线粒体的提取步骤
制备程序：
a.组织匀浆：称取50-200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS冲洗，用
剪刀剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。估计组织块总体积。加入
1.5 ml冰预冷的Mito Sdution。上下研磨组织20次。
b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 ×g 5~10 min离心收集细胞。计数。每次提取需要2-5 ×107个细胞。加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution 重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内。用间隙严密的研杵研磨细胞30-40次。
1. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管。800 ×g 离心5 min 4 oC。细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底,弃去。
2. 收集上清液并转移到新的离心管。800 ×g 离心5 min at 4 oC。弃沉淀
3. 将上清液转移到新的离心管。10,000 ×g 离心10 min 4 oC。离心后的上清含胞浆成分，将上清转移到新离心管，可收集用于对照实验。线粒体沉淀在管底。
4. 洗涤线粒体：清除管内壁粘连的液体和碎片，加入0.2 ml Mito Sdution轻弹管底重悬线粒体沉淀，12,000 ×g 离心10 min 4 oC。弃上清，线粒体沉淀在管底。
5. 用Mito Sdution或合适后续实验的自备缓冲液重悬线粒体沉淀50 μl/每100 mg组织或100 μl/5 ×107个细胞。测定蛋白浓度。立即使用或?70 oC保存。
注意：
1. 为保证获得完整的线粒体，第一是全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中。第二是快速。微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的线粒体。第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。在相差显微镜下检查未裂解细胞应在~50%左右即可。过度研磨将破坏线粒体，研磨不足将降低得率。
2. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。
3. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入样品缓冲液裂解线粒体。
4. 细胞色素c氧化酶可用作线粒体的标志酶。
线粒体的分离
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实验三线粒体的分离、超活染色与观察 一、实验目的 1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。 2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。 3、学习细胞器的超活染色技术。 二、实验原理 利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 三、实验材料与方法 1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。 2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。温箱，冰箱，冷冻控温高速离心机（或普通高速离心机），高速离心机，显微镜，恒温水浴锅，解剖盘，玻璃匀浆器，剪刀、镊子，双面刀片，载玻片，凹面载玻片，盖玻片，漏斗，小烧杯，表面皿，吸管，牙签，吸水纸，纱布，瓷研钵，尼龙织物。 四、实验方法 （一）大鼠肝线粒体的分离 1、制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组
实验八线粒体的分离与观察 实验目的 用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。 实验原理 线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。 制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 I．鸡肝线粒体的分离 实验用品 一、材料 鸡肝脏 二、试剂 1. 生理盐水 2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。 3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：
线虫细胞核和线粒体提取 N2同步化后，转移至培养皿，每皿大约4000条，2 day后到了mid-late L4，day5，day10，day15收集线虫（也有文献选择1、6、12、17day）。初步计划收集10个皿线虫。 1.细胞核分离 细胞核蛋白提取查阅的文献上都没提及是用哪个厂家的试剂盒，只简单说了自己采用的方法，也不是很具体。查到一份Protocol采用蔗糖分离法提取细胞核，此方法开始是用于肝组织(Widnell and Tata 1964)，后来被用于动物软组织(Rickwood et al. 1997)，后来成功用于肌细胞和培养的细胞。 方法如下： 1.在10cm细胞培养皿中培养的细胞系，直到它们达到90％汇合 2.分离当天，吸出培养基，然后用冰冷的PBS清洗细胞。吸出PBS。 3.将培养皿放在冰上，用1 mL PBS将细胞从板上刮掉。转移将细胞加入到冰上的1.5mL离心管中。 4.以10000rpm短暂离心5-10秒。 5.