?诊断技术?
淋巴细胞培养条件及常见失败原因探讨
遵义医学院附属医院肾病风湿科(563003) 刘春梅 赵士启 张克非 陈忠霞 刘 永
淋巴细胞培养是实验研究常用的一项技术,对于培养器皿,可以选用培养板,培养瓶,培养皿,三角烧瓶,试管,青、链霉素小瓶等[1,2]。目前,关于淋巴细胞分离方法的文献资料较多,论述较详细,而对淋巴细胞培养则论述较少,较简单。细胞培养工作十分繁琐,环节较多,探讨细胞培养的条件,对于成功培养细胞具有十分重要的意义。本文选用1.5ml离心管培养淋巴细胞,观察了淋巴细胞培养前后的变化,探讨了淋巴细胞培养的条件及失败的常见原因。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要材料和设备 淋巴细胞分离液(上海试剂二厂):RPMI1640培养液(G ibco,华美生物工程公司进口分装);血清(各实验对象的自身血清);肝素溶液(250U/m1),D’—Hanks液,lm ol/L盐酸,516%氢氧化钠溶液,2%台盼蓝染液,均为本实验室自配; pH试纸(上海三爱思试剂有限公司);1.5ml离心管(Axygen);10ml、15ml、50ml刻度离心管;毛细吸管;移液枪,1～200μl、1000μlT ip(枪头);洁净工作台(月坛牌,北京冠鹏净化设备有限公司);HC—TPⅡ-5架盘药物天平(上海第二天平仪器厂);水平式低速离心机(北京医用离心机厂);kx—21N血细胞自动分析仪(Sysmex,日本):O LY MPUS倒置显微镜;Shel LABC O2恒温培养箱(37℃,5%C O2)(Shelton manufac2 turing,inc,US A);BC D—218冰箱(澳柯玛);202-2型电热恒温干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)。
1.2 研究对象 为2003年3～8月住本院肾内科的部分病人。其中,原发性肾病综合征患者18例(男10例,女8例),年龄15～53岁(平均31.28±11.83岁);慢性肾小球肾炎患者11例(男8例,女3例),年龄18～49岁(平均38.00±8.83岁)。所选病例均符合内科学第五版的诊断标准[3]。初发者未使用过激素和其他免疫抑制剂治疗,复发者至少停用激素4周以上。另外选取10例正常人作为对照组,其中男6例,女4例,年龄28～35岁(平均30.60±
2.84岁)。正常人采血前3周无感染史及免疫抑制剂用药史。1.3 方法
1.3.1 标本的采取 每一研究对象于早晨空腹采静脉血10ml,其中4ml不抗凝,自然凝固20min,2 000rpm离心5～10min,收集血清用于培养。另6ml 肝素抗凝,用于提取淋巴细胞。
1.3.2 淋巴细胞的分离与培养 淋巴细胞的提取参照文献[4]并略加改进,将抗凝血与D’Hanks液对倍稀释后用Ficoll密度梯度离心法提取淋巴细胞,经洗涤2次后,加入定量D’Hanks液,混匀,取0.1ml 用血细胞自动分析仪计数,计算出提取的总细胞数。然后离心弃掉D’Hanks液,加入一定量的RPMI1640培养液(不含双抗,即青霉素和链霉素)和自身血清,混匀,使血清终浓度为15%～20%,细胞浓度在1×106～1×107/ml之间。取0.1ml用血细胞自动分析仪计数,淋巴细胞提取率在80%～95%之间。并取少许用台盼蓝染色,记数活细胞不低于95%。然后加入1.5ml离心管中,每管加0.1～0.3ml,盖紧离心管,置于37℃,5%C O2的恒温培养箱中孵育72小时。在培养过程中,每隔8小时轻轻晃动离心管一次。孵育72小时后,用血细胞自动分析仪计数并计算每培养管的细胞总数。
1.3.3 统计学处理 用SPSS11.0统计软件处理,所有数据用均数±标准差( x±s)表示,显著性检验用配对t检验,P<0.05为有统计学意义。
2 结 果
提取的淋巴细胞用1.5ml离心管培养,细胞生长状况良好。正常人、原发性肾病综合征、慢性肾小球肾炎患者各自的淋巴细胞培养72小时后,与培养前比较,差异无显著性(P>0105,见表1)。
表1 各组培养前后淋巴细胞数(×105/管)比较
例数培养前培养72h后P
肾 病1831457±2194241060±21947>0105
肾 炎1131100±1112731633±11704>0105
正常人1021050±0144621233±01446>0105
合 计3921664±1152431040±11712>0105
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3 讨 论
311 培养条件
31111 严格无菌操作 对实验室以及培养过程中所接触的试剂、液体、器皿、仪器的消毒,均应严格按照有关细胞培养的参考书的要求进行操作,如张卓然主编的《实用细胞培养技术》[5]。无菌观念要贯穿整个实验的始终,不可松懈。
3.1.2 培养器皿的选择 淋巴细胞培养既可选择培养板(24、48、96孔)、培养瓶,也可选择三角烧瓶、试管等器皿进行培养。我们研究发现,提取的淋巴细胞用1.5ml离心管培养72小时,细胞生长状况良好,细胞数与培养前比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。我们用青霉素小瓶进行培养,淋巴细胞生长也非常好。我们认为,对散在的细胞培养来说,用小器皿具有以下优点:(1)便于操作:1.5ml离心管为一次性使用,青霉素小瓶可反复刷洗,而培养板、培养瓶价格偏贵且用过几次之后,便有些模糊不清,尤其是塑料的。更为重要的是,淋巴细胞培养为悬浮培养,在培养过程中需要不断晃动,而大多数实验室没有恒温摇床。我们发现,在培养过程中每隔6～8小时晃动一次培养器皿,便可解决这个问题。青霉素小瓶、1.5ml离心管晃动起来相对容易些。(2)减少污染:因为淋巴细胞培养的液体量较少,一般为100～200μl,故文献资料中多见用培养板(48、96孔),少见用培养瓶。对分散的淋巴细胞培养,一方面一次用不了那么多孔,另一方面一旦一孔有污染,其他孔便有可能被波及,使其他孔的培养也失败。而且,晃动培养板时,很容易使液体溅到培养板盖上,增加污染的机会。而使用青霉素小瓶、1.5ml离心管等小器皿便可避免这些现象,但缺点是不易观察细胞生长,需取样加到载玻片上观察。
3.1.3 血清 淋巴细胞对血清的要求较高,所以选用血清时要注意生产厂家。但胎牛血清价格昂贵,新生小牛血清或小牛血清也价格不菲,而使用自身血清不仅细胞长得好,而且更接近体内环境,避免了外来因素的干扰,使实验设计更严密。我们发现,血清浓度在15%～20%时细胞生长比较好,当超过30%时反而不利于细胞生长。
