病毒感染细胞实验整体流程及原理
目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类
病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒慢病毒原理
慢病毒(Lentivirus )是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Len tivirus-siRNA 克隆经过慢病
毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。
特点
1)直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。
可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
2)
3) 可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。
4) 无需任何转染试剂，操作简便。
5) 可以根据客户需要制备多种标记。
慢病毒包装简要流程:
1) 含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2) 慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。
3) 培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。
4) 病毒的纯化和浓缩。
5) 分装、-80 C保存。
6)滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
、腺病毒 原理
腺病毒(Ade no virus , Ad)是一种无包膜的线状双链DNA 病毒，其复制不依赖 于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad 载体都是基于血清型2和5, 通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在 高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 特点
消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
、慢病毒和腺病毒的比较
1) 几乎可以感染所有类型的细胞
2) 可以获得复制缺陷型(E1和E3缺失)的腺病毒 3) 殖
病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到
1012 PFU/mL 能有效的进行增
4) 腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单
感染细胞时，不整合到染色 体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险, 生物安
全性高。
5) 腺病毒包装简要流程
1) 构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2) 采用PacI 消化纯化的质粒。
3) 4) 将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5) 分装，-80 C 保存。
慢病淹载体S统和?病涎義体S统出a
2、构建目的基因到载体
构建手段一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。
1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定
2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCF扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定质粒载体概念能够进行自主复制的环状DNA双链结构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸（DNA）分子
特征质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体（episome），这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制。通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。
3、质粒DNA在大肠杆菌里转化
连接上目的基因的质粒转化大肠杆菌是为了让目的基因在大肠杆菌里扩增, 提取质粒，以下是质粒DNA在大肠杆菌里转化的三步骤。
大肠杆菌感受态细胞的制备
用冰浴的L氯化钙10ml悬浮细胞沉淀，立即冰浴30min
倒出上清液，用冰浴的L氯化钙2ml悬浮细胞（冰上放置）
质粒DNA勺转化
取200ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2ul混匀，冰浴30min
每管加800ulLB液体培养基，37C培养1h （150r/min ）
取适当体积（100ul）的复苏细胞，涂布在选择性培养基上，正置30min 然后
1）从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落于
