细菌霉菌和酵母菌计数
1 简述
细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。也是评价生产企业的药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者卫生状况的重要手段和依据。
细菌、霉菌和酵母菌计数除另有外均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上常用的一种方法。以琼脂平板上的细菌、霉菌和酵母菌形成的一个独立可见的菌落为计数依据。该法测定结果只反映在规定条件下所生长的细菌（嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数，不包括对营养、氧气、温度、pH 和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。
一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity，cfu）不应理解为细菌、霉菌和酵母菌的个数。
在进行本法测定时，必须严格按本法所规定的条件操作，以免产生实验误差。
2 设备、仪器
2.1 设备
2.1.1 无菌室微生物限度检查应有单独的无菌室，每个无菌室应有独立的净化空气系统。
2.1.1.1 结构和要求见无菌检查法
2.1.1.2 操作间操作间应安装空气除菌过滤层流装置。环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间的净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于4.9pa。操作台上备有电子天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。
2.1.1.3 缓冲间缓冲间内应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不得放置培养箱和其他杂物。
2.1.1.4 洁净级别及检查方法通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法（参照《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
洁净级别尘粒数/m3 浮游菌（个）
/ m3沉降菌（个）/（∮90mm·0.5h）
微粒直径≥0.5μm 微粒直径≥5μm
100级10000级100000级≤3，500
≤350，000
≤3，500，
000
≤0
≤2000
≤20，000
≤5
≤100
≤500
≤1
≤3
≤10
沉降菌数测定（Ⅱ法）
无菌室操作台消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～35℃预培养48h，证明无菌落生长），以无菌方式（或经传递箱）移入操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上，在30～35℃培养箱内倒置培养48h，取
出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。
有条件的单位、同时应检查无菌操作架和净化工作台上的浮游菌和尘粒数，分别应达到10000级和100级。如菌落数或尘粒数超标，应清洗过滤系统中的过滤器，必要时予以更换。
2.1.1.5 在每次操作前、后，用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭操作台及可能污染的死角。然后启动层流净化装置，同时用紫外杀菌灯照射30min。
2.1.2 阳性菌试验应另设单独的净化工作台，不得在供试品检验用的无菌室内或奸猾工作台上操作。
2.1.3 无菌室与洗刷、灭菌消毒、培养、结果观察及办公间等配套设施应相对集中，布局合理，避免污染，便于管理。
2.2 仪器
2.2.1 恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（20～25℃）、微波炉、匀浆仪（3000～8000r/min）或康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（250～300℃）、电冰箱、离心机、离心管、0.45μm滤膜及薄膜过滤器、蒸汽灭菌器（使用时要进行生物指示剂灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。
菌落计数器、显微镜（1500x）、电子天平或天平（感量0.1g），pH系列比色计。
2.2.2玻璃器皿锥形瓶（250～300ml，内装玻璃珠若干；500ml，1000ml）、培养皿（直径9cm）、量筒（100ml，500ml）、试管（18mm×180mm、28mm×198mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）、注射器
（20ml或30ml等）、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）、不锈钢桶（带盖）。玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入与约2cm适宜疏松的棉花，置吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加硅胶塞或棉塞，若振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干或160℃干热灭菌2h，备用。
2.2.3 用具大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%～75%乙醇溶液浸泡）。无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。
接种环（白铱金或镍铬合金，环径4～5mm、长度6～10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘状棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。
3 试液、稀释剂和试剂
3.1 试液
3.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液或其它适宜消毒液（供洗手、擦拭操作台面用）。
3.1.2 5%石炭酸溶液或其他适宜消毒液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒菌吸管用）。
3.1.3 75%乙醇溶液。
3.1.4 碘酊或碘伏溶液。
3.2 稀释剂和试剂
稀释剂配制后，高压蒸汽灭菌法灭菌。
3.2.1 0.9%无菌氯化钠溶液[附录3.1]。
3.2.2 pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液[附录3.2]。
3.2.3 无菌聚山梨酯80氯化钠－溶液[附录3.4]。
3.2.4 pH6.8无菌磷酸盐缓冲液。
3.2.5 pH7.6无菌磷酸盐缓冲液按药典附录ⅩⅤD配制后，过滤，分装，灭菌。
3.2.6 0.1%无菌氯化三苯四氮唑溶液（TTC）[附录2.15]。
3.2.7 pH7.2无菌磷酸盐缓冲液[附录3.5]。
4 培养基
4.1 营养琼脂培养基[附录
5.2]。
4.2 玫瑰红钠琼脂培养基[附录
5.3]。
4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基[附录
5.4]。
培养基制备注意事项：
4.3.1 采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基pH值进行校验。若为自配培养基，原料应挑选，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上。
4.3.2 配制的培养基不应有沉淀。如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。
4.3.3 培养基的分装量不得超过容器的2/3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。
4.3.4 培养基配制后应在2h内灭菌，避免细菌繁殖。
4.3.5 灭菌后的培养基应保存在2～25℃，防止被污染，可在三周内用毕；保存于密闭容器中，可在一年内使用。制备好的培养基放置时间不宜过长，以免水分散失及染菌。
4.3.6 用水浴或微波炉加热溶化琼脂培养基，勿用电炉直接溶化琼脂培养基，以免营养成分过度受热而破坏。已溶化的培养基应一次用完，剩余培养基不宜再用。培养基不能反复加热溶化。
5 供试品抽样、保存及检验量
5.1 抽样
5.1.1 一般采用随机抽样方法，其抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的3～5倍量（以备复试或留样观察）。
5.1.2 抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应选取有疑问的样品。机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。
5.1.3 凡药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格品，无需再抽样检验。
5.2 保存
5.2.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内的污染菌因保存条件不妥导致死亡，损伤或繁殖。
5.2.2 供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。
