亮氨酸氨基肽酶测定试剂盒(L-亮氨酰-p-硝基苯胺底物法)
适用范围：用于体外定量测定人血清中亮氨酸氨基肽酶的活性。
1.1 规格
试剂盒是由试剂组成的液体单试剂，质控品为冻干粉，规格及装量见表1。
表1 规格及装
量
1.2 主要组成成分
试剂主要组分：
质控品主要组分：
2.1 净含量
应不低于试剂瓶标示装量。
2.2 外观
试剂：无色或淡黄色透明溶液。质控品为浅黄色至黄色冻干粉，复溶后为浅黄色至黄色液体。外包装完好、无破损，标签完好、字迹清晰。
2.3 试剂空白
2.3.1 试剂空白吸光度
在405nm处测定试剂空白吸光度，应≤1.7。
2.3.2 试剂空白吸光度变化率
试剂空白吸光度变化率△A/min≤0.5。
2.4 分析灵敏度
测试50U/L的被测物时，吸光度变化率（ΔA/min）应不低于0.0015。
2.5 准确度
参照EP9-A2的方法，用比对试剂盒同时测试40例线性范围内不同浓度的血清样本，其相关系数（r）不小于0.990；每个浓度点在[1，30）U/L区间内绝对偏差不超过±3.6U/L；[30，250]U/L区间内相对偏差不超过±12%。
2.6 重复性
批内变异系数（CV）应不超过10％。
2.7 线性
2.7.1在[1，250]U/L区间内，线性相关系数r应不低于0.990；
2.7.2 [1，30）U/L区间内绝对偏差不超过±
3.6U/L；[30，250]U/L区间内相对偏差不超过±12%。
2.8 批间差
对同一份样品进行重复测定，相对极差不大于12％。
2.9质控品批内瓶间差
变异系数（CV）≤10%。
2.10 质控品赋值有效性
质控品测值应在靶值范围内。
2.11 稳定性
2.11.1效期稳定性
原包装试剂盒在2℃～8℃条件下贮存达到12个月后的试剂进行检测，应符合本标准2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.10之规定。
2.11.2质控品复溶稳定性
质控品复溶后在2℃～8℃条件下密闭避光保存，稳定期为7天，稳定期满后1天内，性能应符合2.10的要求。
腺苷脱氨酶测定试剂盒（过氧化物酶法） 适用范围：本试剂用于体外定量测定人血清中腺苷脱氨酶的活性。 1.1 规格 试剂盒是由试剂1和试剂2组成的液体双试剂，校准品和质控品均为冻干粉。规格及装量见表1。 表1 规格及装 量
1.2 主要组成成分试剂1主要组分: 试剂2主要组分： 校准品主要组分： 质控品主要组分：
2.1 净含量 应不低于试剂瓶标示装量。 2.2 外观 试剂1：无色或淡黄色透明溶液；试剂2：无色或淡黄色透明溶液；校准品：白色至浅黄色冻干粉，复溶后为无色至浅黄色透明液体；质控品：白色至浅黄色冻干粉，复溶后为无色至浅黄色透明液体。外包装完好、无破损，标签完好、字迹清晰。 2.3 试剂空白 2.3.1 试剂空白吸光度 在546nm（540nm-550nm）处测定试剂空白吸光度，应≤0.3； 2.3.2 试剂空白吸光度变化率 试剂空白吸光度变化率△A/min≤0.1。 2.4 分析灵敏度 测试100U/L的被测物时，吸光度变化率（ΔA/min）应不低于0.0065 。 2.5 准确度 使用国际参考品（BCR647）对试剂（盒）进行测试，相对偏差应不大于±15%。 2.6 重复性 变异系数（CV）应不超过10％。 2.7 线性 2.7.1在(0,150]U/L区间内，线性回归的相关系数r应不低于0.990；
2.7.2（0,40）U/L区间内绝对偏差不超过±6U/L；[40,150]U/L区间内相对偏差不超过±15%。 2.8 批间差 对同一份样品进行重复测定，相对极差＜15％。 2.9校准品批内瓶间差 变异系数（CV）应≤10%。 2.10 质控品批内瓶间差 变异系数（CV）应≤10%。 2.11溯源性 根据GB/T 21415-2008的规定，本试剂盒内校准品溯源至国际参考物质BCR647。 2.12质控品赋值有效性 质控品测值应在靶值范围内。 2.13 稳定性 2.1 3.1效期稳定性 原包装的试剂盒在2℃～8℃条件下贮存达到18个月后的试剂进行检测，应符合2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.12之规定。 2.1 3.2复溶稳定性 a)校准品复溶后在2℃～8℃密闭避光保存，稳定期为7天，稳定期满后1天内，性能应符合2.5之规定。 b)质控品复溶后在2℃～8℃密闭避光保存，稳定期为7天，稳定期满后1天内，性能应符合2.12之规定。
土壤亮氨酸氨基肽酶（S-LAP）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC4025 规格：100T/48S 产品内容： 试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存；临用前加入3mL丙酮溶解。 产品说明： S-LAP是一类能水解肽链N-末端为亮氨酸的酶，由土壤微生物分泌。S-LAP活性变化与机体某些病理状态密切相关。 S-LAP分解L-亮氨酸对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在405nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算S-LAP活性。 自备实验用品及仪器： 天平、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、甲苯、丙酮、30目筛（或更小）。操作步骤： 一、样本处理 土样自然风干，过30-50目筛。 二、测定步骤 1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，波长调至405nm，蒸馏水调零。 2、加样表： 测定管对照管 土样（g）0.030.03 甲苯（μL）1515 震荡混匀，室温静置15min。 试剂一（μL）255255 试剂二（μL）30-
