项目十八B淋巴细胞功能检测
一、溶血空斑试验
(Plaque forming cell assay)
【实验原理】
将SRBC免疫动物，隔一定时间取其脾脏制成细胞悬液，当与SRBC混合孵育时，其中抗体形成细胞释放的抗体会与周围SRBC特异性结合，在补体作用下，使这些致敏的SRBC 溶解，从而在琼脂凝胶中的每个抗体形成细胞周围形成一个肉眼可见的溶血空斑。测定与补体结合力强的IgM形成细胞采用直接方法；测定与补体结合力弱的IgG或IgA形成细胞采用间接法，即实验中需加入抗免疫动物Ig的抗体(二抗)，才能促进溶血空斑形成。
此处只介绍小鼠琼脂直接溶血空斑技术。
【试剂和器材】
1．小白鼠体重18~22 g。
2．补体豚鼠混合新鲜血清。
3．SRBC悬液用Gey液将SRBC洗3次，分别配成2.5×108个细胞/ml和5×108个细胞/ml浓度的红细胞悬液。
4．Gey液、琼脂糖。
5．注射器、剪刀、镊子、不锈钢网、小平皿、试管、吸管、显微镜、温箱、水浴箱。
【步骤和方法】
1．免疫小鼠取1ml 2.5×108个细胞/ml 浓度的SRBC悬液注入小鼠腹腔，或取0.2 ml SRBC悬液经小鼠尾静脉注入。
2．制备脾细胞悬液将免疫4天后的小鼠处死，取脾脏制备细胞悬液(制备方法见动物组织中免疫细胞收集)，用Gey液配成1×107个细胞/ml的细胞悬液(每只小鼠约加6~10ml Gey 液)。
3．制备底层琼脂将14g/L琼脂糖(用Gey液配制)溶化后取2~3ml倾注于水平的小平皿内，凝固后去盖反扣于37℃温箱中预温备用。
4．制备顶层琼脂将5g/L琼脂糖(用Gey液配制)溶化，置48℃水浴中平衡备用。取脾细胞悬液和5×108个细胞/ml SRBC悬液各0.1ml，再加入未稀释补体0.05ml，混匀，置48℃水浴平衡片刻。加入0.8ml已平衡好的琼脂糖，混匀后倒入底层琼脂上，旋转平皿使之均匀平铺，凝固后置37℃温育3h。计数溶血空斑形成细胞(PFC)。
【结果判定】
1．将平皿置低倍显微镜下观察计数。溶血空斑中心有淋巴细胞，周围为透明区。
2．全脾中PFC数计算：
每个平皿PFC数×10×脾细胞悬液体积(ml)
或以每百万脾细胞所含PFC数来表示。
【注意事项】
1．试验选用Gey液为洗涤液和培养液，优于Hanks液、Eagle液和Dullecco液，但工作液需现用现配。
2．最好选用近交系小鼠，且鼠龄和体重应基本一致。
3．制备脾细胞过程所用Gey液应预先4℃预冷，制好的细胞悬液应及时放4℃备用，以保持脾细胞活力。
4．制备顶层琼脂时，温度应控制在45～48℃之间，温度太高细胞会失活，过低会使琼脂凝固，细胞不能分散，无法倒入平皿。各细胞成分要充分混匀，同时避免出现气泡；与琼
脂糖混匀、倾倒平皿时动作要敏捷，以免凝固。
【方法评价】
本方法为改良平皿法，稳定性较好，常用于体液免疫功能测定，是临床研究的可靠指标。与经典平皿法比较具有简便、节省试剂、标本可长期保存、敏感性高等优点。
【临床意义】
可用于研究机体免疫机制；筛选药物并探讨其作用机理及对免疫功能的影响。
【附】Gey液配制
1液NaCl 35 g
KCl 1.85 g
Na2HPO4·12H2O 1.5 g
KH2PO40.119 g
葡萄糖 5 g
酚红50 mg
加蒸馏水至1000ml。
2液MgCl2·6H2O 0.42 g
MgSO4·7H2O 0.14 g
CaCl20.34 g
加蒸馏水至1000ml。
3液NaHCO3 2.25 g
加蒸馏水至1000ml。
以上均高压灭菌(112℃15min)后备用。用时取1液20ml，2液5ml、3液5ml，蒸馏水70ml，混匀即为工作液。
【思考题】
溶血空斑试验有哪些方法类型？检测人不同Ig形成细胞的溶血空斑试验常用何种方法？它们的原理如何？
二、溶血素测定法
(Hemolysin quantitative determination)
【实验原理】
SRBC免疫的动物血清中存在有溶血素，在补体存在下能使溶血素致敏的SRBC发生溶血反应，用分光光度计检测溶血释放的血红蛋白，即可确定免疫动物血清中溶血素的含量，从而可评价机体体液免疫功能状态。
【试剂和器材】
1．小白鼠18~22g。
2．SRBC悬液将SRBC用生理盐水洗3次，按压积用生理盐水配成10％浓度(约2×109/ml)，用于免疫小鼠。另按压积用工作BBD配成4％的浓度，用于测定溶血素。
3．补体豚鼠混合新鲜血清，用时用工作BBD 1:30稀释。
4．贮存BBD(5×)和工作BBD 配制见补体结合试验。
5．氰化高铁血红蛋白试剂(都氏试剂)
NaHCO3 1.0 g
KCN 0.05 g
K3Fe(CN)60.2 g
吐温80 0.5 ml
加蒸馏水至1000ml。
6．注射器、眼科镊子、试管、离心管、吸管、水浴箱、分光光度计。
【步骤和方法】
1．溶血素制备
(1)取0.2ml 10％SRBC 悬液给小鼠腹腔注射，每天1次，连续注射3天。
(2)未次注射后6~8天时摘除小鼠眼球取血，分离血清。
(3)将血清用工作BBD 1:10稀释，置56℃作用30min 后备用。
2．溶血素测定
(1)取1:10稀释血清及4％SRBC 悬液各0.2ml ，混匀后置37℃水浴致敏15min 。
(2)加入工作BBD 0.8ml ，1:30稀释补体0.8ml ，混匀，置37℃水浴1h(或放4℃过夜)，中间取出混匀1次。
(3)到时取出离心2000r/min 10min 。取上清液1ml ，加入氰化高铁血红蛋白试剂3ml ，混匀，置室温10min 后测A 540nm 吸光度。
3．50％溶血(CH 50)管制备。
(1)取0.1ml 4％SRBC 悬液，加入1.5ml 蒸馏水，完全溶血后再加入贮存BBD 0.4ml ，混匀。
(2)取出1ml ，加入氰化高铁血红蛋白试剂3ml ，混匀，置室温10min 后测吸光度， 用氰化高铁血红蛋白试剂做空白对照。测值为1个CH 50的吸光度。
【结果判定】
1．CH 50单位计算：
血清稀释倍数％溶血管的吸光度
溶血素测定管的吸光度＝
50CH 50? 2．以CH 50单位数表示溶血素含量。
【注意事项】
1．溶血素测定所用玻璃器材必需十分洁净。
2．补体最好用混合的新鲜豚鼠血清，用前临时稀释。
3．溶血素测定管离心后发现完全溶血，或溶血甚微，应将测试血清稀释度调整后再重新测定。
4．SRBC 不能溶血，应作SRBC-补体对照：取4％SRBC 悬液0.2ml ，加入工作BBD 1.0ml ，1:30稀释补体0.8ml ；按实验温育、离心后应无溶血现象。空白对照：取该上清液1.0ml ，加入氰化高铁血红蛋白试剂3.0ml ，置室温10min ，应以此作为溶血素比色测定的空白对照管。
5．收获免疫血清时应避免溶血，若溶血严重，测定结果应予校正：取1:10稀释血清0.1ml ，加入工作BBD 0.5ml ，1:30稀释补体0.4ml ，氰化高铁血红蛋白试剂3ml ，混匀，置室温10min 后以氰化高铁血红蛋白试剂为空白对照测吸光度，并以下式校正结果。 血清稀释倍数％溶血管的吸光度
－血清对照管的吸光度溶血素测定管的吸光度＝ 50CH 50? 6．溶血素测定时4℃过夜(17～18h)反应结果会更好。
【方法评价】
此法简便、重复性好、结果准确、客观。
【临床意义】
常用于药物筛选及免疫药理作用的研究。
【思考题】
