么大的话，标记的决定簇就会覆盖位点？没明白。
5.抗体两个位点完全一样，这个理解？
0 嗯，一边一个对吧。
6.对啊，如果标记抗原来检测抗体的话你想会有什么问题？
0 是不是一边结合，标记的载体太大挡着另一边的了？
7.对头。
0 所以一个载体李子一个桃子，金标记的算李子。
8.标记的是桃子，如果标记李子的话，两个李子间距小，两个李子就会覆盖位点，标记桃子的话，因为两个位点之间容不下两个桃子，
只能容下一个。这样才能有另一个位点去结合膜上面小的李子，形成夹心。
0标记抗原怎么做大啊，买抗原大的？捕捉抗原用小的？
9.都是做好的，抗原决定簇行相同，但是载体不同。来点专业的，标记和捕获用重组抗原的抗原决定簇编码
基因是相同的，但是，这两个同样的基因被插进了不同的载体，之后表达岀来了重组抗原。HIV二型的，标记gp36大小47KD，包被gp36大小31KD。当然，载体上还有学问，抗原载体不能把抗原决定簇给包裹掉了，那就歇菜了，除了不能封闭抗原决定簇意外，载体上还应该设计胶体金结合片段，方便胶体金和抗原结合。我也是工作后才知道为什么羊抗鼠能和所有鼠源抗体结合的。
0你怎么知道抗原是37K道尔顿时，抗体分子至少多大才会达到空间位阻呢。
10.我不知道，这是重组抗原合成公司提供的数据。他们经过n多次实践和被虐之后才得到的这对抗原。抗体
的话lgG1型大概是150kd左右。
T:小马讲的，有些是对的，有些还不太充分。双抗原夹心测抗体，是基于抗体的两个相同的FAB片段，也就
是说标记抗原和包被抗原，必须特异性序列是一样的才可以，基于此，我们可以用同一个抗原，既标记，又包被，也可以用两个抗原，一个标记，一个包被，但是这两个抗原，特异性片段肯定是一样的。分别阐述：用同一个抗原分别标记和包被，之所以能够实现，是因为标记抗原结合示踪物之后，变成了复合物，形成了空间位阻，也就是说，抗体的两个FAB客观上，很难结合两个相同的标记抗原，一个FAB结合了一个标记抗原之
后，另外一个FAB再结合包被抗原，是没有问题的。当然，在某些产品的实际应用中，很多供应商会提供两个不同的抗原，这两个抗原，大小是不一样的，非特异性的片段有差异，之所以这样做，是为了得到更高的灵敏度，为什么这样做，就可以达到更高的灵敏度呢。首先，标记抗原，要大一些，这样标记示踪物的时候，不容易标记到特异性位点上，标记后，也不容易对特异性位点产生位阻，包被抗原，相对小一点，这样更不容易受到标记抗原位阻的影响，当然，包被抗原，也不能太小，太小的话，包被会岀现问题，标记抗原，也不能太大，太大的话，表达会岀现问题，一般比较理想的分子量是，标记抗原30?40KD左右，包被抗原15?20KD
左右，这个数据，没有太多理论依据，是通过很多产品总结出来的，仅供参考。另外，关于小马刚才阐述的一些细节，赶脚有点乱，之所以采用双抗原夹心测抗体，不是因为两个二抗怎么怎么样。两个二抗，夹心测抗体，不会得到特异性的结合，是因为二抗主要针对的是FC片段，比如你用两个鼠抗人IgG单抗夹心，测的是人的
总IgG抗体，跟目标抗体，是没有直接关系的。
11.你可以针
对目标抗体做一对二抗单抗，之后经过筛选，做岀只针对该抗体的二抗对啊，未必要针对fc针对目标抗体的特异性位点的单抗对不也很赞么。
T :额我明白你的意思了，你其实是想说，用抗体的FAB去免疫二抗，得到单抗，好吧，这儿我理解错了，
你的解释没有问题。
12.嗯能搞到独有的位点最好，现在想想这个想法有点天马行空，理论上对个体有效，对群体无效的概率比较大。
T :这个，你有没有想过这样一个问题，我给你画一下。（交联凝集）其实，你刚说的那个不可行性的原因（漏
检），双抗原夹心也是存在的。比如，客观上，重组抗原不可能太大，我们一般只选择优势表位，所以，我们所检测到的抗体，也仅仅是针对优势表位的抗体，所以，采用不同的抗原表位，分别做产品的话，检测同一份样本，就会有差异，这也是目前双抗原夹心测抗体项目，一致性比较差的原因之一。基于此，双抗原夹心，测抗体，几乎是无法定量的，所以，我们发现，为什么传染病测抗体的，一般都没有标准品，而是参考品，比如HIV HCV 这些，为什么AFP CEA 这些就有标准品，为什么测抗体的项目，客观上，对量值有要求的时候，一般采用活力单位来表示呢，比如NCU之类的，为什么，测抗原的，对量值有要求的时候，就可以采用
ng/ml这种单位呢，原因就在此。所以，双抗原夹心测抗体，主要用于定性，虽然也有定量的产品问世，但是不同厂家的产品，性能差
异会比较大。| 1 I
13.这个就有点像抗rbc聚沉红细胞的感觉了
问：试验做细菌检测条，阴性对照为PBS时有假阳，而换成TBS后无假阳，是什么原因？
1. 体系。
0 啊，那样本稀释液还要筛选啊。
2.恩，有的体系吃肝素钠的抗凝，有的吃枸橼酸钠的抗凝。
0 这种情况是不是在做细菌胶体金试纸条的时候比较明显呢？
T ：这个属于基质效应范畴，很正常啊。
0 那这样理解行不行。就是说，即使不含待检测物质的溶液，检测结果也不都是阴性。
T：那肯定，所谓假阳性，不就这么回事嘛。
0那消假阳性，是不是要做到无论测什么不含待测物质的溶液都没有T线。
3.那不能。
T：比如PBS 假阳性问题，N 多年前大家就一直在讨论，还有跑水假阳性问题。消假阳性，不是这样的，比如，你总不能拿浓硫酸去检测吧。
4.当年的茶水让HCG出线了。
T :茶水尿事件，不是HCG吧。消假阳性，要有针对性，针对特定的某一个或者某一些基质，进行调试。比如检测血清血浆，那么对于正常血清样本，各种抗凝的正常血浆样本，都要阴性，另外，还要考虑到客户的心态。
很多医院的客户，不管拿到什么产品，先测测水或者生理盐水，或者PBS他们认为这些东西，肯定是纯阴性，
所以，结果必须要是阴性。虽然，他们的这种想法比较扯，但是，有一点需要注意，水生理盐水PBS假阳
性，会给你一个暗示，你的工艺体系，还是很脆弱的。在临床上，个体样本间的基质差异，很可能会对结果造成影响。而且往往很容易受到某些抗凝剂的干扰。
0 那在选样本稀释液的时候，有什么原则或者需要注意的呢。
T：然后样本稀释液的选择，这个可就讲究了，不同的产品，有不同的要求，要有针对性。比如疟疾的产品，就比较特殊，因为疟原虫在红细胞内部，因此必须检测全血，而且必须要人为造成溶血，让红细胞破裂，然后让疟原虫释放出来。所以，首先样本要稀释，要不然结果没发看，太红了。然后，稀释液中，应该含有裂解红细胞的成分。另外，对于细菌检测的产品，首先要知道配对抗体所针对的抗原表位，如果是针对表面抗原的，那么只需要简单的稀释即可，如果是针对内部抗原的，还需要裂解，让抗原表位暴露出来。针对简单