30℃水浴反应1h后立刻煮沸5min。流水冷却至室温。 试剂二（μL）-30 14000g常温离心10min，取200μL上清于405nm处测定吸光值，分别记为A测定管、A对照管，计算ΔA=A测定管-A对照顾管。 三、酶活计算公式 （1）按微量比色皿计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟生成1nmol对硝基苯胺为一个酶活力单位。 S-LAP活性（U/g）=△A÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T=0.507×△A÷W。 ε：对硝基苯胺摩尔消光系数：9.87×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，300μL=3×10-4L；W：土样质量，g；T：反应时间，60min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。 （2）按96孔板计算： 酶活性定义：每克土壤每分钟氧化1nmol对硝基苯胺为一个酶活力单位。 S-LAP活性（U/g）=△A÷(ε×d)×109×V反总÷W÷T=0.844×△A÷W。 ε：对硝基苯胺摩尔消光系数：9.87×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V反总：反应总体积，300μL=3×10-4L；W：土样质量，g；T：反应时间，60min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
M em ory T Lym phocyte Responses A fte Hantavirus In fection [J ].Exp Med ,2002,196(5):579-588. [8]王平忠,白雪帆,张颖,等.HFRS 患者汉滩病毒核蛋白特异性T 细胞克隆及其靶细胞的建立[J ].中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(8):600-607. [9]M idori T aruishi ,K um iko Y oshimatsu ,K oichi Araki ,et al.Analysis of the immune response of Hantaan virus nucleocapsid protein -specific CD8+T cells in m ice[J ].Virology ,2007,365:292-301. [10]薛小平,徐志凯,马文煜,等.汉坦病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析[J ].中国病毒学,2000,15(3):220-224. [11]王斌,赵百慧,钱冬萌,等.汉滩病毒截短核蛋白在大肠杆菌中的 表达及其初步应用[J ].中国生物工程杂志,2004,24(1):45-48. [12]Y ue Chen ,Bruce A.M cClane ,Derek J.Fisher ,et al.C onstruction of an Alpha T oxin G ene K nockout Mutant of Clostridium perfringens T ype A by Use of a M obile G roup ⅡIntron [J ].Appl Eviron Microbiol ,2005,71(11):7542-7547. [13]Y ue Chen ,Lori Carus o ,Bruce M cClane ,et al.Disruption of a toxin gene by introduction of a foreign gene into the chrom os ome of Clostridium perfringens using targetron -induced mutagenesis[J ].P lasmid ,2007,58(2):182-189.[14]Y ue Chen ,Ruth Helmus ,Bruce M cClane ,et https://www.doczj.com/doc/c318330741.html,e of a Clostridium perfringens vector to express high levels of SIV p27protein for the development of an oral SIV vaccine[J ].Virology ,2004,329:226-233. 黑曲霉W3350脯氨酰内肽酶在大肠杆菌中的表达 周丽娜 1.2 ,张鹭2 ,路福平3 ,王晓娟1,杨剑芳 1 (1.天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津300457; 2.齐齐哈尔大学生命科学与工程学院,黑龙江齐齐哈尔161006) 摘要:目的:构建pET -PEP 重组原核表达载体,并对表达产物进行鉴定。方法:采用RT -PCR 技术从黑曲霉(Aspergillus niger )W3350中扩增出脯氨酰内肽酶(PEP )的基因,插入表达载体pET -22b (+),经Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切和DNA 序列测定验 证,将正确的重组质粒转入大肠杆茵BL21(DE3)中,IPTG (终浓度1mm ol ΠL )诱导获得表达。结果:表达产物进行超声破碎,经S DS -PAGE 电泳检测,PEP 分子质量大约为57kDa ,与理论值相符,通过酶活方法测定脯氨酰内肽酶酶活为0.656U Πml ,约是出发菌株的5倍。结论:首次成功构建表达载体pET -PEP 并在原核细胞中表达,为进一步研究PEP 的生物学功能奠定了基础。 关键词:RT -PCR ;黑曲霉;脯氨酰内肽酶;基因表达 中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1004-311X (2008)02-0015-03 Expression of PEP of Aspergillus niger W 3350in E .coli ZH OU Li -na 1.2 ,ZH ANGLu 2 ,LU Fu -ping 3 ,W ANG X iao -juan 1,Y ANGJian -fang 1 (1.T ianjin K ey Lab of Industrial M icrobiology ,C ollege of Biotechnology ,T ianjin University of Science and T echnology ,T ianjin 300457,China ; 2.Life Science and Engineering C ollege ,Qiqihar University ,Qiqihar 161006,China ) Abstract :Objective :T o construct the prokary otic expression vector of the pET -PEP ,and identify the expressed production.Method :The PEP gene were am plified from Aspergillus niger W3350cells by RT -PCR ,and inserted into the prokary otic expression vector pET -22b (+)and veri 2fied by Eco R Ⅰand Hind Ⅲdigestion and DNA sequencing.The recombinant plasmid was expressed in E .coli BL21(DE3)by inducing of IPTG (1mm ol ΠL )and identified by S DS -PAGE.R esult :A fter s onication ,S DS -PAGE analysis indicated that the relative m olecular mass (M )of the protein was about 57kDa ,and it was equivalent to the expected value.the activity of PEP was 0.656U Πml by determination ,and it is about as five times as the original strain.Conclusion :T o construct the recombinant expression vector and to express the protein in E .coli success fully and to further the study of the biological function of PEP. K ey w ords :RT -PCR ;Aspergillus niger ;PEP ;gene expression 收稿日期:2007-11-29;修回日期:2008-01-08 作者简介:周丽娜(1982-),女,硕士生,3通讯作者:路福平,男,教授,博士生导师,研究方向:生物药物催化工程、药物设计与合成,E -mail :lfp @https://www.doczj.com/doc/c318330741.html, 。 脯氨酰内肽酶(Proline specific endoprotease 简称PEP )[EC3.4.21.26]能特异性水解小分子量多肽中脯氨酸羧基端肽键,多应用于食品工业、医药领域、多肽工业等领域;同时作为一种分子生物学的工具酶,可用于蛋白质序列测定、肽谱分析、特 异位点的酶切、肽段的修饰和加工等[1] 。 PEP 在生物体内含量甚微,直接从组织中分离提取繁琐且低效[2],且其产量和性质也不易控制。因此,构建和利用基因工程菌作为大规模生产该酶制剂的宿主,成为研究该酶的一种新途径,具有重要的研究价值和潜在的医用价值。国外Y o 2shim oto T 等已经从脑膜炎脓毒黄杆菌、嗜水气单胞菌、耐热古 细菌、人淋巴细胞和猪脑cDNA 库中克隆了PEP 基因[3] ,国内仅李民等克隆和表达了点状产气单胞菌来源的脯氨酰内肽酶基因[4]。黑曲霉是美国食品药品管理机构认定的生物安全菌,从黑曲霉中提取脯氨酸蛋白内肽酶应用于食品药品行业安全可靠,然而,迄今为止国内还没有有关黑曲霉脯氨酸蛋白内肽酶的报道。 本文通过RT -PCR 从黑曲霉(A .niger )W3350中扩增出PEP 的基因序列,利用表达载体pET -22b (+)构建pET -PEP 重组质粒,并在原核表达菌株BL21中进行表达,为进一步研究PEP 的生理功能和生物学意义奠定基础。 l 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料: 菌株E .coli DH5α、E .coli BL2l 和表达载体质粒pET -22b (+)均由本实验室保存。1.1.2 试剂 DNA 片段快速纯化回收试剂盒(博大泰克生物基因技术有限公司);RNase 酶、限制性内切酶(Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ)、T 4DNA 连接酶、T aq DNA 聚合酶(T aK aRa 公司);DNA Marker (fer 2mentas 公司);超绝UNI Q -10柱RNA 抽提试剂盒、RNA 反转录试剂盒(上海生物工程有限公司),其他试剂均为分析纯。1.1.3 仪器:PT C -200型PCR 基因扩增仪;全自动凝胶成像仪;基因脉冲导入仪M icroPulser ;G ene S pc V 核酸测定仪;DYY-III -6B 型稳压稳流电泳仪;DY C2-24b 型电泳槽;P 型移样器;PHS -2C 型pH 计;HG 75-3电热恒温培养箱;HYG -Ⅱ型回转式恒温调速摇床;G L20A 型冷冻离心机;T C L -12台式高速冷冻离心机。1.1.4 培养基和培养条件:大肠杆菌培养基为LB 培养基,培养温度37℃,摇床转速200r Πmin ,氨苄青霉素浓度为0.2%。1.1.5 PCR 引物设计:根据G eneBank 中已发表脯氨酰内肽酶的基因序列,设计PCR 上游引物和下游引物,由T aK aRa 公司合成。 上游引物:5’-CCGG AATT CGG CT CG CCCCCG T CTTG T -3’(Eco R Ⅰ酶切位点); 下游引物:5’-CCC AAG CTTT C AAG C AT AAT ACT CCT CC ACCC -3’(Hind Ⅲ酶切位点)。1.2 方法1.2.1 PEP 基因片段的获得
腺苷脱氨酶ADA测定 1检验目的 指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。 2原理 ADA 腺苷+H2O 肌苷+NH3 PNP 肌苷+Pi 次黄嘌呤+1-磷酸核糖 XOD 次黄嘌呤+2 H2O+2O2尿酸+2 H2O2 POD H2O2 +4-AAP+EHSPT 4H2O+苯醌类 3标本要求 3.1使用新鲜血清,不使用血浆. 3.2在采集血液后2h分离血清.