该试验与补体结合试验中的溶血素测定、血清总补体活性测定在原理、方法和应用上有何异同？
三、酶联免疫斑点试验
(Enzyme-linked immunospot assay)
【实验原理】
酶联免疫斑点(ELISPOT)试验是一种直接检测细胞分泌产物的方法，以此可评价被测细胞的功能、特性。其原理与ELISA类似，此处以测定B细胞分泌抗体活性介绍其检测原理。该方法是用已知抗原包被组织培养板或平皿，再加入B细胞培养3～4h，B细胞沉积到底部，分泌的抗体可与邻近包被抗原结合，就像一个细胞的足印。因此在加入酶标抗相应同种型Ig抗体(二抗)并经酶促反应后，底物形成不溶性颜色斑点，据此可检测抗体的含量；并可在低倍光学显微镜下通过计数斑点即可知抗体形成细胞数。
【试剂和器材】
1．抗原包被缓冲液PBS。
2．封闭液含5%的新生小牛血清(NCS)或含1%的牛血清白蛋白(BSA)的PBS。
3．PBS-T 加入0.005% Tween-20及0.1% BSA的PBS。
4．RPMI-1640培养液含5%NCS。
4．HRP或碱性磷酸酶标记的二抗。
6．1.2％琼脂糖用双蒸水配制，加热溶化。
7．1％琼脂糖用PBS-T溶液配制。用前加热溶化，置46℃水浴平衡。
8．凝胶底物
(1)HRP-底物：将50mg 1,4-对苯二胺(1,4-p-phenylenediamine，PPD)溶于2ml甲醇中，在应用前加入50μl 30% H2O2和46℃预温的1％琼脂糖，混匀后立即应用。PPD与HRP反应性成棕褐色；
(2)碱性磷酸酶底物：5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolylpho- sphate，BCIP)与等体积的1.2％琼脂糖混合。BCIP与碱性磷酸酶反应形成蓝色斑点。
9．可溶性底物
(1)HRP底物：25mg 3-氨基-9-乙基咔巴唑(3-amino-9-ethycarbazole，AEC)溶于2ml二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)中，加入95ml 0.1mol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)。经0.45μm 滤膜过滤，除去沉淀，获无色溶液，加入40μl 30% H2O2。AEC与HRP反应形成红色斑点；
(2)碱性磷酸酶底物：将15mg BCIP和30mg NBT分别溶于1ml DMP中。BCIP和NBT 溶液与100ml 0.1mol/L NaHCO3-1.0mol/L MgCl2(pH9.8)混合。BCIP或BCIP-NBT与碱性磷酸酶反应形成蓝色斑点。
10．96孔板聚苯乙烯培养板(亦可用6孔、24孔、48孔板)，或聚苯乙烯平皿(直径为40~50mm)，或带有硝酸纤维膜的96孔板；微量移液器、CO2孵育箱、光学显微镜等。
【步骤和方法】
1．包被用PBS将抗原作适当稀释后包被聚苯乙烯培养板或聚苯乙烯平皿，4℃过夜或37℃孵育2h。用PBS洗涤平皿或培养板3次，每次2~3min。包被好的平皿或培养板置4℃可保存数周。
2．封闭加入封闭液，每孔200μl，平皿为2ml，置37℃ 30min。弃去封闭液，用PBS 洗涤3~5次。
3．加样反应加入用RPMI-1640稀释的抗体分泌细胞(1×106/ml)，每孔100~200μl，平皿为2ml。置37℃ 5%CO2的温箱3~4h或过夜。用PBS-T洗涤去除细胞，方法同上。注意防止培养液干枯。
4．结果测定：每孔加入酶标二抗50~100μl(2ml/平皿)，置室温(25℃) 2~3h或4℃过夜。用PBS洗涤3次。聚苯乙烯板可用凝胶底物单染色分析，硝酸纤维膜可用可溶性底物作单染色或双染色分析。
(1)凝胶底物法加凝胶底物，每孔50~100μl，平皿为2ml，快速振摇微孔板或平皿使凝胶平铺，置室温使凝胶凝固(需2~5min)，再置5~10min后可见蓝色或棕褐色斑点。
(2)可溶性底物法加可溶性底物50μl至96孔板(盛有硝酸纤维膜)。首先加入碱性磷酸酶底物，置室温5~10min，显蓝色斑点，用PBS漂洗；然后加入HRP底物，再置1~10min 后显示红色斑点，用水洗硝酸纤维膜。
【结果判定】
可在低倍镜下计数斑点形成细胞(spot-foming cells，SFC)。
阴性和空白对照应无斑点出现。有斑点形成为阳性，无斑点出现为阴性。
【注意事项】
1．实验条件应统一；并做好阴性、阳性、空白及参考品对照。
2．加样要准确、不要有气泡，洗涤应彻底。
【方法评价】
本实验方法稳定性好、特异性高，且抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞，结果易于观察。
【临床意义】
常用于检测分泌细胞活性，如抗体形成细胞、杂交瘤细胞、细胞因子分泌细胞等；也可用于研究细胞对抗原、刺激剂、抑制剂的应答性，或药物筛选、药理作用研究。
【思考题】
ELISPOT试验和ELISA比较有何不同？
细胞免疫功能检测常用有哪几种方法 一、迟发型过敏反应的体外检测方法 皮肤试验和接触性过敏的诱发是检测迟发型过敏反应（DTH）的两种常用方法。皮肤试验中诱发对曾经使病人致敏的抗原的再次应答，而接触性过敏是测试受者对从未接触过的物质发生致敏的能力。 1．皮肤试验用皮肤试验诊断DTH，常用的抗原有结核菌纯蛋白衍生物（PPD）、腮腺炎病毒、念珠菌素等，在人类试验时在前臂皮内注射少量可溶性抗原，24～48小后，测量红肿硬结的大小，硬结直径大于10mm即被看作为阳性。表明受试者对该病原菌有了一定的细胞免疫能力，若皮试无反应，可用更高浓度的抗原重复试验，若仍无反应即为阴性，需排除皮试技术误差，也可能受试者从未接触过此抗原，也可能由于细胞免疫功能缺损，或由于细胞免疫功能缺损，或由于严重感染（麻疹、慢性播散性结核）造成的无反应性。 2．接触性过敏常应用低分子量化合物如二硝基氯苯（DNCB）诱发接触性过敏。化合物与皮肤蛋白质结合而导致DTH反应。在动物试验时，初次皮肤上涂抹DNCB后间隔7～10天再激发刺激，则皮肤出现即为阳性。此试验人类已不使用。 二、细胞免疫的体外检测方法 体外检测淋巴细胞的数量和功能，最易采集的是血标本，首先需分离或纯化淋巴细胞，一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重为1.077的淋巴细胞分层液，当将血液重叠于淋巴细胞分层液之上离心时，由于红细胞（1.092）、多形核白细胞（1.090）、淋巴细胞（1.070）的比重不同而相互分开。淋巴细胞和单核细胞在血浆和分层液交界处形成一薄层。仔细分出这一薄层的细胞，其中淋巴细胞占80%，单核细胞占20%，淋巴细胞中T细胞占80%，B细胞占4%～10%，其作为非DT、非B细胞。 1．T细胞计数
C D和C D T淋巴细胞 检测 集团档案编码：[YTTR-YTPT28-YTNTL98-UYTYNN08]
CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测?? ? 1? 范围 本章规定了用多平台三级程序法和单平台一步法检测全血中的CD4+ 和 CD8+ T淋巴细胞。 ? 2?? 规范性引用文件 1997 Revised Guidelines for Performing CD4+ T-Cell Determinations in Persons Infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV) MMWR 46(RR-2);1-29 Publication date: 01/10/1997。 ? 3? 实验室条件 3.1 人员 进行HIV感染者CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全及实验操作技术培训。 3.2? 设施和设备 3.2.1? 样品处理区：生物安全柜、离心机、冰箱、水浴箱、旋转振荡器、精确移液器（5μl~50μl、20μl~200μl、200μl~1000μl）。 3.2.2? 流式细胞仪检测区：流式细胞仪 3.3? 功能分区 实验室原则上应分为样品处理区和流式细胞仪检测区,各区的功能是： 3.3.1? 样品处理区应达到生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室要求，用于样品处理、流式检测样品制备。 3.3.2? 流式细胞仪检测区用于制备好的样品上机检测。
? 4? 样品采集、运输和接收 4.1? 样品的采集 4.1.1? 选择合适的抗凝剂，分别用于血液学检测和流式细胞仪的免疫表型检测。 4.1.1.1? 用于血液学检测的抗凝剂 （1） EDTA（1.5±0.15mg/ml血液）。 （2）在血球分析仪生产商允许的时间范围内检测，不超过30h，不检测超出抗凝时间范围的样品。 4.1.1.2? 用于流式细胞仪免疫表型检测的抗凝剂 （1）用K3EDTA抗凝，收集样品应在30h以内，尽早（8h以内）处理。 （2）用ACD或肝素抗凝，收集样品在48h以内，尽早（8h以内）处理。 4.1.2? 静脉采血收集血样，将血液注入一个事先加入适当抗凝剂的试管（用真空试管）。 4.1.2.1? 当收集儿童样品时，采用儿童用注射器、小试管。 4.1.2.2? 采血后立即握住试管两端，颠倒混匀数次，将血液与抗凝剂混匀，以防止凝固。 4.1.3? 准备适当数量的样品管 4.1.3.1? 当同一样品的血球检测和流式细胞仪免疫表型检测在不同实验室内进行时，用2个装有K3EDTA的试管即可。 4.1.3.2? 在所有其它条件下用2个试管（用K3EDTA作血球检测，用K3 EDTA、ACD或肝素作流式细胞仪免疫表型检测）。 4.1.4 ?对所有样品编号，并写明日期和收集时间。 4.2? 样品运输
第十三章免疫细胞分离及检测技术 本章考点 1.免疫细胞的分离 2.淋巴细胞表面标志的检测 3.淋巴细胞功能检测技术 4.免疫细胞检测的临床意义 第一节免疫细胞的分离 一、外周血单个核细胞的分离 1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间。因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。 2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种 （1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。见下图。 图聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图 引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷 （2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。 图连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图 引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷
项目十八B淋巴细胞功能检测 一、溶血空斑试验 (Plaque forming cell assay) 【实验原理】 将SRBC免疫动物，隔一定时间取其脾脏制成细胞悬液，当与SRBC混合孵育时，其中抗体形成细胞释放的抗体会与周围SRBC特异性结合，在补体作用下，使这些致敏的SRBC 溶解，从而在琼脂凝胶中的每个抗体形成细胞周围形成一个肉眼可见的溶血空斑。测定与补体结合力强的IgM形成细胞采用直接方法；测定与补体结合力弱的IgG或IgA形成细胞采用间接法，即实验中需加入抗免疫动物Ig的抗体(二抗)，才能促进溶血空斑形成。 此处只介绍小鼠琼脂直接溶血空斑技术。 【试剂和器材】 1．小白鼠体重18~22 g。 2．补体豚鼠混合新鲜血清。 3．SRBC悬液用Gey液将SRBC洗3次，分别配成2.5×108个细胞/ml和5×108个细胞/ml浓度的红细胞悬液。 4．Gey液、琼脂糖。 5．注射器、剪刀、镊子、不锈钢网、小平皿、试管、吸管、显微镜、温箱、水浴箱。 【步骤和方法】 1．免疫小鼠取1ml 2.5×108个细胞/ml 浓度的SRBC悬液注入小鼠腹腔，或取0.2 ml SRBC悬液经小鼠尾静脉注入。 2．制备脾细胞悬液将免疫4天后的小鼠处死，取脾脏制备细胞悬液(制备方法见动物组织中免疫细胞收集)，用Gey液配成1×107个细胞/ml的细胞悬液(每只小鼠约加6~10ml Gey 液)。 3．制备底层琼脂将14g/L琼脂糖(用Gey液配制)溶化后取2~3ml倾注于水平的小平皿内，凝固后去盖反扣于37℃温箱中预温备用。 4．制备顶层琼脂将5g/L琼脂糖(用Gey液配制)溶化，置48℃水浴中平衡备用。取脾细胞悬液和5×108个细胞/ml SRBC悬液各0.1ml，再加入未稀释补体0.05ml，混匀，置48℃水浴平衡片刻。加入0.8ml已平衡好的琼脂糖，混匀后倒入底层琼脂上，旋转平皿使之均匀平铺，凝固后置37℃温育3h。计数溶血空斑形成细胞(PFC)。 【结果判定】 1．将平皿置低倍显微镜下观察计数。溶血空斑中心有淋巴细胞，周围为透明区。 2．全脾中PFC数计算： 每个平皿PFC数×10×脾细胞悬液体积(ml) 或以每百万脾细胞所含PFC数来表示。 【注意事项】 1．试验选用Gey液为洗涤液和培养液，优于Hanks液、Eagle液和Dullecco液，但工作液需现用现配。 2．最好选用近交系小鼠，且鼠龄和体重应基本一致。 3．制备脾细胞过程所用Gey液应预先4℃预冷，制好的细胞悬液应及时放4℃备用，以保持脾细胞活力。 4．制备顶层琼脂时，温度应控制在45～48℃之间，温度太高细胞会失活，过低会使琼脂凝固，细胞不能分散，无法倒入平皿。各细胞成分要充分混匀，同时避免出现气泡；与琼
免疫功能评估 解读 重庆斯德姆生物技术有限公司干细胞与再生医学技术研究院重庆再生医学与健康技术研究院
2018 年美国免疫学家詹姆斯·艾利森(James P.Alison) 和日本免疫学家本庶佑 (Tasuku Honjo) 因为在抑制消极免疫调节机制的研究 中发现了新癌症疗法作出的贡献，荣获年度诺贝尔生理学或医学奖。 詹姆斯·艾利森发现阻断CTLA-4 能够激活免疫系统的T 细胞，激活的 T 细胞会重新攻击癌细胞。 本庶佑首先鉴定PD-1 为活化 T 淋巴细胞上的诱导型基因，这一发现为 PD-1 阻断建立癌症免疫治疗原理作出了重大贡献。曾在201 3 年被《 Science 》评为年度十大科学突破之首。