吸掉上清液，并将沉淀物重悬在9个填充细胞体积均质培养基中 6.用Potter-Elvehjem匀浆器将悬浮液均质化，冰上匀6次 7.用棉布过滤匀浆 8.在4℃下以600g离心滤液10分钟。丢弃上清液。用步骤5中一半体积的均匀培养基重悬沉淀。4℃ 600g 离心10分钟。丢弃上清液。 10.将9体积的高渗蔗糖缓冲液加入沉淀。在Potter-Elvehjem匀浆器（5或6冲程）或Dounce均化器在冰上。 11.在4℃下以60,000g-80,000g离心匀浆80分钟。 12.翻转管子去除蔗糖。从管壁擦去剩余的蔗糖，注意不要擦掉细胞核。 核在这个阶段保留其膜。要卸下膜，请执行步骤13。 13.为了除去核膜，将来自步骤12的沉淀重悬含有0.5％Triton X-100的匀浆介质。在4℃下以600g离心10分钟。重复该过程。最后，如果需要，用均质介质洗涤沉淀以除去剩余的TritonX-100。 14.将沉淀物重悬在选择的介质中用于随后的分析。 分离的细胞核可以尝试裂蛋白，再用BCA法检测蛋白浓度。 2.线粒体提取 查阅了文献，线粒体蛋白提取采用的是Qproteome Mitochondria Isolation Kit (Qiagen 37612)，流程如下： 1.将新鲜切除的组织放在冰上，取出适当的大小样品。用1ml 0.9％（w / v）氯化钠溶液洗涤样品。 2.将样品切成约2毫米3片，放入2毫升反应液中管，并加入500μl含蛋白酶抑制剂的裂解液。 3.使用TissueRuptor转子定子使样品均质化，均质器设最低速度转10s。 4.吸取1.5ml含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液加入管中并孵育在4℃摇床上10分钟。 5.在4℃下以1000xg离心匀浆10分钟。 6.小心地清除上清液 7.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中使用1毫升枪头吹打。细胞使用钝头针头和注射器进行破
mt DNA的分离及纯化 按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。 1.2 1000 g?min-1离心15min；取上清液；15000 g?min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L?g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 μg?m L-1，30℃下作用30min。 1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。15000g?min-1离心20min。沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。 1.4 按0.5 m L?g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。 1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。 1.6 15000g?min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl， 0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。 1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50μg?m L-1，37℃保温1h。4℃保存待用。
从动物组织中粗提线粒体 一、实验目的： 从动物组织中分离线粒体，以便线粒体功能分析实验。 二、实验准备 Lysis buffer、匀浆器、离心管、解剖器具 三、实验步骤： 1．实验前一天小鼠禁食过夜。线粒体提取前所有溶液要冰上预冷。 2．解剖小鼠（~30g），快速取出肝脏，去除胆囊，放入50ml预冷的IBc烧杯中； 3．预冷的IBc洗去多余的血液。洗4-5次至IBc澄清。 4．冰上将肝脏剪碎 5．倒掉清洗的IBc，加入新的5mlIBc，将上清转移至玻璃匀浆器 6．以1,600 rpm冰上匀浆3-4次，组织与缓冲液比例1：5-1：10间 7．匀浆液转移至50ml离心管，600g，离心10min 4 ℃ 8．小心将上清转移至新的离心管600g，离心10min 4 ℃ 9．小心将上清转移至新的离心管7000g，离心10min 4 ℃ 10．倒掉上清，加入5ml预冷的IBc，洗一次，不要用枪头重悬 11．7000g，离心10min 4 ℃ 12．去除上清，重悬底部的含有线粒体的颗粒。用玻璃棒搅松底部的沉淀，不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬。用1ml移液管重悬避免出现气泡。 13．转移至14ml离心管，置于冰上。线粒体在1-3小时内用于实验，得到比较好的活性。 14．Bradford法测定线粒体浓度。 四、试剂配方 Buffer for cell and mouse liver mitochondria isolation (IBc)：100 ml 10 ml 0.1M Tris–MOPS 1 ml 0.1M EGTA/Tris 20 ml 1M sucrose 100 ml ddH2O，pH 7.4 储液： 1 M sucrose： 342.3 g sucrose 1L ddH2O Mix, 20 ml分装-20 C保存. 0.1MTris/MOPS： 12.1 g Tris； 500ml ddH2O，MOPS 调pH 7.4，ddH2O 体积至1L保存于4 C. 0.1 M EGTA/Tris： 38.1 g EGTA； 500 ml ddH2O，Tris调pH 7.4 总体积至1L ，保存于4 C. 五、注意事项 1. 开始前将离心管预冷5min，所有步骤包括匀浆在4度冰上进行，降低磷脂酶和蛋白酶活性； 2．最后重悬时，用玻璃棒搅松底部的沉淀。不加IBc，用弃去上清的少量缓冲液重悬，线