3.38h内不能及时测定血清可存放于2-80C冰箱保存,3天后测定的血清置-150C―-200C 冰冻保存,但冰冻血清只能复融一次. 3.4严重溶血或脂血的标本不能作测定. 4试剂 4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司ADA试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1试剂组成 试剂1 60 ml,试剂主要成分如下: Tris—HCL缓冲液（PH8.0）50.0mmol/L XO 0.2u/ml 4-AAP 2.0mmol/L POD 0.6u/ml PNP 0.1u/ml NaN3 0.2g/L 试剂2 60 ml,试剂主要成分如下: Tris—HCL缓冲液（PH4.0） 50.0mmol/L EHSPT 2.0 mmol/L 腺苷 10.0mmol/L
4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。 4.1.3 试剂稳定性与贮存：2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂（盒）自生产之日起有效期为12个月。试剂1 与试剂2 启用后，在2～10℃避光的条件下可稳定20天。 4.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。 4.2 校准品： 4.2.1采用以检测用水为空白的方式进行校准。 4.2.2校准及校准频次的要求：正常情况下，应每周至少对测定进行一次校准。当发生下列情况时（如：使用的试剂批号发生改变时、使用的仪器进行维修、保养或关键部件进行更换后、质控品的测定结果发生漂移或超出规定的范围等），应重新对测定进行校准后再对患者的样本进行检测。 5 仪器 AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪
脯氨酸肽酶缺乏症 脯氨酸肽酶缺乏症（prolidase deficiency）是一种罕见的因先天性胶原代谢异常所致的疾病。本病系1968年首先由Goodman等报道，他们描述了1例47岁的男病人，临床上具有与山黧豆中毒相似的症状，并发现尿中有大量的亚氨基二肽排泄，认为此病例可能是一种较为特殊的疾病，并据此推测是由于组织中缺乏脯氨酸肽酶所致。1974年Powell等在1名7岁男孩中首先证实本病确实是由于脯氨酸肽酶缺乏所引起。随后在北美、西欧、中东和日本等地相继有类似病例报告，并已认识本病为一种独立的遗传性疾病。至今文献中记载的病例已达20余例（由于本病需作特殊的生化检验才能确诊，又有许多病例未被认识，故实际发病数应较此为多）。本病的皮肤症状十分多见且富于特征性，因而认识和了解其皮肤表现，将为患者的诊断提供可靠的证据。 临床表现 本病有多系统受累，可累及皮肤、中枢神经系统、眼、耳鼻咽、齿、骨骼和关节等组织器官。 一、皮肤表现：皮肤是本病的靶器官，其症状绝大多数出现在12岁以前，尤以婴幼儿时期发病者多见，最小者为出生后3个月时发病。大多数患者（90%以上）均有严重而有意义的皮损。其突出的皮肤科特征是诊断本病的最重要的依据。 （一）慢性复发性溃疡：在本病所有的皮肤变化中，顽固性溃疡是多见和最具有特征性的，也是本病最主要的表现。出现在约2/3的病人中。溃疡的特征主要为累及双下肢尤在小腿下部和足部（个别病人也可发生在上肢）、深在、慢性而难治，溃疡表面有肉芽组织和脓性分泌物，不痛也无压痛，往往伴有细菌感染，经数月后溃疡可能缓慢地痊愈，留下萎缩或硬化性瘢痕并有色素沉着或减退。挛缩性瘢痕可致足部畸形或可形成马蹄足。患者的皮肤往往变得脆弱易破故溃疡易于复发。其四周的皮肤可以增厚，伴局部多毛，但无静脉曲张，血管造影无血管闭塞。 由于本病皮肤溃疡的发生率高，故凡发生在婴幼儿和儿童时期的小腿慢性复发性溃疡，均应想到本病的可能。 （二）对光敏感和毛细血管扩张：为本病的另一皮肤体征。毛细血管扩张发生率约40%，多见于面、颊、上肢伸侧、肩部等暴露部位，并可合并皮肤瘙痒。 （三）紫癜性损害：可表现为多发性瘀斑和细小的紫癜性皮疹，但无引起出血的血液学证据。其发病与遗传性毛细血管脆弱有关。 （四）25%患者有青年白发，个别患者可发生早秃。 （五）25%病人皮肤有鳞屑性红斑丘疹损害。 （六）面部、四肢伸侧和臀部可出现小的浅表性棕色萎缩性瘢痕样损害，常伴有点状色素沉着。 （七）皮肤增厚的淋巴水肿：一般仅限局干皮肤溃疡周围，其发生可能与淋巴管进行性损伤有关，
★肺炎 pneumonia ★肺血栓栓塞症 pulmonary thromboembolism ★PTE ★★严重急性呼吸综合征 severe acute respiratory symptom ★SARS ★★慢性阻塞性肺疾病 chronic obstructive pulmonary diseases ★★COPD ★长期家庭氧疗 long-term domiciliary oxygen therapy ★LTOT ★支气管哮喘 bronchial asthma BA 寂静胸沉默胸 silent chest ★支气管激发试验 bronchial provocation test BPT ★支气管舒张试验bronchodilatation test BDT 特发性间质性肺炎 idiopathic interstitial pneumonia IIP ★肺出血-肾炎综合征Goodpasture syndrome 胸腔积液 pleural effussion ★原发性支气管肺癌 primary bronchogenic carcinoma 肺癌 lung cancer ★类癌综合征 carcinoid syndrome ★肺上沟癌 pancoast cancer ★睡眠呼吸暂停综合征 sleep apnea syndrome SAS ★★呼吸衰竭respiratory failure RF 通气/血流比例失调 ventilation-perfusion mismatch ★★肺性脑病 pulmonary encephalopathy 动脉血气分析 arterial blood gas analysis 科赫现象 Koch phenomenon 霍纳综合征 Horner syndrome 胸膜反应 