5.3 检验量
5.3.1 所有剂型的检验量均需取自2个以上包装单位（中药蜜丸需取
自4丸，膜剂取4片以上）。
5.3.2 固体及半固体（黏稠性供试品）制剂检验量为10g。
5.3.3 液体制剂的检验量为10ml。
5.3.4 膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为2cm2（中药膜剂较厚，不宜取量过多），化学药及生化药膜剂检验量为50cm2。
5.3.5 特殊贵重或微量包装的药品，检验量可酌减。除另有规定外，口服固体制剂不低于3g，液体制剂采用原液者不得少于6ml，采用供试液者不得少于3ml，外用药品不得少于5g。
5.3.6 要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。
6 试验准备
6.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等经传递窗移至无菌室内。每次试验所用物品必须事先做好计划，准备足够用量，避免操作中出入无菌间。编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。
6.2 开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30 min。
6.3 关闭紫外杀菌灯后，操作人员用肥皂洗手，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。
6.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。
7 供试液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。如使用了乳化剂、分散剂、中和剂和灭活剂，其用量应证明是有效的，并对微生物的生长和存活无影响性。供试液的制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃，30min。除另有规定外，常用的供试品制备方法如下：
7.1 液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为供试液。油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。
7.2 固体、半固体或黏稠液供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪（3000～5000r/min、2～4min）或其他有效的方法，混匀，作为供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。蜜丸等需剪碎，放入匀浆杯。
7.3 非水溶性供试品
7.3.1 软膏、乳膏剂先将已备妥的含司盘80 5g、单硬脂酸甘油脂3g、聚山梨脂80 10g的混合物融化，待冷至45℃时，加入供试品5g （或5ml），立即用玻棒搅拌均匀，分次少量慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20供试液。
7.3.2 油剂取供试品10ml，加入无菌聚山梨酯80 5～8ml，摇匀，
再加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。
7.3.3 栓剂称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，置45℃水浴保温10min，使溶，加入无菌聚山梨酯80 5～8ml，振摇使之乳化，再加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（稀释剂和聚山梨酯80总量为100ml），摇匀。
7.3.4 眼膏剂取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯（制法选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜，以薄膜过滤法过滤除菌。滤器在140℃干热灭菌2小时，或用集菌仪除菌和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇5～10min，萃取，待油水明显分层，取其水层作为供试液。
7.4 非水溶性膜剂供试品化学药膜剂一般取样为100cm2，置灭菌锥形瓶中，加入适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，于45℃±1℃水浴中保温，浸泡，振摇，以供试品浸液作为供试液。中药膜剂取50cm2，剪碎，加适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（通常1cm2加1ml或2ml），浸泡，振摇，以供试品浸液作为供试液。
7.5 肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品10g，肠溶制剂加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml，结肠溶制剂加pH7.6无菌磷酸盐缓冲液至100ml，均置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为供试液。
7.6 气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品，置冰箱冰冻室内约1h。取出，速消毒供试品容器的开启部位周围，用无菌钢锥在容器上消毒部位钻一小孔，在室温轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。
用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适量的无菌聚山梨酯80）中，混匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1:10的供试液。
7.7茶剂
取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂100ml，振摇2～3分钟，以灭菌纱布过滤（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称样结果按1：10加稀释剂，浸泡30分钟）。
以上供试品如吸水膨胀，或黏度过高，可增加稀释剂的量，制成1：20～1：100供试液。
7.8具抑菌活性的供试品
当供试品具有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查。常用的方法如下：
7.8.1稀释法取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数时，1ml 供试液可等量分注多个平皿控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。
7.8.2离心沉淀集菌法取规定量的供试液，3000r/min,离心20 min，弃去上清液，留底部集菌液约 2 ml，加稀释剂至原规定量。如供试液中有不溶性颗粒、沉淀，先以500 r/min,离心 5 min,留离心沉淀物，取全部上清液按上述高速再离心，留底部集菌液约 2 ml，加稀释剂至原规定量。
7.8.3薄膜过滤法见细菌、霉菌和酵母菌计数10.2。
7.8.4中和法凡含汞、砷或防腐剂等的供试品，可用相应的试剂钝化、中和其抑菌活性，制成供试液。
8供试液的稀释（10倍递增稀释法）
8.1取3～4支灭菌试管，分别加入9 mlPH 7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液。加稀释剂后，试管塞应立即塞上。
8.2另取1支1 ml灭菌吸管吸1：10均匀供试液1 ml，加入装有9 mlPH7.0无菌氯化－蛋白胨缓冲液的试管中，（此时操作一般为：左手执试管并将塞打开，倾斜，右手执10 ml吸管吸量。切勿在乙醇灯焰峰的正上方操作，以免灯焰将供试液中的菌细胞杀灭）混匀，即1：100供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1：103、1：104等适宜稀级（3～4）。每递增1稀释级，必须另一支吸管。
在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级称液内不低于液面2.5cm，反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁，调整液量至刻度，吸管移至第2级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面），缓慢地放出全部供试液（吸管内应无粘附或残留液体），然后将吸管放入消毒液缸内。
9计数方法验证
由于某些供试品具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。
9.1验证用菌株
大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]，白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]，黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]。
9.2验证方法验证试验分4组，至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组和对照级试验的菌回收率
9.2.1试验组取最低稀释级的供试液，按每1ml供试液加入50～100cfu 试验菌，按菌落计数方法测定其菌数。平皿法计数时，取试验菌液、供试液1ml分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基；薄膜过滤法计数时，取供试液2ml过滤，冲洗液冲洗，并在最后一次的冲洗液中加入试验菌。