3.1.4 pH值 细胞生长的最适pH为7.0～7.2,可忍耐的pH范围为6.6～7.8,当pH低于6.8或大于7.6时,都会抑制细胞生长[1,4]。我们发现,RP2 MI1640培养基加入血清后pH值一般升高0.2～0. 4,故配1640培养液及其他用液时使pH值达到7.2比较合适,并且需经常检测pH值。3.1.5 培养空间 培养液与液面上的空间二者的体积比例一般以1∶10为宜,培养液液面高度最好维持在2～5mm的范围,以便于气体交换[1]。
3.1.6 恒温培养箱 温度应维持在37℃,C O2浓度为5%,O2为95%,100%的饱和湿度。
3.2 常见失败原因 我们在2003年2～11月的淋巴细胞培养期间出现过多次培养失败,其原因简单归纳如下。
3.2.1 污染 污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响较小,尤其只培养72小时。一般是分离过程中的用液和培养基出现了污染。
3.2.2 pH值 过高或过低,或培养过程中瓶塞不紧,C O2逸出,导致pH值上升。
3.2.3 诱导剂 淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,在培养过程中须添加刀豆球蛋白(C onA)、脂多糖(LPS)、白细胞介素2(I L-2)、植物血凝素(PH A)、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质。须注意它们的浓度及是否失效。
3.2.4 培养器皿洗涤不干净 有蜡、油污或酸残留。
3.2.5 培养用液含有杂质 配制过程中所使用的各种溶液必须用三蒸水,若含有Fe、Ca等离子及杂质,可影响细胞的增殖[6]。
3.2.6 接种的细胞数目过多或过少,或提取的淋巴细胞中混有大量红细胞[7]。
3.2.7 血清质量不佳。
3.2.8 恒温培养箱的C O2、温度等不稳定。
3.2.9 存在个体差异 我们发现,在相同条件下,某一受试者的血培养不成功,而对照实验培养结果正常,其原因有时无法查出。我们还发现,淋巴细胞的生长情况,还与受试对象的年龄有关,青年人的淋巴细胞比中、老年人的生长得要好。
参考文献
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老年人慢性硬膜下血肿的CT诊断 贵阳中医学院第二附属医院放射科(550003) 何职应 刘吉刚
慢性硬膜下血肿是老年人的一种常见病,占颅内血肿的10%左右。由于大多数病人头部外伤比较轻微,未引起患者注意或被遗忘。有部分病人没有明确的外伤史,加之临床症状又不典型,发病较缓慢,容易造成误诊。本文收集了2001年11月至2004年2月经手术、病理及CT诊断资料完整的22例老年人慢性硬膜下血肿进行总结分析,以便进一步提高对本病的认识。
1 材料与方法
1.1 一般资料 本组22例中,男性20例,女性2例。年龄60～92,平均年龄为7
2.5岁。病程1个月～2年不等,平均5个月。有外伤史4例,无明确外伤史18例。主要症状:反应迟钝、记忆力减退,意识障碍8例,轻微持续性头痛、头晕4例,剧烈头痛、恶心呕吐2例,偏瘫2例,肢体无力4例,癫痫1例。13例有高血压病史。
1.2 方法 采用GE—P orspeedAI全身螺旋CT扫描,以OM为扫描基线,层厚、层间距均为10mm。22例均行CT平扫,5例行增强扫描。经肘静脉快速推注对比剂(非离子型对比剂碘海醇50ml)后扫描。
2 结 果
2.1 慢性硬膜下血肿部位 血肿位于额顶部6例,顶部2例,额颞顶部4例,额部3例,颞部2例,枕部1例。双侧血肿8例,其中双侧额部2例,双侧额顶部3例,双侧额颞顶部2例,双侧颞顶部1例。
2.2 慢性硬膜下血肿的CT表现 (1)颅骨内板下新月形、梭形或双凸透镜形异常密度影。其中低密度12例,等密度3例,混杂密度7例。(2)脑室、脑池、脑沟的改变:双侧脑室受压、变形3例,单侧脑室受压变形6例,同时伴有脑中线结构的移位,22例均表现为患侧灰白质交界内移,局部脑沟变浅或消失。2.3 CT增强扫描 5例行CT增强扫描,可见血肿包膜呈点状或线状强化,以及脑皮质下静脉强化,并有移位改变,血肿本身无强化。
3 讨 论
3.1 慢性硬膜下血肿是指外伤后3周以上,是亚急性硬膜下血肿的延续。但老年人慢性硬膜下血肿通常只有轻微外伤史或无明确外伤史,不伴脑挫裂伤。其出血可能与老年性脑萎缩的颅内空间相对增大有关,遇到轻微惯性力作用时,脑与颅骨产生相对运动,使进入静脉窦的桥静脉撕裂而引起出血[1]。血液缓慢溢入硬膜下腔,引起硬脑膜内层炎性反应形成包膜。由于血肿液化,蛋白质分解,引起囊内渗透压增高,脑脊液自蛛网膜下腔渗入囊内,加之包膜血管的血浆渗入,进一步增加了囊内的渗透压,以至血肿体积不断增大,血肿常常遮盖额、颞、顶叶的表面,脑组织受压。由于慢性压迫使脑供血不足和脑萎缩更加显著,造成此类病人的颅内压增高程度与血肿大小不成比例。数月或数年后包膜尚可有增厚,甚至钙化[2]。
3.2 慢性硬膜下血肿的CT表现 由于形成时间的不同,大小、形态、密度各异及脑组织受压的程度,其CT表现不同。沈天真等认为[3]血肿形态是随着血肿的期龄而变化的,开始为新月形,经由过渡变为梭形或双凸透镜形,再变为过渡形和新月形,最终被吸收消失。根据血肿的大小、形态不同,病侧脑组织、脑室可有不同程度的受压变形和移位,增强后血肿包膜呈线状或点状强化,同时伴有脑灰白质界面内移改变。慢性硬膜下血肿以低密度为多见,CT值为12～20Hu,其次为等密度血肿,CT值为30～40Hu,由于血肿周围纤维包膜形成,血红蛋白溶解,使囊内渗透压增高,脑脊液通过包膜渗入血肿,血肿的密度也随之降低,形成等密度或低密度。混杂密度的血肿上部分是低密度,下部分是高或等密度,还有的内
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#生殖医学# 淋巴细胞培养后主动免疫治疗反复自然流产疗效评价 武美丽 柳肃芬 作者单位:730050 甘肃,甘肃省妇幼保健院生殖免疫诊疗 反复自然流产(recurrent sp i n taneous abo rtion,RSA )是妇科常见病之一,除遗传、内分泌、感染、自身免疫、解剖因素外,80%以上原因不明 [1] ,成为临床难治性不育症。近年来国内外学 者根据Beer 等[2] 在1981年创立的淋巴细胞主动免疫疗法,对原因不明的反复自然流产(unexpla i n ed recurrent spontaneous aborti o n ,URSA )患者大胆采用丈夫和无关个体淋巴细胞进行主动免疫治疗,大大提高了URSA 的临床诊治水平。2006年3月~2007年6月,我们运用配偶淋巴细胞培养后皮内注射法对40例URSA 患者进行治疗,并观察妊娠预后,取得了较好的治疗效果,现报道如下。 对象与方法 11对象:2006年3月至2007年6月,就诊本院生殖免疫诊疗中心门诊的RSA 患者。