pleura reaction 比奥呼吸 Biot's respiration 无创正压通气 non-invasive positive pressure ventilator NIPPV 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌methicillin resistant staphylococcus aureus MRSA 肺脓肿 lung abscess 支气管扩张 bronchiectasis 肺结核 pulmonary tuberculosis ★TB ★全程督导短程化学治疗 directly observed treatment short-course DOTS 纯蛋白衍化物 purified protein derivative PPD 异烟肼 Isoniazid ★INH H 利福平 Rifampicin ★RFR R 吡嗪酰胺 Pyrazinamide ★PZA Z
腺苷脱氨酶（ADA ）测定试剂盒 （酶比色法） 使用说明书 【产品用途】 本试剂用于测定血清、胸腹水、脑脊液中的腺苷脱氨酶活性。 【临床意义】 肝脏疾病时，本酶活性往往升高，有助于黄疸的鉴别诊断。在阻塞性黄疸时，此酶活性升高很少，而在肝实质性损伤时，此酶和转氨酶往往同时升高，特别在慢性活动性肝炎和肝硬变时，转氨酶阳性率较低，增高幅度也不明显，而ADA 活性的阳性率可达90%左右，增高程度也较明显。同时ADA 检测对白血病、伤寒、出血热也有辅助诊断作用。 测定胸腹水及脑脊液标本中的ADA 活性，有鉴别诊断价值。结核性胸腹水中ADA 活力显著高于癌症及炎症胸腹水中ADA 活力，对早期诊断结核性胸、腹膜炎有较高的敏感性和一定的特异性。此外，脑脊液ADA 检测可作为中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断的重要指标，结核性脑膜炎ADA 活性升高，病毒性脑膜炎不升高。 【适用范围】 液体双试剂，即开即用，自动化分析仪用。 【产品规格】 R 1 50ml ×2 R 2 50ml ×1 【试剂成份】 R 1 Tris-HCl pH8.0 50mM 4-AA 2mM PNP 0.1kU/mL XOD 0.2kU/mL POD 0.6kU/mL 稳定剂 R 2 Tris-HCl ph4.0 50mM 腺苷 10mM EHSPT 2mM 【检测原理】 腺苷在腺苷脱氨酶作用下脱氨基形成次黄苷，次黄苷在PNP 作用下生成次黄嘌呤，次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶（XOD ）作用下转化为尿酸和过氧化氢（H 2O 2），H 2O 2与EHSPT 和4-氨基安替比林（4-AA ）反应生成醌色物，显色强度与ADA 活性成正比。 腺苷?? ?→?ADA 次黄苷 + NH 3 次黄苷 + Pi ??→?PNP 次黄嘌呤 + 核酸-1-磷酸 次黄嘌呤 + 2H 2O + 2O 2???→?XOD 尿酸+ 2H 2O 2 2H 2O 2 + 4-AA + EHSPT ??→?POD 醌亚氨染料+ H 20 【样本采集】 新鲜非溶血血清或血浆，ADA 在4℃时可稳定1周。 【测定方法】 1.试剂1、2在使用前恢复到37℃。 2.180μl R 1与5μl 血清（浆）样品混合，在37℃孵育3min-5min 。 3.加入90μl R 2孵育3min ，在540nm 或546nm 处测2分钟，计算每分钟平均光度变化△A/min 。 【参考范围】 血 清：4~24U/L 胸腹水：0~35 U/L 脑脊液：0~6 U/L 各实验室应建立自己的参考范围; 【产品性能】 1.试剂空白吸光度：A 340nm(1cm) ≥0.800 2.本试剂线性范围：0-150 U/L 3.精密度：批内CV ≤5% 批间相对极差CV ≤8% 4.准确度：相对偏差≤±10% 【试剂保存】 R 1、R 2为液体试剂，直接使用。2-8℃避光稳定1年。 【注意事项】 1.本方法特异测定ADA ，其它核苷与本方法不发生反应。 2.血清胆红素达20mg/dL ，血红蛋白100mg/dL ，甘油750mg/dL ，抗坏血酸4mg/dL 对实验无干扰。 【单位意义】 在37℃条件下，每分钟用于产生1 umol 次黄苷的量定义为一个单位的ADA 。 【生产许可证】 【注册标准号】 【注册证号】
亮氨酸氨基肽酶（LAP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号：BC4140 规格：50T/48S 产品内容： 试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存；临用前加入5mL丙酮溶解。 产品说明： LAP是一种膜结合酶，广泛存在于肝、胆、胰等组织中，参与组织蛋白和某些肽类的降解更新。各类肝病患者因肝细胞损伤，血清LAP的活性均有不同程度的升高，LAP可以作为各类肝病的一项初步检测指标，特别是肝癌鉴别诊断的指标。 LAP分解L-亮氨酸对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在405nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算LAP活性。 自备实验用品及仪器： 天平、低温离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、丙酮、匀浆器/研钵。 操作步骤： 一、样本处理： 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 细胞：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 液体：直接检测。 二、测定操作：
