?论 著?
线粒体DNA 提取方法的比较3
李伟文 陆松敏 刘建仓 武 凡 李 萍 柏干荣
第三军医大学野战外科研究所(重庆,400042)
摘要 目的将提取线粒体DNA 的碱变性法、T riton 法、改进高盐沉淀法加以比较,以得到最方便快速提取线粒体DNA 的方法。方法分离W istar 大鼠小肠上皮细胞,用3种方法提取线粒体DNA ,紫外分光光度法定量。用琼脂糖凝胶电泳和线粒体A T Pase 8亚基基因PCR 扩增产物鉴定所提取的线粒体DNA 。结果改进高盐沉淀法线粒体DNA 量最多,T riton 法最少。OD 260 OD 280均在1.78～1.85间。将改进高盐沉淀法提取线粒体DNA 用于PCR 扩增,测定出了线粒体DNA A T Pase 8亚基基因序列。结论改进高盐沉淀法提取线粒体DNA 具有操作简单,产量多的优点,该法所提取m tDNA 可用于m tDNA 测序。
关键词 线粒体;DNA ;分子遗传学
3
国家“九七三”项目资金资助(G 1999054202)
1981年,A nderson 用氯化铯密度梯度分离得到线粒体DNA (m tDNA ),进行了全序列分析。此后,m tDNA 的研究日益得到重视。本实验将T riton 法、碱变性法与改进高盐沉淀法进行了比较,发现后者具有简便、经济、易重复等优点。1 材料和方法111 试剂和溶液
琼脂糖系P rom ega 产品,其它生化试剂系国产分析纯。
①溶液 :含T ris 2HC l 10mm o l L ,N aC l 10mm o l L ,M gC l 25mm o l L pH 7.5;
②溶液 :T ris 2HC l 10mm o l L ,N aC l 400
mm o l L ,ED TA 2mm o l L pH 8.0;
③溶液A :含50mm o l L 葡萄糖,25mm o l L T ris 2HC l 30mm o l L ED TA N a 2,pH 8.0;
④溶液B :0.2m o l L N aOH 含1%SD S (临用前用5m o l L N aOH 和10%SD S 贮存液配制);
⑤溶液C :3m o l L 醋酸钾溶液,pH 5.4,含5m o l L 醋酸根离子;
⑥T riton 溶解液:含10mm o l L KC l ,15mm o l L T ris 2HC l ,pH 8.3, 2.5mm o l L M gC l 2,1%V V T riton X 2100;
⑦ΚDNA B am H M arker 16841、
7233、6770、6527、5256 5505bp ;⑧BD 2000M arker 3000,2000,1000,750,500,200bp 。
112 细胞分离
大鼠颈椎脱臼处死,剖腹取远端回肠约30c m 。先用37℃生理盐水冲洗肠腔后,注入0.25%枸盐酸钠生理盐水溶液,直至近充盈为止。结扎两端,置于盛有37℃生理盐水的三角烧杯中,恒温摇床50r
m in ,20m in 。
弃内容液,分为8段,每段加含0.02%ED TA 生理盐水2m l .37℃恒温摇床100r m in ,35m in ,轻轻挤压一遍,100r m in ,5m in 。
收集肠内容液,加入约12m l 生理盐水,2500r m in ,10m in ,
弃上清,沉淀再加入生理盐水,2500r m in ,5m in .重复洗涤一次.计数后进行m tDNA 提取。113 m t D NA 提取及纯化
1.3.1T riton 法[1] 取107细胞沉淀,悬浮于5m l
的T riton 溶解液中。温和振荡片刻后,室温下放置10m in 。反应完毕的溶液以8000r m in 离心1m in ,
