实验一固定化酵母细胞及蔗糖酶的检测
一、实验目的
1. 掌握固定化酵母的方法，从而获得固定化蔗糖酶。
2. 掌握蔗糖酶活力的测定原理及还原糖的定性检测法。
二、实验原理
酵母细胞中富含蔗糖酶，蔗糖酶能将蔗糖转化成果糖和葡萄糖，葡萄糖和果糖
同为六碳单糖，分子式为C
6H
12
O
6
，但化学结构不同，前者为醛糖，后者为酮糖。
斐林试剂是新配制的Cu(OH)2溶液，它在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红
色的Cu
2
O沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。
三、仪器和试剂
仪器：
三角瓶（1）、注射器（1）、试管（2）、水浴锅。
试剂：
1、海藻酸钠50克；
2、活性酵母150克；
3、 10％蔗糖液：称取100克蔗糖用水定容至1000毫升；
4. 斐林甲、乙液：各50ml。
5、4％氯化钙溶液（180克氯化钙溶于4320克水中）
四、操作步骤
l、称取海藻酸钠0.5克加入50毫升水中，微火加热溶解后冷却到30℃左右，将预先准备好的1.0克活性酵母的悬液加入混匀。
然后用注射器吸取，让其慢慢滴入4％氯化钙溶液中（150毫升），制成直径2
－3毫米的球形固定化酵母。刚形成的凝胶珠应在CaCl
2
溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。
将此固定化酵母装入三角瓶中，加入10％的蔗糖液30毫升。经固定化酵母水解30~40分钟，其成分为葡萄糖和果糖的混合液。
2、蔗糖酶的检测
吸取斐林甲、乙液各1毫升于干燥试管中，加入水解液1毫升，沸水中保温，观察颜色反应。有氧化亚铜沉淀的则说明蔗糖已被水解，管中有蔗糖酶的存在。
空白以10％蔗糖液做对照，其它同上。
斐林试剂甲：NaOH溶液，其浓度为0.1g/ml。
斐林试剂乙：CuSO4溶液，其浓度为0.05g/ml。
斐林试剂是新配制的Cu(OH)2溶液，它在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红O沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。用斐林试剂鉴定可溶性还原色的Cu
2
糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色→棕色→砖红色（沉淀）。
思考题：
1、细胞和酶的固定化有哪些方法？本实验中固定化酵母细胞属何种方法？
2、有哪些方法可以终止酶的催化反应？
3、固定化细胞催化有何特点？
实验二果葡糖浆的酶法生产
一、原理：葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成果糖，果葡糖浆是葡萄糖和果糖的混合糖浆。葡萄糖异构反应平衡时，可将40~50%的葡萄糖转化为果糖，人们将这种葡萄糖与果糖混合的糖浆称为果葡糖浆。
二、实验材料、仪器和试剂
(1)恒温水浴锅
⑵磷酸缓冲液(pH值7.5)
⑶固定化葡萄糖异构酶
⑷激活剂：0.5M硫酸镁溶液
⑸70％(W/V)葡萄糖溶液
⑹1.5％(W/V)半胱氨酸盐酸盐溶液
⑺0.12％(W/V)咔唑酒精溶液
⑻硫酸溶液
⑼恒流泵
⑽分光光度计
⑾玻璃夹套柱
三、操作步骤
⑴取合适量的酶(用固定化酶完整颗粒,不磨碎),加0.02M磷酸缓冲液 (pH7.5) 适量，浸泡0.5h。
⑵开启恒温水浴，温度调节为60~65℃。
⑶倾去浸泡固定化酶的磷酸缓冲液，将用固定化酶完整颗粒装入玻璃夹套柱内，保持60~65℃。
⑷向葡萄糖溶液30mL中加入硫酸镁溶液10mL, 加水至总体积100ml，充分溶解。
⑸利用恒流泵，将加入硫酸镁的葡萄糖溶液自反应柱底部泵入。
⑹收集反应液，适当稀释，测定滤液的果糖含量或作定性鉴定。
试剂配制
1、70％(W/V)葡萄糖溶液:称取70克分析纯葡萄糖加入煮沸的蒸馏水中,再加热使其完全溶解,冷却用蒸馏水定容至100mL。
2、pH7.5磷酸缓冲溶液: 0.2M磷酸二氢钠(GB 1267)溶液:称取3.12g磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O),用蒸馏水溶解并稀释至100mL。0.2M磷酸氢二钠(GB 1263)溶液:称取7.16g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),用蒸馏水溶解并稀释至100mL。取一定量上述二溶液混合,用pH计校正pH至7.5。
3、0.5M硫酸镁溶液:称取6.15g硫酸镁(MgSO4·7H2O),加蒸馏水溶解,用蒸馏水定容至50mL。
果糖测定法(半胱氨酸-咔唑法) )
1、试剂
⑴1.5％(W/V)半胱氨酸盐酸盐溶液:称取生化试剂纯半胱氨酸盐酸盐0.375g,用蒸馏水溶解,并稀释定容至25mL。
⑵0.12％(W/V)咔唑酒精溶液:称取咔唑30.0mg,用无水酒精溶解并定容至
25mL,放置在棕色瓶中,24h后使用。
⑶硫酸溶液:量取分析纯浓硫酸90mL,在不断搅拌下徐徐倒入38mL蒸馏水中。
2、测定果糖
反应终止后(加高氯酸HCLO4 0.5M一滴,或100度沸水终止)溶液适当稀释后,吸取0.5mL, 然后每管中加入0.1mL半胱氨酸盐酸盐溶液,3mL硫酸溶液,摇匀后,立即加入0.1mL咔唑酒精溶液,摇匀,于60℃水浴中保温10min,取出用水冷却呈红紫色（可作定性鉴定）,用10mm光径的比色皿,在560nm波长下比色测定（可作定量测定）。
⑴果糖标准曲线的制作：
①标准果糖溶液：称取预先在55℃真空干燥至恒重的分析纯果糖125.0mg，用蒸馏水定容至25mL(5mg/mL)，存放于冰箱中备用。使用时稀释100倍(50ug/mL)。
②标准曲线的绘制：取4支试管，按表1顺序加入试剂，进行操作，每加入一种试剂后应立即摇匀。以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（ug/mL）为横坐标作图得标准曲线。
表1 果糖测定 (半胱氨酸-咔唑法)—标准曲线的制作
管号 1 2 3 4 5
果糖标准溶液/ mL（50ug/mL）0.0 0.1 0.2 0.4 0.5 纯水/ mL 0.5 0.4 0.3 0.1 0.0 半胱氨酸盐酸盐溶液/ mL 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 硫酸溶液/ mL（摇匀） 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
咔唑酒精溶液/ mL（振荡）0.10.10.10.10.1 OD560
60℃水浴保温10min，然后自来水冷却，于560nm处比色。
⑵反应液果糖含量的测定：
将反应液液稀释，使其果糖含量在10-40ug范围内，准确吸取0.5 mL，每种样品液做3个重复，按表2加样，参照标曲绘制的操作，测定吸光度。根据获得的吸光度在标准曲线图上查得相应的果糖量。