线粒体提取 缓冲液A（100 mM Tricine-KOH (pH 7.4), 300 mM sucrose, 10 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM potassium-EDTA, 0.1% BSA, 5 mM DTT and protease inhibitors: 1 mM PMSF, 10 g/ml pepstatin A）。 缓冲液B（pH 7.4, 无DTT ，余下同分离缓冲液A）。 1、将拟南芥叶片10g,置于研钵中，剪碎。 2、加25ml分离缓冲液A，冰上充分研磨。 3、匀浆液经4层纱布过滤。滤液取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（1）。 4、于2,600g 离心15 min（Beckman J2-HS），弃沉淀。上清取20ul用于细胞色素c活性 测定，记为（2）。 5、上清液进一步在12,000g 离心15 min，此时得到线粒体粗提样。 6、弃上清，将沉淀轻柔地悬浮于2 ml分离缓冲液B中。从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（3）。 7、铺制蔗糖密度梯度于38ml超离管中，介质由上到下依次包括6 ml / 0.6 M sucrose, 6 ml / 0.9 M sucrose, 8 ml/ 1.2 M sucrose, 8 ml /1.45 M sucrose 和8 ml/ 1.8 M sucrose。介质均用缓冲液B配制。 8、然后将2 ml悬浮液铺于蔗糖密度梯度介质上。 9、然后以24000rpm离心90 min（SW28 Beckman rotor）。 10、超离结束后，收集1.45M/1.2M层组分于50ml离心管中，缓冲液B稀释5倍。 11、12000g离心15min，沉淀即为纯化的线粒体。 13、将沉淀重悬于500ul缓冲液B中，从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（4）。 14、纯化的线粒体液氮速冻，存于-80℃。
动物线粒体D NA 提取的原理和方法 *X 夏玉玲 刘彦群 鲁 成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室 重庆 400716) 摘 要 从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。 关键词 线粒体 线粒体D N A 提取方法 线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。它是细胞进行氧化磷酸化的场所。线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。 动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下: 1 提取动物线粒体D N A 的原理 1.1 线粒体的特征 线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。 线粒体的主要成分是蛋白质(占干重60~65%)和脂类(占干重35~40%)。此外还有少量的核酸(主要为D NA 和RNA)、金属离子、阴离子和维生素等。其中线粒体膜主要成分是蛋白质、脂类和一些酶,基质由各种酶、D N A 、RNA 、金属离子、阴离子和维生素等组成。mtD N A 不24蚕 学 通 讯 Ne wsletter of Sericultural Science 第22卷 第3期 2002年 9月 X X X 通讯作者 国家自然科学基金项目资助(项目编号:30170719)
组织和线粒体裂解液（Tissue and Mitochondrial lysis buffer）： Components Final concentration Tris-HCl 50mM pH7.4 NaCl 150mM EDTA 2mM EGTA 2mM Triton X-100 0.2% NP-40 0.3% PMSF 100uM NaVO3 1mM NaF 250mM Leupeptin 10ug/ml Aprotinin 2ug/ml DTT 1mM 组织线粒体的分离 1) 小鼠脱臼处死，迅速取出组织，放入用冰预冷的线粒体提取缓 冲液中， 2) 充分洗去血水，尽量去除非组织成分， 3) 在小烧杯中加入新鲜的提取缓冲液，用小剪刀将组织剪碎， 4) 4℃，电动匀浆机，600rpm 上下3 次， 5) 1000g 4℃离心10min，将上清小心倒入新离心管中， 6) 重复上面步骤一次， 7) 10,00Og 4℃离心10min,沉淀即为线粒体， 8) 倒掉上清，加入新鲜的提取缓冲液重悬沉淀，10,000g 洗一次， 9) 最后用适量的提取缓冲液小心悬起沉淀，冰上保存备用（不要超过6hours）， 10) 定量线粒体蛋白浓度，用于后续分析。 分离或培养细胞线粒体的提取(Dounce 匀浆法) 低渗线粒体缓冲液（Hypotonic mitochondrial buffer）:100 ml Components Final concentration Hepes(KOH) 20mM pH7.2 Sucrose 210mM Mannitol 70mM EDTA 1mM EGTA 1mM