实验四 胶体金快速检测技术试验 一、胶体金试纸条诊断技术的原理： 以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/抗体。 二、层析法免疫胶体金检测方法的优点： ? 1.方便使用，体现在操作简单，不需经过特殊培训。 ? 2.短时间获得检测结果，一般10－15分钟即可得出结论。? 3.不同环境下的稳定性好，不需冷藏。 ? 4.相比而言，其生产成本和检测成本均较低。 ? 5.检测标本种类多：可用于查血、尿液或粪便。 ?三、应用 ?猪伪狂犬病抗体快速金标检测卡 ?原理：猪伪狂犬抗体检测试剂盒（胶体金法），系采用国际最先进的胶体金免疫层析技术检测样本（全血、血清、血浆）中抗猪伪狂犬抗体的方法。整个试验只需20分钟，操作简便、快速、准确，灵敏度高、结果直观、容易判定。 ? 1.操作方法： ?①在检测卡的加样孔内加入100μl待检血清或血液样品。
?②将检测卡平放于桌面上，在室温下静置5-20分钟内判定结果。 超过20分钟的结果只能作为参考。 ? 2.结果判定： ??阳性：在观察孔内，检测线区（T）及对照线区（C）同时出现紫红色线。猪伪狂犬抗体滴度越高，检测线（T）颜色越深。??弱阳性：在观察孔内，检测线区（T）及对照线区（C）同时出现紫红色线，但检测线区（T）出现的颜色很浅。 ??阴性：在观察孔内，只有对照线区（C）出现一条紫红色线。??失效：在观察孔内，对照线区（C）和检测线区（T）都不出现色线；或仅检测线区（T）出现色线。 ?猪瘟病毒抗体、猪蓝耳病抗体快速金标检测卡原理、操作方法、结果判定与猪伪狂犬病抗体快速金标检测卡的基本相同 ? ? ? ?
附件2 食品中呕吐毒素的快速检测胶体金免疫层析法 1 范围 本方法规定了胶体金免疫层析法测定食品中呕吐毒素的快速检测方法。 本方法的适用范围为谷物加工品及谷物碾磨加工品中呕吐毒素的快速检测。 2 原理 试样中呕吐毒素与胶体金标记的特异性抗体发生结合后，抑制了层析过程中抗体与硝酸纤维素膜检测线上呕吐毒素-BSA偶联物的免疫反应，使检测线颜色发生变化，根据检测线颜色变化进行结果判定。 3试剂及耗材 除非另有规定，所用试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682中三级水。 3.1 试剂 3.1.1 提取液：水或胶体金免疫层析检测装置专用提取液。 3.1.2 甲醇：分析纯 3.2 参考物质 呕吐毒素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥99%。 表1 呕吐毒素参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量 注：或等同可溯源物质。 3.3 标准溶液配制 准确称取适量的呕吐毒素参考物质（精确至0.0001g），用甲醇溶解，配成0.1mg/mL 的标准储备液，-20 ℃保存，有效期3个月。 3.4 材料 3.4.1 呕吐毒素胶体金免疫层析检测装置。 3.4.2 中速定性滤纸。 3.4.3 离心管。
3.4.4 滤膜：0.45 μm 水相滤膜。 4 仪器及设备 4.1 天平：感量0.01～0.0001 g。 4.2 粉碎机。 4.3 样品筛：0.9 mm。 4.4 漩涡混合器：1500 rpm/min。 4.5 移液器：100 μL，200 μL，1.0 mL。 4.6 恒温装置：（37.0±2.0）℃。 4.7 设备或方法使用环境条件：温度15 ℃～30 ℃，湿度≤80%。 5 分析步骤 5.1 扦样和分样，按GB 5491 执行。 5.2 试样制备 5.2.1 样品粉碎：将被测样品（5.1）粉碎，过0.9 mm样品筛，充分混合均匀，备用。 5.2.2 质控样品制备：选取经标准方法确认不含呕吐毒素的样品，称取2份平行样，其中一份作为阴性质控样品，另一份添加标准溶液使其样品中呕吐毒素含量为1.0 mg/kg，作为阳性质控样品。 5.2.3 样品溶液制备 准确称取粉碎混匀样品 5.0 g于离心管中，加入25.0 mL 水或专用提取液（3.1.1），漩涡混合器（4.4）提取5 min，静置1 min，中速定性滤纸（3.4.2）过滤，滤液用0.45 μm水相滤膜（3.4.4）过滤，备用； 5.3 测定 5.3.1 将滤液（5.2.3）稀释至呕吐毒素胶体金免疫层析检测装置（3.4.1）检测范围内，漩涡混合器（4.4）混匀，备用。 5.3.2 取150 μL待测溶液加入呕吐毒素胶体金免疫层析检测装置内，恒温装置内反应6 min，结果判定。 6 结果判定 根据检测线（T 线）和控制线（C 线）颜色变化进行结果判定，采用目测法对结果进行判定，比色法和消线法判定原则如下： 6.1 比色法 6.1.1 无效 控制线（C 线）不显色，无论检测卡（T 线）是否显色，表示操作不正确或检测装置已失效。 6.1.2 阳性结果 控制线（C 线）显色，检测线（T 线）显色明显浅于控制线（C 线），判为阳性。 —2—
免疫层析试纸包被技术简介 试纸生产 过程中一般有三种 溶液的包被处理，即 质控溶液，检测溶 液，和结合物溶液 （胶体金）。质控和 检测溶液就是C/T 线上包被的溶液。 在免疫层 析试纸硝酸纤维素 膜表面进行 C/T线的包被，是试纸生产制作的关键环节之一。免疫诊断试剂中使用的硝酸纤维素膜有两类，一种是免疫渗滤产品用的，按孔径选择一般采用0.45um-1.2um的膜，与分子生物学中用的印迹转移膜一样。Whatman Schleicher & Schuell的膜属于纯采用100%的纯硝酸纤维素，蛋白结合能力较高。另一类即免疫层析用膜，一般按侧向流动速度来划分，常用的范围一般在120-180秒/4cm。目前市场上的硝酸 纤维素膜材以带塑料底衬 为主，也有部分的膜不带 底衬。不带底衬的膜需注 意膜面的正反面，其光滑 度有适当差别。 鉴于流动封闭技 术的普及，C/T线的包被 目前流行先将膜粘贴在塑 料支持底板上，然后直接 将塑料板放入仪器上进行 划线操作，干燥后进行其 他部分的贴板组装，这种 划膜工艺可简称为划板。 但部分产品的工艺要求先直接在膜上划好C/T线，然后用特定配方的溶液将膜进行浸泡封闭处理，干燥后再贴膜及其他部分材料，这种划膜工艺可简称为划膜。 在结合物溶液（胶体金）的包被上，较多的用户倾向于用气动喷头进行定量操作。在科研及研发项目中，往往喷一条线或几条线就够用了，因此在单维往复平台上一次喷一条线也可接受。鉴于胶体金膜切条宽度一般在 3--7mm，不方便一条条依次地在移动平台上固定和取放。因此在批量生产过程中，一般建议采用成片的胶体金垫，用三维平台往复来回地间隔喷线，一次即可喷出二三十条。此后将喷好的金干燥再裁切成条，这样的操作会效率高，适合规模生产。 在某些免疫层析试纸产品生产工艺中，层析膜材或样品垫膜材需要用特定溶液进行整平面包被，要求效果均匀，如层析膜和样品垫的特定封闭处理。