过夜。
3mlLB培养基的试管中，37 C振汤培养
2) 取菌液转接到40mlLB液体培养基中, 37C振荡培养2~3h
3) 菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min
4) 4C离心10min (4000r/min )
5) 倒出培养液，将管口倒置以便培养液流尽
6)
7) 4C离心10min (4000r/min )
8)
9) 分装细胞，200ul 一份，4C保存
1)
2) 离心管放到42 C保温90s
3) 冰浴2min
4)
5)
6）倒置平皿37C, 12~16h,出现菌落
质粒提取步骤
1）取1~4ml 在LB 培养基中培养过夜的菌液，12000转离心1min ,弃上清 2）加250ul 溶液I /RNaseA （溶液I 为细胞悬浮液）混合液，漩涡剧烈振荡直至 菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min 。
3）加入250ul 溶液n （细胞裂解液），轻柔的反复颠倒混匀 1-2min ，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
4）加入350ul 溶液m （中和液），立刻轻柔地反复颠倒混匀 现
白色絮状沉淀。
加入500ul 溶液PB （洗涤液）12000转离心1min ,弃滤液，目的是将硅胶膜 上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒 DNA 9）加入500ul 溶液 W （去盐液），12000转离心1min ,弃滤液，重复一次。
10）12000转离心3min ,以彻底去除纯化柱中残留的液体。
11）将DNA 纯化柱置于新的离心管中，悬浮滴加 50-100U1溶液Eluent （为无菌 的双蒸水，PH 为），室温放置2min 。
12） 12000转离心1min ,此时管底即为高纯度的质粒 DNA 质粒于-20 C 保存。
质粒提取步骤：吸取液体培养基于离心管中 12000转离心1mi n ,弃上清，吸取 培养基重复离心弃上清离心，留取少量菌液作为菌种保存，可直接置于-20 C ―― 加250ulBufferS1 悬浮细菌，悬浮均匀——加250ulBufferS2温和充分的上下翻 转4-6次混合均匀，使菌体裂解——加350ulBufferS3温和上下翻转12000离心 10min ――取上清液转移到专用的制备管 （2ml ） 12000转离心1min ,弃滤液一一 加
500ulBufferW112000 转离心 1min ,弃滤液——加 500ulBufferW212000 转离 心1min,弃滤液，重复一遍一一将制备管置回 2ml 离心管12000转离心1min ―― 将制备管移入新的离心管中，加60~80ulEluent 或离子水，室温1min12000转离 心1min 移去制备管，将有质粒的离心管于 4C 或是-20 °C 保存
4、质粒DNA 和其他包装质粒共转染293T 细胞产生病毒（即病毒包装）
名词解释
5-6次。室温放置
5-6次，此时会出
5）
12000室温离心10mi n ,收集上清。 6）
将上清置于DNA 纯化柱中，静置1-2min 。 7）
12000转离心1mi n ,弃滤液。 8）
细胞是由293细胞派生,表达SV40大T 抗原的人肾上皮细胞系,被广泛应用于 瞬时转染以过表达各种目标蛋白，或是用以包装病毒。
脂质体：某些细胞质中的天然脂质小体， 可作为生物膜，用于捕获外源性物质后 更有效地运送到靶细胞，经同细胞融合而释放。
共转染的操作步骤 第一天：用无抗生素DMEM+10%F 铺板293FT 细胞，2ml/孑L 。确保第二天细胞密 度达到80%-90%4合度 第二天:
后，将DNA 溶液和脂质体溶液混合，室温静止 20min
5. 6-10h 后，移除含有DNA 脂质体复合物的培养基, DMED+10%FB 从此刻开始算时间）。
第三天:
1.转染24h 后，荧光显微镜下观察，转染效率应达到
第四天:
1.转染后48和72h 分别收获含病毒的上清。 rpm 离心20min ，滤膜过滤，去除细胞沉淀。
转离心浓缩细胞、分装-80°C 贮存。
4.滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。
病毒包装的原理
质粒DNA 为能转录出慢病毒遗传物质（RNA ，但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋 白成分的载体质粒，其同时连有目的基因和报告基因，
psPAX2为能表达慢病毒
外壳的质粒，其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜， 为慢病毒的膜蛋白 质粒，通过lipofectamine2000 进行三质粒共转到靶细胞基因组中，宿主基因 组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因 RNA 与 PSPAX2基因翻译出的蛋白 组装为慢病毒。
1.500ul 无血清培养基稀释2ug 表达质粒+ psPAX2+
2. 500ul 无血清培养基稀释15ul 脂质体2000
3. 5min
4.从6孔板中吸出1ml 无血清培养基，然后滴加入
1ml 质粒和脂质体混合物。
代之以正常培养液
70%^上