2011 年美国免疫学家和遗传学家布鲁斯·博伊特勒(Bruce A.Be utler) 、卢森堡科学家朱尔斯·霍夫曼 (Jules A.Hoffmann) 和加拿大生 物学家拉尔夫·斯坦曼(Ralph M.Steinman) 三名科学家发现免疫系统 激活的关键原理，革命性地改变人们对免疫系统的理解，从而分享年 度诺贝尔医学奖。 布鲁斯·博伊特勒和朱尔斯·霍夫曼发现了关键受体蛋白质， 称为Toll 样受体（ Toll-like receptors ， TLR ）。 拉尔夫·斯坦曼在上世纪 70 年代第一个发现 DC(树突状细胞 )。D C 是目前已知功能最强大的专职抗原递呈细胞，具有强大的活化T 细胞能力，在获得性免疫启动中发挥重要的“信使”作用，从而引起一系列反应，制 造出抗体和“杀手”细胞等“武器”杀死被感染的细胞以及入， 侵的病原体。
〉〉〉安全防御系统 居家地点不同，保护住家安全的方法就不同。有些公寓有看门卫，有些房子建有栅栏，如果你有城堡，就需要配备一条护城河和一支弓箭部队，或者你可以选择其他一些特殊的家庭防御装置，比如安装锁、电子安全系统，养一只狗。 无论你选择的防御方法是什么，输入通行密码也好，用链条拴门也罢，还是要那种看门护院狗，其中的原因都在于你想要一个的安全 系统来保护你家里所有有价值的东西，从相册、立体声音响设备到传 家宝以及孩子们。 你的身体内也有自己的安全体系来抵御入侵者。皮肤和骨骼能在车祸中或是遇到打偏的高尔夫球时保护体内器官，头发保护头皮不受 紫外线侵害，眼睑保护眼球以防伸向眼睛的指头，但是你体内最重要 的安全系统是一个隐形的系统，你无法感觉或是看见它，而它却承担着抵御入侵病原体和帮助你康复的重任，这个系统就是人体的防御系统。 〉〉〉人体防线 人体有三道防线构成的防御系统，主要功能是抵御病原体的攻击。是由皮肤、黏膜、黏膜分泌物、杀菌物质 (如溶菌酶 )、免疫器官、免疫细胞、免疫活性物质等构成。 第一道防线 是由皮肤和黏膜构成的，他们不仅能够阻挡病原体侵入人体，而
1.掌握T、B淋巴细胞的主要膜表面分子和作用。 T细胞的膜表面分子及其功能T细胞表面具有许多重要的膜分子, 参与识别抗原 和T 细胞的活化、增殖、分化及功能的发挥并且是T细胞亚群的重要标志。 T细胞表面标志： （一）T细胞表面受体 1.T细胞抗原识别受体--TCR及TCR复合体 所有T细胞表面均具有能结合特异性抗原的膜分子，称T细胞抗原受体（TCR）。TCR功能：是识别和结合抗原肽的作用。 CD3分子：由γ、δ、ε、ζ、η五种肽链组成。 CD3分子的功能：稳定TCR的结构，传递T细胞活化信号。 TCR识别抗原后，刺激信号是通过CD3转导的。 2. 细胞因子受体（cytokine receptor，CKR） CK:主要指由细胞经刺激诱导而合成和分泌的具有高活性多功能的小分子蛋白质。. 白细胞介素(interleukin, IL) . 干扰素(Interferon, IFN) . 集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF) . 肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF) . 生长因子(Growth factor, GF) . 趋化因子(chemokine, cK) 静止T细胞——>活化T细胞——>T细胞增殖、分化 3 .病毒受体 CD4分子是HIV的受体，HIV的gp120与CD4分子高亲和性结合。CD4+的T细胞是HIV 攻击的主要靶细胞 4. 丝裂原受体 可致细胞发生有丝分裂，进而增殖得名,可激活某一类淋巴细胞-------非特异性多克隆激活剂 ConA：刀豆素A PHA：植物血凝素 PWM：美洲商陆 丝裂原与受体交联，可直接使静止T细胞活化、增殖、转化为淋巴母细胞 （二）T细胞表面抗原（surface antigen） 1.MHC抗原：MHC-I（所有），活化后表达ＭＨＣ－Ⅱ（活化标志） 2.分化抗原（ＣＤ分子） （１）辅助分子——CD4和CD8分子 （２）协同（辅助）信号分子——CD28、CD152、CD40L、LFA-1、CD2 T细胞表面CD抗原: T细胞的膜辅助受体-CD4/CD8 功能：辅助TCR识别抗原和参与活化信号转导 CD4+/CD8+T能过表面的TCR-CD3复合体分子与APC表面相应抗原肽-MHC分子复合 物结合，CD4/CD8分子可与MHC分子紧密结合，使T细胞与APC的作用加强，并使胞内区的ITAM和蛋白酪氨酸激酶P56LCK活化，从而产生T细胞活化的第一信号，引发一系列激酶级联反应。 一、B细胞的膜表面分子
CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测 1 范围 本章规定了用多平台三级程序法和单平台一步法检测全血中的CD4+ 和 CD8+ T淋巴细胞。 2 规范性引用文件 1997 Revised Guidelines for Performing CD4+ T-Cell Determinations in Persons Infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV) MMWR 46(RR-2);1-29 Publication date: 01/10/1997。 3 实验室条件 3.1 人员 进行HIV感染者CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全及实验操作技术培训。 3.2 设施和设备 3.2.1 样品处理区：生物安全柜、离心机、冰箱、水浴箱、旋转振荡器、精确移液器（5μl~50μl、20μl~200μl、200μl~1000μl）。 3.2.2 流式细胞仪检测区：流式细胞仪 3.3 功能分区 实验室原则上应分为样品处理区和流式细胞仪检测区,各区的功能是： 3.3.1 样品处理区应达到生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室要求，用于样品处理、流式检测样品制备。 3.3.2 流式细胞仪检测区用于制备好的样品上机检测。 4 样品采集、运输和接收
4.1 样品的采集 4.1.1 选择合适的抗凝剂，分别用于血液学检测和流式细胞仪的免疫表型检测。 4.1.1.1 用于血液学检测的抗凝剂 （1）EDTA（1.5±0.15mg/ml血液）。 （2）在血球分析仪生产商允许的时间范围内检测，不超过30h，不检测超出抗凝时间范围的样品。 4.1.1.2 用于流式细胞仪免疫表型检测的抗凝剂 （1）用K3EDTA抗凝，收集样品应在30h以内，尽早（8h以内）处理。 （2）用ACD或肝素抗凝，收集样品在48h以内，尽早（8h以内）处理。 4.1.2 静脉采血收集血样，将血液注入一个事先加入适当抗凝剂的试管（用真空试管）。 4.1.2.1 当收集儿童样品时，采用儿童用注射器、小试管。 4.1.2.2 采血后立即握住试管两端，颠倒混匀数次，将血液与抗凝剂混匀，以防止凝固。 4.1.3 准备适当数量的样品管 4.1.3.1 当同一样品的血球检测和流式细胞仪免疫表型检测在不同实验室内进行时，用2个装有K3EDTA的试管即可。 4.1.3.2 在所有其它条件下用2个试管（用K3EDTA作血球检测，用K3 EDTA、ACD或肝素作流式细胞仪免疫表型检测）。 4.1.4 对所有样品编号，并写明日期和收集时间。 4.2 样品运输 4.2.1 在室温下（18~23℃）保存和运输样品，避免极端温度（冷冻或过热）。超过37℃的温度会破坏细胞，对血液学和流式细胞仪的检测有影响。天气热时，需要用一个隔热的容器装样品，并且把这个容器放于另一个有冰袋和吸热物质的容器中。这种方法有助样品的保存。 4.2.2 尽可能快地将样品送至免疫表型检测实验室。
