·530·检验医学2018年6月第33卷第6期 Laboratory Medicine ，June 2018，V ol. 33，No. 6 作者简介：单洪波，女，1979年生，硕士，主管技师，主要从事临床检验工作。基于PCR 和位点特异性引物延伸反应的SNP 检测方法的建立
单洪波1， 金亚南2
（1. 杭州艾迪康医学检验中心，浙江 杭州 310023；
2. 杭州优思达生物技术有限公司，浙江 杭州 310053）
摘要：目的 建立一种基于聚合酶链反应（PCR ）、位点特异性引物延伸反应（ASE ）和核酸试纸条检测
技术的单核苷酸多态性（SNP ）检测方法。方法 先通过PCR 对包含SNP 位点的特异基因序列进行扩增；然后通过带有A 标记的ASE 引物针对SNP 位点的不同基因类型进行特异性延伸；延伸后的产物可以与B 标记的探针进行杂交结合，形成同时携带A 和B 标记的杂交产物；而该杂交产物可以通过核酸试纸条进行目视化检测，从而完成对SNP 基因型的检测。结果 通过对10倍浓度梯度稀释的人类基因组DNA 进行检测，PCR-ASE 的检测敏感性为88 ng/反应；通过在同一条核酸试纸条上针对同一SNP 位点2种不同基因型的检测，达到了多重检测的目的；PCR-ASE 对19名志愿者的5个不同SNP 位点的检测结果与基因测序法完全一致。结论 PCR-ASE 是一种简单、准确的SNP 基因型检测方法。
关键词：引物特异性延伸反应；单核苷酸多态性；核酸试纸条检测技术
Establishment of PCR and ASE-based detection for SNP SHAN Hongbo 1，JIN Yanan 2. （1. Adicon Clinical
Laboratories ，Hangzhou 310023，Zhejiang ，China ；2. Ustar Biotechnologies （Hangzhou ） Ltd.，Hangzhou 310053，Zhejiang ，China ）
Abstract ：Objective To establish polymerase chain reaction （PCR ），allele-specific extension （ASE ） and
nucleic acid detection strip-based detection for single nucleotide polymorphisms （SNP ）. Methods The specific gene sequence containing SNP sites was ampli?ed by PCR. For each SNP site ，ASE primers labeled with A were extended. The ASE reaction products can bind to probe labeled with B ，and hybridization products containing A and B simultaneously were formed. The products can be detected by disposable amplicon cross-contamination proof device containing a nucleic acid detection strip ，and the detection of SNP genotypes can be accomplished. Results Ten-fold serial dilutions of quanti?ed human genomic DNA were used to determine the sensitivity of PCR-ASE （88 ng/reaction ）. The ability of duplex PCR-ASE with the products can be detected by a single nucleic acid detection strip. A total of 19 samples representing 5 common SNP were detected by PCR-ASE ，and the results had the consistency of 100% with DNA sequencing. Conclusions PCR-ASE is simple and accurate detection for SNP.
Key words ：Allele-specific extension ；Single nucleotide polymorphism ；Nucleic acid detection strip-based
detection
文章编号：1673-8640（2018）06-0530-06 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI ：10.3969/j.issn.1673-8640.2018.06.015单核苷酸多态性（s i n g l e n u c l e o t i d e
polymorphism ，SNP ）是指在基因组水平上，
特定核苷酸位置上存在2种或2种以上不同的碱
基，且其中任何一种等位基因在群体中的频率
不<1%。SNP 是一种单碱基水平的分子遗传标
记，不仅可通过连锁或关联分析来定位疾病易
感基因，而且有些SNP 本身就可能会导致某些疾
病或引起个体对药物反应的差异[1]。同时，SNP
图谱的建立还能有效地帮助破解人类生理学密码，了解人类进化的起源以及对患者进行有效的治疗[2]。因此，SNP 检测对疾病的风险性评估、诊断、预防和治疗等各方面均有很大的价值。目前已报道了多种检测S N P 的方法用于基因检测和药物基因组学的研究[1]。引物特异性聚合酶链反应（allele-specific polymerase chain reaction ，AS-PCR ）是目前比较常见的