附件3 食品中罗丹明B的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201703） 1范围 本方法规定了食品中罗丹明B的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于辣椒粉和辣椒酱中罗丹明B的快速测定。 2原理 本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中罗丹明B经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，罗丹明B与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中罗丹明B进行定性判定。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 3.1试剂 ，用水溶解并稀释至刻度，制成0.2mol/L溶液A；称取31.21g磷酸二氢钠(，用水溶解并稀释至刻度，制成0.2mol/L溶液B。将溶液A与溶液B按照体积比67:33混匀，制成pH7.1磷酸盐缓冲液。 3.2参考物质 罗丹明B参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥98.6% 表1 罗丹明B参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量 注：或等同可溯源物质。 3.3标准溶液配制 ，置于10mL容量瓶中，用甲醇（，摇匀，制成浓度为1mg/mL的罗丹明B标准储备液。冷藏，有效期6个月。 ，置于100mL容量瓶中，用甲醇（，摇匀，制成1μg/mL的罗丹明B标准中间液A。临用新制。，置于10mL容量瓶中，用甲醇（，摇匀，制成100ng/mL的罗丹明B标准中间液B。临用新制。 3.4材料 ，1000mg/6ml。 ，在产品有效期内使用）。 4仪器和设备
4.1移液器：200μL、1mL和10mL。 4.2涡旋混合器。 4.3离心机：转速≥4000r/min。 4.4电子天平：感量为0.01g。 4.5振荡器。 4.6样品浓缩仪：如有需要。 4.7环境条件：温度：15℃—25℃，相对湿度≤60%。 5分析步骤 5.1试样制备 取具有代表性样品约500g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。 5.2试样提取和净化 准确称取试样2g（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，依次加入20mL提取剂（，振荡提取3min，以5000r/min离心5min。上清液待净化。 吸取5mL提取剂（，流出液弃去。将上清液全部转移至固相萃取小柱中，流出液弃去。再加入20mL提取剂（，流出液弃去。用5mL甲醇洗脱小柱，收集洗脱液吹干。精密加入500μL复溶液（，涡旋混合1min，作为待测液。 5.3测定步骤 吸取200μL样品待测液于金标微孔（，抽吸5—10次使混合均匀，室温温育5min；温育结束后，将试纸条（，室温温育5—8min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，进行结果判定。 吸取全部样品待测液于金标微孔（，抽吸5—10次使混合均匀，室温温育5min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（，室温温育5—8min，进行结果判定。 5.4质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 准确称取空白样品2g或适量（精确至0.01g）置于50mL具塞离心管中，加入100μL或适量罗丹明B标准中间液B（100ng/mL）（，使罗丹明B浓度为5μg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 6结果判定要求 通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图1所示。 6.1无效 控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。
胶体金免疫分析技术详解 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业，免疫分析正在向两个方向发展：一类为全自动化的免疫分析；另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒，目前只能在医疗及检测中心应用，虽也能较快速给出结果，但仍需一定时间，不适合远离医疗及检测中心的地区，更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要，在酶免疫分析的基础上，主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析，主要有以下两种方法：斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术，是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后，此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法，使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子（0-100nm）分散在另一种物质中所形成的体系，通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶，用此金溶胶标记蛋白质（抗原、抗体或SPA、SPG），胶体金颗粒具有高电子密度的特性，故在金标蛋白的抗原抗体结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒；当这些标记物在相应的标记处大量聚集时，可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点，从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短，仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原在渗滤或层析时，流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触，很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中，待测抗原要在液相中经过扩散作用，逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时，标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理： 将氯金酸（HAuCl4）用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒（胶体金），标记金黄色葡萄球菌A