1、分光光度计预热30min以上，波长调至405nm，蒸馏水调零。 2、加样表：在1mL玻璃比色皿中分别加入下列试剂 试剂名称（μL）测定管空白管 试剂一50 样品上清50 试剂一850850 试剂二100100在1mL玻璃比色皿中分别加入上述试剂，充分混匀后于405nm处测定30s时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴3min，拿出迅速擦干测定210s时的吸光值A2，计算△A测定管=A2测定-A1测定，△A空白管=A2空白-A1空白，△A=△A测定管-△A空白管。空白管只需做一次。 三、酶活计算公式 1、液体LAP活力的计算： 单位的定义：每mL液体每分钟生成1nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（U/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=675.4×ΔA 2、组织、细菌或细胞中LAP活力的计算: （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（U/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T=675.4×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每g组织每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（U/g鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=675.4×ΔA÷W （3）按细胞密度计算： 单位的定义：每1万个细胞每分钟生成1nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。 LAP（U/104cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.35×ΔA V反总：反应体系总体积，1×10-3L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.87×103L/mol/cm；109：单位换算系数，1mol=109nmol；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入试剂一体积，1mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，需单独测定；W：样本质量，g；
脊髓损伤后大鼠甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶的达及甲基强的松龙干 预后的变化 目的：研究大剂量甲基强的松龙对脊髓损伤后甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶（glycylproline dipeptidyl aminopeptidase，GPDA）基因表达变化的影响。方法：Sprague-Dawley大鼠36只。将所有大鼠随机分为三组，假手术组、脊髓损伤未使用药物干预组（创伤组）、脊髓损伤+甲强龙干预组（甲强龙组）。在大鼠脊髓损伤后24 h将损伤的脊髓组织切取，进行逆转录PCR反应并检测GDPA的表达。结果：假手术组GDPA的mRNA的表达的相对丰度为1.5403±0.1604；脊髓损伤24 h后创伤组GDPA的表达的相对丰度为0.5994±0.3414，与假手术组相比差异有非常显著统计学意义（P＜0.01）；GDPA在脊髓损伤后使用甲强龙干预组中的表达相对丰度为1.8432±0.1294，与创伤组比较差异有非常显著统计学意义（P＜0.01）。结论：大剂量甲基强的松龙的早期使用能促进脊髓损伤后甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表达恢复，发挥细胞保护作用。 脊髓損伤后，神经细胞增生肥大，胞浆呈嗜酸性，突起变粗，分支增多。这些改变可起到减轻损伤及填补组织损伤而形成的空洞等作用，为神经再生创造条件；但聚集的星形胶质细胞所形成的胶质性瘢痕及其所分泌和表达的抑制性因子形成机械及化学屏障对上下行神经元轴突的再生有明显的阻碍作用[1]。N2末端为甘氨酰2脯氨酰的肽键能被GDPA特异地水解，而该肽键正是构成胶质的基本结构[2]，因此，推测GPDA在缓解星形胶质细胞所构成的机械和化学屏障中起到作用，从而改善脊髓继发性损伤的进一步发展。本文对GDPA基因在多种情况下表达的变化进行研究，并探讨脊髓损伤早期，GDPA对继发性脊髓损伤的影响，现报告如下。 1 材料与方法 1.1 动物及分组Sprague-Dawley大鼠（中科院上海实验动物中心提供，10周龄）36只，体重180～240g。根据随机表分为三组。假手术组、脊髓损伤未使用药物干预组（创伤组）、脊髓损伤+甲强龙干预组（甲强龙组）。每组12只。在大鼠脊髓损伤后24 h将损伤的脊髓组织切取，进行逆转录PCR反应。检测GDPA的表达。 1.2 手术方法腹部消毒后腹腔内注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉，腰背部备皮消毒，充分暴露T8～9脊髓腰膨大。采用改良的Allen打击法（5 g×5 cm）制作脊髓损伤模型，甲强龙组大鼠静脉注射甲基强的松龙（30 mg/kg），假手术组未做任何处理关闭切口，创伤组大鼠静脉内注射等量的0.9%氯化钠溶液。24 h 后切除脊髓损伤部位上下1 cm的脊髓组织切取，进行RT-PCR反应。1.3 逆转录PCR反应 1.3.1 脊髓神经细胞总的RNA使用Trizol液提取1 ml Trizol液中加入1 g组织，反复吹打数次。混合均匀后加入0.2 ml氯仿，并予以离心（12 500 r/min，10 min）。吸取上部清液，加入0.5 ml异丙醇，离心（12 500 r/min，10 min）。 沉淀物加入30 μl DEPC溶化。 1.3.2 RNA定量和鉴定紫外分光光度计定量RNA，计算OD260、OD280及比值。取总RNA3 μg，电泳（琼脂糖凝胶）30 min，使用紫外光显示28 s及18 s 两条rRNA带，说明RNA提取完整性好。