A f f y m e t r i x全基因组S N P芯片检测 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP) 指基因组单个核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。单核苷酸多态性是基因组上高密度的遗传标志，在人类基因组中已发现的SNP数量超过3000万。作为第三代遗传标记，SNP数量众多、分布密集、易于检测，因而是理想的基因分型目标。SNP分型检测在疾病基因组（如疾病易感性），药物基因组（药效、药物代谢差异和不良反应）和群体进化等研究中具有重大意义。在人研究方面，Affymetrix 公司有分别基于GeneChip和GeneTitan平台的SNP 6.0 芯片和针对中国人群设计的CHB1＆2 Array，既可用于全基因组SNP分析，又可用于CNV分析，极大地方便了中国人类疾病GWAS研究。Affymetrix公司针对多个农业物种也开发了多款商品化的基因分型芯片，如鸡、牛、水牛、鲑鱼、水稻、小麦、辣椒、草莓等，为农业育种研究、遗传图谱构建、群体基因组学研究提供研究手段。此外，Affymetrix公司还支持定制芯片，最低起订量为480个样品。 检测原理|?技术优势|?产品列表|?定制芯片|?数据分析| 基于GeneChip平台的人SNP 6.0 芯片实验流程： 基于GeneTitan平台的Axiom基因分型芯片检测流程： 从SNP原理谈SNP分析技术之SNP芯片 日期：2012-05-21 ? ? 来源：网络 标签：?SNP原理?SNP分析?SNP芯片 摘要:?SNP是近年来基因突变的热点研究之一。它是指在单个的核苷酸上发生了变异，有四种不同的变异形式，而实际上只发生转换和颠换这两种。当科学家弄清了SNP的突变原理以后，他们就着手对SNP进行分析，以求找到疾病相对应的突变位点或者是进行个性化药物治疗研究。其中应用到的技术多达上百余种，其中包括有测序技术、质谱分析技术、HRM技术、Taqman技术以及SNP芯片技术。 恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 SNP是近年来基因突变的热点研究之一。它是指在单个的核苷酸上发生了变异，有四种不同的变异形式，而实际上只发生转换和颠换这两种。当科学家弄清了SNP的突变原理以后，他们就着手对SNP进行分析，以求找到疾病相对应的突变位点或者是进行个性化药物治疗研究。其中应用到的技术多达上百余种，其中包括有测序技术、质谱分析技术、HRM 技术、Taqman技术以及SNP芯片技术。
现在SNP的常用检测方法主要有：Taqman法、质谱法、芯片法、测序法。 Taqman法：准确性高，适合于大样本、少位点，价格比较贵；质谱法：准确性高，适合于大样本、多位点（能检测25个位点）；芯片法：准确性较低，适合于超多位点分析；测序法：非常准确，但是价格也非常的高，但是对于少样本、超多位点还是非常好的选择。 SNP检测方法汇总 分析SNP的方法有许多种，本文收集目前还在用的方法，按通量从高到低排列： 全基因组测序 这是最贵的方法，但也是看SNP最全的方法 大概一个人样本，花2万元 外显子组测序 外显子组测序，也可以得到较全面的SNP信息
大概一个人样本，花1.5万元 随着人全基因组测序的价格降到2万元左右，外显子组测序会很快退出市场 全基因组SNP芯片 原理，核酸杂交，荧光扫描 Illumina和Affymetrix都有很著名的全基因组SNP芯片，例如： Affymetrix: CytoScan，SNP 6.0， Illumina: 660，中华，450K等 SNP芯片，在2000~5000元每样本，还是比全基因组测序的2万元一个样本的价格要低质谱法
原理，精确测量PCR产物的分子量，就可以知道SNP位点上是A/C/G/T中的哪一个Sequenome MassArray法测中等通量的SNP位点是十分准确的 单个位点、单个样本的费用约2元人民币 无需预制芯片、预订荧光探针,只要合成常规的PCR引物就可以做实验了 如果测几十个点，到上百个点，是很方便的方法 SNPseq法 此方法为天昊公司所创，一次测几百个位点 原理：
用Goldgate法做出针对某些位点的多重PCR片段高通量测序，数据分析得到SNP位点结果SNPlex 中等偏高通量的方法，一次几十个位点 原理： 用末端特异的引物做多重PCR，把模板进行扩增基于毛细管电泳，把片段分离开，读颜色SNaPshot
知道基因和位点，如何查SNP的rs号码，得到PCR 产物序列！ [转自丁香园论坛] 老板让查SNP的东西。我有如下SNP的信息，但不知道怎么查SNP的rs号码，没rs号，没序列，没法设计引物，请同志们教我两招啊，插三根鸡毛： 基因：血管紧张素原(angiotensinogen, AGT)基因 M235T 文章：血管紧张素原H"$’I基因多态性与原发性高血压的相关研究;浙江大学学报；2004年33卷，02期。 引物： P1 CCGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT P2 CAGGGTGCTGTCCACACTGGACCCC 基因：G蛋白β3亚单位(GNB3)C825T 文章：G蛋白β3亚单位C825T等位基因多态性与原发性高血压的关系陈肖俊; 汪大望; 吴建波; 熊术道; 王春香; 临床内科杂志, Journal of Clinical Internal Medicine, 2007年 05期 基因：E-选择素G98T E-选择素基因G98T多态性对原发性高血压患者血压及心脏结构功能的影响中国医学影像技术, Chinese Journal of Medical Imaging Technology, 2007年 05
期 基因：β2-BKR基因-58T/C和AGT基因M235T 文章：缓激肽β2受体(β2-bradyk in in receptor,β2-BKR)基因β_2-BKR基因和AGT基因多态性与原发性高血压的相关性研究第三军医大学学报, Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae, 2006 年 11期 基因：化生长因子β1(TGF-β1)基因第1外显子+869T/C 及+915G/C 文章：转化生长因子β_1基因多态性与原发性高血压关系的研究中国老年学杂志, Chinese Journal of Gerontology,2007年 10期 最好是多查些文献，找到位点附件的序列（如测序图谱和TaqMan探针等的序列），然后在到NCBI上作BLAST，这样就可以找到该位点在基因序列中的位置。有的SNP位点可能没有对应的RS号。 还可以根据该位点的信息直接在NCBI上查出基因序列，在根据该位点在基因中的位置，如mRNA（有的是cDNA）为起始位置，往后计算该位点的位置。通常这样找到的位点还是需要与文献报道的位点序列进行笔对。因为，不少SNP位点的命名规律是不同的，也就是说有的是mRNA 中的位置，有的是cDNA中的位置，有的还是蛋白编码的位置，所以比较容易出错，最好要与文献进行笔对。