货号: QS3307 规格：50管/48样线粒体分离和线粒体酶提取试剂盒说明书 分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： 线粒体是半自主性细胞器，不仅是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，为细胞的活动提供能量，而且在许多生命活动中具有重要调控作用。因此，准确和全面分离保持正常活性的线粒体已经成为许多研究的前提。 测定原理： 利用专门试剂温和匀浆组织和细胞，再采用差速离心法从匀浆中分离完整线粒体；利用专门试剂，配合超声波破碎线粒体，可以得到保持活性的线粒体酶。 自备实验用品及仪器： 超声波破碎仪、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 试剂一：50mL×1瓶，-20℃保存； 试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存； 试剂三：10mL×1瓶，-20℃保存； 试剂四：1mL×1支，-20℃保存； 提取步骤： ①准确称取约0.1g组织或收集约500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂四，用冰浴匀浆 器或研钵研磨。 ② 4 ℃ 600 g离心5min。 ③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心10min。 ④上清液即胞浆提取物，可用于研究线粒体蛋白向胞浆的释放。 ⑤沉淀为完整线粒体。含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能。可用于线粒体的 生理功能等方面的研究。 ⑥在沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂四，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3 秒，间隔10秒，重复30次），可用于线粒体酶活性测定。 ⑦在沉淀中加入200uL试剂三和2uL 试剂四，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3 秒，间隔10秒，重复30次），可用于线粒体蛋白浓度测定。 注意事项： 1、分离线粒体和提取线粒体蛋白质的所有步骤均需在冰上或4℃进行，所用溶液需冰浴或4℃预冷。 2、通常在分离线粒体时前后两次离心速度选取600g和11,000g，如果希望纯度更高，但对 线粒体的得率要求不高，前后两次离心速度可以采用1000g和3500g。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 第1页，共1页
线粒体的提取与观察 线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取，当所用样品较少时（如电镜和光镜的观察）可采用从组织培养细胞中提取，本实验就是介绍两种材料制备用于光镜观察的线粒体。 一、目的与要求 了解提取线粒体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般形态 二、基本原理 线粒体具有完整的结构，一定的大小和质量，低温条件下在等渗液中破碎细胞，差速离心后，获得线粒体。经活性染料Janus green B染色，线粒体呈浅蓝色。 三、实验内容 1．线粒体的分离提取 2. 鼠肝的匀浆制备 3. 线粒体的活体染色 四、实验步骤 （一）动物组织线粒体的分离，提取与观察 显微镜检查：将1％Janus green B溶液按1:1比例加入线粒体悬液中,在室温或水浴中染15~20分钟,用吸管吸取一滴线粒体悬液，滴于载玻片上，加盖玻片后，放显微镜下进行观察，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。 2．组织培养细胞的线粒体的提取与观察
（三）操作中应该注意的问题 1．整个操作过程为保证线粒体的完整，应尽量使操作时的环境如温度（0—4℃），pH (7.0左右)保持恒定，同时尽可能短操作时间。 2．组培细胞消化时要特别小心，防止损失或反复。（损失指细胞脱落到消化液中）。 3．匀浆时，所用的介质一定是等渗缓冲液，常用的有0.25 mol/L蔗糖溶液或生理盐水代替Hank’s液 4．匀浆次数依照匀浆器的松紧而定，次数过少，细胞破损不完全，就会影响线粒体产量。 5．所以取2/3上清夜用来制备线粒体是为防止细胞碎片过多影响观察。 6．整个分离过程，一般最好在30—60分钟内完成，不宜过长。
线粒体提取 缓冲液A(100 mM Tricine-KOH (pH 7.4), 300 mM sucrose, 10 mM KCl, 1 mM MgCl, 1 2mM potassium-EDTA, 0.1% BSA, 5 mM DTT and protease inhibitors: 1 mM PMSF, 10 ,g/ml pepstatin A)。 缓冲液B(pH 7.4, 无DTT ，余下同分离缓冲液A)。 1、将拟南芥叶片10g,置于研钵中，剪碎。 2、加25ml分离缓冲液A，冰上充分研磨。 3、匀浆液经4层纱布过滤。滤液取20ul用于细胞色素c活性测定，记为(1)。 4、于2,600g 离心15 min(Beckman J2-HS)，弃沉淀。上清取20ul用于细胞色素c活性 测定，记为(2)。 5、上清液进一步在12,000g 离心15 min，此时得到线粒体粗提样。 6、弃上清，将沉淀轻柔地悬浮于2 ml分离缓冲液B中。从中取20ul用于细 胞色素c活性测定，记为(3)。 7、铺制蔗糖密度梯度于38ml超离管中，介质由上到下依次包括6 ml / 0.6 M sucrose, 6 ml / 0.9 M sucrose, 8 ml/ 1.2 M sucrose, 8 ml /1.45 M sucrose 和 8 ml/ 1.8 M sucrose。介质均用缓冲液B配制。 8、然后将2 ml悬浮液铺于蔗糖密度梯度介质上。 9、然后以24000rpm离心90 min(SW Beckman rotor)。 28 10、超离结束后，收集1.45M/1.2M层组分于50ml离心管中，缓冲液B稀释5倍。 11、12000g离心15min，沉淀即为纯化的线粒体。