表2 果糖含量的测定
管号 1 2 3 4
样品/ mL 0.0 0.5 0.5 0.5
纯水/ mL 0.5 0 0 0
半胱氨酸盐酸盐溶液/ mL 0.1 0.1 0.1 0.1 硫酸溶液/ mL（摇匀） 3.0 3.0 3.0 3.0
咔唑酒精溶液/ mL（振荡）0.1 0.1 0.1 0.1 OD560
60℃水浴保温10min，然后自来水冷却，于560nm处比色。
四、实验数据处理
⑴果糖含量
果糖（g/mL）=(F*n)/(106)
式中：F---由标准曲线所得的果糖含量，ug/mL
n---样品稀释倍数
106---单位换算
⑵葡萄糖转化率
葡萄糖转化率（%）=样品中果糖含量/21%*100%
式中： 21%---为底物溶液中葡萄糖含量（g/mL）
共三套 《酶工程》试题一： 一、是非题（每题1分，共10分） 1、酶是具有生物催化特性的特殊蛋白质。（） 2、酶的分类与命名的基础是酶的专一性。（） 3、酶活力是指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大，意味着酶活力越高。（） 4、液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。（） 5、培养基中的碳源，其唯一作用是能够向细胞提供碳素化合物的营养物质。（） 6、膜分离过程中，膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒成分或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。（） 7、在酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶之间都是互配的分子对，在酶的亲和层析分离中，可把分子对中的任何一方作为固定相。（） 8、角叉菜胶也是一种凝胶，在酶工程中常用于凝胶层析分离纯化酶。（） 9、α－淀粉酶在一定条件下可使淀粉液化，但不称为糊精化酶。（） 10、酶法产生饴糖使用α－淀粉酶和葡萄糖异构酶协同作用。（） 二、填空题（每空1分，共28分） 1、日本称为“酵素”的东西，中文称为__________,英文则为__________,是库尼（Kuhne）于1878年首先使用的。其实它存在于生物体的__________与__________。 2、1926年，萨姆纳（Sumner）首先制得__________酶结晶，并指出__________是蛋白质。他因这一杰出贡献，获1947年度诺贝尔化学奖。
3、目前我国广泛使用的高产糖比酶优良菌株菌号为__________,高产液化酶优良菌株菌号为___________。在微生物分类上，前者属于__________菌，后者属于__________菌。 4、1960年，查柯柏（Jacob）和莫洛德（Monod）提出了操纵子学说，认为DNA分子中，与酶生物合成有关的基因有四种，即操纵基因、调节基因、__________基因和__________基因。 5、1961年，国际酶委会规定的酶活力单位为：在特定的条件下（25oC，PH及底物浓度为最适宜）__________,催化__________的底物转化为产物的__________为一个国际单位，即1IU。 6、酶分子修饰的主要目的是改进酶的性能，即提高酶的__________、减少__________，增加__________。 7、酶的生产方法有___________，___________和____________。 8、借助__________使__________发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。 9、酶的分离纯化方法中，根据目的酶与杂质分子大小差别有__________法，__________法和__________法三种。 10、由于各种分子形成结晶条件的不同，也由于变性的蛋白质和酶不能形成结晶，因此酶结晶既是__________，也是__________。 三、名词术语的解释与区别（每组6分，共30分） 1、酶生物合成中的转录与翻译 2、诱导与阻遏 3、酶回收率与酶纯化比（纯度提高比） 4、酶的变性与酶的失活
第一章酶的分离提取与纯化 1.1离心分离和层析分离 1.1.1酶的提取方法 离心是利用离心机旋转所产生的的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异，进行分离浓缩和提纯生物样品的一种方法。 离心分离时，要根据待分离物质以及杂志的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 1.1.1.1离心机的种类与用途 常速离心机，高速离心机，超速离心机 1)常速离心机：转速<8000 r/min 用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣 及粗结晶等较大颗粒 2)高速离心机：转速：1~2.5*104 r/min 用途：分离各种沉淀物、细胞碎片 及较大的细胞器 3)超速离心机：转速：2.5~12*104 r/min 用途：用于DNA、RNA、蛋白质 等生物大分子以及细胞器、病毒的分离纯化 1.1.1.2离心方法 差速离心，密度梯度离心，等密度梯度离心 1)差速离心：原理：是采用不同的离心速度和离心时间，是沉降速度不同的颗 粒分不分离的方法。用途：分离沉降系数相差较大的蛋白质分子 2)密度梯度离心原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用 下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 常用介质：蔗糖、甘油 3)等密度梯度离心：原理：当待分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密 度梯度范围内时，不同浮力密度的颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置，形成区带。介质：铯盐 1.1.1.3层析分离技术 又称色谱技术，是一种物理的分离方法。利用混合物中的各组分的物理化学性质（分子的大小和形状，分子极性，吸附力，分子亲和力）的不同，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（固定相），另一个相则流过固定相（流动相）并使各组分以不同速度一定，从而达到分离 根据分离原理分类 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等 1)吸附层析 原理：是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物中各组分分离的方法。 2)分配层析 原理：在一个有两相同时存在的溶剂系统中，根据不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。