一、血清腺苷脱氨酶（ADA）临床意义： 血清ADA活性增高见于： ①肝脏疾病：急性黄疸性肝炎，肝细胞出现损伤，在黄疸尚未出现前，可见增高，因ADA分子量较ALT小，当肝细胞轻度受损时ADA比ALT先释入血内，慢性肝炎活动期，慢性迁延性肝炎升高明显；肝硬化，原发性肝癌时，ADA活性也升高。 ②肿瘤引起的阻塞性黄疸，前列腺癌和膀胱癌，网状细胞瘤，淋巴瘤，溶血性贫血，风湿热，伤寒，痛风，重症地中海贫血，骨髓性白血病，结核，自身免疫性疾病，传染性单核细胞增多症和心力衰竭等均可引起此酶升高。 ③结核性胸腹水ADA活性显著增高，癌性胸腹水不增高，而血清中ADA活性二者无明显差别，故测定胸腹水中ADA活性有助于将两者鉴别。 ④结核性脑膜炎ADA显著增高，而病毒性脑膜炎则不增高，颅内肿瘤及中枢神经系统白血病稍增高，所以脑脊液ADA检测可以作为中枢神经系统疾病诊断和鉴别诊断的重要指标。 血清ADA活性降低见于：见于重度免疫缺陷症状。 二、血清单胺氧化酶（MAO）临床意义 血清中MAO和结缔组织中的MAO性质相似，能促进结缔组织的成熟，在胶原形成过程中，参与胶原成熟的最后阶段架桥形成，使胶原
和弹性硬蛋白结合。临床上测定血清MAO主要用于诊断肝硬变。肝硬变时，血清MAO活性常明显增高，阳性率可高达80%以上。 三、前白蛋白(PA) 临床意义 PA 降低： 1.诊断和监测营养不良：血清PA在无感染情况下，是儿童营养不良的灵敏指标，在蛋白质-热卡不足型营养不良（PCM）中随着营养状况的改善，多数病人血清PA水平显著升高而血清TP、Alb未见明显升高。 2.诊断肝病：肝脏疾病时血清PA变化较Alb早，有30％肝病患者血清Alb正常而PA降低。各型肝炎患者（病毒性肝炎、乙醇性肝炎和药物性肝炎）血清PA水平均有不同程度降低，以肝硬化和重症肝炎降低最著。对重型肝炎预后有较大的参考价值，PA明显上升，预后良好，ＰＡ持久降低者，预后险恶。 3.诊断急性时相反应，PA可作为癌症的筛选指标。 PA升高： 肾病综合征 >500 mg/L （此时ALB<30g/L），发作期 PA ↑ ALB ↓，恢复期 PA ↓ ALB ↑。 四、血清5’-核苷酸酶（5’-NT）临床意义 血清5’-NT活性升高主要见于肝胆胰系统疾病及某些恶性肿瘤，故有较特异的诊断价值。胆管结石或肿瘤所致之肝外胆管阻塞，以及氯
1 产品概述、处方及规格 1.1产品概述 本试剂通过测定人体液中同型半胱氨酸（Hcy）的浓度，主要是用于诊断心肌功能疾病。 产品测定原理： 同型半胱氨酸被转化为游离型后，通过与共价底物反应，循环放大，同时产生腺苷。腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH）转化为NAD+，样本中的同型半胱氨酸的浓度与NADH的变化成正比。 1.2产品处方 1.2.1 试剂为液体双试剂。校准品可使用朗道、罗氏等复合定标液。 1.2.2 产品所用主要原材料为S-腺苷甲硫氨酸（SAM）、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH）、三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP）、α- 酮戊二酸、Hcy甲基转移酶（HMTase）、谷氨酸脱氢酶（GLDH）S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶及腺苷脱氨酶（ADA）等。根据文献资料选用适当的缓冲液和稳定剂。 1.3 产品规格 产品包装规格制定要考虑不同适用机型和不同客户需求，根据以往经验，拟制定规格： R1-8 ml、R2-2 ml；R1-16 ml、R2-4ml；R1-20 ml、R2-5ml；R1-32 ml、R2-8ml；R1-40 ml、R2-10 ml； R1-2×40 ml、R2-2×10 ml；R1-4×40 ml、R2-4×10 ml；R1-2×40 ml、R2-20 ml；R1-4×40 ml、R2-2×20 ml；R1-8×40 ml、R2-8×10 ml；R1-80 ml、R2-20 ml；R1-2×80 ml、R2-2×20 ml； R1-4×80 ml、R2-4×20 ml；R1-8×80 ml、R2-8×20 ml ；R1-60 ml、R2-15 ml；R1-2×60 ml、R2-2×15 ml；R1-3×60 ml、R2-3×15ml；R1-8×50 ml、R2-2×50ml；R1-6×70 ml、R2-3×35ml； R1-5×40 ml、R2-50ml；R1-4×50 ml、R2-50ml；R1-3×60 ml、R2-45ml；R1-8×20 ml、R2-8×5 ml。 2 产品质量标准 根据《临床化学体外诊断试剂（盒）通用技术要求》，应对试剂外观、净含量、试剂空白、灵敏度、准确度、批内精密性、批间精密性、线性范围和稳定性等做出要求和规定。 应参考已上市产品并满足临床使用要求。 2.1外观 R1、R2均为无色至浅黄色透明液体。 2.2净含量 不少于标示值。 2.3试剂空白 2.3.1试剂空白吸光度变化率 以蒸馏水为检测样本时，每分钟吸光度变化值(△A/min)的绝对值应不大于0.100A。
慢性乙肝患者肝纤维化脯氨酸肽酶检测 发表时间：2011-07-12T11:31:02.890Z 来源：《中外健康文摘》2011年第16期供稿作者：秦忠琦[导读] 华医学会检验分会特别强调各临床实验室应根据ROC曲线确定诊断某类疾病适当的临界值[7]。 秦忠琦（辽宁省临床检验中心辽宁沈阳 110016）【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)16-0031-02 【关键词】慢性乙型肝炎脯氨酸肽酶肝纤维化 肝纤维化是肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程。减缓或阻止肝纤维化进程具有非常重要的意义。使用灵敏的、特异的指标早期预测肝纤维化是预防肝纤维化的关键。肝脏穿刺活检一直是重要依据[1]，但是由于它的创伤性和局限性，常规检查尚存在困难，因此非侵入性的间接诊断指标更受到临床医师的关注。有研究认为脯氨酸肽酶（prolidase,PLD）与乙型肝炎患者肝纤维化病变有一定的相关性。为了解乙型病毒性肝炎肝纤维化过程中PLD的变化情况，来确定PLD的检测在慢性乙肝患者肝纤维化中的作用，我们选择2008年1月-2010年4月沈阳市传染病医院住院的慢性乙型肝炎病人进行实验检测，现报告如下。 1 资料与方法 1.1资料选择2008年1月-2010年4月沈阳市传染病医院住院的慢性乙型肝炎病人191例，其中男124例，女67例，年龄12～66岁。