DB15/T 1919—2020 马铃薯黑痣病室内抗性鉴定技术规程
1 范围
本标准规定了室内条件下马铃薯抗黑痣病鉴定材料的选择与鉴定方法。
本标准适用于马铃薯品种（系）在室内条件下对黑痣病抗性水平的鉴定。
2 鉴定材料
2.1 马铃薯
选用抗病品种底西芮、感病品种大西洋、被鉴定品种（材料）的块茎和组培苗。
2.2 病原菌
选用从内蒙古自治区马铃薯主要种植区发病植株上分离得到的黑痣病致病菌株。
2.3 培养基
PDA培养基、改良的Richard培养基、MS培养基。
3 鉴定方法
3.1 薯片接菌法
3.1.1 PDA培养基制备
将马铃薯去皮切成2 cm2~ 3 cm2的小块，取200 g加入1000 mL水，在锅内煮20 min ~ 30 min，至马铃薯软而不烂时，用2层纱布过滤，滤液加入琼脂粉15 g ~ 18 g，加热搅拌至融化，再加葡萄糖20 g搅拌溶解，然后定容至1000 mL，分装到三角瓶内，121 ℃高压湿热灭菌20 min，冷却至室温备用。
3.1.2 病原菌活化
将保存的黑痣病病原菌取小块放置PDA平板中央，放25 ℃恒温培养箱中培养进行活化。
3.1.3 操作方法
——灭菌。将健康的马铃薯块茎用自来水洗净，再用0.5 %的KMnO4溶液进行灭菌20 min；
——切片。将灭菌马铃薯无菌操作切成厚约0.6 cm的薯片，放在装有2层湿润滤纸（加10 mL 无菌蒸馏水）的培养皿中；
——接种。将在PDA培养基上培养4 d的马铃薯黑痣病菌菌饼（直径0.5 cm）倒放在薯片中央，每个薯片接1个菌饼，每份材料处理20片；
——培养。接种后的马铃薯片置25 ℃恒温培养箱内黑暗培养。
DB15/T 1919—2020
3.1.4 调查和抗性评价
接种的马铃薯片培养48h，用十字交叉法测量病斑直径，计算病斑面积，根据病斑面积大小评价马铃薯材料的抗病性。
评价标准如下：
——病斑面积为0.00 免疫（I）；
——病斑面积为0.01 ~ 0.50 高抗（HR）；
——病斑面积为0.51 ~ 1.00 中抗（MR）；
——病斑面积为1.01 ~ 2.0 中感（MS）；
——病斑面积为大于2.0 高感。
3.2 组培苗接种法
3.2.1 改良的Richard培养基制备
取KNO3 10 g、KH2PO4 5 g、MgSO4·7HO2 2.5 g、Fe2(SO4)3 0.02 g、蔗糖50 g加蒸馏水1000 mL搅拌溶解，调pH 7.0，分装于250 mL三角瓶中，每瓶50 mL，121 ℃高压湿热灭菌20 min，冷却至室温备用。
3.2.2 毒素的制备
——病原菌培养。将活化的马铃薯黑痣病菌在PDA培养基上培养4 d；
——接种。用打孔器打取病原菌菌饼（直径0.5 cm），接种到盛有50 mL改良的Richard产毒培养基的250 mL三角瓶中，每瓶5个；
——培养。将接种后的三角瓶置25 ℃恒温培养箱内黑暗培养20 d，每日人工手动振荡1次；
——处理。培养结束后，将培养液于8000 r/min 离心15 min，用定性滤纸过滤，滤液按0.4 %的比例加入琼脂粉，都分装于18 cm × 1.8 cm的试管中，每试管12 mL，于115 ℃灭菌
20 min，即为病原菌毒素。
3.2.3 操作方法
——接种。选取在MS培养基上培养12 cm左右长势一致的不同品种马铃薯脱毒组培苗，将组培苗无菌操作移入装有毒素的试管中，每试管1株，共20株，重复3次；
——培养。将接种的不同材料组培苗于4000 lx、25 ℃光照培养箱中培养，光照16 h/d，培养
8 d。
3.2.4 病情调查和抗性评价
3.2.
4.1 将培养8 d的马铃薯组培苗按下列病情分级标准进行病情调查，计算病情指数和相对抗病指数，根据相对抗病指数进抗性行评价。
3.2.
4.2 脱毒苗病情分级标准：
——0 茎部没有溢缩坏死，叶片没有萎蔫；
——1 茎部溢缩坏死长度占地下茎长1 % ~ 5 %，个别叶片变黄；
——2 茎部溢缩坏死长度占地下茎长6 % ~ 25 %，1/4叶片萎蔫枯死；
——3 茎部溢缩坏死长度占地下茎长26 % ~ 50 %，1/4 ~ 2/4叶片萎蔫枯死；
——4 茎部溢缩坏死长度占地下茎长51 % ~ 75 %，2/4 ~ 3/4叶片萎蔫枯死；
——5 茎部溢缩坏死长度占地下茎长76 % ~ 100 %，3/4以上叶片萎蔫枯死。
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DB15/T 1919—2020 3.2.4.3 病情指数和相对病情指数计算公式如下：
病情指数DI=［Σ（各级病株数×该病级代表数值）/（调查总株数×最高级代表数值）］×100 (1)
相对抗病指数=1-所测品种病情指数/发病最重品种病情指数 (2)
3.2.
4.4 相对抗病指数评价标准：
——1 免疫（I）；
——0.99 ~ 0.80 高抗（HR）；
——0.79 ~ 0.50 中抗（MR）；
——0.49 ~ 0.20 中感（MS）；
——0.19 ~ 0.00 高感（HS）。
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