9.2.2菌液组取上述试验菌液，测定其加入的试验菌菌数。
9.2.3供试品对照组取最低稀释级的供试液1ml，按菌落计数方法测定其所含菌数。
9.2.4稀释剂对照组为考察供试液制备过程对微生物的影响程度，可用相应的稀释液替代供试液，加入试验菌，使最终菌尝试为每1ml 含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
9.2.5试验组的菌回收率
试验组平均菌落数－供试品对照组平
均菌落数
试验组的菌回收率
（％）＝
×100％
9.2.6稀释剂对照组菌回收率
稀释剂对照组的菌落数
稀释剂对照组菌回收率
（100％）＝×100％
9.3结果判定 稀释剂对照组的菌回收率均应不低于70％。若试验组的菌回收率均不低于70％，则可按该供试液制备方法和菌落计数法测定供试品的细菌、霉菌或酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70％，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。
9.4验证试验可与供试品的细菌，霉菌及酵母菌计数同时进行。
9.5注意事项
9.5.1所用标准菌种的传代次数不得超过5代。以冷冻干燥的原始菌种开启后转培养，其培养物为第一代。
9.5.2黑曲霉菌的菌液制备 将黑曲霉菌的孢子接种至真菌琼脂培养菌液组的平均菌落数 菌液组的菌落数
基上，于20～25℃培养５～7天，使大量的孢子产生。加入3～5ml 的0.9％无菌氯化钠无源之水主，用无菌玻棒或接种环轻轻将孢子洗脱。然后，用一支10ml无菌球形毛细吸管，其管口用无菌棉花或纱布包扎且能过滤菌丝的装置，吸出孢子菌液至无菌试管内，用比浊法，将菌液稀释至每毫升含10～100 cfu。
9.5.3做试验菌的回收率试验时，加入菌量以50～100 cfu为宜。加菌量过多，如薄膜法，菌落拥挤，则不好计数；加菌量过少，如小于30个，则误差大。
10检查法
10.1平皿法
10.1.1在上述进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取该稀释级供试液各1ml至每个起先以９0mm的灭菌平皿中，或从高稀释级至低稀释级吸液时可用1支吸管吸供试液各1ml至每个灭菌平皿中。每一稀释级每种培养基至少注2～3个平皿（一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管），注皿时，将1ml供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流到吸管尖端部。一般取适宜的连续2～3个稀释级的供试液进行细菌、霉菌和酵母菌数测定。
10.1.2阴性对照待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管吸取稀释剂（PH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液）各1ml，分别注入4个平皿中，其中2个作细菌数阴性对照；另2个作霉菌、酵母菌数阴性对照，如另有YPD琼脂菌数时，则再增加2个增皿作酵母菌数阴性对照。
10.1.3倾注培养基
将预先配制好的细菌计数用的营养琼脂培养基；霉菌、酵母菌计数用的玫瑰红钠琼脂培养基；含蜂蜜、王浆液制剂用玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌）和YPD琼脂培养基（酵母菌）溶化，冷至约45℃时，倾注上述各个平皿约15 ml，以顺时针或逆时针方向快速旋转平皿，使供试液或稀释液与培养基混匀，置操作平台上待凝。在旋转平皿时勿将培养基溅到皿边及皿盖上。
10.1.4培养
一般细菌计数平板倒置于30～35℃培养箱中培养48小时。霉菌、酵母菌计数平板倒置于20～25℃培养箱中培养72小时。
10.1.5菌数计数
一般将平板置落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察。切勿计细小的琼脂层内和平皿边缘生长的菌落。注意细菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落与供试品颗粒、培养基沉淀物、气泡、油滴等的鉴别。必要时用放大镜或用低倍显微镜直接观察，或挑取可疑物涂片镜检。
10.1.5.2供试品如为微生物制剂，应将有效微生物菌落排除，不可点计在细菌、霉菌和酵母菌数内。排除的方法需按该制剂微生物品种而定，并须观察菌落特征及染色形态。
10.1.5.3供试品稀释液常含有不溶性原料、辅料，培养基注皿后亦可能产生沉淀物，经过培养后有时形成数量很多的有形物，且难与菌落相鉴别。为了有利于菌落计数，可在操作时将适宜稀释级的供试液
多增加注皿（1～2个平皿），注皿后不经培养面放置于冰箱（勿结冻）中，在计数菌落时作为对照。或用0.001％TTC营养琼脂注皿，经培养后该培养基生长的菌落为红色，衬于白色背景上易于点计细菌菌落和区分基他有形物。有些软膏等非水溶性供试品，经营养琼脂注皿后呈乳白色，培养后生长的菌落不易辨认和点计，为防止这种情况，也可用0.001％TTC营养琼脂注皿。
10.1.5.4若平板上有2个或2个以上菌落重叠，肉眼可辨别时仍以2个或2个以上菌落计数；若平板生长有链状或片状、云雾状菌落，菌落间无时显界线时，一条链、片作为为一个菌落计，但若链、片上出现性状与链（片）状菌落不同的可辨菌落时，仍应分别计数，若生长蔓延的较大的片状菌落或花斑样菌落，其外缘有若干性状相似的单个菌落，一般不宜作为计数用。
10.1.5.5若各稀释级2个平板菌落的平均数在15以上，同释释级二平板菌落数相差1倍时，该稀释级菌落数不得作为计数依据；当2个平板菌落均数在15（含15）以下时，两个平板菌落数的差值允许范围为0～4，1～7，2～9，3～10，4～12，5～14，6～15，7～17，8～18，9～19，10～20。超出以上范围即视为操作误差，不得作为计数依据。
10.1.5.6菌落生长呈蔓延趋势者，细菌，霉菌需逐日作初步点计，在点计霉菌菌落时，轻轻翻转平板，勿反复翻转，否则使早期形成的孢子散落在平板的基他部位，又萌生新的霉菌落，导致计数误差。10.1.5.7在48小点计细菌，72小时点计霉菌时，如菌落极小，不易
辨计，可延长培养时间5～7天，再点计菌落数。
10.1.5.8对有疑议的供试品以YPD培养基作酵母菌计数时，可培养至1周再点计菌落数。
10.1.5.9含蜂蜜、王浆液体制剂用玫瑰红钠琼脂培养基点计霉菌数，YYD琼脂培养基点计酵母菌落。两者计数值合并报告。
10.1.5.10在特殊情况下，若营养琼脂培养基上生长有霉菌和酵母菌其数量多于玫瑰红钠琼脂培养基上生长的霉菌和酵母菌，或玫瑰红钠琼脂培养基上生长的细菌数多于营养琼脂培养基上生长的细菌数，以菌落数多的培养基中的菌数报告结果。
10.1.6菌数报告规则
宜选取细菌、酵母菌平均菌落数在30～300之间、霉菌平行菌落数在30～300之间的稀释级，作为菌数报告的依据。
10.1.6.1当公有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数（见附表例10.1.6.1）。
10.1.6.2当有2个相邻稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值
高稀释级平均菌落数×稀释倍数
比值＝
低稀释级平均菌落数×稀释倍数
而定。若比值小于或
等于2，以两稀释级的菌落娄乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数报告菌数（见附表例10.1.6..2，10.1.6.3）；当出现比值大于5，甚至高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证（见附表例10.1.6.4和10.6.7）。
10.1.6.3 当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数（见附表例10.1.6.5）。
10.1.6.4 如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以小于10报告菌数（见附表例10.6.6）。
附表：细菌数报告规则举例
规则原液
各稀释级菌落平均数
比值菌落数报告数1：10 1：102 1：103
10.1.6.1 不可计 164 20 － 16400 16000 10.1.6.2 不可计 295 46 1.6 37750 38000 10.1.6.3 不可计 271 60 2.2 27100 27000 10.1.6.4 39 41 4 10.2 异常
10.1.6.5 24 19 12 － 240 240 10.1.6.6 0.5 0 0 － 5 <10 10.1.6.7 22 27 0 * * * 培养基稀释法测定
10.2 薄膜过滤法
10.2.1 取滤膜孔径不大于0.45μm，直径不小于50mm可拆卸的滤器。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法进行灭菌。使用时，必须保证滤膜在过滤前后的完整性。
10.2.2 水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗液、冲洗量及冲刺方法同方法验证试验。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。
10.2.3 每张滤膜取相当于1g或1ml供试品的供试液直接过滤，或加至适量稀释剂中，混匀，过滤。若供试品1g或1ml含菌较多，可选适宜稀释级的供试液1ml，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生物生长。