蛋白质酶工程，课堂提问整理 第一章 1、酶：酶是生物体内进行新陈代谢不可缺少的受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。 2、酶工程的研究主要分为三个部分：酶的生产，酶的改性，酶的应用 3、蛋白类酶可以分为六大类，分别是（如图） 4、酶的命名有两种方法：系统名（包括所有底物的名称和反应类型）、 惯用名（只取一个较重要的底物名称和反应类型） 判断： （1）寡聚酶：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个 亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。（√） （2）酶活力指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大， 意味着酶活力越高。（×） （3）青霉素酰化酶不但能催化青霉素侧链的水解作用，而且也能催化逆反应。（√） （4）不同细胞最适PH不同，细胞产酶的最适PH与生长最适PH往往有所不同，同一种细胞，生产不同酶的最适PH不同。（√） 5、酶的必需基团包括：（如图） 6、酶的专一性：指酶对底物及其催化反应的严格选择性。（可分为结 构专一性和立体异构专一性） 7、温度对酶的双重影响：温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低。 8、最适温度：酶促反应速度最快时的环境温度。 9、最适PH:酶催化活性最大时的环境pH。 10、酶促反应速度：在适宜的反应条件下，用单位时间内底物的消耗或产物的生成量来表示。 11、酶活力测定的一般步骤：(P8 )1. 根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。 2. 根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。 3. 在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。 4. 反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。 PS:酶的活力的国际单位是IU 12、酶工程：是酶的生产与应用的技术过程，主要任务是通过预先设计，经过人工操作，获得所需的酶，并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。 第二章 1．酶的生产方法：提取分离法，生物合成法，化学合成法 2．遗传密码子的特点：连续性，简并性，普遍性与特殊性 3．酶的生物合成法根据使用的细胞不同分类：微生物发酵产酶，植物细胞培养产酶，动物细胞培养产酶 4．葡萄糖效应的概念：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”，这一现象称葡萄糖效应。 产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。
年级2001 专业生物技术 一名词解释（每题3分，共计30分） 1.酶工程 2.自杀性底物 3.别构酶 4.诱导酶 5.Mol催化活性 6.离子交换层析 7.固定化酶 8.修饰酶 9.非水酶学 10.模拟酶 二填空题(每空1分,共计30分) 1.决定酶催化活性的因素有两个方面，一是，二是 。 2.求Km最常用的方法是。 3.多底物酶促反应的动力学机制可分为两大类，一类是，另一类是 。 4.可逆抑制作用可分为，，， 。 5.对生产酶的菌种来说，我们必须要考虑的条件有，一是看它是不是，二是能够利用廉价原料，发酵周期，产酶量，三是菌种不易，四是最好选用能产生酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。 6.酶活力的测定方法可用反应法和反应法。 7.酶制剂有四种类型即酶制剂，酶制剂，酶制剂和 酶制剂。 8.通常酶的固定化方法有法，法，法， 法。 9.酶分子的体外改造包括酶的修饰和修饰。 10.模拟酶的两种类型是酶和酶。 11.抗体酶的制备方法有法和法。 三问答题(每题10分,共计40分) 1.固定化酶和游离酶相比，有何优缺点 2.写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原理。 3.为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料 4.下面是某人对酶测定的一些数据，据此求出该酶的最大反应速度和米氏常数。
10-6 10-6 10-5 10-5 10-5 10-4 10-4 10-2 酶工程试题（B） 一名词解释 1.抗体酶 2.酶反应器 3.模拟酶 4.产物抑制 5.稳定pH 6.产酶动力学 7.凝胶过滤 8.固定化酶 9.非水酶学 10.液体发酵法 二填空题(每空1分,共计30分) 值增加，其抑制剂属于抑制剂，Km不变，其抑制剂属于抑制剂，Km 减小，其抑制剂属于抑制剂。 2.菌种培养一般采用的方法有培养法和培养法。 3.菌种的优劣是影响产酶发酵的主要因素，除此之外发酵条件对菌种产酶也有很大的影响，发酵条件一般包括，，，， 和等。 4.打破酶合成调节机制限制的方有，，。 5.酶生物合成的模式分是，，， 。 6.根据酶和蛋白质在稳定性上的差异而建立的纯化方法有法，法和 法 7. 通常酶的固定化方法有法，法，法， 法。 8. 酶分子的体外改造包括酶的修饰和修饰。 9.酶与抗体的重要区别在于酶能够结合并稳定化学反应的，从而降低了底物分子的，而抗体结合的抗原只是一个态分子，所以没有催化能力 三问答题(每题10分,共计40分) 1.在生产实践中，对产酶菌有何要求 2.对酶进行化学修饰时，应考虑哪些因素 3.列出用共价结合法对酶进行固定化时酶蛋白上可和载体结合的功能团 4.某酶的初提取液经过一次纯化后，经测定得到下列数据，试计算比活力，回收率及纯化 倍数。