SNP检测(中文) Part I：样本基因组DNA的提取 1.取50 μl血样于离心管中，加PBS缓冲液至1.5mL，轻轻地摇匀。冷冻离心机6500 rpm离心10 min，去掉上清液，保留沉淀物。重复洗2次。 2.向保留沉淀物的离心管中加入DNA提取液500 μl，15 μl的蛋白酶K，混匀放入55℃水浴锅中消化过夜。 3.将消化过夜的反应液冷却至室温，加入等体积冰冷的饱和酚溶液，盖紧离心管盖，缓慢地来回颠倒10 min（在冰上进行），形成均匀的乳浊液。 4.冷冻离心机12000 rpm离心10min。 5.小心地吸取上层水相至新管，用等体积饱和酚再抽提一次。 6.用等体积的氯仿再抽提一次。 7.离心后再取上清液于另一离心管中，加入1∕10体积3mol/L的NaAc使终浓度达到0.3mol/L，并加2倍体积冷无水乙醇，上下倒置混匀，置-20℃冰箱沉淀30-60min。 8.冷冻离心机12000 rpm离心10 min，弃上清液。 9.加入500 μl 70%冷乙醇小心洗涤沉淀。冷冻离心机6500 rpm离心5 min，弃上清，用干净的吸水纸或用吸头将管壁残留的乙醇去除，干燥10～15 min，不要等沉淀完全干燥，否则难以溶解。 10.沉淀于100 μl超纯水中。 11.将提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳及浓度的测定。 Part II：SNP分型检测 1.引物的设计与合成 (1)查阅文献，参考文献中的引物，直接合成； (2)根据SNP的位置找到其序列，设计引物并合成 2.PCR扩增片段 (1)PCR扩增体系： Components Volume (μl)
DNA template1 PrimeSTAR0.5 dNTPs (2.5 mM)1 Primer-F (10 μM)1 Primer-R (10 μM)1 5*PS buffer(Mg2+)10 ddH2O1 (2)PCR扩增程序： (3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。 (4)A. 测序法：对目的条带进行切胶回收纯化测序，根据测序结果统计分析各个样本下该SNP的基因型。 B. 酶切法：一般这种方法都有文献支持，在前期可以确定好对应的内 切酶。根据内切酶的反应体系将PCR产物进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。根据酶切条带来统计分析各个样本下该SNP的基因型。 Part II 标签SNP检测 1.引物的设计与合成 根据基因的序列设计扩增片段引物并合成。 2.PCR扩增片段 (1)PCR扩增体系： Components Volume (μl) DNA template1 PrimeSTAR0.5 dNTPs (2.5 mM)1 Primer-F (10 μM)1 Primer-R (10 μM)1 5*PS buffer(Mg2+)10 ddH2O1
1定义：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP 并不包括后两种情况。单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换（C T，在其互补链上则为G A），也可能是颠换（C A，G T，C G，A T）。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有
1分子标记： 分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。即使想要验证已经定位的QTLs，我们也需要相对应的区间内的分子标记，尤其是SNP标记。 全基因组SNP—Affymetrix芯片： 一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单，高通量。可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。在国家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型检测的芯片。 目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。而Affymetrix公司目前并没有相应的产品。但是通过跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的结果进行开发。 番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，但是他们包括的基因数目~30,000个，整体情况相近。另外，番茄作为自交植物，其LD 的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。因此，综合考虑，我建议我们可以开发~3k芯片，应该可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。总之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高的应用价值。即使像玉米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。 