上清即为m tDNA 。
1.3.2碱变性法[2] 取107细胞沉淀,依次加入溶
液A (4℃)150Λl ,冰浴中将沉淀吹打分散后加入
300Λl 溶液B (常温),将Eppendrof 管缓慢颠倒10次,冰浴裂解变性6～8m in ,再加入225Λl 溶液C (0～4℃),轻柔混匀,冰浴复性20～25m in 。反应完毕的溶液以10000r m in 离心6m in ,4℃,取上清。1.3.3改进高盐沉淀法[3] 取107细胞沉淀,加入溶
液 5500Λl ,混匀,2000r m in ,10m in ,弃上清。沉淀加溶液 5500Λl ,混匀,3500r m in ,10m in ,弃上清。沉淀加溶液 950Λl ,混匀后加入20m g m l 蛋白酶K 50Λl 和10%SD S 120Λl ,快速混匀。40℃过夜或50℃4h 。加入300Λl 饱和醋酸钠,混匀,轻摇15S 。15000r m in ,4℃,15m in ,取上清于
Eppendrof管中。取上清后步骤相同。上清中加入等体积酚∶氯仿∶异醇(25∶24∶1),温和振荡8 m in,10000r m in,10m in4℃,取上层水相重复该过程抽提一次,轻取上层水相。加入2倍体积冰乙醇或等体积异丙醇,冰浴30m in,15000r m in,10 m in,弃上清。用70%冰乙醇漂洗沉淀,15000r m in,2m in,彻底去上清。沉淀于空气中自然部分干燥25m in,加入适量R T E液溶解。贮于4℃。
114 m t D NA样品鉴定
1.4.1紫外分光光度法测定 样品经适当稀释,用
B ECK M AN DU7500紫外分光光度计定量。
1.4.2琼脂糖凝胶电泳 电泳用D YY2 2型电泳仪,0.7%琼脂糖凝胶,取6Λl溶解液与2Λl上样液混匀后点样,与ΚDNA B am H M arker比较, 100V4m in,50V60m in,紫外灯下观察并拍照。1.4.3聚合酶链反应(PCR)检测 以改进高盐沉淀法所提取m tDNA样品作为模板,测定线粒体DNA A T Pase8亚基基因序列。2个引物由上海博亚生物工程公司设计,1A:5′2 A CAA T GA CA T GCCA CAA C23′;1B:5′2GGGAA CA TAA T AA T GGTCA C23′;扩增长度248bp。扩增PCR标准反应体系在0.5m l Eppendrof管中进行,反应总体积为50Λl。加入10×buffer5Λl,M gC l2(25mm o l L)3.6Λl,4
×
dN T P3.6Λl,引物1A 1B(0.5Λl Λg)各1.4Λl,
模板(0.03Λg Λl)10Λl,PCR用水27Λl,石蜡油
23Λl,95℃预变性220s,加入T aqDNA聚合酶0.9
Λl。循环条件,95℃变性40S,55℃退火30S,72℃延
伸36S,反应30个循环,最后72℃延伸10m in.用
D YY2 2型电泳仪,2%琼脂糖凝胶,取4Λl溶液与
1ΛL上样液混和后点样,与BD2000M arker比较,
100V4m in,55V35m in后紫外灯下观察、拍照,并
进行DNA序列测定。
2 结果
211 m t D NA的紫外吸收光谱分析
m tDNA样品浓度在0.3～1.3Λg Λl之间。
OD260 OD280在1.78～1.85之间,改进高盐沉淀
法所提取m tDNA量最多,碱变性法次之,T riton法
最少(表1)。
表1 几种方法提取m tDNA量的比较(x
θ±s,n=8)
T riton法碱变性法高盐沉淀法
m tDNA量(Λg Λl)0.21±0.020.30±0.02313.29±0.8833??