在上述程序中提及的“第四天”收集病毒。在第五天再用该病毒感染靶细胞，病毒进入细胞后，其遗传物质RNA反转录出DNA该基因再整合到靶细胞的基因组中，完成转染过程，因为质粒DNA只能转录出病毒RNA和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分，因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖，故对宿主细胞是无害的
并且高效的将目的基因转然到靶细胞基因组中。
5、慢病毒感染细胞
流程图
迎；：注
Lennwrfli ￡ ipieswn System
感染步骤
将对数生长期的细胞消化重悬后，按1*105/L密度接种于12孔板，生
2）感
染：
PBS浓度梯度稀释的病毒液，混合均匀后即可放入孵箱培养。
3）24h左右可换液，48小时即可看荧光，具体根据细胞状态来看。
荧光显微镜的操作流程打开荧光器（30min内不能关闭，否则影响显微镜寿命），细胞培养板置于载物台，调节物镜和光圈，先用自然光观察视野内细胞，再关闭光，开启荧光通道，观察荧光强度，判定感染率。图片取样前可以调节曝光时间，增益值和彩色度使荧光照片最完美。（针对leica ）注意事项内容
1.病毒浓度要适宜，太少的话细胞被感染的也少，但是病毒浓度太大，对细胞有伤害。1）铺板:
长过夜
将70-80%!满12孔板中的培养液吸除，换新鲜的培养液，同时加入
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
一、实验室常见菌株简介 Xl1-Blue菌株 基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F?[Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)。 特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。 用途：分子克隆和质粒提取。 BL21(DE3)菌株 基因型：F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。 特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。 用途：蛋白质表达。 BL21(DE3)ply菌株 基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cm R)。 特点：该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。 用途：蛋白质表达 DH5α菌株 基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, λ– 特点：一种常用于质粒克隆的菌株。其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC 载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。 用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 JM109菌株 基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F? traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)。 特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达, 可用于M13克隆序列测定和蓝白斑 筛选。 用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 DH10B菌株 基因型： F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 endA1 recA1 deoR Δ(ara,leu)7697 araD139 galU galK nupG rpsL λ- The most widely used E. coli strain for BAC cloning is DH10B 。 host for pUC and other α-complementation vectors; pBR322
一、Transwell小室制备 1. 无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的
DOI ：10.7507/1002-0179.20150280作者简介：龙海燕（1989－），女，重庆人，在读硕士，E m a i l ：longhaiyan1989@https://www.doczj.com/doc/bf14314107.html, 通讯作者：冯萍，Email: fengp_62@https://www.doczj.com/doc/bf14314107.html, 网络出版时间：2015-05-14 15:16网络出版地址：https://www.doczj.com/doc/bf14314107.html,/kcms/detail/51.1356.R.20150514.1516.022.html 感染性疾病实验室诊断技术及其研究进展 龙海燕，冯萍 四川大学华西医院感染性疾病中心（成都 610041） 【摘要】 目前全球感染性疾病现状严峻，应用于感染性疾病诊断的实验室技术种类繁多，为了解感染性疾病实验室诊断技术及其最新进展，帮助临床工作者早期、快速、准确地诊断感染性疾病，降低感染性疾病暴发的危险性，及时启动感染性疾病的正确治疗等，现从病原学检测、免疫学技术、分子生物学技术、生物传感器、流式细胞术这几个方面对感染性疾病诊断技术进行综述。 