按肝纤维化程度进行分期，S0-1期（无明显肝纤维化）101例，S2-4期（明显肝纤维化）90例。所有病例均符合以下条件：（1）有慢性乙型肝炎病史；（2）入院前无其他型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒感染；（3）排除肝癌和器官移植；（4）排除脂肪肝和酒精肝。以上患者的诊断均符合2000年西安会议肝炎诊断标准[2]，在性别、年龄、病情和病程方面均有可比性。 1.2方法静脉真空采血2ml，检测白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（Hb）、血小板（PLT）等血常规检查用全血细胞分析仪检测（美国贝克曼公司）；静脉真空采血5ml，检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）等生化指标，用7170生化分析仪进行检测（日本日立公司）。PLD(脯氨酸肽酶)活性测定采用脯氨酸肽酶ELISA试剂盒（上海生科生物科技有限公司），按说明操作。 1.3统计分析采用SPSS13.0软件进行统计分析。描述结果以中位数（最小值～最大值）表示。连续性变量用Mann-Whitney U Test分析；分类性变量用x2检验。利用ROC曲线(receiver operating characteristic curve)确定最优截断点，同时计算ROC曲线下面积(AUROC)和各截断点的灵敏度、特异度、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)及Youden指数等。 2 结果 2.1 不同肝纤维化程度的患者各指标比较（表1）在S0-1和S2-4不同分期中，除了性别、Hb、TP外，其他各项指标差异有统计学意义(P<0.05)。 表1 慢性乙型肝炎患者的临床特点 2.2 血清ALT，AST，AST/ALT和PLD活性的ROC曲线面积和最优截断点 ALT、AST、AST/ALT比值和PLD的ROC曲线下面积分别为0.614，0.648，0.655和0.807。PLD的AUROC最大，其95％的可信区间为0.739～0.874。最优截断点约为1250 U/L，灵敏度和特异度分别为75.6%和75.2%。 2.3 不同截断点PLD特征（表2）列出PLD在不同截断点的灵敏度、特异度、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）。如果以PLD≤1250 U/L作为无明显肝纤维化的诊断，PLD≤1250 U/L的99中有77人诊断正确（77.8％）；PLD≥1250U/L 的92人中有68人具有明显肝纤维化(7 3.9％)。当PLD≤1300 U/L的Youden指数为0.535，灵敏度和特异度分别为73.3％和80.2％，当PLD≥1400 U/L的Youden 指数为0.555，灵敏度和特异度分别为6 4.4％和91.1％，与最优截断点为1250U/L时比较，灵敏度降低，但是特异度增加。表2 血清PLD在不同截断点下的灵敏度和特异度
胸腔积液中腺苷脱氨酶的临床检测意义分析 目的探讨胸腔积液中腺苷脱氨酶的临床检测意义。方法选择本院结核性胸腔积液患者共35例，作为结核组；同时选择本院肿瘤性胸腔积液患者共30例，作为肿瘤组。取两组患者胸腔积液，测定腺苷脱氨酶活性。结果结核组胸腔积液中腺苷脱氨酶活性显著高于肿瘤组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；结核组胸腔积液中腺苷脱氨酶阳性检出率显著高于肿瘤组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。结论胸腔积液患者中行胸腔积液腺苷脱氨酶活性检测有助于结核性胸腔积液和肿瘤性胸腔积液鉴别诊断，检测意义重要，值得借鉴。 标签：胸腔积液；肿瘤；结核；鉴别诊断；检测意义 胸腔积液在临床症状中很常见，导致胸腔积液的病因较多，在临床上主要有肿瘤性胸腔积液及结核性胸腔积液。对于胸腔积液来说，明确病因对正确诊断和治疗至关重要。但胸腔积液的早期诊断较为困难。部分患者采用常规的方法不能明确胸腔积液的性质。本文探讨腺苷脱氨酶在胸腔积液中的检测意义。现报道如下： 1 资料与方法 1.1 一般资料 选择本院2009年10月～2011年10月结核性胸腔积液患者共35例，作为结核组，男19例，女16例，年龄最小为18岁，最大为63岁，平均（38.1±4.6）岁。结核性胸腔积液诊断条件：所选患者有结核中毒症状表现；合并有肺结核，痰涂片检测到抗酸杆菌；胸腔积液为渗出性改变；结核菌素试验阳性；血沉加快；抗结核药物治疗有效。上述5条中具备3条即可诊断为结核性胸腔积液。同时选择本院肿瘤性胸腔积液患者共30例，作为肿瘤组，男21例，女9例，年龄最小为18岁，最大为67岁，平均（40.1±6.1）岁。肿瘤组患者中，14例纤维支气管镜取组织行病理检查，6例患者经肺活检确诊，10患者胸腔积液中发现癌细胞。 1.2 方法 取两组患者胸腔积液，操作步骤如下：患者坐位，面向椅背，两前臂置于椅背上，前额伏于手臂上；选择肩胛下角线或腋后线7～8肋间作为穿刺点；常规消毒；2%利多卡因局部逐层浸润麻醉；左手固定穿刺部位皮肤，右手持穿刺针沿麻醉部位经肋骨上缘垂直缓慢刺入，当有突破感时停止；接上注射器后；注射器抽满后再次用血管钳夹闭胶管才能取下注射器；抽完液后拔出穿刺针，再次消毒皮肤，覆盖无菌纱布；用胶布固定。胸腔积液均为患者入院后第一次抽取的，离心后取上清液2 mL置于管中待测。腺苷脱氨酶检测采用酶法，检测步骤严格根据说明书提供的步骤进行。当腺苷脱氨酶活性大于19.6 U/L为诊断结核阳性界值。 1.3 统计学处理 采用统计学软件SPSS 14.0进行统计学分析，均数比较采用t检验，率的比较采用卡方检验，P ＜0.05，显示差异有统计学意义。 2 结果 结核组和肿瘤组胸腔积液中腺苷脱氨酶活性检测结果显示，结核组胸腔积液中腺苷脱氨酶活性显著高于肿瘤组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；结核组胸腔积液中腺苷脱氨酶阳性检出率显著高于肿瘤组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。