10.2.4 阴性对照试验取试验用的稀释剂1ml同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。
10.2.5 培养和计数培养及菌落计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不多于100个。如菌落数超过100个，不便计数时，可取高
稀释级的供试液同法操作，点计滤膜上的菌落数。
10.2.6 菌数报告规则以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告；若滤膜上无菌落生长，以<1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或<1乘以稀释倍数的值报告菌数。
10.3 培养基稀释法：
取低稀释级供试液（原液或1：10供试液）2份，每份各1ml，分别注入5个或5个以上平皿中（每皿0.2ml或<0.2ml），每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml，混匀，凝固后，倒置培养，计数。
每1ml供试液等量分注5个或5个以上平板点计的菌落数之和，即为每1ml的菌落数，共得2组数据。以2份低稀释级供试液菌落数的平均数乘以稀释倍数的值报告。
10.4 结果报告
10.4.1 菌落数在100以内时，按实有数据报告。
10.4.2 菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约规则处理。
10.5 复试
供试品细菌数、霉菌和酵母菌数其中任一项一次检验不合格，应从同一批样品中随机重新取2倍包装量的供试品，依法作单项复试两次，以三次检验结果的均值报告。若3次结果的平均值不超过高品种项下的规定，判供试品符合规定；否则，判供试品不符合规定。
11 注意事项
11.1 供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时，
酵母菌和霉菌教学设计Teaching design of yeast and mould
酵母菌和霉菌教学设计 前言：小泰温馨提醒，生物学又称生命科学、生物科学，是一门由经验主义出发，广泛的 研究生命的所有面向之自然科学，内容包括生命起源、演化、分布、构造、发育、功能、 行为、与环境的互动关系，以及生物分类学等。本教案根据生物课程标准的要求和针对教 学对象是初中生群体的特点，将教学诸要素有序安排，确定合适的教学方案的设想和计划、并以启迪发展学生智力为根本目的。便于学习和使用，本文下载后内容可随意修改调整及 打印。 1.了解（青霉或曲霉）的形态结构，营养方式和生殖方式及酵母 菌和霉菌对自然界的意义和与人类的关系。 2.通过指导学生观察酵母菌、青霉或曲霉，继续培养学生的 动手实验能力和观察能力。 3.通过了解酵母菌和霉菌与人类的关系，学会用一分为二的 方法分析事物。 重点、难点分析 1.酵母菌和霉菌的形态结构和生活特点，酵母菌和霉菌对自 然界的意义和与人类的关系是本章的重点知识。因为： （1）通过学习酵母菌和霉菌的形态结构，让学生与所学过 的植物细胞结构、细菌细胞结构进行比较分析，归纳总结出它们 在细胞结构上的异同。这样有利于培养学生的分析和综合能力。 （2）通过学习酵母菌和霉菌的生活特点，有利于了解酵母 菌和霉菌对自然界的意义和与人类的关系，使学生懂得研究微生 物的重要任务之一就是用其利，避其害。了解真菌在经济上所蕴
藏的潜在价值是巨大而多样的。 2.酵母菌的营养方式是本章的教学难点： 酵母菌既是异养（腐生）厌氧型真菌，又是异养需氧型真菌，由于初一学生知识水平有限，教师要讲清酵母菌获得能量的方式一定难度。 教学过程设计 一、本课题参考课时为一课时。 二、第一课时： 1.课前准备： 教师首先做好酵母菌的培养。酵母菌的简易培养方法如下： ①提前2～3天用3％～5％的蔗糖或2％葡萄糖溶液放入鲜酵母或一小块发面，恒温22℃培养。 ②将苹果皮切碎或用散发酒味的水果皮，装入瓶内，注意瓶子不要太大，轻轻压实，加入凉开水浸没，不用接种，在较温暖的地方培养2～3天镜检，即能找到酵母菌。 2.教学过程： （1）关于酵母菌形态结构的教学，可以用边讲述边实验的方法进行，有条件的学校最好在实验室上课。课上教师首先指导学生制作含有大量酵母菌的临时装片，并指导学生用显微镜观察酵母菌的形态结构；如果无实验室条件，在教室上课，课前教师可事先做好1～2台观察酵母菌的示范镜。这样学生通过对酵母菌形态结构的观察，对酵母菌建立感性认识。如果不具备以上条件
GB 4789.15－2010
食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数
福建省疾病预防控制中心 马群飞
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食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数
National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of moulds and yeasts
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霉菌和酵母的基本特性
相对于低等的细菌来说，霉菌 和酵母生长缓慢，竞争能力较弱， 故霉菌和酵母常在不利于细菌生长 繁殖的环境中形成优势菌群。由于 霉菌和酵母的细胞较大，新陈代谢 能力强，故10２～10４个酵母即可引 起一克食物的变质，而细菌则需要 100倍于此数的细胞。
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食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数
National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of moulds and yeasts
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《观察酵母菌和霉菌》教案 封丘县曹岗乡第一初中张立柱一．教学目标 1.让学生利用显微镜和放大镜，观察酵母菌和霉菌 2.让学生掌握酵母菌、霉菌的结构以及显着的区别，让学生熟练的操作酵母菌的染色，看到细胞核及突起物。 3.学生看到霉菌的结构会说出孢子的颜色，菌丝的表现，总结出霉菌的结构特点。 二．教学重点难点 1.教学重点：让学生自己总结出酵母菌、霉菌的结构，霉菌、蘑菇等真菌的细胞里都有细胞核，是真核生物。 2. 教学难点：在显微镜下观察酵母菌和霉菌后写出实验报告以及小组合作的效果。 三．教学过程 1.导语 同学们，我们已经知道了细菌的结构、特点和作用，但是你们知道不知道真菌的结构呢？我们都吃过蘑菇，蘑菇的种类很多，最有代表性的蘑菇是黑木耳、白木耳，又叫做银耳、香菇、牛肝菌，还有我们叫不出名字的野蘑菇，我们这里下过雨以后在路边、树林都会发现默默无闻的可爱的蘑菇，他们有的像把雨伞，有的像个蒙古房，它们都是真菌长出来的，它们没有叶绿素，没有根茎叶的分化，他们由菌盖、菌柄、菌丝，菌褶构成，菌褶处存在有孢子，孢
子是蘑菇的后代，靠风传播。有的蘑菇能吃，有的有毒，但能提取兴奋剂，真菌种类多，但不外乎几大类，正如人一样，有黑人、白人、黄种人。有人从霉菌培养皿中提取一种药物，他把它叫做青霉素，并获得了诺贝尔奖，青霉素的药效是抑制病菌的生长和发育，可以治疗咳嗽、发热，还可以治疗淋病。真菌也有坏处，如让人手长手癣、脚气。 真菌又小又可爱，我们用肉眼直接看不到它们，今天我们上实验课，借助显微镜来观察，我为大家配置好的酵母菌、霉菌，大家分小组一起观察，最后写出实验报告 2.目的要求 认识酵母菌和霉菌的结构，并且知道它们属真菌。 3.材料用具 酵母菌的培养液，橘子皮上的霉菌，吸管，镊子，显微镜，解剖针，载玻片，盖玻片，放大镜，碘液，吸水纸。 4.实验步骤 （1）观察酵母菌 a.取一滴酵母菌的培养液，滴在载玻片上，盖上盖玻片，用显微镜观察。 b.在盖玻片一侧滴上一滴碘液，以防碘液过多从另一侧流出，可以用吸水纸吸引，千万不要把碘液滴在实验台上，在显微镜下观察。 结论：①看到酵母菌是椭圆形，液泡。 ②经染色看到细胞核，淀粉粒，大小突起是酵母菌，出芽生
一、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。 二、适用范围：细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。 三、责任者：质量标准分析方法验证小组。 四、正文： 1、验证申请 2、验证立项申请表 3、验证方案 4、验证方案的批复 5、验证报告 6、验证报告的审批 7、验证证书
细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证申请。我公司细菌、霉菌及酵母菌计数方法严格按照《中华人民共和国兽药典》2005年版质量标准分析方法验证指导原则进行，今拟对细菌、霉菌及酵母菌计数方法进行验证。请予以批准！ 附：细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证小组成员名单 组长： 成员： 申报单位：质量标准分析方法验证小组 申报日期：年月日
验证申请批复