一、名词解释 1、蛋白质工程（Protein Engineering）——以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求的工程技术。 2、结构模体（supersecondary structure，motif）——介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。 3、结构域（domain）——是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。 4、蛋白质的折叠(protein folding)——从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。 5、分子伴侣（molecular chaperone）——一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。 6、晶胞(Unit cel l)——空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。 7、核磁共振现象（nuclear magnetic resonance ，NMR）——指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射（radio frequency, RF）的物理过程。 8、化学势（位）移（ ）——在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。 9、耦合常数（J）——由于自旋裂分形成的多重峰中相邻2峰间的距离。用以表征2核之间耦合作用的大小，单位赫兹Hz。 10、蛋白质组（proteome）——一个基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达的全套蛋白质。 二、问答题 1、蛋白质修饰特异性与非特异性诱变方法： 随机突变：UV、X射线、其他化学方法、转座元件、简并引物 定点突变：核式突变、限制性内切酶位点、寡核苷酸介导突变、PCR依赖 1）、Kunkel突变法 双突变菌株 转染于dut+ung+野生型受体菌不含U碱基的保留，含U碱基的被切除 原理：当大肠杆菌dUTP酶缺失突变时（dut-），这些细菌就不能把dUTP转化为dUMP,因而细菌体内的dUTP浓度大为增加，并且一些dUTP会掺入到DNA合成中应该由胸腺嘧
酶工程复习提纲 第一章绪论 1.酶及酶工程的概念。 酶：是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质。 酶工程：利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需产品的一门工程技术。(名词解释) 2.了解酶学的发展历史，尤其是一些关键事件。 1833年，Payen和Persoz发现了淀粉酶。1878年，Kuhne首次将酵母中进行乙醇发酵的物质称为酶。给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个词来自希腊文，其意思“在酵母中”。 1902年，Henri提出中间产物学说。1913年，Michaelis and Menton推导出酶催化反应的基本动力学方程，米氏方程：V=VmS/（Km+S）。1926年，Summer分离纯化得到脲酶结晶。人们开始接受“酶是具有生物催化功能的蛋白质”。Cech and Altman于1982和1983年发现具有催化活性的RNA即核酸类酶，1989年获诺贝尔化学奖。现已鉴定出5000多种酶，上千种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。 3.了解酶在医药、食品、轻工业方面的应用。 医药：（1）用酶进行疾病的诊断：通过酶活力变化进行疾病诊断，谷丙转氨酶/谷草转氨酶用于诊断肝病、心肌梗塞等，酶活力升高；葡萄糖氧化酶用于测定血糖含量，诊断糖尿病。 （2）用酶进行疾病的治疗：来源于蛋清、细菌的溶菌酶用于治疗各种细菌性和病毒性疾病；来源于动物、蛇、细菌、酵母等的凝血酶用于治疗各种出血病；来源于蚯蚓、尿液、微生物的纤溶酶用于溶血栓。 （3）用酶制造各种药物：来源于微生物的青霉素酰化酶用于制造半合成青霉素和头孢菌素；来源于动物、植物、微生物的蛋白酶用于生产L-氨基酸。 食品：生产低聚果糖，原料为蔗糖，所需酶为果糖基转移酶、蔗糖酶α（黑曲霉、担子菌）；生产低聚异麦芽糖，原料为淀粉，所需酶为α-淀粉酶、β-淀粉酶、真菌α-淀粉酶（米曲霉）、α-葡萄糖苷酶（黑曲霉）、普鲁兰酶、糖化型α-淀粉酶（枯草杆菌）。 轻工业：用酶进行原料处理；用酶生产各种轻工、化工产品；用酶增强产品的使用效果。
酶工程试题(A) 年级2001 专业生物技术 一名词解释（每题3分，共计30分） 1.酶工程 2.自杀性底物 3.别构酶 4.诱导酶 5.Mol催化活性 6.离子交换层析 7.固定化酶 8.修饰酶 9.非水酶学 10.模拟酶 二填空题(每空1分,共计30分) 1.决定酶催化活性的因素有两个方面，一是，二是 。 2.求Km最常用的方法是。 3.多底物酶促反应的动力学机制可分为两大类，一类是，另一类是 。 4.可逆抑制作用可分为，，， 。 5.对生产酶的菌种来说，我们必须要考虑的条件有，一是看它是不是，二是能够利用廉价原料，发酵周期，产酶量，三是菌种不易，四是最好选用能产生酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。 6.酶活力的测定方法可用反应法和反应法。 7.酶制剂有四种类型即酶制剂，酶制剂，酶制剂和 酶制剂。 8.通常酶的固定化方法有法，法，法， 法。 9.酶分子的体外改造包括酶的修饰和修饰。 10.模拟酶的两种类型是酶和酶。 11.抗体酶的制备方法有法和法。 三问答题(每题10分,共计40分) 1.固定化酶和游离酶相比，有何优缺点？ 2.写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原理。 3.为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？ 4.
酶工程试题（B） 一名词解释 1.抗体酶 2.酶反应器 3.模拟酶 4.产物抑制 5.稳定pH 6.产酶动力学 7.凝胶过滤 8.固定化酶 9.非水酶学 10.液体发酵法 二填空题(每空1分,共计30分) 1.Km值增加，其抑制剂属于抑制剂，Km不变，其抑制剂属于抑制剂，Km减小，其抑制剂属于抑制剂。 2.菌种培养一般采用的方法有培养法和培养法。 3.菌种的优劣是影响产酶发酵的主要因素，除此之外发酵条件对菌种产酶也有很大的影响，发酵条件一般包括，，，， 和等。 4.打破酶合成调节机制限制的方有，，。 5.酶生物合成的模式分是，，， 。 6.根据酶和蛋白质在稳定性上的差异而建立的纯化方法有法，法和 法 7. 通常酶的固定化方法有法，法，法， 法。 8. 酶分子的体外改造包括酶的修饰和修饰。 9.酶与抗体的重要区别在于酶能够结合并稳定化学反应的，从而降低了底物分子的，而抗体结合的抗原只是一个态分子，所以没有催化能力 三问答题(每题10分,共计40分) 1.在生产实践中，对产酶菌有何要求？ 2.对酶进行化学修饰时，应考虑哪些因素？ 3.列出用共价结合法对酶进行固定化时酶蛋白上可和载体结合的功能团 4.某酶的初提取液经过一次纯化后，经测定得到下列数据，试计算比活力，回收率及纯化 倍数。 （A）答案及评分细则 一 1. 酶工程：又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术。