【关键词】 感染性疾病；免疫学；分子生物学；生物传感器；流式细胞术 目前全球感染性疾病现状严峻，很多经典疾病卷土重来或出现了新特点，如新变异型克-雅病、重症急性呼吸综合征（SARS ）、新型冠状病毒感染、H7N9禽流感等。以前从未认识到的感染性疾病正在持续不断出现，包括人类免疫缺陷病毒（HIV ）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、霍乱弧菌和登革热病毒所致疾病等[1]。从不断新发和再发的感染性疾病中可以看出，感染性疾病仍然给人类的生存带来了巨大的挑战，因此对感染性疾病的诊断技术提出了更高的要求。本文就现有的感染性疾病实验室诊断技术和最新研究进展进行综述，为临床工作者对感染性疾病的诊治 提供参考。 1 病原学检测 传统的病原微生 物实验室诊断技术以分离、培养、染色、生物化学鉴定为主，目前仍是许多病原体检测的“金标准”。传统人工病原学检测方法操作复杂、检测周期长（2～5 d ），干扰因素多，敏感性与特异性也有限。为了缩短传统细菌“鉴定”时间，微生物鉴定自动化技术也应运而生，如V i tek 系统、Mi c roScan 系统、Phoenix 系统、Mini API 系统等。自动化微生物鉴定系统是根据微生物代谢特点，如细菌分解底物后反应液中pH 值的变化，色原性或荧光原性底物的酶解，测定挥发或不挥发酸，或识别是否生长等方法来分析鉴定细菌，鉴定时间约15～24 h 。Crowley 等[2]采用Vitek2自动化微生物鉴定系统和 Vitek2革兰染色阴性鉴定识别卡对707例G ?菌株进行鉴定，准确率98%，10 h 内可以出结果。此类鉴定系统大大缩短了检测时间，降低了劳动强度，为疾病的确诊争取了宝贵时间。 2 免疫学检测 免疫学技术是通过检测病原微生物的抗原或抗体来进行快速鉴定的技术。该方法简化了病原微生物的鉴定步骤，因此广泛应用于临床。感染性疾病传统的免疫学技术包括凝集反应、沉淀反应、中和反应等，如临床上常用的肥达反应、免疫固定电泳、抗链球菌溶血素O 试验等。近二十几年来，免疫学分析方法 发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，灵敏度和特异度显著提高。目前常用的标志物有放射性同位素、酶、荧光素、电子致密物、化学发光物质、DNA 等。 放射免疫沉淀实验是敏感性很高的免疫标记技术，精确度高且易标准化和自动化，但由于放射性同位素有一定的危害性，其临床应用受到一定限制。酶联免疫吸附试验（ELISA ）是目前免疫酶技术中应用最广泛的，由此发展出了阵列-ELISA （array-ELISA ），同时具备简便、高通量、快捷等特点[3]。时间 分辨荧光免疫分析及上转换发光免疫分析技术拥有灵敏度高、示踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、无放射性污染、多标记等优点[4-6]。胶体金免疫层析技术操作简单、成本低、结果判读直观快速，虽然只能定性，但可用于基层单位，可进行现场诊断或大规模检测等[7]。免疫-聚合酶链反应（PCR ）是1992年Sano 等[8]建立的一种检测微量蛋白的免疫标记技术。它是用一段已知的DNA 分子来标记特定的检测抗体作为探针，然后用此探针与待检抗原结合反应，再通过 PCR 方法扩增吸附在抗原抗体复合物上的这段标记 ?综述?
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 慢病毒 原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通 siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合 RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 、腺病毒 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到 1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 腺病毒包装简要流程 1）构建表达 siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用 PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染 293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染 293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 、慢病毒和腺病毒的比较 2、构建目的基因到载体