人的淋巴细胞有什么功能？淋巴细胞是人体最主要的免疫细胞，它由人体的淋巴组织，如脾脏、淋巴结、扁桃体等生成，所以扁桃体不能随便摘除，它对人体的免疫功能是有帮助的，除非在反复扁桃体炎，对人体造成危害时才摘除。 T细胞的主要功能是调节B细胞制造抗体，当外来抗原增多时，T细胞就促进B 细胞制造大量抗体，当外来抗原减少时，T细胞就抑制B细胞的功能，从而起到免疫监控作用。此外，T细胞还能分泌一些细胞因子，如白细胞介素—2、转移因子、干扰素等来调控免疫反应和直接杀伤有害的抗原性物质。 B细胞的主要功能是制造抗体，当外界抗原侵入机体后，它能识别抗原，制造相应抗体。正常情况下，B细胞对人体组织是不形成抗体的，这就是“识别自我，排斥异己”。但是当正常组织由于某种原因（如感染等）产生变化，B细胞也会对自身变质的组织抗原成分产生抗体，在T细胞的辅助下，与相应抗原结合，引起自身反应。 T细胞是淋巴细胞的一种，在免疫应答中扮演着重要的角色。T细胞在胸腺内分化成熟，成熟后移居于周围淋巴组织中。T是“胸腺”（Thymus）而不是甲状腺（Thyroid）的英文缩写。T细胞膜表面分子与T细胞的功能相关，也是T细胞的表面标志（cell-surface marker），可以用以分离、鉴定不同亚群的T细胞。 T细胞按照功能和表面标志可以分成很多种类： 细胞毒T细胞（cytotoxic T cell）：消灭受感染的细胞。这些细胞的功能就像一个“杀手”或细胞毒素那样，因为它们可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。细胞毒T细胞的主要表面标志是CD8. 辅助T细胞（helper T cell）在免疫反应中扮演中间过程的角色：它可以增生扩散来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。辅助T细胞的主要表面标志是CD4。T细胞调控或“辅助”其它淋巴细胞发挥功能。它们是已知的HIV病毒的目标细胞，在艾滋病发病时会急剧减少。 调节/抑制T细胞（regulatory/suppressor T cell）：负责调节机体免疫反应。通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过度损伤机体的重要作用。调节/抑制T细胞有很多种，目前研究最活跃的是CD25+CD4+T细胞。 记忆T细胞（memory T cell）：在再次免疫应答中起重要作用。记忆T细胞由于暂时没有非常特异的表面标志，目前还有很多未知之处。 B淋巴细胞亦可简称B细胞。来源于骨髓的多能干细胞。在禽类是在法氏囊内发育生成，故又称囊依赖淋巴细胞（bursa dependent lymphocyte）/骨髓依赖性淋巴细胞简称B细胞，是由骨髓中的造血干细胞分化发育而来。与T淋巴细胞相比，它的体积略大。这种淋巴细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。B 细胞淋巴瘤是一种最常见的淋巴细胞白血病，有关这种疾病的研究不断涌现。在哺乳类是在类囊结构的骨髓等组织中发育的。又称骨髓依赖淋巴细胞。从骨髓来的干细胞或前B细胞，在迁入法氏囊或类囊器官后，逐步分化为有免疫潜能的B细胞。成熟的B细胞经外周血迁出，进入脾脏、淋巴结，主要分布于脾小结、脾索及淋巴小结、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小结中，受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，合成抗体，发挥体液免疫的功能。目前使用的大多数疫苗就是通过刺激这类B淋巴细胞产生抗体的。B细胞在骨髓和集合淋巴结中的数量较T细胞多，在血液和淋巴结中的数量比T细胞少，在胸导管中则更少，仅少数参加再循环。B细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原及表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。 B细胞表面有多种膜表面分子，籍以识别抗原、与免疫细胞和免疫分子相互作用，也是分离和鉴别B细胞的重要依据。B细胞表面分子主要有白细胞分化抗原、MHC以及多种膜表面受体。
免疫功能（淋巴细胞亚群）检测的临床意义 外周血淋巴细胞根据生物学功能和细胞表面抗原表达 分为3个群：T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）和NK淋巴细胞【自然杀伤细胞（natural killer)，CD3-CD16+和/或CD56+】。T细胞又分为辅助T细胞（CD3+CD4+）和抑制T细胞（CD3+CD8+)。淋巴细胞亚群分析是检测细胞免疫和体液免疫功能的重要指标，它总体反应机体当前的免疫免疫功能、状态和平衡水平，并可以辅助诊断某些疾病，如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等，分析发病机制，观察疗效及检测预后有重要意义。T淋巴细胞百分率或计数绝对值可用于区别和监测某些免疫缺陷病和自身免疫性疾病。辅助T淋巴细胞减少：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷病、艾滋病、应用免疫抑制患者。抑制T淋巴细胞增多：见于自身免疫性疾病，如SLE、艾滋病初期、慢性活动性肝炎、肿瘤及病毒感染等。抑制T细胞百分率在一些免疫性疾病表现出超出正常参考范围，在许多先天性或获得性免疫缺陷病人中升高（如重症综合性免疫缺陷SCID,AIDS）。 CD4+/CD8+>2.5表明细胞免疫功能处于“过度活跃”状态，容易出现自身免疫反应，见于类风湿性关节炎、I型糖尿病等。CD4+/CD8+ 在肿瘤病人外周血中T淋巴细胞亚
群数值都有异常，其特征是患者体内CD3+细胞、CD4+细胞明显减少，而CD8+细胞明显增加，CD4+/CD8+比值显著降低，说明肿瘤患者的细胞免疫功能处于免疫抑制状态，患者对识别和杀伤突变细胞的能力下降，形成了肿瘤的生长转移。骨髓造血细胞的增殖和分化障碍也与T细胞亚群异常有关。如在再生障碍性贫血与粒细胞减少症中，患者的外周血CD4+细胞数减少，CD8+细胞数增多，CD4+/CD8+比值明显下降。NK细胞介导某些肿瘤和病毒感染细胞的细胞毒性反应。B淋巴细胞为体液免疫的重要指标。
免疫学技术原理与应用 PAIT-12 淋巴细胞功能测定 孙汭 中国科技大学生命科学学院 免疫学研究所