详细询问病史、经妇科检查、子宫输卵管造影或宫腔镜检查证实无生殖器器质性病变,内分泌化验正常,体温双相,黄体期不少于12d,且较平稳,夫妻染色体核型正常,TORC H 常规检查无异常,排除血型不合,自身免疫无异常(抗心磷脂抗体、抗核抗体、抗精子抗体、抗透明带抗体等阴性),配偶精液常规在正常范围者诊断为URSA 。对其符合条件的66例URSA,经征求意见表示愿意参加研究,并签知情同意书,根据患者的自愿分为3组,孕前实行主动免疫治疗(孕前治疗组)20例,确诊妊娠后实行主动免疫治疗(孕后治疗组)20例,对照组26例。对照组采用黄体酮保守治疗。3组年龄(23~35岁,平均年龄29岁)、健康状况、流产次数(既往曾发生自然流产2~10次,平均流产次数314次)及流产时间(流产时孕周为5~12周,平均孕周7周),差异无统计学意义(P >0105)。 21淋巴细胞的培养:全部采用RSA 患者配偶 为供血对象,身体健康,传染病4项正常(甲肝病毒、乙肝病毒、梅毒螺旋体、爱滋病病毒检测阴性)。无菌技术抽取配偶外周抗凝全血30m ,l 常规肝素抗凝,与等量磷酸缓冲液(phosphate ba-l anced so l u ti o n ,PBS)混合,使用Fico ll-H ypaque 法密度离心分离外周血单个核细胞(periphera l b l o od m ononuc lear cel,l PB M C)。用RP M I 1640培养液洗涤离心2次,加入培养液后置于培养瓶中于37e 5%CO 2培养箱内。培养液配制,每1m l 含RP M I 1640为0173m ,l 其中含重组人C -干扰素0105万U /m ,l 植物血凝素(phytohe m agg l u ti n i n ,P HA )0102m g /m ,l 5%小牛血清(012m l)。培养细胞内毒素和细菌培养阴性,酚红染色细胞活率\85%,培养72h 后的细胞再用019%氯化钠溶液洗涤2次,调整至细胞数为20~30@106 /m l 方可用于治疗。 31免疫治疗方法:孕前治疗组20例孕前治疗3次后嘱其妊娠,如3月内未受孕,行输卵管通液,并在排除不育症的情况下重新加强1次主动免疫治疗。妊娠35d 加强免疫1次,此后每3周治疗1次。孕后治疗组20例在确定怀孕后开始主动免疫治疗。2组均每3周给患者双侧前臂皮内多点免疫注射1次,每次每点为013~015m ,l 直至妊娠14周。课题组人员固定,接受本免疫疗法者不接受对该病的其它治疗。对照组26例URSA 患者再次妊娠后仅以黄体酮常规保胎药物治疗到妊娠12周停药。 41疗效判断标准:妊娠达28周以上,或分娩正常新生儿为成功妊娠,再次流产、死胎及新生儿畸形作为妊娠失败。 51统计学处理:采用SPSS 1010软件进行数据 分析,分析方法为V 2 检验,P <0105判定差异有统计学意义。 结果 40例URSA 患者经配偶淋巴细胞免疫治疗后,
人体外周血淋巴细胞培 养与染色体核型分析 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分 析 学院：生命科学学院 专业：生物科学 年级班级：2010级5班 校区编码：北区 姓名：陈建坤 二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析 【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。 【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养 一．引言: 染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科
1 原理巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。 2试验材料 昆明种小鼠10只体重约18g～25g（约6周龄）由广西医科大学动物实验中心提供 公鸡1只 PRMI1640培养基 新生小牛血清 HEPES D-Hanks液 青霉素 链霉素 3试验仪器 无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳5m注射器注射针，试管、培养瓶（12），12孔培养板(12)等。 二氧化碳培养箱 生物显微镜 高速冷冻离心机 低温冰箱 4实验步骤 4．1细胞培养液的制备及消毒制备方法: 将RPMI1640干粉一袋，HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中，充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水，使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间，容积为1000m1。 鸡红细胞悬液制备:按无菌操作,自鸡翼下静脉采血,立即置入盛有五倍于取血量的1%肝素抗凝剂的三角烧瓶中,混匀,4℃冰箱内保存。使用前,以无菌生理盐水离心洗涤3次,前一次离心速度为1500r/min,离心5分钟,弃上清液和界面粒细胞层,最后连续离心2次(2000r/min,5分钟),用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液备用。 培养液的无菌处理： (1)将0.45微米和0.22微米的微孔滤膜浸过三蒸水，与zeiss过滤装置所需的清洁不锈钢筒、钢筛、胶管安装好，并高压灭菌。 (2)在净化室内，打开己消毒的zeiss抽滤器，将配制好的RPMI1640培养液进行过滤，开将过滤后的RPMI1640培养液分装，置入4℃冰箱中备用。
行业信息[石油化工] 美国、欧盟和中国生物技术药物的比较 05 25 2005 10:34AM 美国、欧盟和中国生物技术药物的比较 胡显文1** 陈惠鹏1 汤仲明2 马清钧1 (1. 军事医学科学院生物工程研究所，北京，100071； 2. 军事医学科学院生物工程研究所，北京，100850) 美国、欧盟和中国的药管部门每年批准的药物中有很大一部分是已上市药物的新适应症，有一部分是不同公司生产的相同产品，许多相同药物重复计算，造成了统计上的很多混淆，使人误认为现在已批准上市的生物技术药物有几百种，而实际上只有不到100种，即人们想象的生物技术药物数量要远高于实际的数量。本文按照以下原则合并归纳生物技术药物，试图全面、准确、科学地统计欧美和中国已批准上市的生物技术药物，以期令人对生物制药有一个详尽准确的了解： （1）本文归纳的生物技术药物是文献定义的狭义生物制药产品，即基因工程产品、抗体工程产品或细胞工程产品，如用大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞表达的重组蛋白、用杂交瘤技术生产的治疗性抗体、用细胞培养技术制备的组织工程产品等，但不包括用细胞培养方法生产的减毒或灭毒疫苗。 （2）本文的生物技术药物不包括从血液、尿液或组织中提取的生物活性物质，如人血清白蛋白Albutein 、血源性凝血因子Alphanate (Factor VIII)、AlphaNine（Factor IX）、血源性CMV特异性免疫球蛋白CytoGam、血源性乙肝免疫球蛋白Nabi-HB、AVENTIS公司生产的链激酶Streptase?（非基因重组产物）等生物制品，也不包括FDA定义的New Biotech Drug中可引起细胞凋亡的物质，如三氧化砷注射液（Trisenox）、硝酸镓注射液（Ganite）等无机盐、Fuzeon等化学合成多肽，小分子有机物质Gleevec、Hepsera、Leustatin等。 （3）由于目前全球只有一种反义寡核苷酸药Vitravene，并且它是化学合成药物，不在本文统计范畴。（4）用同一系统表达的蛋白质序列完全一致的产品视为一种产品，如用E coli.表达的有8个品牌的生长激素产品BioTropin、GenoTropin、Humatrope、Norditropin、Nutropin Depot等，用CHO表达的2个品牌的EPO- 产品Epogen、Procrit等，统计时当作一种产品。 （5）用不同细胞或细菌表达的同一产品视为不同产品，如生长激素，有的用E coli.表达如BioTropin，有的用小鼠C127细胞表达如Saizen；又如胰岛素，有的用E coli.表达如Humulin，有的用Yeast表达如Novolin；再如凝血因子VIII，有用CHO表达的ReFacto，有用BHK表达的Helixate。 （6）突变体视为不同产品，如胰岛素突变体Humulog、Lantus、NovoLog等；又如EPO产品Epogen和EPO突变体产品 Aranesp。 （7）剂型的改变、添加其他成分或化学修饰都视为一种产品。如Novo Nordisk公司生产的速效、中效、长效、混合胰岛素系列产品Novolin、Novolin L、Novolin N、Novolin R、Novolin 70/30等，都是剂型的改变以改变胰岛素的生物吸收和药代动力学。又如干扰素a2b 的产品为Intron A，而在Intron A 中加入病毒唑就成为Rebetron，这两种产品都视为干扰素a2b一种生物技术药物；再如许多PEG修饰的药物如PEG-Intron（PEG化干扰素a2b），都与未修饰的产品归为一种产品。 本文所列的生物技术药物，几乎涵盖了所有美国、欧盟和中国的批准上市的生物技术药物，主要资料来源为美国食品药品管理局(FDA，https://www.doczj.com/doc/bd8942571.html,)、美国制药协会(https://www.doczj.com/doc/bd8942571.html,)、美国生物技术产业协会(https://www.doczj.com/doc/bd8942571.html,)、欧盟医药管理局(EMEA, www.emea.eu.int)，以及每个生产厂商的网站及产品说明书，并且参考了文献。 1 美国FDA批准的生物技术药物
《静脉注射常见失败原因的分析—如何练到“一针见血”》微课教学方案设计 授课教师姓名张苹蓉所授课程护理基本技能教龄11年微课名称静脉注射常见失败原因的分析—如何练到“一针见血”视频长度5分40秒录制时间2015.9所属专业医药卫生类护理类基本护理技术 教学类型讲授类 知识点来源《护理基本技能》--静脉注射法 适用对象适用于中、高职护理专业学生 教学背景 1.静脉注射常见失败的原因是一个很抽象的知识点，也是教学中的难点。 静脉注射失败时，学生看不到针头在血管内的实际情形，因而无法很好的理解失败的原因。本微课运用二维动画，将针头在血管内动态的进行过程形象的展示出来，将抽象的知识点变得具体，使学生轻 松理解失败的原因，从而总结经验，掌握正确的静脉注射方法，有效地解决教学中的难题。 2.静脉注射成功率不高，容易挫伤学生的学习积极性，对“打针”产生惧怕心理。 “失败乃成功之母”,本微课先从静脉注射失败谈起，以学生为主体，让学生在老师的指导下分析原因，总结经验，探讨静脉注射成功的方法。这样既可以提高学生学习兴趣；锻炼学生的心理素质；还可 以培养学生分析问题、解决问题的能力。 教学目标 1.学生会分析静脉注射常见失败的原因。 2.正确掌握静脉注射的穿刺技巧，提高静脉注射的成功率。 教学内容 1.静脉注射失败常见的四种原因 2.静脉注射成功的方法 设计思路本微课设计的思路：发现问题——分析问题——解决问题。教学中以学生为主体，在静脉注射操作练习中发现失败的现象，引导学生一起分析失败的原因，总结经验，找到成功静脉注射的方法。学生示范静 脉注射的操作技巧，熟练掌握静脉注射操作的要点。 教学过程 步骤教学内容教学方法教学手段时间 片头※展现本次课的内容： 同学们好，今天我们学习的内容是静脉注射常见失败原因的分析--如何练 到“一针见血” 讲授多媒体10秒告知 ※告知教学的目标： 本次课的目标是让学生学会分析静脉注射失败的原因，从而正确掌握静脉 注射的穿刺技巧，提高静脉注射的成功率。 讲授多媒体10秒 问题导入※由失败的现象，导入问题： 在学生临床实习静脉注射操作过程中，经常出现这样的现象： 没回血“鼓包” 这都是什么原因导致的呢？ 学生思考多媒体20秒 原因分析※师生一起分析原因：好，下面我们一起来分析一下： 原因一：学生因为初次扎针，非常紧张，进针太浅，在看到回血后就不敢 再进针，使得针头的斜面一半在血管内，一半在血管外： 这时我们可见断断续续的回血，但推药时，药液溢出至皮下，病人局 部皮肤隆起，感到疼痛。 讲授二维动画 2分 38秒 原因二：学生血管“落空感”不强，针头刺入较深，在看到回血后未能及 时将针头放平，而是继续有角度的进针，使得针头斜面的一半穿破对侧血 管壁： 这时我们可以看到有回血，推药时，部分药液溢出至深层组织，局部 可无隆起，病人感到疼痛。 讲授二维动画 原因三：学生穿刺前未探明静脉深浅，进针角度太大，刺入过深，使得针 头斜面完全扎破对侧血管壁： 这时我们看不到回血，药物注入深部组织，病人有疼痛感。如果此时 药物注入过少，病人局部皮肤不隆起；注入药物过多，局部皮肤则隆起。 讲授二维动画 原因四：学生扎止血带的位置离穿刺部位太近，针头刺入静脉过浅，松解 止血带后，静脉回缩，针头脱出血管外： 这时我们可以看到有回血，推药时，药液溢出至皮下组织，病人局部 皮肤隆起，有疼痛感。 讲授二维动画