线粒体的提取步骤 制备程序： a.组织匀浆：称取50-200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS冲洗，用剪 刀剪为0.5cm2碎块放入小容量玻璃匀浆器内。估计组织块总体积。加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution。上下研磨组织20次。 b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 × g 5~10 min离心收集细胞。计数。每次提取需要2-5 × 107个细胞。加入1.5 ml冰预冷的Mito Sdution重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内。用间隙严密的研杵研磨细胞30-40次。 1. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管。800 × g 离心 5 min 4 oC。细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底,弃去。 2. 收集上清液并转移到新的离心管。800 × g 离心5 min at 4 oC。弃沉淀 3. 将上清液转移到新的离心管。10,000 × g 离心10 min 4 oC。离心后的上清含胞浆成分，将上清转移到新离心管，可收集用于对照实验。线粒体沉淀在管底。 4. 洗涤线粒体：清除管内壁粘连的液体和碎片，加入0.2 ml Mito Sdution轻弹管底重悬线粒体沉淀，12,000 × g 离心10 min 4 oC。弃上清，线粒体沉淀在管底。 5. 用Mito Sdution或合适后续实验的自备缓冲液重悬线粒体沉淀50 μl/每100 mg组织或100 μl/5 × 107个细胞。测定蛋白浓度。立即使用或?70 oC保存。 注意： 1. 为保证获得完整的线粒体，第一是全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中。第二是快速。微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的线粒体。第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。在相差显微镜下检查未裂解细胞应在~50%左右即可。过度研磨将破坏线粒体，研磨不足将降低得率。 2. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。 3. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入样品缓冲液裂解线粒体。 4. 细胞色素c氧化酶可用作线粒体的标志酶。 威斯腾生物400-675-6758
线粒体提取试剂盒 产品组成： 产品组成 BB-3601-1 BB-3601-2 规格 50T 100T 线粒体提取液A 20ml 40ml 线粒体提取液B 20ml 40ml 线粒体保存液 20ml 40ml 产品简介： 本试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的线粒体提取。不能用于冷冻样品 的线粒体提取。 细胞线粒体提取： 1.取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基， 尽可能吸干，收集细胞； 2.用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 3.加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。 4.用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。 5.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。 6.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。 7.在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。 8.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。 9.弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。 10.即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。 组织线粒体提取： a)取50-100mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。 b)用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。 c)加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。 d)用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。 e)快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。 f)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。 g)在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。 h)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。 i)弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。 j)即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。 相关产品： 产品 产品号 产品 产品号 总蛋白提取试剂盒BB-3101 磷酸化蛋白富集试剂盒 BB-3108 核蛋白提取试剂盒 BB-3102 膜蛋白提取试剂盒 BB-3103 - 1 -