ATCC? Number: CRL-2865? Price: $329.00 Designations: T47D-KBluc Depositors: VS Wilson Biosafety Level: 1 Shipped: frozen Medium & Serum: See Propagation Growth Properties: adherent Organism: Hom o sapi ens (human) Morpholog y: epithelial Source: Organ: mammar y gland; breas t Tissue: duct Disease: ductal carcinoma Derived from metastatic site: pleural effusion Cell T y p e: epithelialtransfected with reporter plas mid Permits/F orms: In addition to the MTA menti oned above, other ATCC and/or regulatory per mits may be required for the transfer of this ATCC material. Any one purchasing ATCC material is ultimatel y r esponsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the s pecific requirements for shipment to your loc ation. Reverse Transcript: N Age: 54 years adult HeLa Mar kers: N
细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。 相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA 中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。
细胞冻存、复苏及传代操作流程 1. 试剂与仪器： 1.1 试剂 PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，货号15400054 100 mL； 青链霉素：Gibco公司，货号15140-112 100 mL； FBS：Gibco公司，货号10091-148 500 mL； DMEM （4.5g/L glucose）培养基：CORNING公司，货号10-013-CVR 500 mL；RPMI 1640 ：CORNING公司，货号10-040-CVR 500mL； DMSO：SIGMA公司，货号：D8418； PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022 1.2 仪器 生物安全柜： 离心机： 37℃恒温水浴箱： -80℃冰箱： 4℃冰箱： 荧光倒置显微镜： 37℃恒温培养箱： 液氮罐： 2、实验方法： 2.1 细胞冻存 配制含10% 体积DMSO的冻存培养液（90% FBS+10% DMSO或70%培养基+20%FBS+10%DMSO），冻存盒室温放置。 将正常生长的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6 cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入消化液体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离
心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬细胞，1mL分装于冻存管中，做好标记。 悬浮细胞收集细胞培养液于15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬，1 mL分装于冻存管中，做好标记。 将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃过夜，第二天转入液氮中长期保存。2.2 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存管，快速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，在安全柜中，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15 mL离心管中（15 mL 离心管中已事先加入4 mL培养基）混匀，800 rpm，离心5 min，弃去上清液，加入含10%血清的培养液重悬细胞，根据离心后的细胞沉淀，将细胞培养在10 cm 皿或6 cm皿的培养皿中（一般选用6 cm皿）37℃培养箱静置培养。次日更换1次培养液，继续培养。 2.3 细胞传代 状态良好的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入胰酶体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入1-2ml培养基重悬细胞，吹打均匀后根据细胞生长速度1瓶传2瓶或1瓶传3瓶，补齐培养基（6cm皿加5ml，10cm皿加10ml）后放入37℃培养箱继续培养。 悬浮细胞在显微镜下观察，健康的细胞干净而透明，核清晰可见，静置培养时常见小细胞团。 ①若细胞状态好，培养基干净而无明显颗粒物沉淀，可直接1:2或1:3分瓶传代培养。 ②若细胞有碎片，培养基中颗粒物多，则需收集细胞培养液于15ml离心管中，600rpm离心5min，去上清，加入适量完全培养基重悬，轻柔吹打混匀后，根据细胞生长速度，1:2或1:3传代培养。 3、注意事项 1）细胞一旦染菌后直接舍弃并检查所有试剂耗材是否污染，如细胞样本非常