淋巴细胞培养 一、严格无菌操作 对实验室以及培养过程中所接触的试剂、液体、器皿、仪器的消毒,均应严格按照有关细胞培养的参考书的要求进行操作。无菌观念要贯穿整个实验的始终,不可松懈。 二、培养器皿的选择 淋巴细胞培养既可选择培养板(24 、48 、96 孔) 、培养瓶,也可选择三角烧瓶、试管等器皿进行培养。有研究表明提取的淋巴细胞用1. 5ml 离心管培养72 小时,细胞生长状况良好,细胞数与培养前比较,差异无统计学意义( P >0. 05) 。用青霉素小瓶进行培养,淋巴细胞生长也非常好。可以认为,对散在的细胞培养来说,用小器皿具有以下优点: (1) 便于操作:1. 5ml 离心管为一次性使用,青霉素小瓶可反复刷洗,而培养板、培养瓶价格偏贵且用过几次之后,便有些模糊不清,尤其是塑料的。更为重要的是,淋巴细胞培养为悬浮培养,在培养过程中需要不断晃动,而大多数实验室没有恒温摇床。我们发现,在培养过程中每隔6～8小时晃动一次培养器皿,便可解决这个问题。青霉素小瓶、1. 5ml 离心管晃动起来相对容易些。(2) 减少污染:因为淋巴细胞培养的液体量较少,一般为100～200μl , 故文献资料中多见用培养板( 48 、96孔) ,少见用培养瓶。对分散的淋巴细胞培养,一方面一次用不了那么多孔,另一方面一旦一孔有污染,其他孔便有可能被波及,使其他孔的培养也失败。而且,晃动培养板时,很容易使液体溅到培养板盖上,增加污染的机会。而使用青霉素小瓶、1. 5ml 离心管等小器皿便可避免这些现象,但缺点是不易观察细胞生长,需取样加到载玻片上观察。 三、血清的选择 淋巴细胞对血清的要求较高,所以选用血清时要注意生产厂家。但胎牛血清价格昂贵,新生小牛血清或小牛血清也价格不菲,而使用自身血清不仅细胞长得好,而且更接近体内环境,避免了外来因素的干扰,使实验设计更严密。血清浓度在5 %～20 %时细胞生长比较好,当超过30 %时反而不利于细胞生长。 四、pH 值 细胞生长的最适pH 为7. 0～7. 2 ,可忍耐的pH 范围为6. 6～7. 8 ,当pH 低于6. 8 或大于7. 6 时, 都会抑制细胞生长。RPMI1640 培养基加入血清后pH 值一般升高0. 2～0.4 ,故配1640 培养液及其他用液时使pH 值达到7. 2比较合适,并且需经常检测pH 值。 五、培养空间 培养液与液面上的空间二者的体积比例一般以1∶10 为宜,培养液液面高度最好维持在2～5mm 的范围,以便于气体交换。 六、恒温培养箱 温度应维持在37 ℃,CO2 浓度为5 % ,O2 为95 % ,100 %的饱和湿度。 七、常见失败原因
（一）项目的意义、必要性和依据 近年来大量的研究证实间充质干细胞（MSCs）是骨髓微环境细胞的起源细胞，是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞。MSCs因其具有以下特点而日益受到人们的关注：(1)多向分化潜能：在体内/外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞； (2)造血支持和促植入：作为造血微环境主要细胞成分——基质细胞系的干细胞，MSCs通过细胞对细胞的直接作用、分泌细胞外基质及多种细胞因子，实现对造血的精细调控，支持造血干细胞的生长，与造血干细胞共同移植可促进造血干细胞的植入；(3)免疫调控：MSCs表达MHC-I类分子，不表达CD80，CD86，HLA-DR等协同刺激分子，体外可抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受，对于预防和治疗异基因造血细胞移植后引起的移植物抗宿主病，诱导器官移植免疫耐受有较好的应用前景。(4)自我复制：MSCs作为干细胞可以自我复制，体外扩增、增殖能力强，可以作为基因操作的干细胞平台，在基因治疗中有着十分诱人的前景。 在造血干细胞移植治疗恶性血液病的应用研究 促进造血干细胞移植的造血重建：近年来有关MSCs体内、外支持造血，抑制免疫功能的报道有很多，提示MSCs可以作为造血干细胞移植的共移植手段以及应用于临床相关疾病的治疗，可提高造血干细胞移植患者的存活率和移植后生存质量，从而大大提高移植治疗的有效性和适应症，具有良好的应用前景。MSCs经静脉回输后广泛分布于骨髓、肝脏、脾、胃肠道、肾脏、肺脏及肌肉等器官组织，对受体BM-MSCs来源的检测结果发现，供体来源的MSCs能够定植于受体骨髓。Maitra等体外扩增人MSCs，与造血干细胞（HSC）共移植给NOD/SCID小鼠，对照研究结果显示，当HSC数量有限时，只有同时给予MSCs输注才能获得更为有效的造血植入。黄绍良等进行了自体和异基因MSCs联合脐血移植的I期临床试验，结果显示异基因MSCs联合UD-UCBT具有明显促进造血恢复的作用。Lazarus等对MSCs 自体输注进行了I期临床试验，从23例造血系统肿瘤包括急性髓细胞白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病（ALL）、多发性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤缓解期患者中分别抽取骨髓10ml-15ml，体外培养扩增MSCs，15例患者经2-3次传代后给与3个
107 第 30 卷第 1 期2012 年 2 月广东医学院学报 JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL COLLEGE V ol. 30 No. 1Feb. 2012 实验教学是高校教学的重要组成部分，在培养了使学生更好地了解和掌握消毒灭菌知识和技能，学生分析和解决问题能力、培养严密的思维方法和通过在PPT 上讲解后，再由带教老师用实物进行操踏实肯干的工作作风等方面具有不可替代的作用。作演示。这个过程加强了学生的无菌操作意识，树要使实验室成为推行素质教育、培养学生创新精神立学生的无菌概念。 和实验能力的主要阵地，必须突破传统的教学观念 1.2 通过实际操作，培养学生动手实践的兴趣，确和教学模式，探讨不同层次、具有特色的、多样化立严格的无菌操作观念 的实验教学方法。《医学遗传学》是高等医学院校在经过适当改装后的实验室里，带教老师向学的一门必修课，外周血淋巴细胞培养和染色体制备生讲解细胞培养基的配制方法及要求后，由学生自是这门课程的重要实验教学项目之一，是综合性实己操作。配制培养基是实验的重要环节之一，要求验项目。该实验包括灭菌技术、培养基配制、采血在无菌条件下操作。以往因为实验室条件所限，必接种、细胞培养、收集细胞制备标本、Ｇ显带处理 须用预先在无菌实验室里配制好的培养基给学生做[1-2] 和镜下观察分析等内容，实验过程繁琐，耗时实验，如果使用市售的培养基则成本费用高，并且长。根据目前学生人数多以及本实验的特点，我们学生都没有动手的机会。由于配制培养基是一项细进行了以下教学方法的探索和改进：微且繁琐的实验过程，一旦失败则后面的实验无法进行，要求带教老师把每一个细小的环节都仔细向1 多种实验手段结合，使繁琐的实验简单化学生交代清楚，包括一些操作的动作要领和容易出现的问题。