《蛋白质与酶工程》教学大纲 课程名称：蛋白质与酶工程 学分：2 学时：32 先修课程：生物化学 适用专业：生物工程 开课系部：生命科学学院 一、课程性质、目的和培养目标 课程性质：专业选修课 课程目的：本课程是生物工程本科专业选修课，目的是让学生在学习了普通生化的基础上，进一步对蛋白质和酶工程进行深入系统的学习。并对于酶在生产实践中的应用，也能有一些感性和理性的认识。 课程培养目标：采用多媒体课件和国内外最新的教学参考书、教案，灵活运用多种教学方法，因材施教，使学生在牢固掌握基础知识和基本概念的同时，得到科学研究、科学思维和科学方法的良好训练，为其他专业基础课和专业课的学习及日后的研究工作打下基础。 二、课程内容和建议学时分配 第一章绪 论 2课时 （一）教学基本要求 掌握蛋白质工程和酶工程的定义，了解其发展史，以及应用前景。 （二）教学内容 第一节蛋白质工程概论 第二节蛋白质工程的应用 第三节蛋白质工程展望 第四节酶工程简介 一酶工程 二组成：酶的产生；酶的分离纯化；酶的固定化；生物反应器。 三分类：化学酶工程；生物酶工程。 第五节酶与酶工程的发展简史 一酶学研究简史 二酶工程研究简史
（三）教学重点和难点 重点：蛋白质与酶工程定义; 难点：酶工程的组成分类 第二章蛋白质的结构与功能 2课时（一）教学基本要求 掌握蛋白质的基本结构组成及功能 （二）教学内容 第一节蛋白质的基本结构与功能 一蛋白质的组成 二蛋白质的一级结构 三蛋白质一级结构与功能的关系 第二节蛋白质的空间结构与功能 一蛋白质的二级结构 二超二级结构和结构域 三蛋白质的三级结构 四蛋白质空间结构与功能的关系 五蛋白质-蛋白质相互作用 （三）教学重点和难点 重点：蛋白质的空间结构；难点：蛋白质间的相互作用； 第三章蛋白质的修饰和表达4课时（一）教学基本要求 掌握蛋白质的化学修饰途经，了解蛋白质改造的一些途经等。 （二）教学内容 第一节蛋白质修饰的化学途径 一功能基团的特异性修饰 1多位点取代 2 3 二基于蛋白质片段的嵌合修饰 第二节蛋白质改造的分子生物学途径 一编码基因的专一性位点和区域性定向突变 1 2 二基因融合和基因剪接 三tRNA介导定点搀入非天然氨基酸 第三节重组蛋白质的表达
一、名词解释（本题共8个小题，每小题2分，共16分）。 1、固定化酶： 2、原生质体： 3、超滤： 4、酶的催化特性： 5、生物酶工程： 6、酶的必需基团和活性中心： 7、诱导与阻遏： 8、酶反应器： 二、填空题（本题共5个小题，每空2分，共24分）. 1、酶的分类（）（）（）。（三种即可） 2、酶活力是（）的量度指标，酶的比活力是（）的量度指标，酶转换数是（）的量度指标。 3、微生物产酶模式可以分为同步合成型，（）中期合成型，（）四种。 4、酶的生产方法有（），生物合成法和化学合成法。 5、优良的产酶微生物所具备的条件：（1）（）（2）（）（3）（）（写出三种即可）。 三、判断题（本题共10个小题，每空1.5分，共15分）。 1、酶是具有生物催化特性的特殊蛋白质。 2、酶活力是指在一定条件下酶所催化的反应速度，反应速度越大，意味着酶活力越高。 3、液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式。 4、培养基中的碳源，其唯一作用是能够向细胞提供碳素化合物的营养物质。 5、在酶与底物、酶与竞争性抑制剂、酶与辅酶之间都是互配的分子对，在酶的亲和层析分离中，可把分子对中的任何一方作为固定相。 6、补料是指在发酵过程中补充添加一定量的营养物质，补料的时间一般以发酵前期为好。 7、酶固定化过程中，固定化的载体应是疏水的。 8、在酶的抽提过程，抽提液的 pH 应接近酶蛋白的等电点。 9、青霉素酰化酶不但能催化青霉素侧链的水解作用，而且也能催化逆反应。 10、亲和试剂又称活性部位指示试剂,这类修饰剂的结构类似于底物结构。 四、问答题（本题共5个小题，共45分）。 1、试述提高酶发酵产量的措施。（8 分，答出四点即可） 2、酶失活的因素？（8分） 3、酶的提取方法有哪些？（8分） 4、酶分子修饰的意义有哪些？（6分） 5、试简述酶分子的定向进化。（5分） 6、固定化酶和游离酶相比，有何优缺点？（10分，优缺点答五点即可） 答案 一、1、固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶固定在载体上，能使酶发挥催化作用的酶；2、原生质体：脱去细胞壁的植物、真菌或细菌细胞；3、超滤：超滤是采用中空纤维过滤新技术，配合三级预处理过滤清除自来水中杂质；4、酶的催化特性：①极高的催化效率②高度的专一性③酶活性的可调节性④酶的不稳定性5、生物酶工程：是指在基因水平上，对酶蛋白分子进行修饰、改造，改进酶蛋白的催化特性或酶蛋白的蛋白质特性等；6、酶的必需基团：指酶分子中与酶的活性密切相关的基团；活性中心：是与底物结合并催化反应的场所；7、酶合成的诱导是指加入某种物质使酶的合成开始或加速进行的过程；酶合成
酶工程期末考试试题(A) 一名词解释：( 每小题3分共30分) 1 酶催化的专一性：绝对专一性和相对专一性； 2 酶催化的邻近效应、定向效应：底物彼此靠近、活性中心浓度增大、底物与结合部位按有利于催化反应的方向定位； 3 Kcat：催化常数，即在最适条件下，没摩尔酶每分钟所转化的底物摩尔数； 4 酶活力：酶催化活力，用酶催化反应速度表示； 5 酶催化周期：每mole酶蛋白催化每mole底物所需要的时间； 6 Ks盐析和β盐析 Ks盐析：即蛋白质溶液的pH值和温度固定不变，改变溶液的盐浓度（离子强度），以达到沉淀蛋白的作用；此法常用的盐是硫酸铵。 β盐析法：是在一定的离子强度下，改变溶液的pH值和温度，以达到蛋白沉淀的目的。 7 离子交换剂：离子交换剂是借酯化、氧化或醚化等化学反应，在琼脂糖、纤维素或凝胶分子上某些极性基团，通过极性基团的静电吸附作用，对极性大分子进行分离。按离子交换剂上的活性基团的性质不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两种。 8 生物酶工程：是指在基因水平上，对酶蛋白分子进行修饰、改造，改进酶蛋白的催化特性或酶蛋白的蛋白质特性等。 本章主要介绍核酶、进化酶、杂合酶和抗体酶的有关基本概念和基本知识。 9 酶分子的定向进化： 是指在分子水平上，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），对酶基因进行改造，并进行定向选择，筛选出所需性质的酶蛋白。10 核酶：化学本质是核酸的酶，包括核酶和脱氧核酶 二填空题：（每空1分共 20分） ⑴按催化反应类型分，将酶分成6个大类，它们的名称及其代码分别是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶； ⑵根据葡聚糖凝胶的交联度不同，软胶包括 G75 、 G100 、 G150 、 G200 ； ⑶酶固定化方法有吸附法、交联法、吸附交联法、共价结合法、微胶囊法； ⑷酶蛋白化学修饰的方法包括金属离子置换、大分子结合、肽链有限水解、 氨基酸置换、侧链基团修饰；
