CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测??
1? 范围
本章规定了用多平台三级程序法和单平台一步法检测全血中的CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞。
2?? 规范性引用文件
1997 Revised Guidelines for Performing CD4+ T-Cell Determinations in Persons Infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV) MMWR 46(RR-2);1-29 Publication date: 01/10/1997。
3? 实验室条件
3.1 人员
进行HIV感染者CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全及实验操作技术培训。
3.2? 设施和设备
3.2.1? 样品处理区：生物安全柜、离心机、冰箱、水浴箱、旋转振荡器、精确移液器（5μl~50μl、20μl~200μl、200μl~1000μl）。
3.2.2? 流式细胞仪检测区：流式细胞仪
3.3? 功能分区
实验室原则上应分为样品处理区和流式细胞仪检测区,各区的功能是：
3.3.1? 样品处理区应达到生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室要求，用于样品处理、流式检测样品制备。
3.3.2? 流式细胞仪检测区用于制备好的样品上机检测。
4? 样品采集、运输和接收
4.1? 样品的采集
4.1.1? 选择合适的抗凝剂，分别用于血液学检测和流式细胞仪的免疫表型检测。
（1）EDTA（1.5±0.15mg/ml血液）。
（2）在血球分析仪生产商允许的时间范围内检测，不超过30h，不检测超出抗凝时间范围的样品。
（1）用K3EDTA抗凝，收集样品应在30h以内，尽早（8h以内）处理。
（2）用ACD或肝素抗凝，收集样品在48h以内，尽早（8h以内）处理。
4.1.2? 静脉采血收集血样，将血液注入一个事先加入适当抗凝剂的试管（用真空试管）。
4.1.3? 准备适当数量的样品管
4.1.4 ?对所有样品编号，并写明日期和收集时间。
4.2? 样品运输
4.2.1? 在室温下（18~23℃）保存和运输样品，避免极端温度（冷冻或过热）。超过37℃的温度会破坏细胞，对血液学和流式细胞仪的检测有影响。天气热时，需要用一个隔热的容器装样品，并且把这个容器放于另一个有冰袋和吸热物质的容器中。这种方法有助样品的保存。
4.2.2? 尽可能快地将样品送至免疫表型检测实验室。
4.2.3? 如需运送样品到其它地点时，应将装样品的试管放于一个防漏的容器中，并将此容器放于一个装有充足的吸水性物质的纸罐中，以防止震动并可吸收所有因试管破裂漏出的血液。盖紧纸罐，用橡皮带系紧。
4.2.4 应选择特定的方案，并且安排合适的时间收集和运输样品。
4.3? 样品接收
4.3.1? 样品到达以后立即检查试管及其所装的血样。
4.3.2? 如有以下现象发生，采取正确的方法处理：
5? 方法
目前用于CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞计数的检测方法分为自动检测方法和手工操作法。自动检测方法包括流式细胞仪（主要采用单平台一步法）和专门的细胞计数仪，手工操作法包括几种手工操作试验，需要显微镜或酶联免疫试验设备。
6 实验资料的记录
6.1? 实验应及时、准确地记录结果。
6.2? 实验记录中应包括以下内容：日期、操作者、所有样品、实验内容、过程（步骤）、结果及有无事故等。
6.3? 整个实验室的实验资料要统一有专人负责，按固定格式记录在案。
6.4? 计算机生成的实验结果，存档备案；定期拷贝计算机结果文档，备案保存。
7? 结果报告
7.1? 按照实验结果填写CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测报告单，检测人员签字。
7.2? 根据CD命名标准报告数据，用一个简短的描述解释命名的意义。注意：CD4+T细胞是指辅助性T细胞。正确的报告CD4+ T细胞应该是那些CD4+ 和CD3+ 双阳性的细胞。同样地，CD8+ T细胞是T-suppressor/cytotoxic细胞，为CD3+ 和CD8+ 双阳性的细胞。在CD4+ 和CD8+ 的判定中重要的是排除其它细胞（非T细胞）的干扰。
7.3? 以全部淋巴细胞的百分比报告数据，并且修正门内淋巴细胞纯度。例如，如果淋巴细胞纯度是94%，而CD3值为70%，可以通过0.7除以0.94乘以100得到74%，修正CD3的值。
7.4? 为检测免疫亚群而取血的同时，用该血样作自动测定全血细胞（CBC）计数白细胞（WBC）及分类测定，报告淋巴细胞亚群绝对数值。
7.4.1? 用淋巴细胞的总数（来自于WBC及分类）乘以淋巴细胞亚群的百分率（从流式细胞仪的数据中得到），计算绝对数值。
7.4.2? 如可能，应报告计数的百分率和绝对值。
7.5? 单平台一步法由计算机软件直接出结果并打印出报告单，报告单的内容包括如下结果：CD45+ Abs Cnt；CD3+ Abs Cnt；CD3+ CD4+ %T Lym；CD3+CD4+ Abs Cnt；