有些学生会忘记按无菌操作要求用酒精1.1 运用现代教学手段，了解实验中使用器械、物灯高温消毒试管口和玻璃器皿，或者忘记消毒玻璃品的清洗消毒灭菌程序 安培，教师要预先强调并密切观察学生的操作，及由于学生初次接触本实验使用的仪器设备和试时纠正其错误，避免培养基被污染。学生们通过自剂，例如CO 培养箱、抽滤器、培养基(所需的药品2己动手配制培养基，了解了细胞培养的实验过程，及试剂)和秋水仙素、离心机、显微镜及玻璃器皿认识了每个操作环节的重要性，培养了高度的责任等，感到非常的陌生，因此我们应用多媒体教学手心和严谨的科学态度。 段介绍它们的作用、原理和正确的使用方法，让学 1.3 开放实验室，使每个学生参与整个实验过程，生容易理解和掌握。 激发其学习兴趣 外周血淋巴细胞培养是在体外条件下的细胞培在完成了以上实验课后，根据实验要求分2次安养技术，整个过程必须在严格无菌条件下进行，对排学生回实验室完成以下2个实验步骤。(1) 采血接实验所需的器皿(如烧杯、量筒、培养瓶、抽滤器、种及培养：在老师的指导下，由学生自己互相采静胶塞等)的消毒灭菌是进行细胞培养最重要及最基本脉血，注入配制好的培养液内进行培养。让学生互的条件，这个过程包括洗、煮、烤、高压灭菌。为 相采血进行实验，学生会更加关心实验的结果，更认真地进行后面阶段的实验，激发他们对这个实验的兴趣。(2) 在收获细胞前4 h ，尚要进行一个很关 摘 要：由于外周血淋巴细胞培养和染色体制备这一实验教学课程耗时长，步骤繁琐，要求学生完成全部实验过程并达到较好的教学效果操作起来不容易。经过多年的摸索，我们将普通实验室加以改造，采用集中采血、分批分阶段进行实验的方法开展实验教学，结果绝大多数学生均能顺利完成该实验，达到预期的教学效果。 关键词：细胞培养；染色体；实验教学 中图分类号：G 624.4 文献标识码：B 文章编号：1005-4057(2012)01-0107-02DOI: 10.3969/j.issn.1005-4057.2012.01.044 外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备实验教学方法的探索 廖 霞，陈小萍，周汝滨 （广东医学院生物学教研室，广东湛江 524023） 收稿日期：2011-11-12；修订日期：2012-01-30作者简介：廖 霞(1959－)，女，大专，实验师。
细胞生物学实验报告 实验三细胞原代培养 1引言 1.1 实验目的 1. 理解细胞原代培养原理。 2. 了解细胞原代培养的应用。 3. 独立进行鼠胚和鸡胚细胞原代培养操作。 4. 巩固无菌操作技术。 1.2 实验原理 细胞原代培养：原代培养组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，严格意义上的原代培养指在首次传代前的培养，但通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 2实验仪器、试剂及操作步骤 2.1 实验仪器 超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒 （头）、废液缸、手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶等 2.2 实验试剂 DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等 2.3 实验材料 动物：9至12日龄的鸡胚、15日龄的鼠胚 2.4 实验步骤 A.鸡胚成纤维细胞的原代培养 1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。 2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。 3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。 4.在D-Hanks缓冲液中按1：100的比例加入双抗。 5.取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋 壳。 6.用镊子在鸡蛋气室位置敲一道划痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。 7.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿中，用D-Hanks缓冲液冲洗鸡胚。 8.用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks缓冲液充分洗涤躯干。 9.将躯干置于小平皿盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。 10.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组 织块接种到培养瓶内。在培养瓶中放置10-15个组织块。 11.在培养瓶的另一侧面加入完全培养基，注意不要冲到组织块。将接种组织块的培养瓶面朝上在
人的外周血淋巴细胞培养 摘要：正常情况下哺乳动物的外周血中没有分裂相，这是由于外周血中的小淋巴细胞大多处于G0期。但在一定条件下，外周血中的小淋巴细胞受刺激转化成淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。本实验介绍人外周血淋巴细胞的培养方法，染色体标本的制备和正常人染色体的组型分析。[1] 关键词：外周血淋巴细胞低渗处理空气干燥法染色体组型分析 前言：人体外周血细胞培养是制备染色体标本的常用方法。此方法取材方便，用血量少，操作简便。 1960年Nowell和Morhead验证，使红细胞凝集从而能分离出白细胞的植物凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。这样经过短期培养，以秋水仙素或其衍生物秋水仙胺进行处理，经过低渗和固定，就可获得大量的处于有丝分裂时期的细胞[2]，因为秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。 淋巴细胞经过培养以后，形成了体外活跃生长的细胞群体，经过空气干燥法制片。所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素—低渗处理—充分的固定—滴片等步骤之后再载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载玻片在室温中自然干燥的方法。[3] 淋巴细胞的培养已成为制备染色体的最主要的方法。因为该法材料便宜易得，对同一个体可进行连续观察，并可得到优良的染色体制片。各种因素的作用效应（如病毒、电离辐射、化学试剂等）可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而可进行多种在体内无法进行的研究。本方法已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。[2]染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。 1.材料方法 1.1 材料 人的外周血淋巴细胞。 1.2 器具 采血针、20mL培养瓶、毛细管、离心管、载玻片和盖玻片、显微镜、恒温箱、离心机、电子天平、分析天平、精密PH试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪
实验五人的外周血淋巴细胞培养 一、实验原理 外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素(PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 二、实验目的 掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。 三、实验材料 人的外周血。 四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。 隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO， 1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养 一.实验目的 1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。 2 ?熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。 3?了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。 二.实验原理 自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物 理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。 如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传 代培养。 1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化 培养法。 组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶 中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。组织块培养法操作过程简 便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。 消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。该方法主要使用生物化学手段将 较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接 松散、相互分离，细胞失去与间质的连接，活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液，分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。胰蛋白酶
几种细胞混合培养特点及应用 高征 摘要：混合细胞培养又称协同培养(coculture)，系指两种或多种细胞在同一个培养容器内，同样的培养条件(如培养液、培养温度等)下进行混合培养。根据实验不同的要求，可采用不同种类的敏感细胞，以细胞合适的比例进行混合培养。本文介绍了几种常见的细胞混合培养方法及其特点。 关键字：混合细胞；培养；淋巴细胞；兔成骨细胞；兔骨髓基质干细胞；肝癌细胞；大鼠皮层神经元细胞；大鼠胶质细胞；表皮细胞；纤维细胞；U937；鼻咽癌细胞 混合细胞培养又称协同培养(coculture)，系指两种或多种细胞在同一个培养容器内，同样的培养条件(如培养液、培养温度等)下进行混合培养。根据实验不同的要求，可采用不同种类的敏感细胞，以细胞合适的比例进行混合培养。 1.混合淋巴细胞培养 1.1混合淋巴细胞培养定义 混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture）是指同种异体的淋巴细胞在体外共同培养的现象。若一方(通常为供者)淋巴细胞经灭活处理，则称“单向混合淋巴细胞培养(one-way mixed lymphocyte culture)”。 两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原中D和DP抗原不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养(two way MLC)。若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C(mytomycine C)处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)。 1.2混合淋巴细胞培养用途 混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR) 常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多