一、选择题 1．下列不属于Prion蛋白特点的是（C） A.没有核酸 B.没有病毒形态 C.在120℃高温及2h高压下可灭活 D.病毒潜伏期长 2．蛋白质工程研究的核心内容是（A） A.蛋白质结构分析 B.蛋白质结构预测 C.改造蛋白质 D.创造新蛋白质 3．蛋白质工程的最终目的是（C） A.研究蛋白质的结构组成 B.创造新理论 C.生产具有新性能的蛋白质 D.研究蛋白质的氨基酸组成 4．蛋白质分子设计中“小改”是指（B） A.对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装 B.对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的替换 C.完全从头设计全新的蛋白质 D.对蛋白质中的一个肽段进行替换 5．可用于蛋白质功能分析的方法是（D） A.X射线晶体衍射技术 B.圆二色谱法 C.显微技术 D.蛋白质芯片技术 6．以下那种方法，可以方便地在溶液中研究分子结构，并且是唯一可以使试样不经受任何破坏的结构分析方法？（B） A. X射线晶体衍射技术 B.核磁共振技术 C.圆二色谱法 D.电镜三维重构法 7．以下不属于根据分子大小不同进行蛋白质纯化的方法的是（D） A.超滤 B.透析 C.密度梯度离心 D.盐析 8．Western-Blotting是对（B）进行印迹分析的方法。 A.RNA B.单向电泳后的蛋白质分子 C.DNA D.双向电泳后的蛋白质分子 9．以下不属于酶的固定化方法中非化学结合法的是（A） A.交联法 B.结晶法 C.吸附法 D.离子结合法 10.最常用的交联剂是（A） A.戊二醛 B.聚乙二醇
C.异氰酸酯 D.双重氮联苯胺 11.世界上生产规模最大，应用最成功的固定化酶是（C） A.氨基酰酶 B.天冬酰胺酶 C.葡萄糖异构酶 D.胆固醇氧化酶 12.抗体酶是（ A ） A、具有催化活性的抗体分子 B、具有催化活性的RNA分子 C、催化抗体水解的酶 D、催化抗体生成的酶 13.以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构而形成一种新的人工酶是（C） A.胶束酶 B.肽酶 C.半合成酶 D.抗体酶 14.制备游离酶可选用的酶反应器是（B） A.填充床反应器 B.喷射式反应器 C.连续搅拌罐反应器 D.流化床反应器 15.金属离子置换修饰是将（ D）中的金属离子用另一种金属离子置。 A.酶液 B.反应介质 C.反应体系 D.酶分子 16.被称为“分子手术刀”和“分子针线”的酶分别是（A） A.限制性内切酶、DNA连接酶 B.DNA解旋酶、DNA连接酶 C.DNA聚合酶、限制性内切酶 D.DNA解旋酶、DNA聚合酶 17.当前生产酶制剂所需的酶主要的来自（C） A.动物组织和器官 B.植物组织和器官 C.微生物发酵 D.基因工程 18.溶菌酶的作用对象是（A） A.革兰氏阳性菌 B.酵母
酶工程试题(A) 一名词解释（每题3分，共计30分） 1. 酶工程：又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术。 2.自杀性底物：底物经过酶的催化后其潜在的反应基团暴露，再作用于酶而成为酶的不可逆抑制剂，这种底物叫自杀性底物。 3.别构酶；调节物与酶分子的调节中心结合后，引起酶分子的构象发生变化，从而改变催化中心对底物的亲和力，这种影响被称为别构效应，具有别构效应的酶叫别构酶 4.诱导酶：有些酶在通常的情况下不合成或很少合成，当加入诱导物后就会大量合成，这样的酶叫诱导酶 5.Mol催化活性：表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心转换的分子数目 6.离子交换层析：利用离子交换剂作为载体这些载体在一定条件下带有一定的电荷，当带相反电荷的分子通过时，由于静电引力就会被载体吸附，这种分离方法叫离子交换层析。 7.固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚于一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶发挥催化作用的酶 8.修饰酶：在体外用一定的化学方法将酶和一些试剂进行共价连接后而形成的酶 9.非水酶学：通常酶发挥催化作用都是在水相中进行的，研究酶在有机相中的催化机理的学科即为非水酶学 10模拟酶：利用有机化学合成的方法合成的比酶结构简单的具有催化作用的非蛋白质分子叫模拟酶。 二填空题(每空1分,共计30分) 1.决定酶催化活性的因素有两个方面，一是酶分子结构，二是反应条件。 2.求Km最常用的方法是双倒数作图法。 3.多底物酶促反应的动力学机制可分为两大类，一类是序列机制，另一类是乒乓机制。 4.可逆抑制作用可分为竞争性，反竞争性，非竞争性，混合性； 5.对生产酶的菌种来说，我们必须要考虑的条件有，一是看它是不是致病菌，二是能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高，三是菌种不易退化，四是最好选用能产生胞外酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。 6.酶活力的测定方法可用终止反应法和连续反应法。 7.酶制剂有四种类型即液体酶制剂，固体酶制剂，纯酶制剂和固定化酶制剂。 8.通常酶的固定化方法有吸附法，包埋法，交联法， 共价键结合法。 9.酶分子的体外改造包括酶的表面修饰和内部修饰。 10.模拟酶的两种类型是半合成酶和全合成酶。 11.抗体酶的制备方法有拷贝法和引入法。 三问答题(每题10分,共计40分) 1.固定化酶和游离酶相比，有何优缺点？ 解：优点（1）易将固定化酶和底物，产物分开产物溶液中没有酶的残留简化了提纯工艺 （2）可以在较长的时间内连续使用（3）反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化（4）提高了酶的稳定性 （5）较能适于多酶反应 （6）酶的使用效率高产率高成本低 缺点 （1）固定化时酶的活力有损失 （2）比较适应于水溶性底物 （3）与完整的细胞相比，不适于多酶反应。 2.写出三种分离纯化酶蛋白的方法，并简述其原理。 解：.方法:透析与超虑离心分离凝胶过滤盐析等电点沉淀共沉淀吸附层析电泳亲和层析热变性酸碱变性表面变性等（原理略） 3.为什么酶制剂的生产主要以微生物为材料？ 解：（1）微生物种类多，酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样 （2）微生物生长繁殖快，酶易提取，特别是胞外酶 （3）来源广泛，价格便宜 （4）微生物易得，生长周期短 （5）可以利用微电脑技术控制酶的发酵生产，可进行连续化，自动化，经济效益高 （6）可以利用以基因工程为主的分子生物学技术，选育和改造菌种，增加产酶率和开发新酶种 4 解：最大反应速度140 ，Km: 1.0?10-5 酶工程试题（B） 一名词解释 1抗体酶：是一种具有催化作用的免疫球蛋白，属于化学人工酶 2酶反应器：是利用生物化学原理使酶完成催化作用的装置，他为酶促反应提供合适的场所和最佳的反应条件，使底物最大限度的转化为物。 3模拟酶：利用有机化学合成的方法合成的比酶结构简单的具有催化作用的非蛋白质分子叫模拟酶。 