PMIT-12 淋巴细胞功能测定 一、常用的淋巴细胞功能测定 二、T淋巴细胞功能测定 三、B淋巴细胞功能测定 四、NK细胞细胞毒试验 一、常用的淋巴细胞功能测定 1、淋巴细胞增殖试验 ① 3H-TdR掺入法 原理：淋巴细胞在丝裂原或特异性抗原刺激下转化为淋巴母细胞，发生转化过程中，细胞DNA合成大量增多。此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-Thymidine riboside, 3H-TdR), 使3H-TdR掺入新合成的DNA中，经β-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA 的3H-TdR掺入量，根据掺入细胞内的核素的量可判断淋巴细胞增殖的程度。 ② MTT比色法 原理：MTT（（3-4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑）是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢过程，MTT代谢形成蓝色的甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。甲攒经异丙醇溶解后呈紫蓝色，借助酶标仪测定OD值，可反映细胞增殖水平。 2、细胞毒试验 ①51Cr释放法 原理：用放射性核素51Cr（Na251-CrO4，鉻酸钠）标记靶细胞，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合。然后将51Cr标记的靶细胞与待检细胞（效应细胞）共同孵育一定时间后，若待检细胞能够杀伤靶细胞，则51Cr从靶细胞释放出来。51Cr的释放量与效应细胞的活性成正相关。即靶细胞被杀伤的越多，释放到上清中的游离51Cr越多，用γ计数仪测定上清中51Cr的放射活性（cpm）值，以计算待检细胞的细胞毒活性。 （一）、用51Cr铬酸钠标记靶细胞 1．用RPMI-1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100μCi（3.7MBq）51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。 2．用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g 10分钟。用50ml RPMI-1640培养液悬浮细胞，置37℃水浴30分钟，以减少非特异的自然释放。 3．离心200×g 10分钟，去上清液。小心用RPMI-1640培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为0.5×105或1×105/ml备用。 （二）、4小时51Cr释放实验 1．在96孔圆底细胞培养板中加入51Cr标记的靶细胞，每孔加100μl。
所翻译综述发表于Science的时间：2013-10-11 影响因子：31.027 译者：谢金攀 翻译完成时间：2013-12-20 REVIEW 综述 Fueling Immunity: Insights into Metabolism and Lymphocyte Function 能量免疫：洞察代谢和淋巴细胞功能 Erika L. Pearce, Maya C. Poffenberger, Chih-Hao Chang, Russell G. Jones Lymphocytes face major metabolic challenges upon activation. They must meet the bioenergetic and biosynthetic demands of increased cell proliferation and also adapt to changing environmental conditions, in which nutrients and oxygen may be limiting. An emerging theme in immunology is that metabolic reprogramming and lymphocyte activation are intricately linked. However, why T cells adopt specific metabolic programs and the impact that these programs have on T cell function and, ultimately, immunological outcome remain unclear. Research on tumor cell metabolism has provided valuable insight into metabolic pathways important for cell proliferation and the influence of metabolites themselves on signal transduction and epigenetic programming. In this Review, we highlight emerging concepts regarding metabolic reprogramming in proliferating cells and discuss their potential impact on T cell fate and function. 淋巴细胞在活化时面临主要的代谢挑战。它们必须满足增长的细胞增殖对生物能量和生物合成的要求，并且适应营养和氧气可能受限的变化中的环境条件。免疫学一个新兴的主题是，代谢重编程和淋巴细胞活化有复杂的联系。不管怎样，为什么T细胞采用特定的代谢程序，这些程序对T细胞功能的影响，以及最终的免疫结果都仍不明确。关于肿瘤细胞代谢的研究已经提供了有价值的洞见，涉及细胞增殖的重要代谢途径和代谢本身对信号转导和表观遗传学编程的影响。在这篇综述，我们突出关于增殖细胞中代谢重编程新兴的概念并探讨它们对T细胞命运和功能的潜在影响。 The immune system is comprised of a series of specialized cells conditioned to respond rapidly to“danger”signals such as foreign pathogens or inflammatory stimuli. T lymphocytes,or T cells, are sentinels of the adaptive immune system that respond to antigen-specific signals by blasting, proliferating, and differentiating into effector subsets tailored to identify and eliminate threats to the host. Integrated into this program of activation is the regulation of cellular metabolism.Upon activation, T cells dramatically