静脉穿刺失败的原因及处理 张周燕 静脉穿刺失败的原因： 1.护理人员静脉穿刺技术不熟练：主要表现为一些初到临床的护理人员，业务 技术素质不高，对静脉穿刺的技术操作方法、要领掌握不熟练，缺乏临床实践经验，而致穿刺失败。 2.进针角度不当：进针角度的大小与进针穿刺的深度要适宜，一般情况下，进 针角度应为15°～20°，如果穿刺深，角度就大，反之，穿刺浅，角度则小，但角度过大或过小都易将血管穿破。 3.进针时用力速度不当：在穿刺整个过程中，用力速度大小不同，各个组织的 进针力量和进针速度掌握得不当，直接影响穿刺的失败。 4.扎止血带时间过长：患者肢体远端功血不足，静脉回流障碍，静脉不明显导 致的穿刺失败。 5.固定不当：针头向两侧摆动，在穿刺过程中，由于穿刺比较表浅，贴胶布、 松止血带时不注意，固定不好，使针头左右摆动，穿刺失败导致血管破裂。 6.患者因素：①因静脉硬化，失去弹性，进针后无回血，落空感不明显，误认 为失败，试图退出再进针，而局部已青紫。②脆性静脉注射时选择不直不显的血管盲目穿刺或针头过大，加之血管壁脆性增加以致血管破裂，造成失败。 ③塌陷静脉：患者病情危重，血管弹性差，给穿刺者造成一定的难度，加上 操作者心情紧张，成功心切，以致失败。④腔小静脉引起失败的原因多因针头与血管腔直径不符，见回血后未等血管充分扩张就急于继续进针或偏出血管方向进针而穿破血管。⑤水肿患者的静脉：由于患者皮下水肿，组织积液，遮盖了血管，导致静脉穿刺的失败。 7.天气寒冷或发热寒战期的患者。四肢冰冷，末梢血管收缩致血管难找，有些 即使看上去较粗的血管，由于末梢循环不良，针头进入血管后回血很慢或无回血，操作者误认为未进血管继续进针，使针头穿透血管壁而导致穿刺失败。 8.物品因素：在选择止血带时要认真检查，对反复使用的止血带的弹性、粗细、 长短是否适当。如止血带弹性过低、过细，造成回血不畅，止血带过粗，易压迫止血带下端血管，使管腔变小，针头达不到血管腔内，易损伤血管壁，
实验四乳鼠肺细胞原代培养 一、实验目的 1.了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。 2.学习细胞消化、细胞计数方法。 二、实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的地生长及繁殖。 三、实验用品 1.设备 培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、恒温水浴箱、离心机等。 CO 2 2.器材 眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃漏斗、量筒、移液管、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养皿等。 上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，15磅灭菌30min。此外，还需显微镜、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球等。 3.试剂 （1）D-Hanks平衡盐溶液：即无钙、镁离子的Hanks液。 （2）细胞消化液：％胰蛋白酶液（胰蛋白干粉，加D-Hanks平衡盐溶液100mL，溶解后过滤除菌，调pH值） 溶液。 （3）％NaHCO 3 （4）RPMI1640培养液。 以上溶液均经适当包装，除菌后备用。此外，还需胎牛血清和1000U/mL的青、链霉素液（双抗）。在RPMI1640培养液中加入10%胎牛血清，1%双抗，即成细胞培养液。 4.仪器药品 以3-5人为一个小组，每组需备：乳鼠一只；眼科剪、眼科镊各两把；90mm玻璃培养皿3个，用以清洗组织块；50mL离心管1个；5mL、10mL移液管各5支；35mm培养皿1个。 四、材料 出生后2-3天的乳鼠。 五、实验步骤 1.清洗与消毒 操作者首先进行手的清洗与消毒。 2.处死动物 新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟，置平皿中。 3.取肺 左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。用眼科聂取出肺，置于盛有Hanks液（含有200U/ml青链霉素）的玻璃平皿中，冲洗去血。 4.剪肺 用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的Hanks液冲洗1遍。用弯头眼科剪，将肾剪成1mm3大小的组织块，大小应尽量均匀一致，再用Hank液洗涤2-3次，直到液体澄清为止。 5.消化及分散组织块 将上步清洗过的Hank液吸掉，按组织块体积的5-6倍量加入消化液。转入50mL离心管，置于37℃水浴中进行消化。消化时间在20-40min左右。每隔10min摇动一次，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变为白色为止。
第四大组实验方案 外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1.了解动物细胞培养的方法。 2.掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 3.学会对人类染色体的组型分析。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。经过短期的培养后，用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理细胞，使细胞胀大而不破裂使最后的子染色体充分散开，滴片后再以空气干燥法制片，可获得质量较好的染色体标本。人类外周血细胞几乎都处于G0期和G1期，一般情况不分裂，但在离体培养中，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，可转变成可分裂的转化细胞。 核型是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。正常的核型能代表个体的核型。组型是以模式图的方式表示，它是通过多许多细胞染色体的测量取其平均值制成的，是理想的、模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。 染色体的特征以中期最为显著，所以一般都都分析中期分裂相，根据染色体着丝粒位置的不同，可将染色体分为中部着丝粒染色体（m），亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝粒染色体（st），端部着丝粒染色体（t）。 对任何一个染色体的基本形态，重要参数有3个： 1.相对长度，指单个染色体长度与包括X与Y染色体在内的单倍染色体总长之比，用百分率表示。 2.臂指数，指长臂同短臂的比率。按Levan（1964）的划分标准，臂指数在1.0~1.7之间的称中部着丝粒染色体；臂指数在1.7~ 3.0之间称亚中部着丝粒染色体；臂指数在3.0~7.0之间称亚端部着丝粒染色体；臂指数在大于7.0者称端部着丝粒染色体 3.着丝粒指数，指短臂占该染色体长度的比，用百分率表示。他决定着丝粒饿相对位置。按Levan（1964）的划分标准，着丝粒指数在50%~37.5%之间称中部着丝粒染色体；指数在 37.5%~25.0%之间称亚中部着丝粒染色体；指数在25.0%~12.5%之间称亚端部着丝粒染色体；指数在12.5%~0.0%之间者称端部着丝粒染色体。 正常人类染色体的数目为46条(23对，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22