线粒体蛋白提取 1.线粒体蛋白抽取液配方(pH7.4)：250mM蔗糖，20mM HEPES，10mM KCl,1.5mM MgCl2,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM DTT, 17ug/mL PMSF, 8ug/mL aprotinin, 2ug/mL leupeptin；-20℃保存。 2.步骤： （1）收集5X10E7细胞，并用PBS洗细胞； （2）往细胞沉淀加入2mL上述抽取液，并混匀，可以采用超声或匀浆器方法破膜，程度至苔盼兰染色约90%的细胞为蓝色。 （3）750g，4℃离心5分钟，收集上清，此时沉淀即为细胞膜成分。 （4）13000rpm,4℃离心30分钟, 弃上清，此时沉淀即为线粒体成分。 （5）用100uL列解液重悬沉淀，-80℃保存备用. 培养悬浮细胞全蛋白裂解的方法 1.细胞裂解液（pH8.0）的配方：20mM Tris-Cl，1% NP-40, 137mM NaCl, 20mM DTT, 2mM Sodium Vanadate，1ug/mL Aprotinin, 1ug/mL leupetin, 1mM PMSF；配好后分装-20℃保存，其中PMSF和蛋白酶抑制剂量使用时现加。 2.裂解方法：按1X106细胞/100uL的比例加细胞裂解液,混匀后冰浴30分钟, 12,000r pm, 4℃,离心10min, 实验时取25uL的上清加5uL 6X上样缓冲液煮沸5分钟使蛋白变性后，12000rpm离心5分钟，取上清和预染Marker加样电泳。或-80℃保存备用。 细胞核蛋白质的提取2009-04-28 21:28 一、试剂准备 缓冲液A 缓冲液B 10mmol/L HEPES-KOH pH7.9 20mmol/L HEPES-KOH pH7.9 1.5mmol/L MgCL2 1.5mmol/L MgCL2 10mmol/L KCL 420mmol/L NaCL 0.5mmol/L DTT 0.2mmol/L EDTA 0.2mmol/L PMSF 25% Glycerol 0.5mmol/L DTT 0.2mmol/L PMSF 二、操作步骤
线粒体提取试剂盒使用说明 货号：SM0020 规格：50T/100T 保存：四周内使用可4℃储存，长期保存请置于-20℃ 产品内容： 组份SM0020-50SM0020-100 Lysis Buffer50ml100ml Mito-Wash Buffer25ml50ml Store Buffer5ml10ml 产品简介： 线粒体提取试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞的线粒体的制备。其制备物产量高，可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。 操作步骤： 1.样本处理 a.组织匀浆：称取100~200mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.0mL冰预冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨组织20次； b.培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800g离心5~10min收集细胞，计数。每次提取需要5×107个细胞，加入 1.0mL冰预冷的Lysis Buffer重悬细胞，将细胞悬液转
移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨30~40次。 2.将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4℃，1000g离心5min。 3.取上清，转移至新的离心管中，4℃，1000g再次离心5min。 4.取上清，转移至新的离心管中，4℃，12,000g离心10min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。 5.往线粒体沉淀中加入0.5mL Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000g离心5min。 6.取上清，转移至新的离心管中，4℃，12,000g离心10min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底。 7.用50-100μL Store Buffer或合适的反应缓冲液重悬线粒体沉淀，立即使用或-70℃保存。 注意事项： 1.为保证获得完整的线粒体，务必做到：第一，全程低温操作；第二，快速；第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞，这是制备线粒体的最关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。 2.以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。 3.进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入上样缓冲液裂解线粒体。 转速与离心力换算： G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]２ G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示；