注:3P<0.05(碱变性法与T riton法比较),
33P<0.01(高盐沉淀法与T riton法比较);
??P<0.01(高盐沉淀法与碱变性法比较)
212 m t D NA琼脂糖凝胶电泳分析
3种方法所提取m tDNA样品电泳后,均可见
16.3kb的单一m tDNA条带(图1)。改进高盐沉淀
法提取m tDNA电泳条带最亮,T riton法的最弱。
图1 3种方法提取m tDNA琼脂糖凝胶电泳图 图2 A T Pase8基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳
A、E泳道为ΚDNA BamH IM arkers, A、B泳道分别为BD2000M arker,248bp产物
B、C、D泳道分别为高盐沉淀法、碱变性法、
T riton法提取ntDNA。
213 PCR产物分析
扩增产物图谱为248bp左右片段(图2)。送上
海博亚生物工程公司测序,将测序结果经计算机
GenB ank查询,发现与W istar大鼠m tDNA
A T Pase8亚基基因同源性在99%,确定为线粒体
基因,位置为7735～7983。
3 讨论
自A nderson用氯化铯密度梯度分离得到线粒
体DNA后,有人参考T am u ra和Palva提取动物组
织m tDNA的方法,结合碱变性法提20kb以下质
粒DNA原理,提取了人肝组织中m tDNA。胡义德
对该方法进行了改进。戴纪刚建立通过核质分离,即利用非离子型去污剂T riton2100能溶解核被膜以外的所有细胞膜的特点[4],分离细胞核 细胞质,来获取m tDNA。而高盐沉淀法通过SD S(十二烷基硫酸钠)破坏细胞膜、核膜,使蛋白质变性,从而游离出来核酸。ED TA能抑制细胞中DNA酶的活性。蛋白酶K进一步将蛋白质降解成小肽。加入饱和乙酸钠后,绝大部分线性大分子量DNA和蛋白质在SD S作用下变性形成沉淀,而环状m tDNA仍为自然状态,通过高速离心,除去绝大部分细胞碎片、染色体DNA及蛋白质,m tDNA仍在上清中。
上述方法都用酚 氯仿 异戊醇抽提蛋白质、乙醇沉淀核酸。但均优缺点并存。虽然碱变性法操作时间较短,但该类方法要求条件比较严格,不易重复。使用T riton2100将核质分离制备m tDNA法操作时间短,但产量低,易降解。而高盐沉淀法操作简单,易重复,可依需用量扩大反应体系,使m tDNA质量得以轻松控制。因此,该法具有其它方法无法比拟的优点。
参考文献
1 胡义德.人白细胞线粒体DNA的快速分离与鉴定.中华血液学杂志,1997;18(11):605
2 戴纪刚.一种简单快速制备动物线粒体DNA的方法.
第三军医大学学报,2000;22(4):391
3 伍新尧.分子遗传与基因工程,河南医科大学出版社.
郑州,1997:p37
4 H ym er W C et al.Iso lati on of nuclei from m amm alian tissues th rough the use of T ritonX2100.J H isto l Chem Cytochem,1994:312(12):359
(2002206214 收稿)
收稿日期:2006-09-041 作者简介:刘晓侠(1978- ),女,江苏丰县人,嘉兴学院生物与化学工程学院教师,博士,研究方向为基因工程、发酵工程。 微生物基因组DNA 提取方法的比较与改进 刘晓侠1 ,林建平2 ,岑沛霖 2 (11嘉兴学院生物与化学工程学院,浙江嘉兴314001;21浙江大学生物工程研究所,浙江杭州310027) 摘 要:高质量的微生物基因组DNA 是基因工程的前提。目前国内外关于微生物基因组DNA 提取的方法很多,根据研究对象和目的不同而方法各异。该文就现有方法中应用最为广泛的三种提取微生物基因组 DNA 的方法进行了比较,并对它们进行一些改进,获得了针对不同细胞壁成分的微生物相应的简便、快速 且高质量基因组DNA 提取方法,并对提取的DNA 进行PCR 特异性扩增检测,获得较清晰的谱带[1],为基因克隆表达研究奠定了基础。 关键词:微生物;DNA 提取;PCR 中图分类号:Q933 Co m par ison and I m prove m en t of Extracti on M ethods for Geno m i c D NA L I U Xiao -xia 1 ,L I N J ian -p ing 2 ,CE N Pei -lin 2 (11School of B i ol ogy and Che m ical Engineering,J iaxing university,J iaxing,Zhejiang 3140001; 21I nstitute of B i oengineering,Zhejiang University,Hangzhou,Zhejiang 310027) Abstract:H igh quality genom ic DNA fr om m icr oorganis m is the p reconditi on of genetic mani pulati on .Now many methods f or the extracti on of genom ic DNA are devel oped according t o different research object and intenti on .Three kinds of methods widely app lied are compared and ref or med in is olati on of genom ic DNA fr om m icr oorganis m.And ef 2fective methods for extracting high pure genom ic DNA are established considering different cell wall components .Ge 2nom ic DNA gained by three different methods above is s pecifically a mp lified and clear band is observed by agar ose gel electr ophoresis,which is convenient t o genetic mani pulati on later . Key words:m icr oorganis m;DNA extracti on;PCR (Poly merase Chain Reacti on ) 文献标识码:A 1 文章编号:1008-6781(2007)03-0048-03 1 材料与方法111 试验材料 黄色短杆菌(B revibacteriu m helvolum AT CC11822,G -)从北京微生物所购买;放射形土壤杆菌 (Agr obacteriu m radi obacter ACCC10056,G -)从中国菌种保藏中心购买;金黄色葡萄球菌(G +),枯 草芽孢杆菌(G + )为本实验室保藏。 112 试剂及仪器 [2] 主要试剂为10mg/m l 溶菌酶,20mg/m l 蛋白酶K,2×CT AB (十六氨基三乙基溴化铵)。引物序列为:5π-ggaattcggatccatggacttcgaggcattt (B am H I,EcoR I ),3π-ttaagcttcctcacgccaccgcacgcgc (H in d III ),由上海博亚生物技术有限公司合成。 仪器有Lengguang Tech 1Spectrum lab54型分光光度计,L I TT LE GE N I U S (Japan )基因扩增仪。113 聚合酶链式反应(PCR ) PCR 扩增的反应体系为:反应总体积20μl,含10pmole 引物,50ng 基因组DNA,2μl 10×PfuTaq ? 84? 嘉兴学院学报 Jou rna l of J iaxing U n iversity 第19卷第3期2007年5月 Vol .19No .32007.5