细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证方案 一、概述： 1、名称：微生物限度检查法细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证报告。 2、目的：当建立微生物限度检查法时，应进行细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌霉菌及酵母菌数的测定。 3、验证判断标准：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ 4、验证人员： 质保部：负责对验证结果进行评价。 化验室：负责验证情况的检测和监督。 总经理：负责对验证结果进行评价。 5、验证日期： 二、验证 1、验证依据：《中华人民共和国兽药典》2005年版附录XIJ微生物限度检查法。 按供试液的制备和细菌霉菌及酵母菌计数所规定的薄膜过滤法及其有关要求进行。 2、内容： （1）菌液所用的菌株传代次数为3 代，接种大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，培养24小时， 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养48小时，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为60cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养7天，加入5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌沙布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数60cfu的孢子悬液。 （2）验证方法验证试验进行了3次独立的平行试验。 A、试验组供试液（Ⅰ）纯化水1ml（Ⅱ）药品名称（1：100）10g，取供试液
1目的 规范食品中霉菌和酵母菌测定的标准操作规程。 2范围 本标准规定了食品中霉菌和酵母菌（moulds and yeasts）的计数方法。本标准适用于各类食品中霉菌和酵母菌的计数。 3责任 质量部组织制订、化验室负责实施。 4内容 4.1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 4.1.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。 4.1.2 恒温培养箱：28 ℃±1 ℃。 4.1.3 均质器。 4.1.4 恒温振荡器。 4.1.5 显微镜：10×～100×。 4.1.6 电子天平：感量0.1 g。 4.1.7 无菌锥形瓶:容量500 mL、250 mL。 4.1.8 无菌广口瓶：500 mL。 4.1.9 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)。
4.1.10 无菌平皿：直径90 mm。 4.1.11 无菌试管: 10 mm×75 mm。 4.1.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。 4.2 培养基和试剂 4.2.1 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：见附录A 中A.1。 4.2.2 孟加拉红培养基：见附录A 中A.2。 4.3检验程序 霉菌和酵母计数的检验程序见图1。
图1 霉菌和酵母计数的检验程序4.4操作步骤 4.4.1 样品的稀释
4.4.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品至盛有225 mL 灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225 mL 无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10 的样品匀液。 4.4.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 4.4.1.3 取1 mL 1:10 稀释液注入含有9 mL 无菌水的试管中, 另换一支1 mL 无菌吸管反复吹吸,此液为1:100 稀释液。 4.4.1.4 按 5.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管。 4.4.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液于2 个无菌平皿内。同时分别取1 mL样品稀释液加入2 个无菌平皿作空白对照。 4.4.1.6 及时将15 mL～20 mL 冷却至46 ℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂或孟加拉红培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 4.4.2 培养 待琼脂凝固后，将平板倒置，28℃±1℃培养5d，观察并记录。 4.4.3 菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colonyforming units，CFU）表示。
GB 4789.15-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数 录入时间:2010-4-28 9:02:54 来源：国家卫生部 本标准自实施之日起代替 GB/T 4789.15-2003《食品卫生微生物学检验霉菌和酵母计数》。 本标准与 GB/T 4789.15-2003 相比，主要修改如下： ——修改了范围； ——修改了检验程序和操作步骤； ——修改了培养基和试剂； ——修改了设备和材料； ——修改了附录。 本标准的附录 A为规范性附录，附录 B 为资料性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ——GB 4789.15-1984、GB 4789.15-1994、GB/T 4789.15-2003。 1 范围 本标准规定了食品中霉菌和酵母菌（moulds and yeasts）的计数方法。 本标准适用于各类食品中霉菌和酵母菌的计数。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 冰箱：2℃～5℃。 2.2 恒温培养箱：28℃±1℃。 2.3 均质器。 2.4 恒温振荡器。 2.5 显微镜：10×～100×。 2.6 电子天平：感量 0.1 g。 2.7 无菌锥形瓶:容量 500 mL、250 mL。
2.8 无菌广口瓶：500 mL。 2.9 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL 刻度)、10 mL(具0.1 mL 刻度)。 2.10 无菌平皿：直径 90 mm。 2.11 无菌试管: 10 mm×75 mm。 2.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。 3 培养基和试剂 3.1 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：见附录 A 中 A.1。 3.2 孟加拉红培养基：见附录 A 中 A.2。 4 检验程序 霉菌和酵母计数的检验程序见图1。
霉菌和酵母菌介绍及检测方法 一、霉菌和酵母菌介绍： 霉菌和酵母菌及其检验酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。 霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。长期以来，人们利用某些霉菌和酵母加工一些食品，如用霉菌加工干酪和肉，使其味道鲜美；还可利用霉菌和酵母酿酒、制酱；食品、化学、医药等工业都少不了霉菌和酵母。但在某些情况下，霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。 二、检验方法： 霉菌和酵母的计数方法，与菌落总数的测定方法基本相似。主要步骤为：将样品制作成10倍梯度的稀释液，选择3个合适的稀释度，吸取1mL于平皿，倾注培养基后，培养观察，计数。对霉菌的计数，还可以采用显微镜直接镜检计数的方法。 具体检测标准参见： GB4789.15-94，《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物检验霉菌和酵母计数》三、说明： 1．样品的处理。为了准确测定霉菌和酵母数，真实反映被检食品的卫生质量，首先应注意样品的代表性。对大的固体食品样品，要用灭菌刀或镊子从不同部位采取试验材料，再混合磨碎。如样品不太大，最好把全部样品放到灭菌均质器杯内搅拌2min。液体或半固体样品可用迅速颠倒容器25次来混匀。 2．样品的稀释：为了减少榈稀释倍数的误差，在连续递增稀释时，每一稀释度应更换一根吸管。在稀释过程中，为了使霉菌的孢子充分散开，需用灭菌吸管反复吹吸50次。 3．培养基的选择：在霉菌和酵母计数中，主要使用以下几种选择性培养基。 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）：霉菌和酵母在PDA培养基上生长良好。用PDA作平板计数时，必项加入抗菌素以抑制细菌。 孟加拉红（虎红）培养基：该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌落的计数。 高盐察氏培养基：粮食和食品中常见的曲霉和青霉在该培养基上分离效果良好，它具有抑制细菌和减缓生长速度快的毛霉科菌种的作用。 4．倾注培养。每个样品应选择3个适宜的稀释度，每个稀释度倾注2个平皿。培养基熔化后冷却至45℃，立即倾注并旋转混匀，先向一个方向旋转，再转向相反方向，充分混合均匀。培养基凝固后，把平皿翻过来放温箱培养。大多数霉菌和酵母在25－30℃的情况下生长良好，因此培养温度25~28℃。培养3d后开始观察菌落生长情况，共培养5d观察记录结果。 5．菌落计数及报告：选取菌落数10~150之间的平板进行计数。一个稀释度使用两个平