细胞株管理规定 一、什么是细胞株？ 原代代培养物经第一次传代培养后的细胞，常被称为细胞系（cell line）。由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系有一定差异的细胞系，常被称为该细胞系的亚系（subline）。 从一个经过鉴定的细胞系采用选择法或单细胞克隆进一步所得到的细胞群，常被称细胞株（cell strain）。由原细胞株进一步分离培养出的与原株性状不同的细胞群，又被称为亚株（substrain）。 二、细胞株管理规定 对已建立和经过鉴定的细胞株要进行严格管理，规定如下： 1.制度管理规定 A.细胞株应有专人负责保管，并由实验室负责人监督检查。更换保管人时应提 前做好工作交接，确保使用安全。 B.建立细胞株使用登记制度，记录细胞株的编号、名称、来源、冻存数量及日 期、取用数量及日期、剩余数量及保存方法。 C.细胞株长期保存应放置于液氮罐中，短时保存或过渡保存可置于-80℃冰箱 中。 D.保存的细胞株应定期复活、保种，即每半年对没有复苏过的细胞株进行维护， 复苏、培养和保存，并详细记录细胞株状态，如形态、生长速度、抗体分泌情况等。 E.细胞株不得外借，不得随便带出实验室。 F.细胞株的使用、保存、转移和销毁应符合相关部门的有关规定。 2．使用流程规定 A.如有新细胞株进入实验室，需告知实验室负责人并进行冻存保种； B.实验室人员需复苏细胞时，需提前向实验室负责人申请，经批准后方可复苏； C.设存取记录表，实验人员存取细胞时做好记录并把细胞复苏情况反馈至实验
室负责人，实验室负责人需监督实验人员做好细胞株使用记录情况； D.若复苏细胞人员复苏同一株细胞株两次均未成活，需通知负责人进行检查和 复苏，如贮存细胞确实出现问题，则及时清理。 三、细胞保存 A.冻存条件：90%FBS+10%DMSO，4℃冰箱预冷； B.冻存方法： 4 ℃（30-40min）→-20 ℃（1-2h）→-80 ℃（过夜/24 h以上，可短时保存 1-3个月）→液氮（永久保存； C.填写冻存记录表 四、细胞复苏 A.水浴锅37℃预热 B.从细胞冻存管理表中查找并记录所需细胞在液氮罐中的位置。 C.液氮罐中快速取出细胞，迅速放入水浴锅中融化，并持续晃动，避免因受热 不均产生冰晶，损伤细胞，融化时间为1～2min； D.将细胞悬液移至离心管中，加入10倍体积的细胞培养液，混匀； E.1200rpm/min，离心5min F.弃去上清液，加入新的培养液重悬，移至细胞培养瓶中，显微镜下观察细胞 形态，37℃培养箱培养。 G.次日，更换培养液继续培养，待其铺满培养瓶面积80%及以上，可尽心传代。 四、液氮罐的使用 A.开启液氮罐时，戴好防冻棉手套，防止冻伤； B.提前确定细胞保存位置，避免提篮在外停留时间过长； C.填写复苏记录表，负责人做好整理保藏记录，禁止短期内使用同一株细胞的 多管细胞，复苏后使用细胞的同时需补充细胞株库存，写明细胞名称、冻存时间、冻存人等细节。 五、附件 1.细胞冻存记录表 以50L液氮罐所配的6个提篮，每个提篮6层抽屉柜，每个抽屉柜5*5个冻存管。
实验一：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察 【基本原理】 细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。 本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。 由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。 【实验报告】 1．简图表示凝集素使血细胞凝集原理 2．怎样根据细胞膜渗透性实验结果分析确定物质进入细胞的速度？物质进入细胞的快慢有什么规律？ 实验二：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合 【基本原理】 两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。 人工细胞融合开始于五十年代，六十年代到七十年代作为一门新兴的技术发展很快，应用范围极广。细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。 细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域，如研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、育种等。
精心整理 肿瘤学研究常用实验技术及方法复习题 1.表观遗传的科学内涵 三个特点？ a)基因功能完全、稳定地丧失，有遗传性； b)细胞外环境长期作用的结果，有可逆性； c)分析方法灵敏，可检出少数细胞的变化 2. DHPLC 3. i. ii. 梯度中 iii. SDS- iv. 1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时一定要注意防护。 2.制备聚丙烯酰胺凝胶时，小心防止凝胶渗漏。 3.蛋白加样量要合适，加样量太小，条带不清晰，加样量太大，则泳道超载，条带过宽而重 叠，甚至覆盖至相邻泳道。 4.对多种蛋白质而言，电流大则电泳条带清晰，但电流过大，玻璃板会因受热而破裂，故适 合的电流为玻璃板微热。 5.胶转膜后应在膜上标记好正反面及电泳方向。 6.电转移时应注意勿将滤膜和胶的位置放反，而且滤纸、滤膜和胶应等大，以免短路。