CD3+CD8+ %T Lym；CD3+CD8+ Abs Cnt；Th/Ts及其正常参考值范围(BD公司建立的正常参
考值范围见表3)，检测人员签字。
表3? BD公司应用单平台一步法建立的正常参考值范围表
*另有报告：①0.68-2.47（中华检验医学杂志，2003，26（2）：123-125）
②0.71-2.87（中华检验医学杂志，1998，21（4）：223-227）
③1.38±0.34(中华检验医学杂志，1998，21（2）：98)
7.6? 应报告所有相关数据的正常值范围（如CD4＋T淋巴细胞百分率和绝对数）。每个实验室都应测定参考数值。应分别建立成人和儿童的正常值参考范围，在对病人样品检测时应使用合适的参考值。
7.7? 报告单经复核人复核签字及签发，加盖检验专用公章后发出。
7.8? 报告发放时，可经挂号邮寄或直接交给送检人。
8? 质量控制和评价
制定质量保证计划，建立内部质量控制制度。参加室间质量评价。正常参考数据见7.5。
9? 检测CD4+、CD8+ T淋巴细胞的意义
T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一群细胞。在正常机体内各淋巴细胞亚群相互作用，维持着机体正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，可导致机体免疫功能紊乱并发生一系列病理变化。因此，Ｔ淋巴细胞亚群的免疫分型能够提供有关患者免疫状态的重要信息。AIDS是由HIV引起的一组综合征，HIV主要侵犯人CD4+ T淋巴细胞，导致其数量上的减少和功能缺陷，使机体免疫平衡被打破造成免疫功能低下，最终导致各种机会感染和肿瘤。因而，对HIV感染者和AIDS病人定期进行CD4+、CD8+T淋巴细胞检测具有十分重要的意义。主要表现在以下几个方面：
9.1? 了解机体的免疫状态以进行疾病分期，如美国CDC就是以此为基础制订了HIV感染者/AIDS病人的诊断和分类标准（见表4），目前国内外仍被采纳应用。
表4? 1993年修订的HIV感染的分类系统和青少年及成人扩展的AIDS监测病例定义
备注：A、B、C的解释请参考《艾滋病病毒感染的诊断与治疗》邵一鸣、蒋岩、栾文民主译，
科学出版社，2002年。
9.2? 长期监测CD4+ T淋巴细胞绝对数的变化，有助于了解患者的病情发展，决定正确的治疗方案，并观察对治疗的反应。如判断HIV感染者的临床合并症（当CD4+ T淋巴细胞细胞＜200/ml时，很容易发生卡氏肺孢子虫肺炎；当CD4+ T淋巴细胞<50时，易发生CMV感染）。
9.3? 帮助确定抗HIV药物治疗及预防机会性感染治疗的适应症，如当CD4+ T淋巴细胞＜200/ul时，应给予抗卡氏肺孢子虫肺炎的预防性治疗。
9.4? 是用来评价一些新的、针对HIV的治疗方法和治疗药物疗效的重要指标。
C D和C D T淋巴细胞 检测 集团档案编码：[YTTR-YTPT28-YTNTL98-UYTYNN08]
CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测?? ? 1? 范围 本章规定了用多平台三级程序法和单平台一步法检测全血中的CD4+ 和 CD8+ T淋巴细胞。 ? 2?? 规范性引用文件 1997 Revised Guidelines for Performing CD4+ T-Cell Determinations in Persons Infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV) MMWR 46(RR-2);1-29 Publication date: 01/10/1997。 ? 3? 实验室条件 3.1 人员 进行HIV感染者CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全及实验操作技术培训。 3.2? 设施和设备 3.2.1? 样品处理区：生物安全柜、离心机、冰箱、水浴箱、旋转振荡器、精确移液器（5μl~50μl、20μl~200μl、200μl~1000μl）。 3.2.2? 流式细胞仪检测区：流式细胞仪 3.3? 功能分区 实验室原则上应分为样品处理区和流式细胞仪检测区,各区的功能是： 3.3.1? 样品处理区应达到生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室要求，用于样品处理、流式检测样品制备。 3.3.2? 流式细胞仪检测区用于制备好的样品上机检测。
? 4? 样品采集、运输和接收 4.1? 样品的采集 4.1.1? 选择合适的抗凝剂，分别用于血液学检测和流式细胞仪的免疫表型检测。 4.1.1.1? 用于血液学检测的抗凝剂 （1） EDTA（1.5±0.15mg/ml血液）。 （2）在血球分析仪生产商允许的时间范围内检测，不超过30h，不检测超出抗凝时间范围的样品。 4.1.1.2? 用于流式细胞仪免疫表型检测的抗凝剂 （1）用K3EDTA抗凝，收集样品应在30h以内，尽早（8h以内）处理。 （2）用ACD或肝素抗凝，收集样品在48h以内，尽早（8h以内）处理。 4.1.2? 静脉采血收集血样，将血液注入一个事先加入适当抗凝剂的试管（用真空试管）。 4.1.2.1? 当收集儿童样品时，采用儿童用注射器、小试管。 4.1.2.2? 采血后立即握住试管两端，颠倒混匀数次，将血液与抗凝剂混匀，以防止凝固。 4.1.3? 准备适当数量的样品管 4.1.3.1? 当同一样品的血球检测和流式细胞仪免疫表型检测在不同实验室内进行时，用2个装有K3EDTA的试管即可。 4.1.3.2? 在所有其它条件下用2个试管（用K3EDTA作血球检测，用K3 EDTA、ACD或肝素作流式细胞仪免疫表型检测）。 4.1.4 ?对所有样品编号，并写明日期和收集时间。 4.2? 样品运输