1试剂的作用 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 2 DNA提取分为三个基本步骤 每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。 .细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。 加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA 结合的组蛋白。将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA 的商业化试剂盒。 DNA提取的几种方法 (1).浓盐法 A. 利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. B. 也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. C.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中
1 试剂的作用 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA 时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl或 NaAc，Na+中和DNA 分子上的负电荷，减少DNA 分子之间的同性电荷相斥力， 而易于聚集沉淀。 2 DNA 提取分为三个基本步骤 每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而 有区别。 .细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS 处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。 利用研磨或者超声破碎细胞，并通过加入去污剂以除掉膜脂。 加入蛋白酶，醋酸盐沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉细胞内的蛋白，如与DNA 结合的组蛋白。将DNA 在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA 在醇中不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分。另外，目前也有利用吸附过柱的方法提取DNA 的商业化试剂盒。 DNA 提取的几种方法 (1).浓盐法 A.利用RNA 和DNA 在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯纳抽提,得到的DNA 粘液与含有少量蛋白质氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA 位于上层水相中,用2 倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来. B.也可用0.15 MNaCL 液反复洗涤细胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脱氧 核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.
一、移液器使用 移液器（也称作“枪”）是所有分子实验操作不可或缺的工具，其正确使用是顺利开展各项实验的先决条件。为保证实验结果的准确性和稳定性，同时延长移液器的使用寿命，请大家细心操作并遵守以下使用规则和注意事项： 1.从未使用移液器或刚进入实验室的研究生，只有完全准确掌握移液器使用 规则后方可独立使用移液器。 2.按需要选用合适量程的移液器，调整刻度时，注意看移液器刻度表，不要 超过最大刻度。 3.装配吸头时，用力不要过猛，以免吸头难以脱卸，同时损坏移液器。 4.吸取液体时，注意要慢慢向上释放控制按钮以免吸入速度过快导致液体进 入移液器内。 5.切忌平放带有残液的吸头的移液器，更不能倒放。 6.使用移液器清洗或溶解固体物质等需反复吸打时，请装配多个叠加的吸 头，且调整刻度不超过移液器最大量程的一半。 7.移液器使用完毕，务必调到最大刻度，并稳妥地放回对应的移液器架上。 8.细心操作，如不小心使移液器表面沾到液体，请及时清洗干净；如不小心 将液体吸入移液器内，应及时清洗。 9.严禁用沾有放射性或腐蚀性物质的手套触摸移液器表面；严禁不熟悉移液 器构造者私自校对移液器刻度。 第一节叶片总DNA的提取 一、取样须知 1. 取样之前一般要先编号（牌子和离心管的编号）和挂牌，务必保证离心管中 的叶片是来自于同一编号单株，编号切勿混淆； 2. 为保证质量，所取样品尽量为幼嫩叶片组织，并尽量保证全程低温（使用冰 袋或碎冰）； 3. 取样时间最好在晴天或阴天上午叶面露水干后进行，尽量使样品不沾水及泥 土。 4. 如使用塑料袋装样品，切记将袋内空气排尽，以免在–70℃保存时塑料袋破裂导致样品混合。 二、试剂的配制 1. Tris-HCl ( 1.0 M/L, pH8.0 ) 121.16g Tris-HCl 和43ml HCl 加dd H2O 定容至1 L. 2. EDTA ( 0.5M/L, pH8.0 ) 186g EDTA和25g NaOH加dd H2O 定容至1 L. 3. 2％CTAB 81.9g NaCl 100ml 1.0 M/L Tris-HCl ( pH8.0 )
植物DNA提取经典方法：CTAB法原理 植物DNA提取经典方法：CTAB法原理 植物DNA提取经典方法CTAB法 标题:植物DNA提取经典方法：CTAB法原理 摘要: CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0 7mol L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复…… 关键词:植物DNA提取经典方法CTAB法 最专业的生命科学学术交流论坛 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 一、CTAB提取缓冲液的经典配方： Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。 二、CTAB提取缓冲液的改进配方： (1) PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖； (2) 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化； (3)多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化； (4) 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合； (5) 盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解。 三、基因组DNA提取常见问题 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制