鼠疫快速检测试剂盒（胶体金法） 鼠疫概述： 鼠疫是由鼠疫杆菌（Yersinia pestis）引起一种自然疫源性的烈性传染病。因其传播速度快、传染性强、病死率高、社会危害性大,被我国法定为甲类传染病。鼠疫主要通过鼠蚤类传播，曾在历史上有过三次大暴发流行。其临床症状主要表现为发热、严重毒血症症状、淋巴结肿大、肺炎、出血倾向等；随着现代社会交通的发展，对鼠疫快速诊断，尽早发现控制其传播的速度有着重要的意义！ 产品简介： 鼠疫抗原快速检测试剂盒采用胶体金标记技术，应用膜层析双抗体夹心法原理检测组织样本中的鼠疫菌抗原。用于疑似鼠疫病例的辅助诊断及现场筛查。 性能特点： 1、特异性：本品与假结核杆菌、布氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、土拉菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、变形杆菌的108/ml悬液及正常人血清、褐家鼠血清样品，无交叉反应。 2、最低检出量：用生理盐水配制鼠疫菌F1抗原，最低检出量为1ng/ml。 检测原理： 本试剂盒以鼠疫菌特异性抗体致敏硝酸纤维素膜和制备免疫胶体金探针，应用层析式双抗体夹心法原理，用于临床标本、污染物和环境中鼠疫菌抗原的检出，也可用于纯培养鼠疫菌的鉴定。临床标本中，淋巴液的检出率高于血清和尿液。 试剂盒组成： 1、鼠疫抗原快速检测板 2、样本稀释液 3、说明书 4、干燥剂 包装规格：10人份/盒，单人份独立包装。 储存条件：4-25℃避光保存，不得冻存。 有效日期：2年 生产企业：广州市标健生物科技有限公司 样本要求： 制备样品检测液 1、纯培养细菌：挑取疑似鼠疫菌单个菌落，于小试管中制成0.3ml生理盐水菌悬液作为样品检测液。 2、临床标本：取疑似鼠疫患者或病畜腹股沟淋巴结针刺吸出物、脑脊液、血、痰和尿液标本，或死亡动物肝脾研磨标本，加少量生理盐水(约0.3ml)充分振荡混均，自然沉降后取上清作为样品检测液。 3、环境中污染物：取疑似鼠疫菌污染的土壤、灰尘，或物体表面、动物皮毛的擦拭子，浸
胶体金技术 问：检测cle ，金标记抗体扩大后，烘干后检测各项指标良好，但室温保存一天后，T 线下降很多是由什么原 因造成的？室内开除湿机，组装好的板子，在自封袋里加干燥剂。我烘干用了一整天，30 多个小时了，还有方法进行改进吗，这个抗体还能用来生产吗？经检测还是金子出了问题，我就是先少量做，找出各个值，然后才扩大的。我就是先3ml ，再10ml 。 T ：（涛哥）那可能是生产放大过程控制的问题。重新试验，先小试，逐步放大。这就不行了啊，这还算不上生产扩大呢，怀疑误操作，重复试验试试，3ml 的、10ml 的都做一下。 0 是啊，有时标记完检测后，T 线就下降（比预实验） T :标记完检测就下降，说明你标记本身就有问题呗。你标记条件太脆弱，主要考虑你标记条件，重新优化下。 0 如果我再调整pH 值，抗体浓度，灵敏度就会达不到了 T：通过其他途径提高灵敏度。 问：请问为什么C 线包被3mg/ml 不出现条带，而2mg/ml 的就有条带出现呢？ T：正常，从蛋白固定基本原理出发，好好想想。NC 结合蛋白的能力是有限的，其结合位点是会饱和的，假 设其结合能力仅仅为2mg ，你包被3mg ，那边必然有相当一部分是结合不牢固或者压根就没固定住的，样本层析之后，金标蛋白结合了这些不牢固的蛋白，就会流走，不会显色。检测线，也会有同样的情况，不过检测线包被过量的影响不止这么简单。我主要指夹心法。 0 一般调整膜上浓度时在湿法时调整还是干法时调整啊？ 问：标记好的胶体金有沉淀是什么原因？ T：常见的原因：标记条件不合适，封闭物质不纯，复溶液不合适都有可能，当然颗粒大了，也容易沉淀。 0 你们主要用什么方法摸索最佳PH 值？ 1.用碳酸钾用量调整，搞一排，然后看变色和离心后现象，还有检测结果啊。 0 这样岂不是需要很多抗体？呵呵 2.标记又用不了多少抗体，又不是包膜。 0 离心后现象，怎么样的是理想的？ 3.就是没有预期想要的略微蓬松有红色的沉淀，比如贴壁、黑点、离不干净等，离心速度时间也要选好。 0 是啊，之前就发现有点贴壁和黑点，我延长了离心时间也没用。 4.小号金子1ml 离心几分钟就够了。越大速度越低时间，这个速度和时间折中下自己调整。 问：不知道那些强假阳性有什么办法可以抑制？ T：你加阻断剂试过没？ 0试过几种，没有效果，能阻断C线，对T线基本没阻断。 T：照这么说的话既然是同一对抗体而且胶体金法临床假阳性率这么高，我觉得你这对抗体可能对某种因素太敏感了吧，ELISA 是共价标记胶体金是物理标记是会有差异。（涛） 0 现在就是找不到原因，那强阳漏检呢？其实也有试过好几个抗体配对，基本都是那样的结果 问：请教一下各位大虾，多抗标记的时候要注意哪些细节呢？ T：尽量别标记多抗，实在是想标记多抗，把标记PH 提高点。 问：划线时的湿度条件是NC膜制备的要点之一，湿度应控制在45 %?65%，有文献支持吗？ T：文献呢是有滴，不过NC 供应商也会给你建议滴，你自己也是可以探索滴，最终都是要以产业化需要为准。 1.主要膜吸收蛋白的时候要是湿度太低会比较疏水，不利于吸收，一般在40% 以上，膜在点之前在这个环境