霉菌与酵母菌计数方法 1试验菌液得制备与使用(以白色念珠菌为示例) 白色念珠菌(0)代 ↓ 传代培养 ↓ 实验菌液得制备:沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养 基,培养温度20～２5℃,培养时间2~3天 ↓ 计数培养基适用性检查:胰酪大豆胨琼脂培养基,培养温度３0～3５℃, 培养时间不超过5天,接种量不大于10０cｆu ↓ 计数方法适用性试验:胰酪大豆胨琼脂培养基(ＭPＮ法不适用),培养温 度３０～３5℃,培养时间不超过５天,接种量不大于10０cfu 注:当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌与酵母菌总数时,应进行培养基适用性检查,检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基 1.１菌种 试验用菌株得传代次数不得超过５代(从菌种保藏中心获得得干燥菌种为第0代),并采用适宜得菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株得生物学特性。 1。2菌液制备(按表1规定程序培养各试验菌株) 取白色念珠菌得新鲜培养物 ↓ 用pH7、0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无菌氯化钠溶液制成适宜浓度得菌悬液 取黑曲霉得新鲜培养物 ↓ 加入3～５ｍｌ含0.０５%聚山梨酯80得pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0、9％无 菌氯化钠溶液,将孢子洗脱 ↓ 采用适宜得方法吸出孢子悬液至无菌试管内 ↓ 用含0。05％聚山梨酯80得pＨ7.０无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液或0。９%无菌氯 化钠溶液制成适宜浓度得黑曲霉孢子悬液 菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;若保存在２~8℃,可在24小时内使用、稳定得黑曲霉孢子悬液可保存在2~８℃,在验证过得贮存期内使用、
1。３阴性对照 为确认试验条件就是否符合要求,应进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长,应进行偏差调查、 2、培养基适用性检查 按表1规定,接种不大于100cｆu得菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板 ↓ 置表１规定条件下培养 ↓ 每一试验菌株平行制备2管或2个平皿 ↓ 同时,用相应得对照培养基替代被检培养基进行上述试验 ↓ 被检固体培养基上得菌落平均数与对照培养基上得菌落平均数得比值应在0。5-2范围内,且菌落形态大小应与对照培养基上得菌落一致;被检液体培养基管与对照培养基管比较,试验 菌应生长良好 3计数方法适用性试验 供试液制备:水不溶性非油脂类供试品 ↓ 取供试品,用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液,或pH7。2磷酸盐缓冲液,或胰酪大豆胨 液体培养基 ↓ 制备成１:10供试液。 ↓ 若需要,调节供试液ｐH值至6~8。必要时,用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释、 ⒉接种与稀释 所加菌液得体积应不超过供试液体积得1％、为确认供试品中得微生物能被充分检出,首先应选择最低稀释级得供试液进行计数方法适用性试验。
“观察酵母菌和霉菌”实验报告单 名称 姓名实验“观察酵母菌和霉菌” 组员 实验内容 材料用具 目的要求酵母菌培养液、橘子皮上的青霉、吸管、镊子、显微镜、解剖针、载玻片、盖玻片、放大镜、稀释的碘液、吸水纸 认识酵母菌、霉菌的形态结构年级八上生物实验类型提交时间分组实验指导老师 方法步骤 酵母菌电镜照片xx霉菌电镜照片 (1)观察酵母菌 1.取一滴酵母菌培养液，滴在载玻片上、盖上盖玻片、用显微镜观察，就能看到一个个椭圆形的细胞，细胞中有明显的液泡，这就是酵母菌。 2.在盖玻片的一侧滴一滴碘液、用吸水纸从另一侧吸引，对酵母菌进行染色、在显微镜下能看到酵母菌细胞中染上颜色的细胞核和淀粉粒。有的细胞上长出大小不一的突起，这是酵母菌在进行出芽生殖。 （2）观察青霉 1.从培养皿中取一块长有青霉的橘子皮，垫上白纸，用放大镜观察，可以看到一条条直立生长的白色绒毛，这就是青霉的直立菌丝，菌丝的顶端长有成串的青绿色的孢子。
2.用解剖针挑取少许长有袍子的菌丝，制成临时装片，置于显微镜下观察。注意观察菌丝有没有颜色，直立菌丝的顶端有没有扫帚状的结构，以及孢子的着生状态和颜色。 讨论 1.酵母菌的细胞结构有什么特点？ 2.青霉孢子的颜色和着生状态有什么特点？ 1.制备酵母菌培养液时，应将装置放在25-30℃的环境中培养，以使酵母菌快速繁殖。 2.酵母菌培养液应含有一定浓度的糖，但是糖的浓度不宜过高。 3.培养青霉时，可以在培养皿里垫一层吸水纸，加适量的水，并盖上盖，放在阴暗温暖的环境中。 每天往里面加适量的温水，以保持一定的温度。 4.青霉分生孢子梗上成串的孢子容易碰落，盖盖玻片时要特别小心，动作须轻缓，盖好后不能移动位置。 注意事项 AA
霉菌和酵母菌检测 1设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1.1 冰箱：2°C ?5°C。 1.2恒温培养箱：28C±1C O 1.3均质器。 1.4恒温振荡器。 1.5显微镜：10＞?100 X, 1.6电子天平：感量0.1g o 1.7无菌锥形瓶:容量500ml、250ml O 1.8无菌广口瓶：500ml O 1.9无菌吸管：1ml（具0.01m I刻度）、10ml（具0.1m I刻度）。 1.10无菌平皿：直径90mm。 1.11 无菌试管：10mn X 75mm。 1.12无菌牛皮纸袋、塑料袋。 2培养基和试剂 2.1马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：见附录A中A.1 O 2.2孟加拉红培，养基: 见附录A中A.2 O 3操作方法 3.1试验前准备 3.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。 3.1.2开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。 3.1.3操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用
乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。 3.1.4操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。 3.2样品稀释液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备样品稀释液。样品稀释液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45C。样品稀释液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 3.2.1固体和半固体样品 称取25g样品至盛有225ml灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225ml无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。 3.2.2液体样品 以无菌吸管吸取25ml样品至盛有225ml无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 3.3霉菌和酵母菌计数 3.3.1用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:10 0的样品匀液。 3.3.2按3.3.1操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。 3.3.3根据对样品污染状况的估计，选择2个?3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 3.3.4及时将15ml?20ml冷却至46C的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基或孟加拉红培养基（可放置于46C±C恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 3.4培养