DNA提取方法进展综述 2014-05-10 14:18:51 来源：浏览次数：21 网友评论 0 条 [DNA提取方法进展综述] 张宁，王凤山(山东大学药学院生化与生物技术药物研究所，山东济南250012《中国海洋药物》杂志2004年第2期(总第98期)摘要：dna的提取是分子生物学研究的基础技术，提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程(Genetic Engi [海洋生物微生物 DNA提取方法进展细胞组织蛋白质] 张宁，王凤山 (山东大学药学院生化与生物技术药物研究所，山东济南250012 《中国海洋药物》杂志2004年第2期(总第98期) 摘要：dna的提取是分子生物学研究的基础技术，提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程(Genetic Engineering)各项研究所必需的条件。近年来一些新的或改进的DNA提取纯化方法不断出现，本文对从陆生动物、植物、微生物以及海洋生物提取DNA的方法进行综述。 关键词：DNA；提取；动物；植物；微生物；海洋生物 Advances of DNA extraction methods ZHANG Ning，WANG Feng-shan (Institute o f Biochemic and Biotechnological Drugs，School of Pharmacy，Shandon g University, Jinan 250012，China) Abstract：DNA extraction is a basic technology of molecular biology. The purity and the integrality of DNA structure are necessary for different experiments of gene eng ineering. In recent years there have been some new or improved DNA extraction methods appeared. The methods of DNA extraction from animals，plants，microorga nisms and marine organisms were summarized in this article. Keywords：DNA；ex traction；an imals；plants；microorganisms；marineo rganisms 自20 世纪50年代Watson和Crick提出DNA双螺旋模型以来，分子生物学在广度和深度上都获得空前的发展。DNA作为分子生物学研究的基础，在生物领域尤其是遗传学方面的研究日渐深人，在此基础上产生的基因工程(Genetic Engineering)技术已在医药、农业、畜牧业等领域获得广泛应用。研究和应用DNA的基础是提取纯化结构完整的DNA，为此针对不同来源的DNA建立了不同的提取纯化方法。本文对从陆生动物、植物、微生物以及海洋生物来源的DNA的传统提取方法及近年来诸多的改良方法进行综述。
v1.0 可编辑可修改 1 各种DNA 提取方法 一，基因组DNA 提取方法 制备基因组DNA 是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb 。在DNA 提取过程中应尽量避免使DNA 断裂和降解的各种因素，以保证DNA 的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB 方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤： 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS 漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA 提取缓冲液，(10mmol/%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K 使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm 离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min 离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L 的LiCL 混匀，冰浴，10min.。 7、2500rpm 离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min 。2500rpm 离心10min 。弃上清。 8、加入倍体积3mol/L 乙酸钠与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min 。 9、12000r/min 室温离心5min 。弃上清。将DNA 溶于适量TE 中。 二，外周血DNA 提取技术 分离外周血白细胞提取方法： 试验步骤： 1、取人肘静脉血5ml ，EDTA 抗凝，2500rpm 离心10min 。 2、小心吸取上层血浆，分装到3个 离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min 。 4、2500rpm 离心10min ，弃上清。 5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min 。 6、3000rpm 离心10min ，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，－80℃冻存。 试验要求： 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h ，4℃放置不超过5h ，以防白细胞自溶。 三，氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA ： 试验试剂： Ligsisbuffer ： 7.12g30.071g ；最后加灭菌去离子水至1000ml ，高压灭菌。ACD 抗凝剂：__________柠檬酸1.68g 柠檬酸钠4.62g 葡萄糖5.15g ；最后加灭菌去离子水至350ml ，高压灭菌。 提取缓冲液（Extractionbuffer ）： 10mMTrisCl(PH=(PH=(PH=(PH=%SDS10%；最后加灭去离子水至100ml ， 高压灭菌 试验步骤： 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm ，离心5min 。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm ，离心5min 。 3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h 。
D N A提取方法(一) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1