实验三线粒体的分离、超活染色与观察 一、实验目的 1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。 2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。 3、学习细胞器的超活染色技术。 二、实验原理 利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 三、实验材料与方法 1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。 2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。温箱，冰箱，冷冻控温高速离心机（或普通高速离心机），高速离心机，显微镜，恒温水浴锅，解剖盘，玻璃匀浆器，剪刀、镊子，双面刀片，载玻片，凹面载玻片，盖玻片，漏斗，小烧杯，表面皿，吸管，牙签，吸水纸，纱布，瓷研钵，尼龙织物。 四、实验方法 （一）大鼠肝线粒体的分离 1、制备大鼠肝细胞匀浆。实验前大鼠空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干。称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0－4℃的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。然后在0－4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25mol/L缓冲蔗糖溶液将肝组织
?论 著? 线粒体DNA 提取方法的比较3 李伟文 陆松敏 刘建仓 武 凡 李 萍 柏干荣 第三军医大学野战外科研究所(重庆,400042) 摘要 目的将提取线粒体DNA 的碱变性法、T riton 法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线粒体DNA 的方法。方法分离W istar 大鼠小肠上皮细胞,用3种方法提取线粒体DNA ,紫外分光光度法定量。用琼脂糖凝胶电泳和线粒体A T Pase 8亚基基因PCR 扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA 。结果改进高盐沉淀法线粒体DNA 量最多,T riton 法最少。OD 260 OD 280均在1.78～1.85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA 用于PCR 扩增,测定出了线粒体DNA A T Pase 8亚基基因序列。结论改进高盐沉淀法提取线粒体DNA 具有操作简单,产量多的优点,该法所提取m tDNA 可用于m tDNA 测序。 关键词 线粒体;DNA ;分子遗传学 3 国家“九七三”项目资金资助(G 1999054202) 1981年,A nderson 用氯化铯密度梯度分离得到线粒体DNA (m tDNA ),进行了全序列分析。此后,m tDNA 的研究日益得到重视。本实验将T riton 法、碱变性法与改进高盐沉淀法进行了比较,发现后者具有简便、经济、易重复等优点。1 材料和方法111 试剂和溶液 琼脂糖系P rom ega 产品,其它生化试剂系国产分析纯。 ①溶液 :含T ris 2HC l 10mm o l L ,N aC l 10mm o l L ,M gC l 25mm o l L pH 7.5; ②溶液 :T ris 2HC l 10mm o l L ,N aC l 400 mm o l L ,ED TA 2mm o l L pH 8.0; ③溶液A :含50mm o l L 葡萄糖,25mm o l L T ris 2HC l 30mm o l L ED TA N a 2,pH 8.0; ④溶液B :0.2m o l L N aOH 含1%SD S (临用前用5m o l L N aOH 和10%SD S 贮存液配制); ⑤溶液C :3m o l L 醋酸钾溶液,pH 5.4,含5m o l L 醋酸根离子; ⑥T riton 溶解液:含10mm o l L KC l ,15mm o l L T ris 2HC l ,pH 8.3, 2.5mm o l L M gC l 2,1%V V T riton X 2100; ⑦ΚDNA B am H M arker 16841、 7233、6770、6527、5256 5505bp ;⑧BD 2000M arker 3000,2000,1000,750,500,200bp 。 112 细胞分离 大鼠颈椎脱臼处死,剖腹取远端回肠约30c m 。先用37℃生理盐水冲洗肠腔后,注入0.25%枸盐酸钠生理盐水溶液,直至近充盈为止。结扎两端,置于盛有37℃生理盐水的三角烧杯中,恒温摇床50r m in ,20m in 。 弃内容液,分为8段,每段加含0.02%ED TA 生理盐水2m l .37℃恒温摇床100r m in ,35m in ,轻轻挤压一遍,100r m in ,5m in 。 收集肠内容液,加入约12m l 生理盐水,2500r m in ,10m in , 弃上清,沉淀再加入生理盐水,2500r m in ,5m in .重复洗涤一次.计数后进行m tDNA 提取。113 m t D NA 提取及纯化 1.3.1T riton 法[1] 取107细胞沉淀,悬浮于5m l 的T riton 溶解液中。温和振荡片刻后,室温下放置10m in 。反应完毕的溶液以8000r m in 离心1m in , 上清即为m tDNA 。 1.3.2碱变性法[2] 取107细胞沉淀,依次加入溶 液A (4℃)150Λl ,冰浴中将沉淀吹打分散后加入 300Λl 溶液B (常温),将Eppendrof 管缓慢颠倒10次,冰浴裂解变性6～8m in ,再加入225Λl 溶液C (0～4℃),轻柔混匀,冰浴复性20～25m in 。反应完毕的溶液以10000r m in 离心6m in ,4℃,取上清。1.3.3改进高盐沉淀法[3] 取107细胞沉淀,加入溶 液 5500Λl ,混匀,2000r m in ,10m in ,弃上清。沉淀加溶液 5500Λl ,混匀,3500r m in ,10m in ,弃上清。沉淀加溶液 950Λl ,混匀后加入20m g m l 蛋白酶K 50Λl 和10%SD S 120Λl ,快速混匀。40℃过夜或50℃4h 。加入300Λl 饱和醋酸钠,混匀,轻摇15S 。15000r m in ,4℃,15m in ,取上清于