霉菌和酵母菌检测 1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1.1 冰箱：2℃～5℃。 1.2 恒温培养箱：28℃±1℃。 1.3 均质器。 1.4 恒温振荡器。 1.5 显微镜：10×～100×。 1.6 电子天平：感量0.1g。 1.7 无菌锥形瓶:容量500ml、250ml。 1.8 无菌广口瓶：500ml。 1.9 无菌吸管：1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)。 1.10 无菌平皿：直径90mm。 1.11 无菌试管：10mm×75mm。 1.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。 2 培养基和试剂 2.1 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基：见附录A中A.1。 2.2 孟加拉红培养基：见附录A中A.2。 3 操作方法 3.1 试验前准备 3.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。 3.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。 3.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。 3.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。 3.2 样品稀释液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备样品稀释液。样品稀释液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。样品稀释液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 3.2.1 固体和半固体样品 称取25g样品至盛有225ml灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225ml无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。 3.2.2 液体样品 以无菌吸管吸取25ml样品至盛有225ml无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 3.3 霉菌和酵母菌计数 3.3.1 用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。 3.3.2 按3.3.1操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ml 无菌吸管或吸头。 3.3.3 根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 3.3.4 及时将15ml～20ml冷却至46℃的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基或孟加拉红培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 3.4 培养 待琼脂凝固后，将平板翻转，28℃±1℃培养5d，观察并记录。 3.5 菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位（colony forming units，CFU）表示。选取菌落数在10CFU～150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。 3.6 结果与报告
霉菌与酵母菌计数方法 1试验菌液的制备和使用（以白色念珠菌为示例） 白色念珠菌（0）代 ↓ 传代培养 ↓ 实验菌液的制备：沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养 基，培养温度20～25℃，培养时间2～3天 ↓ 计数培养基适用性检查：胰酪大豆胨琼脂培养基，培养温度30～35℃， 培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu ↓ 计数方法适用性试验：胰酪大豆胨琼脂培养基（MPN法不适用），培养温 度30～35℃，培养时间不超过5天，接种量不大于100cfu 注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培养基 1.1菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 1.2菌液制备（按表1规定程序培养各试验菌株） 取白色念珠菌的新鲜培养物 ↓ 用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液取黑 曲霉的新鲜培养物 ↓ 加入3～5ml含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化 钠溶液，将孢子洗脱 ↓ 采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内 ↓ 用含0.05％聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯 化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。 1.3阴性对照 为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴 性对照有菌生长，应进行偏差调查。 2.培养基适用性检查 按表1规定，接种不大于100cfu的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板 ↓ 置表1规定条件下培养 ↓ 每一试验菌株平行制备2管或2个平皿 ↓ 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验 ↓ 被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试 验菌应生长良好 3计数方法适用性试验 供试液制备：水不溶性非油脂类供试品 ↓ 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨 液体培养基 ↓ 制备成1:10供试液。 ↓ 若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀 释。
1. 霉菌和酵母的基本特性 霉菌和酵母这种称谓仅是为了方便起见，将小型真菌有真正菌丝的称为霉菌，没有菌丝的称酵母，并没有分类学上的依据。相对于低等的细菌来说，霉菌和酵母生长缓慢，竞争能力较弱，故霉菌和酵母常在不利于细菌生长繁殖的环境中形成优势菌群。由于霉菌和酵母的细胞较大，新陈代谢能力强，故10２～10４个酵母即可引起一克食物的变质，而细菌则需要100倍于此数的细胞。 通常霉菌和酵母适合在高碳低氮有机物如植物性物质上生存。适合的pH 3～8，有些霉菌可以在pH2，酵母在pH 1.5时生活。水活度要求0.99～0.61，霉菌0.85时最适宜，某些嗜渗酵母和霉菌常引起糖果类食品的变质。一般的霉菌的生长温度为20～30℃，部分霉菌可以在不低于－7℃的温度下生长。酵母一般在0～45℃时生长。耐热能力较差，酵母细胞55～56℃几分钟就被杀死。少数霉菌的孢子（如丝衣霉）则可在90℃中耐受几分钟。霉菌和酵母很多可以耐受防腐剂。如乳酸、醋酸、CO２和SO２等。有些酵母酯酶活性高并能合成B族维生素。 2. 食品中酵母的常见类群 在食品中能分离出各种酵母菌，但它们很可能没有什么意义，因为其中多数来源于外界的偶然污染。仅有非常有限的几个酵母属可使经过加工并正常生产工艺包装的食品腐败。比如抗SO２熏蒸的酵母，就是饮料、葡萄酒变质的常见因素。耐受保鲜剂的毕赤酵母，高度嗜氧，可以形成泡菜和酱油的表面膜。
当然，如果不按照标准的生产程序进行食品生产，那么许多外界污染的酵母都将在食品中大量繁殖，这种情况下，就谈不上优势菌群问题了，也不必进行酵母的分类鉴定。处理方法只有一个，恢复正常的生产程序。 2.1 乳制品：鲜奶易因细菌污染而腐败，酵母菌不是重要问题。当鲜奶被加工成奶油、乳酪、酸奶等制品后，由于细菌被抑制，酵母可相应地成为优势菌。它们使奶油、乳酪产生怪味和气体，使黄油产生有味物质，并可使酸奶和酸乳酪腐败。在实验室中，汉逊德巴利酵母、布提利假丝酵母、多孢丝孢酵母和红酵母均能导致固体和液体乳酪的腐败。 2.2 肉类与肉制品：通常情况下，这类制品适于细菌的生长，酵母不是引起变质的主要原因。某些德巴利酵母可使冷冻的猪、牛肉香肠和午餐肉表面出现令人不愉快的粘滑感觉。 2.3 水果和蔬菜：两者的差别主要是pH值。水果通常为酸性，pH值在1.8～2.2左右（味浓的水果，柠檬等）到pH 4.5～5.0（西红柿等）之间，对细菌有抵抗力。而蔬菜的pH值接近中性，对细菌侵入敏感。通常引起水果腐败的原因是霉菌而非酵母，只有柠檬型克拉克酵母可侵入破损的草莓。 2.4 果酱、蜜饯、果汁和干果：这类食物的特点是水活度低。一些接合酵母能使加热不完全的果酱败坏。鲁接合酵母和拜尔接合酵母可引起包装好的巧克力变质。即使仅沾上几个细胞，最终也将生长而产生大量气体至将外包装胀破。拜尔接合酵母同样能使果汁变质，它能在
项目三食品中霉菌和酵母菌计数 一、实验目的 1.掌握测定霉菌和酵母菌的方法和技能 2.熟练无菌操作技术。 二、实验原理 酵母菌是真菌中的一大类，通常是单细胞，呈圆形,卵圆形、腊肠形或杆状。 霉菌也是真菌，能够形成疏松的绒毛状的菌丝体的真菌称为霉菌。 霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为食品中正常菌相的一部分。 霉菌和酵母也可造成中腐败变质。由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等。由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长；有些霉菌能够合成有毒代谢产物－霉菌毒素。霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鲜的和加工的食品中繁殖，可使食品发生难闻的异味，它还可以使液体发生混浊，产生气泡，形成薄膜，改变颜色及散发不正常的气味等。因此霉菌和酵母也作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。目前已有若干个国家制订了某些食品的霉菌和酵母限量标准。我国已制订了一些食品中霉菌和酵母的限量标准。 霉菌和酵母菌的测定是指食品检样经过处理，在一定条件培养后，所得1g或1ml检样中霉菌和酵母菌菌落数。 三、设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 冰箱 恒温培养箱 均质器 恒温振荡器 显微镜 电子天平无菌锥形瓶 无菌广口瓶 无菌吸管 无菌平皿 无菌试管 无菌牛皮纸袋、塑料袋 培养基和试剂