全基因组SNP—Douglas： 当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）对于优良的QTLs或是基因，我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行Douglas 系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也而不需要再一次利用系统只检测材料覆盖定位区间的基因型，Douglas可以利用． ）对于一些高信息量，。3Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图）一套可以用来构建番茄的指纹图谱。因此，均匀分布在全基因的SNP分子标记，SNP标记是必不可少的。完整能够与Affymetrix芯片相对应的 SNP标记分布图图 QTL区间上的注：蓝色为深入片段，棕色为背景染色体。SNP标记的开发Douglas系统下筛选具有一PCR反应体系，通过建立稳定、可靠的番茄DNA提取流程与优化致性、稳定性与多态性SNP分子标记引物，从而构建番茄全基因组SNP分子标记。全基因组的SNP分子标记，可以用于番茄QTL定位群体的检测，分子标记辅助育种的选择以及全基因组选择的群体基因型的检测。同时，从中挑选高质量，高信息量的分子标记用于构建一套完成的番茄指纹图谱，检测品种一致性。 供试材料： 22份材料的DNA用作特异性引物筛选，2份水作为NTC（None Template Control），共计24份模板作为SNP引物的初期筛选。以上实验在Q6仪器上进行。对于筛选获得的一致性引物，在利用94株番茄自交系与2份水作为模板，进一步在Douglas仪器上验证。 DNA提取：
Affymetrix 全基因组SNP 芯片检测 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP) 指基因组单个核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。单核苷酸多态性是基因组上高密度的遗传标志，在人类基因组中已发现的SNP数量超过3000万。作为第三代遗传标记，SNP数量众多、分布密集、易于检测，因而是理想的基因分型目标。SNP分型检测在疾病基因组（如疾病易感性），药物基因组（药效、药物代谢差异和不良反应）和群体进化等研究中具有重大意义。在人研究方面，Affymetrix 公司有分别基于GeneChip和GeneTitan平台的SNP 6.0 芯片和针对中国人群设计的CHB1＆2 Array，既可用于全基因组SNP分析，又可用于CNV分析，极大地方便了中国人类疾病GWAS研究。Affymetrix公司针对多个农业物种也开发了多款商品化的基因分型芯片，如鸡、牛、水牛、鲑鱼、水稻、小麦、辣椒、草莓等，为农业育种研究、遗传图谱构建、群体基因组学研究提供研究手段。此外，Affymetrix公司还支持定制芯片，最低起订量为480个样品。 检测原理| 技术优势| 产品列表| 定制芯片| 数据分析| 基于GeneChip平台的人SNP 6.0 芯片实验流程： 基于GeneTitan平台的Axiom基因分型芯片检测流程：
从SNP原理谈SNP分析技术之SNP芯片 日期：2012-05-21 来源：网络 标签：SNP原理SNP分析SNP芯片 摘要: SNP是近年来基因突变的热点研究之一。它是指在单个的核苷酸上发生了变异，有四种不同的变异形式，而实际上只发生转换和颠换这两种。当科学家弄清了SNP的突变原理以后，他们就着手对SNP进行分析，以求找到疾病相对应的突变位点或者是进行个性化药物治疗研究。其中应用到的技术多达上百余种，其中包括有测序技术、质谱分析技术、HRM技术、Taqman技术以及SNP芯片技术。 恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 SNP是近年来基因突变的热点研究之一。它是指在单个的核苷酸上发生了变异，有四种不同的变异形式，而实际上只发生转换和颠换这两种。当科学家弄清了SNP的突变原理以后，他们就着手对SNP进行分析，以求找到疾病相对应的突变位点或者是进行个性化药物治疗研究。其中应用到的技术多达上百余种，其中包括有测序技术、质谱分析技术、HRM 技术、Taqman技术以及SNP芯片技术。 SNP 的分型技术可分为两个时代，一为凝胶时代，二为高通量时代。凝胶时代的主要技术和方法包括限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)、寡核苷酸连接分析(OLA)、等位基因特异聚合酶链反应分析(AS2PCR)、单链构象多态性分析(SSCP)、变性梯度凝胶电泳分析(DGGE)，虽然这些技术与高通量时代的技术原理大致一样，但是由于它不能进行自动化，只能进行小规模的SNP分型测试，所以必然会被淘汰。高通量时代的SNP分型技术按其技术原理可分为:特异位点杂交(ASH)、特异位点引物延伸(ASPE)、单碱基延伸(SBCE)、特异位点切割(ASC)和特异位点连接(ASL)5 种方法。此外，采用特殊的质谱法和高效液相层析法也可以大规模、快速检出SNP 或进行SNP 的初筛。近年来已经在晶体上用“光刻法”实现原位合成，直接合成高密度的可控序列寡核苷酸，使DNA 芯片法显示出强大威力，对SNP 的检测可以自动化、批量化，并已在建立SNP 图谱方面投入实际应用。DNA 芯片法有望在片刻之间评价整个人类基因组。 2007 年5月份，Affymetrix公司发布了Genome-wide SNP 6.0 芯片，除包括90多万个用于单核苷酸多态性(SNP)检测探针外，还有90多万个用于拷贝数变化(CNV)检测的探针，可使全基因组平均分辨率达3 kb，既可用于全基因组SNP分析，又可用于CNV分析，真正实现了一种芯片两种用途，方便研究者挖掘基因组序列变异信息。通过基因分型信息还可以鉴别中性拷贝数的杂合性缺失(copy neutral LOH)、单亲二体病(UPD)及嵌合现象(可以精确检测到20% 嵌合体)。近来Affymetrix 公司又陆续发布了多款针对东亚、中国、