项目十八B淋巴细胞功能检测 一、溶血空斑试验 (Plaque forming cell assay) 【实验原理】 将SRBC免疫动物，隔一定时间取其脾脏制成细胞悬液，当与SRBC混合孵育时，其中抗体形成细胞释放的抗体会与周围SRBC特异性结合，在补体作用下，使这些致敏的SRBC 溶解，从而在琼脂凝胶中的每个抗体形成细胞周围形成一个肉眼可见的溶血空斑。测定与补体结合力强的IgM形成细胞采用直接方法；测定与补体结合力弱的IgG或IgA形成细胞采用间接法，即实验中需加入抗免疫动物Ig的抗体(二抗)，才能促进溶血空斑形成。 此处只介绍小鼠琼脂直接溶血空斑技术。 【试剂和器材】 1．小白鼠体重18~22 g。 2．补体豚鼠混合新鲜血清。 3．SRBC悬液用Gey液将SRBC洗3次，分别配成2.5×108个细胞/ml和5×108个细胞/ml浓度的红细胞悬液。 4．Gey液、琼脂糖。 5．注射器、剪刀、镊子、不锈钢网、小平皿、试管、吸管、显微镜、温箱、水浴箱。 【步骤和方法】 1．免疫小鼠取1ml 2.5×108个细胞/ml 浓度的SRBC悬液注入小鼠腹腔，或取0.2 ml SRBC悬液经小鼠尾静脉注入。 2．制备脾细胞悬液将免疫4天后的小鼠处死，取脾脏制备细胞悬液(制备方法见动物组织中免疫细胞收集)，用Gey液配成1×107个细胞/ml的细胞悬液(每只小鼠约加6~10ml Gey 液)。 3．制备底层琼脂将14g/L琼脂糖(用Gey液配制)溶化后取2~3ml倾注于水平的小平皿内，凝固后去盖反扣于37℃温箱中预温备用。 4．制备顶层琼脂将5g/L琼脂糖(用Gey液配制)溶化，置48℃水浴中平衡备用。取脾细胞悬液和5×108个细胞/ml SRBC悬液各0.1ml，再加入未稀释补体0.05ml，混匀，置48℃水浴平衡片刻。加入0.8ml已平衡好的琼脂糖，混匀后倒入底层琼脂上，旋转平皿使之均匀平铺，凝固后置37℃温育3h。计数溶血空斑形成细胞(PFC)。 【结果判定】 1．将平皿置低倍显微镜下观察计数。溶血空斑中心有淋巴细胞，周围为透明区。 2．全脾中PFC数计算： 每个平皿PFC数×10×脾细胞悬液体积(ml) 或以每百万脾细胞所含PFC数来表示。 【注意事项】 1．试验选用Gey液为洗涤液和培养液，优于Hanks液、Eagle液和Dullecco液，但工作液需现用现配。 2．最好选用近交系小鼠，且鼠龄和体重应基本一致。 3．制备脾细胞过程所用Gey液应预先4℃预冷，制好的细胞悬液应及时放4℃备用，以保持脾细胞活力。 4．制备顶层琼脂时，温度应控制在45～48℃之间，温度太高细胞会失活，过低会使琼脂凝固，细胞不能分散，无法倒入平皿。各细胞成分要充分混匀，同时避免出现气泡；与琼
1.掌握T、B淋巴细胞的主要膜表面分子和作用。 T细胞的膜表面分子及其功能T细胞表面具有许多重要的膜分子, 参与识别抗原 和T 细胞的活化、增殖、分化及功能的发挥并且是T细胞亚群的重要标志。 T细胞表面标志： （一）T细胞表面受体 1.T细胞抗原识别受体--TCR及TCR复合体 所有T细胞表面均具有能结合特异性抗原的膜分子，称T细胞抗原受体（TCR）。TCR功能：是识别和结合抗原肽的作用。 CD3分子：由γ、δ、ε、ζ、η五种肽链组成。 CD3分子的功能：稳定TCR的结构，传递T细胞活化信号。 TCR识别抗原后，刺激信号是通过CD3转导的。 2. 细胞因子受体（cytokine receptor，CKR） CK:主要指由细胞经刺激诱导而合成和分泌的具有高活性多功能的小分子蛋白质。. 白细胞介素(interleukin, IL) . 干扰素(Interferon, IFN) . 集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF) . 肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF) . 生长因子(Growth factor, GF) . 趋化因子(chemokine, cK) 静止T细胞——>活化T细胞——>T细胞增殖、分化 3 .病毒受体 CD4分子是HIV的受体，HIV的gp120与CD4分子高亲和性结合。CD4+的T细胞是HIV 攻击的主要靶细胞 4. 丝裂原受体 可致细胞发生有丝分裂，进而增殖得名,可激活某一类淋巴细胞-------非特异性多克隆激活剂 ConA：刀豆素A PHA：植物血凝素 PWM：美洲商陆 丝裂原与受体交联，可直接使静止T细胞活化、增殖、转化为淋巴母细胞 （二）T细胞表面抗原（surface antigen） 1.MHC抗原：MHC-I（所有），活化后表达ＭＨＣ－Ⅱ（活化标志） 2.分化抗原（ＣＤ分子） （１）辅助分子——CD4和CD8分子 （２）协同（辅助）信号分子——CD28、CD152、CD40L、LFA-1、CD2 T细胞表面CD抗原: T细胞的膜辅助受体-CD4/CD8 功能：辅助TCR识别抗原和参与活化信号转导 CD4+/CD8+T能过表面的TCR-CD3复合体分子与APC表面相应抗原肽-MHC分子复合 物结合，CD4/CD8分子可与MHC分子紧密结合，使T细胞与APC的作用加强，并使胞内区的ITAM和蛋白酪氨酸激酶P56LCK活化，从而产生T细胞活化的第一信号，引发一系列激酶级联反应。 一、B细胞的膜表面分子
CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测 1 范围 本章规定了用多平台三级程序法和单平台一步法检测全血中的CD4+ 和 CD8+ T淋巴细胞。 2 规范性引用文件 1997 Revised Guidelines for Performing CD4+ T-Cell Determinations in Persons Infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV) MMWR 46(RR-2);1-29 Publication date: 01/10/1997。 3 实验室条件 3.1 人员 进行HIV感染者CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全及实验操作技术培训。 3.2 设施和设备 3.2.1 样品处理区：生物安全柜、离心机、冰箱、水浴箱、旋转振荡器、精确移液器（5μl~50μl、20μl~200μl、200μl~1000μl）。 3.2.2 流式细胞仪检测区：流式细胞仪 3.3 功能分区 实验室原则上应分为样品处理区和流式细胞仪检测区,各区的功能是： 3.3.1 样品处理区应达到生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室要求，用于样品处理、流式检测样品制备。 3.3.2 流式细胞仪检测区用于制备好的样品上机检测。 4 样品采集、运输和接收
4.1 样品的采集 4.1.1 选择合适的抗凝剂，分别用于血液学检测和流式细胞仪的免疫表型检测。 4.1.1.1 用于血液学检测的抗凝剂 （1）EDTA（1.5±0.15mg/ml血液）。 （2）在血球分析仪生产商允许的时间范围内检测，不超过30h，不检测超出抗凝时间范围的样品。 4.1.1.2 用于流式细胞仪免疫表型检测的抗凝剂 （1）用K3EDTA抗凝，收集样品应在30h以内，尽早（8h以内）处理。 （2）用ACD或肝素抗凝，收集样品在48h以内，尽早（8h以内）处理。 4.1.2 静脉采血收集血样，将血液注入一个事先加入适当抗凝剂的试管（用真空试管）。 4.1.2.1 当收集儿童样品时，采用儿童用注射器、小试管。 4.1.2.2 采血后立即握住试管两端，颠倒混匀数次，将血液与抗凝剂混匀，以防止凝固。 4.1.3 准备适当数量的样品管 4.1.3.1 当同一样品的血球检测和流式细胞仪免疫表型检测在不同实验室内进行时，用2个装有K3EDTA的试管即可。 4.1.3.2 在所有其它条件下用2个试管（用K3EDTA作血球检测，用K3 EDTA、ACD或肝素作流式细胞仪免疫表型检测）。 4.1.4 对所有样品编号，并写明日期和收集时间。 4.2 样品运输 4.2.1 在室温下（18~23℃）保存和运输样品，避免极端温度（冷冻或过热）。超过37℃的温度会破坏细胞，对血液学和流式细胞仪的检测有影响。天气热时，需要用一个隔热的容器装样品，并且把这个容器放于另一个有冰袋和吸热物质的容器中。这种方法有助样品的保存。 4.2.2 尽可能快地将样品送至免疫表型检测实验室。
人的淋巴细胞有什么功能？淋巴细胞是人体最主要的免疫细胞，它由人体的淋巴组织，如脾脏、淋巴结、扁桃体等生成，所以扁桃体不能随便摘除，它对人体的免疫功能是有帮助的，除非在反复扁桃体炎，对人体造成危害时才摘除。 T细胞的主要功能是调节B细胞制造抗体，当外来抗原增多时，T细胞就促进B 细胞制造大量抗体，当外来抗原减少时，T细胞就抑制B细胞的功能，从而起到免疫监控作用。此外，T细胞还能分泌一些细胞因子，如白细胞介素—2、转移因子、干扰素等来调控免疫反应和直接杀伤有害的抗原性物质。 B细胞的主要功能是制造抗体，当外界抗原侵入机体后，它能识别抗原，制造相应抗体。正常情况下，B细胞对人体组织是不形成抗体的，这就是“识别自我，排斥异己”。但是当正常组织由于某种原因（如感染等）产生变化，B细胞也会对自身变质的组织抗原成分产生抗体，在T细胞的辅助下，与相应抗原结合，引起自身反应。 T细胞是淋巴细胞的一种，在免疫应答中扮演着重要的角色。T细胞在胸腺内分化成熟，成熟后移居于周围淋巴组织中。T是“胸腺”（Thymus）而不是甲状腺（Thyroid）的英文缩写。T细胞膜表面分子与T细胞的功能相关，也是T细胞的表面标志（cell-surface marker），可以用以分离、鉴定不同亚群的T细胞。 T细胞按照功能和表面标志可以分成很多种类： 细胞毒T细胞（cytotoxic T cell）：消灭受感染的细胞。这些细胞的功能就像一个“杀手”或细胞毒素那样，因为它们可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。细胞毒T细胞的主要表面标志是CD8. 辅助T细胞（helper T cell）在免疫反应中扮演中间过程的角色：它可以增生扩散来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。