心脏型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)胶体金快速检测试剂盒 使用说明书 (仅供专业人员体外诊断使用) 用途 心脏型脂肪酸结合蛋白（h-FABP）检测试剂盒是应用免疫胶体金层析技术建立的快速、特异、操作简便的一步法定性检测方法，用于定性检测人血清或血浆中的心脏型脂肪酸结合蛋白（h-FABP）。可用于急性心肌梗塞（AMI）的辅助诊断。 简介 用于早期诊断急性心肌梗塞（AMI, Acute Myocardial infarction）的指标主要有肌酸激酶异构酶(CK-MB)、肌钙蛋白I（Troponin I）、肌钙蛋白T（Troponin T）和肌红蛋白（Myoglobin）等，但它们对于早期诊断AMI却很不理想，主要原因是：CK-MB、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T缺乏敏感性，它们在胸痛后6-8小时才浓度上升；而肌红蛋白则缺乏特异性，它虽然在胸痛后2-3小时浓度上升，但不能区分骨骼肌和心肌损伤。 而心脏型脂肪酸结合蛋白（h-FABP）则克服了以上两缺点，对于早期诊断AMI具有特异性和敏感性，它是15KD的小分子，动力学特征类似于肌红蛋白，即在胸痛后2-3小时后浓度开始上升，在12-24小时内恢复到正常水平，在4-8小时内达到最高值；而且h-FABP的免疫性不同于其它类型的FABP（如小肠型FABP 和肝脏型FABP），具有特异性，不会发生交叉反应。基于h-FABP以上特点使得其成为理想的AMI早期诊断生化指标。
检测原理 心脏型脂肪酸结合蛋白（h-FABP）检测试剂盒是采用固相免疫胶体金层析技术，利用双抗体夹心法定性检测人血清或血浆中的h-FABP。 人血清或血浆扩散通过附着红色颗粒包被的抗体的滤膜，与滤膜中的包被抗体结合，在检测线（T）区域内，h-FABP－抗体复合物开始与包被在检测线区内的抗体接触，如果血清h-FABP浓度大于10ng/ml，在检测线区h-FABP－抗体复合物被抗-h-FABP的抗体捕获，并出现一条可见的红色条带。h-FABP浓度越高，检测线区出现色带的速度越快，色带越深。彩色颗粒包被的抗体扩散到质控线（C）区域被第二抗体捕获形成质控区红色带。 保存条件和有效期 铝箔袋包装, 4－25℃储存，切勿冷冻, 有效期1年。 试剂盒组成 每盒包装中含：单人份检测卡25包，使用说明书1份。 注意事项
农药残留胶体金快速检测试纸介绍 国家十五重大科技专项“食品安全关键技术”农药残留胶体金免疫快速检测试纸课题成果国家十一五 、“食品安全综合示范一一蔬菜安全生产质量控制技术研究课题”科技成果 原理及产品介绍： 农药残留胶体金检测试纸是属于国际医学界普遍公认的POCT方法，美国国家临床生 化科学院（NACB ）在其制定的“ POCT循证文件”的草案中，将POCT定义为“在接近患者治疗处，由未接受临床试验室科学训练的临床人员或患者（自我监测、检测）进行的临床实验室检验。是一种操作简单快速的方法，监测结果与理化仪器一一色谱仪检测结果相一致或相近似。胶体金免疫快速诊断试纸其原理是利用单克隆抗体建立诊断系统，多克隆抗体建立对照系统。用胶体金标记单克隆抗体，多克隆抗体或免疫原建立一套装置系统。它是应用胶体化学、有机合成化学、免疫学、物理学和材料学的精华综合学科集一体的高科技，实现了复杂的原理与简单操作的统一。产品按国家GB2763-2005《食品中农药最大 残留限量》标准或国际农药残留限量标准设定Cutoff值，能半定量检测出最大限量标准值。 Cutoff值以上表现一条红线，为阳性，代表农药残留超标；Cutoff值以下表现两条红线， 代表农药不超标。适合于蔬菜种植者采摘上市前自行检测，作为农药不超标的把关手段。也适合有目的性的单一品种的抽检。 万华公司现有农药残留胶体金快速检测试纸19种（明细见下表），其中包含了杀虫剂、 杀菌剂和除草剂三大类。
自检。 【样品的前处理方法】 参照农药残留分析样品的采样方法（NY/T 789-2004 ）进行样品的采集、处理、贮存。 整体测定法：选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右见方碎片（叶 类剪成宽度为1cm左右的样品，果菜类、块茎类取1-2mm厚度左右的表皮样品），取5? 50g放入带盖瓶中，加入等量的水，振摇50次，静置6min以上。 【检验方法】 条型： 撕开铝箔袋，取出检测试纸条。将试纸条MAX端浸入样品液中（液面不得超过MAX 线）,此时样本液在毛细管作用下向试纸条的另一端缓缓移行，将固相的金标抗体溶解并带动它向前移行。 1?5分钟观察结果，最长不超过5分钟。 板型： 撕开铝箔袋，取出检测板和塑料滴管，平放在桌面上。用吸管吸取样品液并滴2?3滴 于检测板的圆孔（S）中，此时样本液在毛细管作用下向试纸条的另一端缓缓移行，将固相的金标抗体溶解并带动它向前移行。
胶体金是一种常用的标记技术，是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。 1971年Faulk 和Taytor将胶体金引入免疫化学，此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法，在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA)，用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链ＤＮＡ抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。 免疫胶体金技术的基本原理： 胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA 等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。
双抗体夹心法原理 以FABP 为例（检测抗原） 阳性反应 Y1=F14A （标记了胶体金） Y2=F104B （固定在NC 膜上即T 线） Y3=羊抗鼠IgG （固定在NC 膜上即C 线） 此方法较常用，主要用于较大分子量的蛋白（抗原）的检测。要求两株抗体针对一个抗原的不同位点才可以。也有个别的检测项目是双抗原夹心检测抗体的，原理类似。 样品（血清）含FABP 蛋白 金标记F14A 抗体 金-F14A-FABP 金-F14A-FABP-F14A 金-F14A-羊抗鼠IgG 金-F14A-FABP 羊抗鼠IgG 显示红色 显示红色 金标记F14A 抗体 不显色 显示红色 金-F14A-羊抗鼠IgG 阴性反应 阳性反应
竞争法原理 以吗啡为例（检测抗原） 阳性反应 Y1=胶体金标记的吗啡单抗 Y2=吗啡-BSA 偶联物 Y3=羊抗鼠 此方法主要用于小分子抗原（毒品、农药、肽链等）的检测。由于抗原分子量小不能直接固定于NC 膜上，常常用化学方法把小分子偶联到BSA 等大分子物质上再固定于NC 膜上。此结果与双抗原夹心法相反，阴性CT 两条都是红线，阳性只有C 线一条红线。 金-吗啡抗体-吗啡 吗啡-BSA 金标记吗啡抗体 显示红色 不显色 金-吗啡抗体-吗啡 羊抗鼠 样品（尿液）含吗啡 显示红色 显示红色 金标记吗啡抗体 金-吗啡抗体-羊抗鼠 阴性尿液抗体-吗 阴性反应 阳性反应