马铃薯 葡萄糖 琼脂培养基 孟加拉红培养基： ４检验程序 霉菌和酵母计数的检验程序见图１。 ５操作步骤 ５．１样品的稀释 ５．１．１固体和半固体样品：称取２５ｇ样品至盛有２２５ｍＬ灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为１∶１０ 稀释液。或放入盛有２２５ｍＬ无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打２ｍｉｎ，制成１∶１０的样品 匀液。 ５．１．２液体样品：以无菌吸管吸取２５ｍＬ样品至盛有２２５ｍＬ无菌蒸馏水的锥形瓶（可在瓶内预置适 当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成１∶１０的样品匀液。 ５．１．３取１ｍＬ１∶１０稀释液注入含有９ｍＬ无菌水的试管中，另换一支１ｍＬ无菌吸管反复吹吸，此液为１∶１００稀释液。图１霉菌和酵母计数的检验程序５．１．４按５．１．３操作程序，制备１０倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用１次１ｍＬ无菌吸管。 ５．１．５根据对样品污染状况的估计，选择２个～３个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）， 在进行１０倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取１ｍＬ样品匀液于２个无菌平皿内。同时分别取 １ｍＬ样品稀释液加入２个无菌平皿作空白对照。 ５．１．６及时将１５ｍＬ～２０ｍＬ冷却至４６℃的马铃薯 葡萄糖 琼脂或孟加拉红培养基（可放置于 ４６℃±１℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 ５．２培养 待琼脂凝固后，将平板倒置，２８℃±１℃培养５ｄ，观察并记录。 ５．３菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位
第一节酵母菌和霉菌 第一节酵母菌和霉菌 第一节酵母菌和霉菌 教学目标 1．了解酵母菌和霉菌（青霉或曲霉）的形态结构，营养方式和生殖方式及酵母菌和霉菌对自然界的意义和与人类的关系。 2．通过指导学生观察酵母菌、青霉或曲霉，继续培养学生的动手实验能力和观察能力。 3．通过了解酵母菌和霉菌与人类的关系，学会用一分为二的方法分析事物。 重点、难点分析 1．酵母菌和霉菌的形态结构和生活特点，酵母菌和霉菌对自然界的意义和与人类的关系是本章的重点知识。因为：（1）通过学习酵母菌和霉菌的形态结构，让学生与所学过的植物细胞结构、细菌细胞结构进行比较分析，归纳总结出它们在细胞结构上的异同。这样有利于培养学生的分析和综合能力。 （2）通过学习酵母菌和霉菌的生活特点，有利于了解酵母菌和霉菌对自然界的意义和与人类的关系，使学生懂得研究微生物的重要任务之一就是用其利，避其害。了解真菌在经济上所蕴藏的潜在价值是巨大而多样的。 2．酵母菌的营养方式是本章的教学难点：
酵母菌既是异养（腐生）厌氧型真菌，又是异养需氧型真菌，由于初一学生知识水平有限，教师要讲清酵母菌获得能量的方式一定难度。 教学过程设计 一、本课题参考课时为一课时。 二、第一课时： 1．课前准备： 教师首先做好酵母菌的培养。酵母菌的简易培养方法如下： ①提前2～3天用3％～5％的蔗糖或2％葡萄糖溶液放入鲜酵母或一小块发面，恒温22℃培养。 ②将苹果皮切碎或用散发酒味的水果皮，装入瓶内，注意瓶子不要太大，轻轻压实，加入凉开水浸没，不用接种，在较温暖的地方培养2～3天镜检，即能找到酵母菌。 2．教学过程： （1）关于酵母菌形态结构的教学，可以用边讲述边实验的方法进行，有条件的学校最好在实验室上课。课上教师首先指导学生制作含有大量酵母菌的临时装片，并指导学生用显微镜观察酵母菌的形态结构；如果无实验室条件，在教室上课，课前教师可事先做好1～2台观察酵母菌的示范镜。这样学生通过对酵母菌形态结构的观察，对酵母菌建立感性认识。如果不具备以上条件的学校，教师可以课前画好酵母菌结构的投影片，也可以利用挂图及书中的插图，有录像设备的'学校可以在课上放一段酵母菌形态
霉菌和酵母菌检测 1范围 本规范规定了化妆品中霉菌和酵母菌数的检测方法。 本规范适用于各种化妆品中霉菌和酵母菌的总数测定。 2定义 本规范采用下列定义。 霉菌和酵母菌总数是指化妆品检样在一定条件下培养后，1g或1mL化妆品中所污染的活的霉菌和酵母菌菌落总数，藉以判明化妆品被霉菌和酵母菌污染程度及其一般卫生状况。 本方法根据霉菌和酵母菌特有的形态和培养特性，在虎红培养基上，置28℃培养72h，计算所生长的霉菌和酵母菌数。 3仪器和设备 3.1恒温霉菌培养箱：28℃。 3.2振荡器。 3.3天平。 3.4三角瓶。 3.5试管。 3.6试管架。 3.7平皿： 直径90mm。 3.8刻度吸管：1mL、2mL、10mL。 3.9量筒。
3.10酒精灯。 3.11高压灭菌器。 4培养基和试剂 4.1生理盐水 4.2虎xx(xxxx)培养基 成分： 蛋白胨5g 葡萄糖10g 磷酸二氢钾1g 硫酸镁(含7H 2O) 0.5g xx20g 虎红溶液100mL (四氯四碘荧光素) 蒸馏水1000mL 氯霉素100mg 制法： 将上述前5种成分加入蒸馏水中溶解后，再加入虎红溶液。分装后，103.43kPa(15
lb)20min高压灭菌。另用少量乙醇溶解氯霉素，过滤除菌后，加入培养基中，若无氯霉素，可用链霉素代替，每1000mL培养基加链霉素30mg。 5操作步骤 5.1样品稀释： 用灭菌吸管吸取1:10稀释的检液2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。 另取1mL注入到9mL灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面)，更换一支吸管，并充分混匀，制成1:100检液。吸取2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成1:1000，1:100，……等，每种稀释度应换1支吸管。。 5.2取1:10的检液2mL分别注入2个灭菌平皿内，每皿1mL（若菌量较多时可顺序再做10倍稀释），另取1个灭菌空平皿（作空白对照），每皿分别注入融化并冷至45℃左右的虎红培养基约15mL，充分摇匀。凝固后，翻转平板，置28℃培养箱，培养72h，计数平板内生长的霉菌和酵母菌数。若有霉菌蔓延生长，为避免影响其它霉菌和酵母菌的计数时，于48h应及时将此平板取出计数。 5.3计算方法： 先点数每个平板上生长的霉菌和酵母菌菌落数，求出每个稀释度的平均菌落数。判定结果时，应选取菌落数在5～50个范围之内的平皿计数，乘以稀释倍数后，即为每g(或每mL)检样中所含的霉菌和酵母菌数。其它范围内的菌落数报告应参照菌落总数的报告方法报告之。 5.4每g(或每mL)化妆品含霉菌和酵母菌数以CFU/g(mL)表示。
注意：由于实验内容较多，所以我们只要把蓝色字体部分写在实验报告上即可，黑体字部分自己看一下。由于11-13周为教学质量检查周，督导随时可能来查，所以预习报告还是要写。 细菌、酵母菌、放线菌和真菌接种方法和形态观察 一、微生物的接种技术 1 目的 1.1学习掌握微生物的几种接种技术 1.2 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节 2 基本原理 将微生物培养物或含有微生物的样品在无菌条件下移植到培养基上的操作技术称为接种。接种的关键是严格进行无菌操作。常用的接种方法有斜面接种、液体接种、穿刺接种、平板接种和固体接种等。 3 实验材料 3.1 菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、玫瑰暗黄链球菌、曲霉、荨麻青霉的斜面培养物 3.2 培养基：营养琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基及高氏1号培养基的斜面和平板3.3 试剂：5ml无菌生理盐水试管 3.4 仪器与其他用品 酒精灯、记号笔、试管、橡胶塞、试管架、接种环、培养皿、超净台等。 4 操作步骤 4.1 斜面接种法 斜面接种法主要用于传代活化、纯化培养、鉴定或保存菌种。通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，液体培养基中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行。 将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在外侧，接种管在内侧，斜面向上管口对齐，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。 右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍。 用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。 将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出。 接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。不同种类微生物的接种方式各异，具体如下： （1）细菌和放线菌由斜面培养基底部自下而上来回做“Z”形密集划线，勿划破培养基。（2）真菌菌落为局限性生长的曲霉、青霉等采用上下涂布法接种。菌落为扩散性生长的根霉、毛霉等采用点植法接种。 4.1.6塞管塞和接种环灭菌 接种完毕，将接种环抽出，灼烧管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放