4底物抑制：在酶促反应中，高底物浓度使反应速度降低的现象。 5稳定pH：酶在一定的pH范围之内是稳定的，超过这个限度易变性失活，这样的pH范围为此酶的稳定pH 6产酶动力学：主要研究细胞产酶速率及各种因素对产酶速率的影响，包括宏观产酶动力学和微观产酶动力学。 7凝胶过滤：又叫分子排阻层析，分子筛层析，在层析柱中填充分子筛，加入待纯化样品再用适当缓冲液淋洗，样品中的分子经过一定距离的层析柱后，按分子大小先后顺序流出的，彼此分开的层析方法。 8固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚于一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶发挥催化作用的酶 9非水酶学：通常酶发挥催化作用都是在水相中进行的，研究酶在有机相中的催化机理的学科即为非水酶学 10液体发酵法：以液体培养基为原料进行微生物的繁殖和产酶的方法，根据通风方法不同又分为液体表层发酵法和液体深层发酵法。 二填空题(每空1分,共计30分) 1.Km值增加，其抑制剂属于竞争性抑制剂，Km不变，其抑制剂属于非竞争性抑制剂，Km减小，其抑制剂属于反竞争性抑制剂。 2.菌种培养一般采用的方法有固体培养法和液体培养法。 3.菌种的优劣是影响产酶发酵的主要因素，除此之外发酵条件对菌种产酶也有很大的影响，发酵条件一般包括温度，PH ，氧气，搅拌，湿度和泡沫等。 4.打破酶合成调节机制限制的方有控制条件，遗传控制，其它方法。 5.酶生物合成的模式分是同步合成型，延续合成型，中期合成型，滞后合成型。 6.根据酶和蛋白质在稳定性上的差异而建立的纯化方法有热变性法，酸碱变性法和表面变性法 7. 通常酶的固定化方法有交联法、包埋法，吸附法、共价结合法 8. 酶分子的体外改造包括酶的表面修饰和内部修饰。 9.酶与抗体的重要区别在于酶能够结合并稳定化学反应的过滤态，从而降低了底物分子的能障，而抗体结合的抗原只是一个基态分子，所以没有催化能力 三问答题(每题10分,共计40分) 1.在生产实践中，对产酶菌有何要求？ 一般必须符合下列条件： a)不应当是致病菌，在系统发育上最好是与病原菌无关 b)能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高 c)菌种不易变异退化，不易感染噬菌体 d)最好选用产胞外酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高 在食品和医药工业上应用，安全问题更显得重要 2.对酶进行化学修饰时，应考虑哪些因素？ 解：（1）被修饰酶的性质，包括酶的稳定性，酶活性中心的状况，侧链基团的性质及反应性 （2）修饰反应的条件，包括PH与离子强度，修饰反应时间和温度，反应体系中酶与修饰剂的比例等 3.列出用共价结合法对酶进行固定化时酶蛋白上可和载体结合的功能团 解：（1）酶蛋白N端的α氨基或赖氨酸的∑氨基 （2）酶蛋白C端的羧基及天冬氨酸的β羧基或谷氨酸的γ羧基 （3）半胱氨酸的巯基1分 （7）丝氨酸骆氨酸苏氨酸上的羟基 （8）苯丙氨酸和骆氨酸上的苯环 （9）组氨酸上的咪唑基 色氨酸上的吲哚基 解：（1）起始总活力：200?120＝24000（单位） （2）起始比活力：200÷2.5＝80（单位/毫克蛋白氮） （3）纯化后总活力810?5＝4050（单位）2 （4）纯化后比活力810÷1.5＝540（单位/毫克蛋白氮） （5）产率（百分产量）：4050÷24000＝17％ （6）纯化倍数：540÷80=6.75
蛋白质工程和酶工程在现代工艺中的应用 06120801 20081903 付婷钰 摘要：蛋白质工程[1]，是指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学，计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识通过对基因的人工定向改造等手段，对蛋白质进行修饰，改造和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋白质；酶作为一种生物催化剂，已广泛地应用于轻工业的各个生产领域。近几十年来，随着酶工程不断的技术性突破，在工业、农业、医药卫生、能源开发及环境工程等方面的应用越来越广泛。 关键词：蛋白质工程酶工程应用 正文： 一、蛋白质工程的应用 1、在医药方面[2] 许多蛋白质工程的目标是设法提高蛋白质的稳定性。在酶反应器中可延长酶的半衰期或增强其热稳定性，也可以延长治疗用蛋白质的贮存寿命或重要氨基酸抗氧化失活的能力。在这个领域已取得了一些重要研究成果。用蛋白质工程来改造特殊蛋白质为制造特效抗癌药物开辟了新途径。如人的β- 干扰素和白细胞- 2 是两种抗癌作用的蛋白质。但在它们的分子结构中，有一个不成对的基因，是游离的，因而很不稳定，会使蛋白质失去活性。当通过蛋白质工程修饰这种不稳定的结构就可以提高这两种抗癌物质的生物活性。美国的Cetus 公司成功地修饰了这两种治疗癌瘤的蛋白质，大大提高了它们的稳定性，已用于临床试验并取得了良好的效果。具有抗癌作用的蛋白质工程产品免疫球蛋白质是一种高效治癌药物，它能成为征服癌症的“生物导弹”，即具有对准目标杀死特定癌细胞而不伤害正常细胞的特效。近年来，澳大利亚医学科学研究所的一个微生物研究课题组经过多年的研究后发现了激发基因开始或停止产生癌细胞的蛋白质。这种蛋白质在癌细胞生长过程中对癌基因起着开通或关闭的作用。这个发现，对于通过蛋白质工程研制鉴别与控制多种类型的血液癌、固体癌的蛋白质有很好的作用，并为诊断和治疗癌症提供了新的方法。目前，应用蛋白质工程研究开发抗癌及抗艾滋病等重大疑难病症等方面，均取得了重大进展。 另据实验，蛋白质工程还可以改变α1 抗胰蛋白（ATT）。运用此工程技术在ATT 的Met358 和Ser359 之间切开后，可以与嗜中性白细胞弹性蛋白酶迅速结合而引发抑制作用。在病理学的氧化条件下可导致Met358变成蛋氨酸硫氧化物使ATT 不可能与弹性蛋白酶的弹性位点相结合。通过位点直接诱变，Met358 被Val 代替就成为抗氧化疗法的AAT 突变体。含AAT 突变体的血浆静脉替代疗法已经用于AAT 产物基因缺陷疾病患者的治疗，并已取得明显疗效。 2、在农业方面 蛋白质工程正在成为改造农业，大幅度提高粮食产量的新途径。如植物光合作用是利用白光能将二氧化碳转化成贮成能量淀粉，在植物叶片中普遍存在着一种重要的起催化作用的酶，它能固定住二氧化碳，这种酶叫核酮糖- 1.5- 二磷酸羧化酶。而这种酶具有双重性：它既能固定二氧化碳，又会使二氧化碳在光照条件下通过光呼吸作用损失一半，即光 合效率只有50%。现在。这种酶的三维结构已经搞清楚了。参与研究的工作人员认为，可以通过蛋白质工程改造这种酶，控制其不利于人需要的一面，从而大大提高其光合作用效率，增加粮食产量。近年来，美国坎布里奇的雷普里根公司的科研人员立题，以蛋白质工程作为设计优良微生物农药的新思路，他们实施对微生物蛋白质结构进行修改，仅此一举，使微生物农药的杀虫率提高了10 倍。 3、在工业方面[3] 蛋白质工程在工业上的应用取得的成果亦是很多。现以改变酶的动力学特性研制出高效