辅助T细胞的主要表面标志是CD4。T细胞调控或“辅助”其它淋巴细胞发挥功能。它们是已知的HIV病毒的目标细胞，在艾滋病发病时会急剧减少。 调节/抑制T细胞（regulatory/suppressor T cell）：负责调节机体免疫反应。通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过度损伤机体的重要作用。调节/抑制T细胞有很多种，目前研究最活跃的是CD25+CD4+T细胞。 记忆T细胞（memory T cell）：在再次免疫应答中起重要作用。记忆T细胞由于暂时没有非常特异的表面标志，目前还有很多未知之处。 B淋巴细胞亦可简称B细胞。来源于骨髓的多能干细胞。在禽类是在法氏囊内发育生成，故又称囊依赖淋巴细胞（bursa dependent lymphocyte）/骨髓依赖性淋巴细胞简称B细胞，是由骨髓中的造血干细胞分化发育而来。与T淋巴细胞相比，它的体积略大。这种淋巴细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。B 细胞淋巴瘤是一种最常见的淋巴细胞白血病，有关这种疾病的研究不断涌现。在哺乳类是在类囊结构的骨髓等组织中发育的。又称骨髓依赖淋巴细胞。从骨髓来的干细胞或前B细胞，在迁入法氏囊或类囊器官后，逐步分化为有免疫潜能的B细胞。成熟的B细胞经外周血迁出，进入脾脏、淋巴结，主要分布于脾小结、脾索及淋巴小结、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小结中，受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，合成抗体，发挥体液免疫的功能。目前使用的大多数疫苗就是通过刺激这类B淋巴细胞产生抗体的。B细胞在骨髓和集合淋巴结中的数量较T细胞多，在血液和淋巴结中的数量比T细胞少，在胸导管中则更少，仅少数参加再循环。B细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原及表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。 B细胞表面有多种膜表面分子，籍以识别抗原、与免疫细胞和免疫分子相互作用，也是分离和鉴别B细胞的重要依据。B细胞表面分子主要有白细胞分化抗原、MHC以及多种膜表面受体。
免疫功能（淋巴细胞亚群）检测的临床意义 外周血淋巴细胞根据生物学功能和细胞表面抗原表达 分为3个群：T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）和NK淋巴细胞【自然杀伤细胞（natural killer)，CD3-CD16+和/或CD56+】。T细胞又分为辅助T细胞（CD3+CD4+）和抑制T细胞（CD3+CD8+)。淋巴细胞亚群分析是检测细胞免疫和体液免疫功能的重要指标，它总体反应机体当前的免疫免疫功能、状态和平衡水平，并可以辅助诊断某些疾病，如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等，分析发病机制，观察疗效及检测预后有重要意义。T淋巴细胞百分率或计数绝对值可用于区别和监测某些免疫缺陷病和自身免疫性疾病。辅助T淋巴细胞减少：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷病、艾滋病、应用免疫抑制患者。抑制T淋巴细胞增多：见于自身免疫性疾病，如SLE、艾滋病初期、慢性活动性肝炎、肿瘤及病毒感染等。抑制T细胞百分率在一些免疫性疾病表现出超出正常参考范围，在许多先天性或获得性免疫缺陷病人中升高（如重症综合性免疫缺陷SCID,AIDS）。 CD4+/CD8+>2.5表明细胞免疫功能处于“过度活跃”状态，容易出现自身免疫反应，见于类风湿性关节炎、I型糖尿病等。CD4+/CD8+ 在肿瘤病人外周血中T淋巴细胞亚
群数值都有异常，其特征是患者体内CD3+细胞、CD4+细胞明显减少，而CD8+细胞明显增加，CD4+/CD8+比值显著降低，说明肿瘤患者的细胞免疫功能处于免疫抑制状态，患者对识别和杀伤突变细胞的能力下降，形成了肿瘤的生长转移。骨髓造血细胞的增殖和分化障碍也与T细胞亚群异常有关。如在再生障碍性贫血与粒细胞减少症中，患者的外周血CD4+细胞数减少，CD8+细胞数增多，CD4+/CD8+比值明显下降。NK细胞介导某些肿瘤和病毒感染细胞的细胞毒性反应。B淋巴细胞为体液免疫的重要指标。
免疫学技术原理与应用 PAIT-12 淋巴细胞功能测定 孙汭 中国科技大学生命科学学院 免疫学研究所