间接法原理 以HIV 为例（检测抗体） 显示红色显示红色 显示红色 不显色 此方法主要用于血清中抗体检测，纯化或者重组的抗原固定于NC膜上，标记多为蛋 白A(ProteinA或叫SPA，抗体Fc端结合而与其它蛋白质不结合)。此方法要求胶体金 过量，一般来说样品再加入前需要稀释或者加极少量后再加缓冲液。 斑点免疫渗滤法使用就是间接法。
武汉欣泰扬生物科技有限公司 名称 灵敏度（ppb ） 孔雀石绿（显性） 2 孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂 内含：试剂板，滴管 提取剂 1 提取剂 2 氧化剂 复溶液 说明书 金标微孔 孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂 卡 使用说明书（Ⅱ） 【产品简介】 本产品用于快速检测水产品组织样品中 的孔雀石绿残留，整个检测过程只需要 40 分钟 左右，适用于各类企业及检测机构。 表一 产品灵敏度 表二 产品的组成 【样品处理】 组织样品（虾要去掉头和壳后彻底清洗干 净，鱼要去鳞后洗干净）应当避光冷藏保存。 样品的处理方法如下： 1. 取切碎的一定量的去脂肪组织样本，用均质机均质； 2. 称取 3 g 均质物于 50 ml 离心管中； 3. 向上述50ml 管中加入提取剂1 溶液 3 ml ，提取剂2溶液3ml,再加入 8 ml 乙腈，盖上盖子剧烈振荡2 min 后，室温下 4000 rpm 离心 5 min ； 4. 移取4 ml 上清液于5 ml 离心管中，加入100μl 氧化剂，颠 倒 混 匀 1 0 秒 ，于 6 0 ℃ 环 境 下 ，利 用 氮气 或 空 气 吹 干。（若管底剩余 少于10 0 微升吹不干液体为正常现象，可直接复溶使用，不影响检测结果） 5.向吹干的离心管中加入 0.3 ml MG 复溶液，和正己 6.烷 500μl ,于室温下 4000 rpm 离心 1 min ，用移液器移取下层 150 μl 溶液 ，待检。(移液器枪头一定要抵着管底，取底层溶液，以免取到油脂，导致结果异常) 【使用步骤】 测试前先完整阅读使用说明书，使用前 将试剂板和待检样本溶液恢复至室温（20℃~30℃）。 从原包装袋中取出试剂板，水平放置于观察者正面，如下图所示（打开后请立即使用）； 吸取待检样品 150 微升加入到金标微孔中，等待反应2分钟后，用滴管吹打至完全溶解孔内红色物质； 吸取孔内所有溶液滴加到加样孔中，加样后开始计时； 结果应在:8～10 分钟读取，其他时间判读无效。 T 线 明显显为绿色的，可判为阳性结果 【结果判断】 阴性（-）： T 线显色（测试线，靠近加样孔一端）比 C 线（对照线）深或一样深，表示样品中待检 药物浓度低于2 ppb 或不含待检药物。 阳性（+）： T 线显色明显比C 线浅，或T 线呈绿色， 表示样品中待检药物浓度高于2 ppb ，T 线相比C 线越浅，表示样品中待检药物浓度越高。 无效：未出现C 线，表明不正确的操作过程或试剂板 已失效。应再次仔细阅读说明书，并用新的试 剂板重新测试。 【注意事项】 尽量不要触摸试剂板中央的白色膜面； 请勿使用过期的试剂板； 若需直接检测标准品，请用我方提供的 PBST 缓冲液 进行配制。 切勿重复使用配备的滴管，以免交叉污染； 切勿食用配备的试剂； 试验中务必戴上配备一次性手套； 试验场地要求常温 20℃-30℃的通风条件 【特异性】 本产品与其他种类药物无交 叉反应。 【精密度】 同时使用本产品和孔雀石绿液相质谱串联 质谱法对 150 份样品包括 94 份阴性样本和 56 份阳性样本进行检测，检测结果表明本产品与质谱法的结果符合率为98.0％。 【贮存条件】 4℃～30℃避光保存，切勿冷冻。 【有效期】 12 个月。 【生产日期及批号】 详见包装袋。
免疫胶体金技术常见影响因素分析 自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程就是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响与制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1、1不同型号膜的筛选。硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物与表面活性剂的来源、类型与数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径与分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但就是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小与分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。 1、2结合垫的选择。结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物与待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1、3样品垫及吸水纸的选择。样品垫与吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫与吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸与样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收与蓄积。 2关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性与重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离与沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深与假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体金结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离,从而影响试验结果。