一. 名词解释 1．生物酶工程又称高级酶工程它是酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。 2．蛋白质工程蛋白质工程就是运用蛋白质结构功能和分子遗传学知识，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质。 3.多核糖体把细胞放在极其温和的条件下处理，就能得到几个到几十个核糖体在一条mRNA上结合起来的形态 4.固定化酶水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物 5.酶反应器以酶或固定化酶为催化剂进行酶促反应的装置。 6．酶工程又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术 7.生物传感器对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。 8. motif(模体指的是蛋白质分子结构中介于二级结构与三级结构之间的一个结构层次，又称超二级结构 9. domain功能域生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域,特别指蛋白质中这样的区域 10.PDB蛋白质数据库（Protein Data Bank,PDB）是一个生物大分子， 11. DNA shuffling体外同源重组技术。通过改变单个基因原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予产物以新功能。 12.生物催化剂是指生物反指应过程中起催化作用的游离或固定化细胞各游离或固定化酶的总称 13.必需基团有的基团既在结合中起作用，又在催化中起作用，所以常将活性部位的功能基团统称为必需基团(essential group 14.活性中心。酶的活性中心是酶与底物结合并发挥其催化作用的部位。 15.有性PCR dna改组 16.DNA改组通过改变单个基因原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予产物以新功能。 17.免疫传感器偶联抗原/抗体分子的生物敏感膜与信号转换器组成的，基于抗原抗体特异性免疫反应的一种生物传感器。
第一章 1、蛋白质工程的产生： 1，最早的蛋白工程是福什特（Forsht）等在1982-1985年间对酪氨酰-t-RNA合成酶的分子改造工作。2，佩里（Perry）1984年通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进一步氧化生成Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。3，1987年福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp（99）和Glu（156）改成Lys，而导致了活性中心His（64）质子pKa从7下降到6，使酶在pH＝6时的活力提高10倍。 二，蛋白质工程的内容 1、定义：广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 2、内容：确定蛋白质的化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质 三，蛋白质工程的程序 蛋白质分子设计基因改造方案基因成或突变 分离纯化蛋白质结构蛋白质分子基因克隆与表达 目的基因和功能测定 改造的蛋白质分子 四，酶工程的应用范围 （1）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产； （2）自然酶的分离纯化及鉴定技术； （3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）； （4）酶反应器的研制和应用； （5）与其他生物技术领域的交叉和渗透。 其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。 五，医用药物酶应用的问题：1）异体蛋白引起免疫反应；2）酶不纯，引起各种副作 3）酶在体内降解，时间短； 4）药物无法定向分布。 解决办法： 1) 制成微胶囊； 2) 制成衍生物；3) 制成脂质体包埋与免疫系统隔开(酶蛋白)；4) 酶上引入一定基团，起导向作用。 五，分子酶学与酶工程 1、酶——由活细胞产生的具有催化功能的蛋白质（或其它类型的生物大分子），是生物体进行代谢、维持生命活动的必需物质，没有酶就没有生命，因此研究酶的结构与功能、性质与作用机理，对于阐明生命现象的本质具有重要意义。
LUOYANG NORMAL UNIVERSITY 2010年酶工程学年论文分子酶工程研究进展 院（系）名称生命科学系 专业名称生物科学 学生姓名李艳艳 学号101314022 指导教师程彦伟 完成时间2013年12月
分子酶工程研究进展 李艳艳 （生命科学系生物科学专业学号：101314022） 摘要：酶工程的研究已经发展到分子水平，通过基因操作，已实现了许多酶的克隆和表达定点突变成为研究酶结构与功能的常规手段，并被广泛用于改善酶的性能。体外分子进化方法则大幅提高了酶分子的进化效率，并有可能发展新功能酶。融合蛋白技术的发展使构建新型多功能融合酶成为可能。这里对分子酶工程学的研究与发展情况进行了综述。 关键词：分子酶工程；基因克隆；改造；定向进化；融合；人工模拟 酶，由于其特异和高效的催化作用，在生命活动中扮演重要的角色。其中，尤其是源于微生物的酶。很早就被广泛开发服务于人类的各种需求，如酿造、酶法转化、疾病诊断与治疗、药物生产、环境污染物去除，等等。然而，天然酶常常十分昂贵，且大多数酶由于非常“娇嫩”而难以实际应用。近年来，结构生物学和基因操作技术的发展使得科学家能够对酶分子进行有效地改造，甚至开始为“目的”而设计，从而导致了分子酶工程学的发展。概括地说，分子酶工程学就是采用基因工程和蛋白质工程的方法和技术，研究酶基因的克隆和表达、酶蛋白的结构与功能的关系以及对酶进行再设计和定向加工，以发展性能更加优良的酶或新功能酶。当前的研究热点可以概括为3个方面：一是利用基因工程技术大量生产酶制剂；二是通过基因定点突变和体外分子定向进化对天然酶蛋白进行改造；三是通过基因和基因片段的融合构建双功能融合酶。 1 酶的基因克隆与异源表达 天然酶在生物体中含量一般较低，难以提取和大量制备。限制了它的推广应用。重组DNA技术的建立，使人们可以较容易地克隆各种各样天然的酶基因，并将其在微生物系统中高效表达，从而在很大程度上摆脱对天然酶源的依赖。这一技术已成功地应用于酶制剂的工业生产。世界上最大的工业酶制剂生产商丹麦Novozymes公司生产的酶制剂80％为基因工程产品。我国在这个领域中也取得了令世人瞩目的研究成果。黄日波教授研究小组从广西象州温泉中分离到一株硫