PMIT-12 淋巴细胞功能测定 一、常用的淋巴细胞功能测定 二、T淋巴细胞功能测定 三、B淋巴细胞功能测定 四、NK细胞细胞毒试验 一、常用的淋巴细胞功能测定 1、淋巴细胞增殖试验 ① 3H-TdR掺入法 原理：淋巴细胞在丝裂原或特异性抗原刺激下转化为淋巴母细胞，发生转化过程中，细胞DNA合成大量增多。此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-Thymidine riboside, 3H-TdR), 使3H-TdR掺入新合成的DNA中，经β-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA 的3H-TdR掺入量，根据掺入细胞内的核素的量可判断淋巴细胞增殖的程度。 ② MTT比色法 原理：MTT（（3-4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑）是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢过程，MTT代谢形成蓝色的甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。甲攒经异丙醇溶解后呈紫蓝色，借助酶标仪测定OD值，可反映细胞增殖水平。 2、细胞毒试验 ①51Cr释放法 原理：用放射性核素51Cr（Na251-CrO4，鉻酸钠）标记靶细胞，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合。然后将51Cr标记的靶细胞与待检细胞（效应细胞）共同孵育一定时间后，若待检细胞能够杀伤靶细胞，则51Cr从靶细胞释放出来。51Cr的释放量与效应细胞的活性成正相关。即靶细胞被杀伤的越多，释放到上清中的游离51Cr越多，用γ计数仪测定上清中51Cr的放射活性（cpm）值，以计算待检细胞的细胞毒活性。 （一）、用51Cr铬酸钠标记靶细胞 1．用RPMI-1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100μCi（3.7MBq）51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。 2．用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g 10分钟。用50ml RPMI-1640培养液悬浮细胞，置37℃水浴30分钟，以减少非特异的自然释放。 3．离心200×g 10分钟，去上清液。小心用RPMI-1640培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为0.5×105或1×105/ml备用。 （二）、4小时51Cr释放实验 1．在96孔圆底细胞培养板中加入51Cr标记的靶细胞，每孔加100μl。
所翻译综述发表于Science的时间：2013-10-11 影响因子：31.027 译者：谢金攀 翻译完成时间：2013-12-20 REVIEW 综述 Fueling Immunity: Insights into Metabolism and Lymphocyte Function 能量免疫：洞察代谢和淋巴细胞功能 Erika L. Pearce, Maya C. Poffenberger, Chih-Hao Chang, Russell G. Jones Lymphocytes face major metabolic challenges upon activation. They must meet the bioenergetic and biosynthetic demands of increased cell proliferation and also adapt to changing environmental conditions, in which nutrients and oxygen may be limiting. An emerging theme in immunology is that metabolic reprogramming and lymphocyte activation are intricately linked. However, why T cells adopt specific metabolic programs and the impact that these programs have on T cell function and, ultimately, immunological outcome remain unclear. Research on tumor cell metabolism has provided valuable insight into metabolic pathways important for cell proliferation and the influence of metabolites themselves on signal transduction and epigenetic programming. In this Review, we highlight emerging concepts regarding metabolic reprogramming in proliferating cells and discuss their potential impact on T cell fate and function. 淋巴细胞在活化时面临主要的代谢挑战。它们必须满足增长的细胞增殖对生物能量和生物合成的要求，并且适应营养和氧气可能受限的变化中的环境条件。免疫学一个新兴的主题是，代谢重编程和淋巴细胞活化有复杂的联系。不管怎样，为什么T细胞采用特定的代谢程序，这些程序对T细胞功能的影响，以及最终的免疫结果都仍不明确。关于肿瘤细胞代谢的研究已经提供了有价值的洞见，涉及细胞增殖的重要代谢途径和代谢本身对信号转导和表观遗传学编程的影响。