4.组织培养/基因的克隆、转化与表达 i.请列举至少3种流式细胞仪的用途? 1.定量检测细胞膜、细胞质和细胞核中的各种细胞成分 2.研究细胞的各种功能状态(细胞增殖，细胞凋亡、细胞分化、酶活性、细胞膜通透性、 氧化还原状态、吞噬性等)。 3.定量检测血清中的各种可溶性生物分子成分 临床中应用：1.白血病和淋巴瘤的免疫分型 1. 2. 3.细胞 磷酸酶（phosphatase） 激酶（Kinase） 连接酶（Ligase） 5.生物质谱简介 生物质谱在蛋白组学中的应用？ 1.ProteinsMWmeasurements； 2.ProteinIdentification；(ID) 3.Peptideandproteinprofiling； 4.ImagingMS； 5.ProteinPTMs；5.ProteinQuantification 6.《常用电泳技术基本原理及应用》课程复习题
体外培养细胞的种类和命名 体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变。最早采用的名称为细胞株（Cell strain），以后又出现细胞系（Cell Line）一词，两者曾一度混用致概念不明确，导致文献中也很混乱。我国也曾有类似情况，在我国尚未制定出统一名词前，本书用的名词基本参考Schaeffer，W.I.（1979）和国内有关会议、以及国内外杂志常用名词为准。 （一）初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。 （二）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。这两种不同性质的无限细胞系，在国内外文献中对这些名词的应用上也常不十分严格。为概念上的明确，本书中对有恶性的无限细胞系采用“恶性转化细胞系”一词表示可能更妥。而对那些只具永生性而无恶性的细胞系，则用无限细胞系或转化细胞系即可。当前流传的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均属这类细胞系。 由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系（Subline）。 （三）克隆细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain） （四）二倍体细胞 细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有8～10代，人胚神经胶质细胞15～30代；如从老龄个体取可传50则细胞生存期更短。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或2～5代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。 （五）遗传缺陷细胞 从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。 （六）肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体
感染性疾病检查 感染性疾病是由病原微生物（细菌、病毒、真菌、支原体、立克次体、螺旋体）和寄生虫（原虫或蠕虫）感染人体后产生的疾病。实验室检查对感染性疾病的诊断具有特殊的意义。病原学检查包括病原体直接检出和病原体分离培养，可直接确定诊断。而免疫学检查抗原或抗体亦可提供重要依据。荧光定量PCR 检测快速、特异、灵敏，被用于感染性疾病的早期快速诊断。 第一节感染性疾病一般检测 一、白细胞常规检查 白细胞总数显著增多常见于化脓性感染（尤其是革兰阳性球菌），如流行性脑脊髓膜炎、败血症和猩红热等；某些病毒感染（如传染性单核细胞增多症）。革兰阴性杆菌感染时白细胞升高不明显甚至减低，如布鲁菌病、伤寒及副伤寒等。病毒咸染时白细胞通常减少或正常，如流行性感冒、登革热和病毒性肝炎等。蠕虫感染时嗜酸粒细胞通常增多，如钩虫、血吸虫、肺吸虫等。 二、血清C反应蛋白检验测定 【参考区间】成人和儿童：0~8. 0mg/L. 【临床意义】C反应蛋白（CRP) 是一种能与肺炎链球菌C多糖体反应的急性时相反应蛋白，由肝细胞合成，是一种经典的、灵敏的、急性时相蛋白，此反应不受放射治疗、化学治疗、皮质激素治疗影响。 （1) CRP作为急性时相蛋白在各种急性炎症、组织损伤、心肌梗死、手术创伤、器官移植排斥、放射性损伤等疾病发作后数小时迅速升高，峰值可达500mg/L.病变好转时，又迅速降至正常。其升高幅度与疾病的程度呈正相关。 （2) 细菌和非细菌感染（病毒、支原体等）的鉴别诊断：细菌感染发生炎症后6~8小时CRP即可明显上升，CRP升高与感染的程度呈正相关。非细菌感染（病毒、支原体等）大多正常。 （3) 鉴别风湿活动期和稳定期：风湿活动期CRP含量可高达200mg/L.病情好转逐渐下降到正常，稳定期不升高。 （4) 鉴别器质性与功能性疾病：前者升高，后者不升高。 （5) CRP测定有助于孕妇并发感染的观察，对羊膜破裂早产并伴有绒毛膜炎的孕妇，CRP测定具有准确和早期预报作用。 （6) 恶性肿瘤患者CRP大都升高，如CRP与 AFP的联合检测，可用于肝癌与肝脏良性疾病的鉴别诊断。 三、降钙素原测定 【参考区间】健康人群小于100ng/L. 【临床意义】降钙素原（PCT) 是一种糖蛋白，是降钙素（CT) 的前肽，在正常