alter their metabolic activity to meet the increased metabolic demands of cell growth, proliferation, and effector function. Metabolism fundamentally underpins T cell function; thus, there is great interest in understanding how metabolic pathways influence immune responses and ultimately affect disease progression.It should be noted that“metabolism”refers to a complex network of biochemicalreactions involved in energy production and macromolecular biosynthesis, and comprehensive coverage of such a broad topic is difficult. Several recent reviews have highlighted the molecular mechanisms that govern metabolic reprogramming in the immune system (1–3). This Review will focus on emerging areas in intermediary metabolism in lymphocytes and will discuss their potential impact on T cell fate, plasticity, and effector
（一）免疫检测点简介 “免疫检验点”，为抑制受体和抑制信号通路，这些“检验点”在正常情况下能抑制T 细胞的功能，同时在肿瘤组织中可能被肿瘤利用形成免疫逃逸。 PD-1 、PD-L1、CTLA-4、B 和T 细胞衰减器（B and T cellattenuator，BTLA）、T 细胞免疫球蛋白以及Tim-3 等分子均属于“检验点”分子，在肿瘤组织中可能被肿瘤利用形成免疫逃逸，它们通过控制胞外以及胞内信号来控制细胞周期进程。 淋巴细胞活化基因3（LAG-3）是表达在活化T细胞、NK细胞及 B细胞上的免疫抑制检验点分子。目前已知的唯一配体是MHC-II分子。 NK细胞表面存在杀伤抑制受体（KIRs，可抑制NK细胞的杀伤作用），在肿瘤微环境中可能会被诱导表达，从而抑制NK细胞的杀伤功能。因此，KIRs也被认为是免疫抑制检验点，通过阻断其信号可增强NK细胞的杀伤肿瘤的功能[53]。目前已有针对KIRs单抗进入临床实验（lirilumab单抗治疗急性粒细胞白血病已进入I期临床实验）很多免疫抑制检验点在肿瘤细胞中与PD-1/PD-L1共表达，另一方面，免疫抑制检验点的联合阻断中可供选择的目标增多有利于筛选出最佳组合从而达到最佳效果。 （二）临床常用的检测点 “程序性死亡分子1”（programmed deah-1，PD-1）和“细胞毒T淋巴细胞相关抗原4”（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）表达在T细胞表面，同属于抑制性共刺激分子，在免疫系统
中扮演着类似“刹车”的角色。 CTLA的配体（即CD80和CD86）只表达在抗原递呈细胞上，而非肿瘤细胞表面，因此CTLA-4抑制T细胞活化发生在次级免疫器官（淋巴结）内，而不是肿瘤微环境中。同时CTLA-4主要表达在CD4+ T细胞而非CD8+ T细胞，CTLA-4单抗的抗肿瘤作用可能是通过增强CD4+ T细胞间接促进CD8+ T细胞的功能。 不同于CTLA-4的是，PD-1的配体PD-L1在肿瘤细胞及肿瘤浸润淋巴细胞上均有表达，而不是在抗原递呈细胞上，因此PD-1/PD-L1抑制T细胞活化主要在肿瘤微环境中[5-7]。目前，在肺癌领域研究得比较多的免疫检验点抑制剂有抗PD-1（Nivolumab，Pembrolizumab）和PD-L1单抗（MPDL3280A和MEDI-4736）。 PD-L1仍然是现阶段PD-1/PD–L1类药物最有前景的预测疗效的生物标记物之一 在黑色素瘤相关研究中发现，抗PD-1抗体的疗效要好于抗CTLA-4抗体。在NSCLC，CTLA-4抗体单药治疗鲜有疗效，而PD-1/PD-L1阻断剂的单药均表现出肿瘤活性。 PD-1有两个配体，PD-L1和PD-L2；PD-L1有两个受体PD-1和CD80（B7.1）。所以，尽管抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体都作用于PD-1/PD-L1信号轴，但阻断PD-1并不等同于阻断PD-L1。抗PD-1抗体能阻断PD-1与PD-L1、PD-L2结合，却不能阻断PD-L1与CD80相互作用，而抗PD-L1抗体能阻断PD-L1与PD-1、CD80结合，却不能阻断PD-1与PD-L2的结合。
淋巴细胞增殖功能的测定 淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。因此，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常用方法。 (一)原理 T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA),抗CD２、抗CD３McAb 作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体(SAC)、脂多糖(LPS，对小鼠有作用)则刺激B细胞发生增殖；美洲商陆(PWM)、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。最近发现,integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。目前临床上最常选用PHA刺激PBMC, 根据形态学或氚标记胸腺嘧啶核苷(３H-TdR)掺入率测定T细胞的增殖水平。 (二)操作步骤 无菌从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC) 洗涤后用10％FCS RPMI1640调整细胞数为1～2×10６／ml ↓ 加入96孔培养板中，1～2×10５细胞／100μl／孔，每组设3孔。 加入最适剂量PHA，100μl／孔，同时设不加PHA阴性对照。如观察细 胞因子(如IL-2)或其它刺激物(PMA)对增殖功能的调节作用，则根据 加入因子的浓度而确定加入量，一般每孔最终体积为200μl ↓37℃、5％CO２孵育，66h 每孔加入0.5～1μci３H-TdR(50μl) ↓继续培养6～12h 用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品 于"9999"型玻璃纤维滤纸上 ↓ 烤干后β液闪仪计数 计算 1.增殖水平直接用CPM值表示。 2.也可用刺激指数(SI)表示: PHA(或实验组)cpm-机器本底 SI＝─────────────── 阴性对照组cpm-机器本底 (三)试剂和器材 1.PBMC或其它含淋巴细胞的悬液。 2.PHA或其它有丝分裂原、刺激物 3.闪烁液PPO(2，5-二苯茎恶唑)3～5g POPOP[1，4双(5苯基恶唑)苯] 0.3～0.5g溶于1000ml二甲苯中。也可将POPOP加入少量二甲苯在37℃水浴上溶解后，再加PPO，然后补足二甲苯。 4.３H-TdR，一般临用时稀释 5.10％FCS RPMI1640, CO２孵箱 6. 细胞收集仪，β液闪仪 (四)注意事项
CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测?? 1? 范围 本章规定了用多平台三级程序法和单平台一步法检测全血中的CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞。 2?? 规范性引用文件 1997 Revised Guidelines for Performing CD4+ T-Cell Determinations in Persons Infected with Human Immunodeficiency Virus (HIV) MMWR 46(RR-2);1-29 Publication date: 01/10/1997。 3? 实验室条件 3.1 人员 进行HIV感染者CD4+ 和CD8+ T淋巴细胞检测的人员须具有艾滋病实验室的上岗资格，并接受过省级以上艾滋病实验室安全及实验操作技术培训。 3.2? 设施和设备 3.2.1? 样品处理区：生物安全柜、离心机、冰箱、水浴箱、旋转振荡器、精确移液器（5μl~50μl、20μl~200μl、200μl~1000μl）。 3.2.2? 流式细胞仪检测区：流式细胞仪 3.3? 功能分区 实验室原则上应分为样品处理区和流式细胞仪检测区,各区的功能是： 3.3.1? 样品处理区应达到生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室要求，用于样品处理、流式检测样品制备。 3.3.2? 流式细胞仪检测区用于制备好的样品上机检测。 4? 样品采集、运输和接收 4.1? 样品的采集 4.1.1? 选择合适的抗凝剂，分别用于血液学检测和流式细胞仪的免疫表型检测。 （1）EDTA（1.5±0.15mg/ml血液）。 （2）在血球分析仪生产商允许的时间范围内检测，不超过30h，不检测超出抗凝时间范围的样品。 （1）用K3EDTA抗凝，收集样品应在30h以内，尽早（8h以内）处理。 （2）用ACD或肝素抗凝，收集样品在48h以内，尽早（8h以内）处理。
项目14：细胞免疫功能测定 【目的要求】 1、熟悉非特异性免疫细胞功能的测定方法 2、了解特异性免疫细胞的测定方法和应用 【实验内容】 一、吞噬细胞吞噬功能测定 【原理】 具有吞噬功能的细胞称为吞噬细胞，包括小吞噬细胞和大吞噬细胞二类。小吞噬细胞一般指血液中的中性粒细胞，大吞噬细胞则是存在于组织中的巨噬细胞和血液中的大单核细胞。 病原微生物、红细胞等异物侵入机体或在体外与吞噬细胞接触，吞噬细胞即进行吞噬。取细胞作涂片，镜检计算吞噬百分率和吞噬指数，可估计吞噬细胞的吞噬功能。吞噬细胞（巨噬细胞）在体液免疫和细胞免疫中均起着重要作用，吞噬细胞（巨噬细胞）与抗肿瘤免疫也有重要的关系。因此，测定吞噬细胞的吞噬和消化功能，可在一定程度上反映机体的免疫状态，也可作为判断疗效的指标之一。 【实验动物与试剂】 1、实验动物：小白鼠 2、实验试剂：无菌生理盐水、5%无菌可溶性淀粉溶液、瑞氏染液、白色葡萄球菌培养物 3、实验器材：无菌注射器、吸管、载玻片、解剖器械、显微镜等。 【方法】 1、试验前3天，小鼠腹腔注射5%无菌可溶性淀粉溶液1ml。 2、试验当天，小鼠腹腔注射1mL白色葡萄球菌悬液。 3、注射后30min，断颈处死小鼠，仰位固定小鼠，正中剪开腹部皮肤，吸出腹腔液制定涂片，自然干燥后瑞氏染液染色。 4、瑞氏染液染色：在涂片上滴3~5滴瑞氏甲液，30~60sec后,滴加瑞氏乙液,并用洗耳球吹数下,将乙液与甲液充分混均,5~10min后,水洗,干燥,镜检. 5、镜检：低倍对光，用油镜下观察巨噬细胞吞噬细菌的情况。 【结果观察】 1、吞噬细胞吞噬现象镜下观：如染色结果正确，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色，而白细胞浆则为淡红色。 2、吞噬细胞吞噬功能的测定 （1）吞噬百分率：观察100个吞噬细胞，计数被吞噬百分率以表示吞噬
淋巴细胞亚群与临床 人体外周血的淋巴细胞是机体重要的免疫细胞，主要包括三种：T 淋巴细胞（TC）、B淋巴细胞（BC）、自然杀伤细胞（NK）。TC主要表达 CD3+，约占正常人外周血淋巴细胞总数的60--80%；BC主要表达CD19+， 约占正常人外周血淋巴细胞总数的15--20%；自然杀伤细胞（NK）主 要表达CD3--CD16+CD56+，约占正常人外周血淋巴细胞总数的 10--20%。 通过T淋巴细胞亚群的监测可以了解在不同疾病状态下患者的细 胞免疫功能状态，已经广泛在肿瘤、自体免疫、感染性疾病中,辅助临 床诊断、帮助了解发病机理、判断预后和指导临床治疗。T淋巴细胞 亚群检测的内容为总T细胞（CD3+）及其亚群（辅助性T淋巴细胞，CD4+；抑制性或细胞毒T淋巴细胞，CD8+）的数量和比例。 在某些自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、自体免疫性溶血性 贫血患者中CD3+/CD4+细胞的比值升高。在病毒感染（上感，AIDS等）、恶性肿瘤、再生障碍性贫血等疾病中，患者CD4+/CD8+比值降低，三种淋巴细胞的数量和比例均可能有相应的改变。T细胞亚群已被用来 监测器官移植病人的免疫状态，协助发现和使其避免受到GVHD的攻击。由于在感染性、肿瘤 性疾病、自体免疫性疾病和器官移植中患者的免疫功能和预后之间有着密切的关系，对其给予 密切注意并及时采取适当措施、调节患者的免疫状态以改善预后就成为现代医学的一个 重要内容。 常见疾病T淋巴细胞的改变（参考） 疾病T细胞亚群 精品doc
CD4+/CD8+CD4+（辅助T）CD8+（抑制T） 类风关↑（活动期）↑↑ SLE--或↓（活动期）↑↓↑ 胰岛素依赖性糖尿病↑ 多发性硬化症↓↓↑ 乙型肝炎↑ 自身免疫溶血性贫血↑↑ 上呼吸道感染↓↓↓ 结核↓ AIDS↓↓↑ CD4+/CD8+CD3+（总T）CD4+（辅助T）CD8+（抑制T） 恶性肿瘤（白血病）↓↓↓↓↑↑↑↑ 再障及粒细胞减少症↓↑↓ CMV感染↓↑↓ 血小板减少↓↓↓↓↓↓ CD19为全部B细胞共有的表面标志，增高见于B细胞系统的恶性肿瘤，减低见于体液免疫缺陷病。BC主要介导抗感染等体液免疫，故 不作为肿瘤患者的检测指标。 NK细胞主要表达CD3--CD16+CD56+，约占淋巴细胞的10--15%左右。 NK细胞能非特异性杀伤肿瘤细胞，是机体第一道肿瘤防线，其杀伤活 性可被IL-2等细胞因子诱导而显著增强。 通常在肿瘤患者外周血中，CD3+、CD4+、NK细胞减少，而CD8+ 细胞增加，CD4+/CD8+的比值降低，。说明肿瘤病人的细胞免疫功能处精品doc