在这篇综述，我们突出关于增殖细胞中代谢重编程新兴的概念并探讨它们对T细胞命运和功能的潜在影响。 The immune system is comprised of a series of specialized cells conditioned to respond rapidly to“danger”signals such as foreign pathogens or inflammatory stimuli. T lymphocytes,or T cells, are sentinels of the adaptive immune system that respond to antigen-specific signals by blasting, proliferating, and differentiating into effector subsets tailored to identify and eliminate threats to the host. Integrated into this program of activation is the regulation of cellular metabolism.Upon activation, T cells dramatically alter their metabolic activity to meet the increased metabolic demands of cell growth, proliferation, and effector function. Metabolism fundamentally underpins T cell function; thus, there is great interest in understanding how metabolic pathways influence immune responses and ultimately affect disease progression.It should be noted that“metabolism”refers to a complex network of biochemicalreactions involved in energy production and macromolecular biosynthesis, and comprehensive coverage of such a broad topic is difficult. Several recent reviews have highlighted the molecular mechanisms that govern metabolic reprogramming in the immune system (1–3). This Review will focus on emerging areas in intermediary metabolism in lymphocytes and will discuss their potential impact on T cell fate, plasticity, and effector
淋巴细胞增殖功能的测定 淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。因此，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常用方法。 (一)原理 T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA),抗CD２、抗CD３McAb 作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体(SAC)、脂多糖(LPS，对小鼠有作用)则刺激B细胞发生增殖；美洲商陆(PWM)、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。最近发现,integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。目前临床上最常选用PHA刺激PBMC, 根据形态学或氚标记胸腺嘧啶核苷(３H-TdR)掺入率测定T细胞的增殖水平。 (二)操作步骤 无菌从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC) 洗涤后用10％FCS RPMI1640调整细胞数为1～2×10６／ml ↓ 加入96孔培养板中，1～2×10５细胞／100μl／孔，每组设3孔。 加入最适剂量PHA，100μl／孔，同时设不加PHA阴性对照。如观察细 胞因子(如IL-2)或其它刺激物(PMA)对增殖功能的调节作用，则根据 加入因子的浓度而确定加入量，一般每孔最终体积为200μl ↓37℃、5％CO２孵育，66h 每孔加入0.5～1μci３H-TdR(50μl) ↓继续培养6～12h 用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品 于"9999"型玻璃纤维滤纸上 ↓ 烤干后β液闪仪计数 计算 1.增殖水平直接用CPM值表示。 2.也可用刺激指数(SI)表示: PHA(或实验组)cpm-机器本底 SI＝─────────────── 阴性对照组cpm-机器本底 (三)试剂和器材 1.PBMC或其它含淋巴细胞的悬液。 2.PHA或其它有丝分裂原、刺激物 3.闪烁液PPO(2，5-二苯茎恶唑)3～5g POPOP[1，4双(5苯基恶唑)苯] 0.3～0.5g溶于1000ml二甲苯中。也可将POPOP加入少量二甲苯在37℃水浴上溶解后，再加PPO，然后补足二甲苯。 4.３H-TdR，一般临用时稀释 5.10％FCS RPMI1640, CO２孵箱 6. 细胞收集仪，β液闪仪 (四)注意事项
CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测?? 1? 范围 本章规定了用多平台三级程序法和单平台一步法检测全血中的CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞。 2?? 规范性引用文件 1997 Revised Guidelines for Performing CD4+ T-Cell Determinations in Persons Infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV) MMWR 46(RR-2);1-29 Publication date: 01/10/1997。 3? 实验室条件 3.1 人员 进行HIV感染者CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全及实验操作技术培训。 3.2? 设施和设备 3.2.1? 样品处理区：生物安全柜、离心机、冰箱、水浴箱、旋转振荡器、精确移液器（5μl~50μl、20μl~200μl、200μl~1000μl）。 3.2.2? 流式细胞仪检测区：流式细胞仪 3.3? 功能分区 实验室原则上应分为样品处理区和流式细胞仪检测区,各区的功能是： 3.3.1? 样品处理区应达到生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室要求，用于样品处理、流式检测样品制备。 3.3.2? 流式细胞仪检测区用于制备好的样品上机检测。 4? 样品采集、运输和接收 4.1? 样品的采集 4.1.1? 选择合适的抗凝剂，分别用于血液学检测和流式细胞仪的免疫表型检测。 （1）EDTA（1.5±0.15mg/ml血液）。 （2）在血球分析仪生产商允许的时间范围内检测，不超过30h，不检测超出抗凝时间范围的样品。 （1）用K3EDTA抗凝，收集样品应在30h以内，尽早（8h以内）处理。 （2）用ACD或肝素抗凝，收集样品在48h以内，尽早（8h以内）处理。
淋巴细胞亚群与临床 人体外周血的淋巴细胞是机体重要的免疫细胞，主要包括三种：T 淋巴细胞（TC）、B淋巴细胞（BC）、自然杀伤细胞（NK）。TC主要表达 CD3+，约占正常人外周血淋巴细胞总数的60--80%；BC主要表达CD19+， 约占正常人外周血淋巴细胞总数的15--20%；自然杀伤细胞（NK）主 要表达CD3--CD16+CD56+，约占正常人外周血淋巴细胞总数的 10--20%。 通过T淋巴细胞亚群的监测可以了解在不同疾病状态下患者的细 胞免疫功能状态，已经广泛在肿瘤、自体免疫、感染性疾病中,辅助临 床诊断、帮助了解发病机理、判断预后和指导临床治疗。T淋巴细胞 亚群检测的内容为总T细胞（CD3+）及其亚群（辅助性T淋巴细胞，CD4+；抑制性或细胞毒T淋巴细胞，CD8+）的数量和比例。 在某些自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、自体免疫性溶血性 贫血患者中CD3+/CD4+细胞的比值升高。在病毒感染（上感，AIDS等）、恶性肿瘤、再生障碍性贫血等疾病中，患者CD4+/CD8+比值降低，三种淋巴细胞的数量和比例均可能有相应的改变。T细胞亚群已被用来 监测器官移植病人的免疫状态，协助发现和使其避免受到GVHD的攻击。由于在感染性、肿瘤 性疾病、自体免疫性疾病和器官移植中患者的免疫功能和预后之间有着密切的关系，对其给予 密切注意并及时采取适当措施、调节患者的免疫状态以改善预后就成为现代医学的一个 重要内容。 常见疾病T淋巴细胞的改变（参考） 疾病T细胞亚群 精品doc
CD4+/CD8+CD4+（辅助T）CD8+（抑制T） 类风关↑（活动期）↑↑ SLE--或↓（活动期）↑↓↑ 胰岛素依赖性糖尿病↑ 多发性硬化症↓↓↑ 乙型肝炎↑ 自身免疫溶血性贫血↑↑ 上呼吸道感染↓↓↓ 结核↓ AIDS↓↓↑ CD4+/CD8+CD3+（总T）CD4+（辅助T）CD8+（抑制T） 恶性肿瘤（白血病）↓↓↓↓↑↑↑↑ 再障及粒细胞减少症↓↑↓ CMV感染↓↑↓ 血小板减少↓↓↓↓↓↓ CD19为全部B细胞共有的表面标志，增高见于B细胞系统的恶性肿瘤，减低见于体液免疫缺陷病。BC主要介导抗感染等体液免疫，故 不作为肿瘤患者的检测指标。 NK细胞主要表达CD3--CD16+CD56+，约占淋巴细胞的10--15%左右。 NK细胞能非特异性杀伤肿瘤细胞，是机体第一道肿瘤防线，其杀伤活 性可被IL-2等细胞因子诱导而显著增强。 通常在肿瘤患者外周血中，CD3+、CD4+、NK细胞减少，而CD8+ 细胞增加，CD4+/CD8+的比值降低，。说明肿瘤病人的细胞免疫功能处精品doc