附件3 液体乳中黄曲霉毒素M1的快速检测 胶体金免疫层析法（KJ201709） 1范围 本方法规定了牛奶、羊奶、牦牛奶等液体乳中黄曲霉毒素M1的胶体金免疫层析快速检测方法。 本方法适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳中黄曲霉毒素M1的快速测定。 2原理 本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的黄曲霉毒素M1与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条或检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中黄曲霉毒素M1进行定性判定。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。 3.1试剂 甲醇。 3.2参考物质 黄曲霉毒素M1参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量见表1，纯度≥90%。 表1 黄曲霉毒素M1参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量 注：或等同可溯源物质。 3.3标准溶液的配制 3.3.1黄曲霉毒素M1标准储备液（100 μg/mL）：精密称取适量黄曲霉毒素M1标准品（3.2），置于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 μg/mL的黄曲霉毒素M1标准储备液；或可直接购买黄曲霉毒素M1标准储备液。-20℃避光保存备用，有效期3个月。 —1—
3.3.2黄曲霉毒素M1标准中间液（100 ng/mL）：精密量取黄曲霉毒素M1标准储备液（100 μg/mL）（3.3.1）0.1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为100 ng/mL 的黄曲霉毒素M1标准中间液。临用新制。 3.4材料 黄曲霉毒素M1胶体金免疫层析试剂盒，适用基质为液体乳。 3.4.1金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体）。 3.4.2试纸条或检测卡。 4仪器和设备 4.1移液器：100 μL、200 μL和500 μL。 4.2涡旋混合器。 4.3电子天平：感量为0.01 g。 4.4环境条件：温度15—35℃，湿度≤80%。 5分析步骤 5.1试样制备 取适量有代表性样品充分混匀。 5.2试样提取和净化 以液体乳为基质的样品可直接上样检测或根据产品说明书稀释后检测。 5.3测定步骤 5.3.1试纸条与金标微孔测定步骤 吸取100—200 μL样品待测液于金标微孔（3.4.1）中，抽吸5—10次使混合均匀，不要有气泡，室温温育3—5min（根据配套说明书进行避光操作），将检测试纸条（3.4.2）样品端垂直向下插入金标微孔中，温育5—10min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。 5.3.2检测卡与金标微孔测定步骤 吸取100—200 μL样品待测液于金标微孔（3.4.1）中，抽吸5—10次使混合均匀，不要有气泡，室温温育3—5 min（根据配套说明书进行避光操作），将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡（3.4.2）上的加样孔中，温育5—10 min，进行结果判定。 5.4质控试验 每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 5.4.1空白试验 称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。 5.4.2加标质控试验 —2—
胶体金技术的发展原理及制备方法 1971年Faulk与Taylor首先将胶体金应用于免疫细胞化学研究,1974年Romano建立了间接免疫金染色法,从此胶体金作为新型的免疫标记技术得到迅速发展。 由胶体金标记技术发展起来的胶体金免疫快速诊断技术主要有两种:快速斑点免疫金渗滤法与胶体金免疫层析法。后者具有操作简便(浸入液体中就行)、快速(全程5~10分钟搞定)、无需仪器设备(结果目测就OK)、试剂稳定、成品易于保存(保质期1~2年)等优点,就是科学研究与临床诊断的有力工具。 胶体金(colloidal gold)即胶体状态的金单质,因为其单质粒径非常小可以分散于溶液中形成胶体,故名胶体金。胶体金的常规制备方法就是用还原剂还原氯金酸(HAuCl4,橘黄色晶体,易潮解,氯金酸合成见下图)里的金元素形成金胶体颗粒。这种胶体颗粒在碱性环境下带上负电荷,可与蛋白质的正电荷基团牢固结合,对蛋白进行标记,用于后续的检测,如制成胶体金试纸条(卡)进行物质的检测。 还原氯金酸的化合物很多,通常我们选择柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)。当用1%柠檬酸三钠还原100 mL 0、01%金氯酸时,不同体积比可以得到不同粒径与颜色的胶体金哦！
制备胶体金步骤简单(见下图),重点就是制备过程所用到的材料都必须就是彻底清洁的。例如水至少就是双蒸水,玻璃棒、玻璃容器等要酸洗后冲洗干净并且最好就是硅化的,制备好的胶体金可以加入0、02％ NaN3在洁净玻璃容器内长期存放。 适合于胶体金试纸条(卡)的胶体金粒径在20~40 nm之间为宜,制备的胶体金溶液呈红色,胶体金被置于试纸条(卡)的样品垫下游。当液体样品滴加后,液体溶解胶体金并带动其与样品中的抗原(抗体),在硝酸纤维素膜的毛细作用下从一端慢慢渗移到吸收垫一端,利用抗体/抗原特异性结合及胶休金的显色(红色)反应,可以检测抗原／抗体存在与否。 胶体金试纸条(卡)主要分为双抗夹心法与竞争法两类,前者适合检测大分子物质,后者适合检测小分子物质。两种试纸条(卡)的原理见下图:
一、胶体金的一般性状 (一) 胶体金的颜色 溶胶的颜色取决于分散相物质的颜色、分散相物质的分散度和入射光线的种类，是散射光线还是透射光，粒子越小，分散度越高，则散射光的波长越短。对同一种物质的水溶胶来说，粒子大小不同，呈现的颜色亦不同。如胶体金颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈红色的葡萄酒色；20～40nm之间的金溶胶主要吸收波长530nm的绿色光，溶液呈深红色；60nm的胶体金溶胶主要吸收波长600nm的橙黄色光，溶液呈蓝紫色。一般应用于免疫组织化学的胶体金颗粒为5～60nm范围内，溶液呈现红色。在相当的一段时期内保持其溶胶不变性，称为胶体金的稳定性。影响其稳定性的因素主要是电解质，其次是胶体金本身的浓度、温度及其他非电解质等。 (二) 胶体金的稳定性 溶胶的稳定性介于小分子离子溶液和粗分散相之间，其颗粒作布朗运动，不易受重力影响而下沉。然而，溶胶又是不稳定体系，它的胶粒溶剂化作用很弱，总面积较大、因在胶粒相互碰撞时，有自动合并为较大、较重的颗粒倾向。当胶体颗粒直径变大，超出胶体范围而从介质中沉淀出来的现象叫聚沉。影响其稳定性的主要原因有三点。 (1) 胶粒间的相互吸引力当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶体颗粒合并而变大。 (2) 胶粒及其溶剂化层胶粒及其溶剂化层(溶剂是水时就是水化层)的带电情况。一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。同性电荷相斥，双电子层变厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。 (3) 胶体接口的溶剂膜当二个固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。 (三) 溶胶的聚沉现象 胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，在溶胶胶粒带电及溶剂化的情况下，排斥力成为矛盾的主要方面，溶胶稳定而不聚沉。因为某种原因使溶胶粒带电量减到很小，甚至中和其所带电荷并能去溶剂化膜，胶粒之间可在更近的距离互相接近，引力成为主要矛盾，引力超过斥力时胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有。 (1)少量电解质对溶胶的聚沉作用少量电解质即可使溶胶聚沉，但各种电解质的聚沉能力可用聚沉值来表示。聚沉值是在一定时间内使1L某浓度的溶胶产生聚沉所需电解质的最小物质的量(mm01)。显然，聚沉值愈小，聚沉能力愈大。聚沉值从实验中得出如下的规则：①电解质负离子对带正电的溶胶起主要聚沉作用，正离子对带负电的溶胶起主要聚沉作用；
胶体金标记技术 胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。 用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。1971年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。近年来的研究表明，胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。由于胶体金作为标记物具有很多优点，因此自其问世以来，在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。 近年来，它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。尤其随着人们物质生活的改善，有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。从90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。 制备方法 在溶液中金颗粒呈圆形，边缘平整，界线十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电的排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定的胶体，所以称其为胶体金。胶体金的制作方法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例（即增加或减少还原剂的量）可得到所需不同直径的金颗粒。 但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一，所以目前常用后两种方法，以柠檬酸三钠还原法为例，有两种方法。 1．Frens标准方法： 1)取0.01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL。 2)约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色，大约再过70s，蓝色突然转变为亮红色， 3)继续煮沸约5分钟后结束反应。 4)冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。 5)此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。 该法制备得到的金颗粒直径约为41nm，如前所述要想得到更大或更小的金颗粒，该方法依然可行，唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。另外，采用此标准方法所需反应时间最短。2．Slot标准方法： 1)取1mL1%HAuCl4溶液溶于100mL水中，2)再加入2mL1%二水柠檬酸钠溶液。 3)将该混合溶液加热煮沸约15~30min，直至溶液颜色变为亮红色， 4)冷却后，用0.1M K2CO3溶液调整PH值，该法制备的金颗粒直径约为15nm。 胶体金标记蛋白的原理是：在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。 胶体金免疫技术可大致分为液相胶体金标记技术和固相胶体金标记技术，其分类依据同酶免疫技术。最早的液相胶体金标记技术叫免疫金染色法（IGS），它仅以胶体金作为标记物和显色剂。最初的免疫金染色都采用单标记。即采用大小均一的金颗粒进行标记。后来发展到可利用不同颗粒大小的胶体金作双重标记甚至多重标记。但该方法均仅以胶体金显色，需要较高浓度的标记物，耗费抗体或抗原的量较多，而且需要较大直径的金颗粒（40-50nm），才能获得较高的灵敏度，而且当金颗粒过大时，标记物不稳定，长期贮存容易发生自动聚集。 为克服以上缺点，免疫金银染色法（IGSS）应运而生。该方法的原理是，先用胶体金标记物作免疫金染色，再加入含银的物理显影液，则银离子靠电荷吸引，大量吸附于金颗粒周围，使显色结果呈现金属银的蓝灰色，同时将显色信号进一步放大。应用时，由于本法最终显色是靠金属银的吸附沉积，因此不需要高浓度的胶体金标记物，将胶体金标记物稀释几十倍，仍可获得同免疫金染色一样的最佳效果。这样不仅可以节省大量的抗体或抗原标记物，而且可以节省大量的胶体金。本方法灵敏度的关键在于胶体金吸附银颗粒的数量。小直径的