各种DNA提取方法 一，基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤： 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris- cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm离心10min。弃上清。 8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。 9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。二，外周血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法：试验步骤： 1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。 2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml 离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。 4、2500rpm离心10min，弃上清。 5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min。 6、3000rpm离心10min，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，－80℃冻存。 试验要求： 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。 三，氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA： 试验试剂： Ligsisbuffer： 133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMED TA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。ACD抗凝剂：__________柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。 提取缓冲液（Extractionbuffer）： 10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5m MEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭去离子水至100ml， 高压灭菌 试验步骤： 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。 3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。 4、加入8μl 的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。 5、每管加入450μl 饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。 6、取上清，每管加入250μl 饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 7、取上清，每管加入500μl 氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 8、取上清，每管加50μl 的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。 9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。 10、加入50μl 灭菌去离子水，转弹，混匀。 四，NaI提取法提取外周血白细胞基因组： 实验步骤： 1、取外周抗凝血（全血）100ul 于eppendorf管中，12000rpm离心12min。 2、弃上清，加双蒸水200ul 溶解，摇匀20s。 3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。 4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。 5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm 离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。 6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心 12min。 7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。 五，常用的外周血白细胞基因提取方法： 试验原理： 苯酚/氯仿提取DNA是利用岘_Q______酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA 从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质
植物DNA的提取分离技术 摘要：主要介绍了近年来国内外几种常用的DNA提取方法：CTAB法、SDS法等，并在对其进行了简单的归纳总结与比较分析同时，并介绍了一些新的改良方法和其他植物提取方法 关键词：植物DNA 提取方法研究进展 市售中药材大多为干品,而中药材的加工和贮藏整个过程,如日晒、高温烘干等都不利于DN的完整性, 为达到要求目前国内外研究发现并使用的DNA提取方法有很多[1-12]，其中被最为广泛应用的DNA提取方法是传统的CTAB法和SDS法[13]。由于不同植物的材料组分和干湿程度各异，因此对不同植物DNA的提取存在着不同的效果。目前许多学者都在致力于研究不同的植物DNA提取方法。他们在探索新方法的同时，也针对不同的植物，在传统的提取方法上进行着一些新的改良。 1.十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法 在目前众多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最为广泛应用的一种。它既可以裂解细胞，又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的沉淀，因而经常被应用于植物的DNA提取工作中。 1.1方法及原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽
提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 1.2 CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP 充分溶解，在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离。 β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 1.3适用范围及一些改良 由于CTAB提取法能够有效地去除多糖及酚类物质的沉淀，因而适用于从含酚类及糖类物质较高的植物材料中提取DNA。经研究发现CTAB提取法在落羽杉属树木、黑木相思、野生稻、野燕麦、枸杞、花生的DNA的提取中，相比较其他提取方法来说都是最好的提取方法。为了缩短提取流程，提高提取质量，研究人员在传统方法的基础上，针对不同植物的特点，对一些提取步骤进行了改进。李先进［11］在对四种药用蕨类DNA提取的比较研究中发现，由于酚类物质极其容易被氧化，因此可以在最开始研磨材料的时候加入4%PVP，以防止研磨中细胞组织破裂后酚的氧化，从而获得更为理想的DNA。黄永莲［5］