SNP位点的选择 1，如果是检测基因的所有已知的SNP，那么首先要去了解并查询到这些SNP位点，SNP 位点可以通过查询dbSNP数据库（https://www.doczj.com/doc/bd12418449.html,/SNP/）和TSC（The SNP Consortium）数据库（https://www.doczj.com/doc/bd12418449.html,/），可以获知基因及上下游邻近序列的SNP位点。 2，至于挑选的原则，可以介绍一下Hap Map的正规化标准： SNP Selection Criteria Category 1 "verified" This contains all SNPs for which we have allele frequency or genotyping data. This includes SNPs from the TSC allele frequency project, as well as SNPs characterized by JSNP. These SNPs were generated from those rs clusters in which at least one of the SNPs in the cluster contains genotype or allele frequency data and the minor allele must have been seen in at least two individuals. Category 2 "two-hit" These are true double-hit SNPs, produced in collaboration with Jim Mullikin and Sarah Hunt. A double-hit SNP must be seen twice, in two different DNA samples which must have produced two alleles. TSC trace data was only allowed to contribute one hit per allele because the individual source DNA for a trace could not be identified. Category 3 "jsnp-verified/perlegen-verified" This category contains two groups: SNPs that JSNP certifies are likely to be real based on manual inspection of their data (but have not been genotyped)，and SNPs that Perlegen verified independently. Category 4 "bac-overlap" These are SNPs from BAC overlaps that do not fall into category 1 or 2 above. 我的经验： 也可以从文献中查找，找好几个SNP位点，如果你样本量很大，那么很容易出有意义的结果。有以下三种方法可供选择： 1、提取EDTA抗凝全血中的DNA，荧光定量PCR法。用ABI的SNP分型试剂盒，只要你提供位点，买来试剂盒就上仪器，成本也不高，效果还可靠。 2、提取EDTA抗凝全血中的DNA，普通PCR扩增（需设计引物，可自己设计或者让公司设计），限制性内切酶分型（在引物设计的同时找到合适的酶切位点），分出基因型，统计SPSS 卡方检验 3、提取EDTA抗凝全血中的DNA，高分辨溶解曲线，一次性即可完成PCR扩增及基因分
. SNP开发/验证的研究方法和技术路线 1分子标记： 分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。即使想要验证已经定位的QTLs，我们也需要相对应的区间内的分子标记，尤其是SNP标记。 1.1 全基因组SNP—Affymetrix芯片： 一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单，高通量。可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。在国家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型检测的芯片。 目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。而Affymetrix公司目前并没有相应的产品。但是通过跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的结果进行开发。 番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，但是他们包括的基因数目~30,000个，整体情况相近。另外，番茄作为自交植物，其LD 的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。因此，综合考虑，我建议我们可以开发~3k芯片，应该可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。总之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高的应用价值。即使像玉米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。 1.2全基因组SNP—Douglas： 当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）对于优良的QTLs或是基因，我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行Douglas 系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也. . 而不需要再一次利用系统只检测材料覆盖定位区间的基因型，可以利用Douglas 对于一些高信息量，）。3）Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图1.1分子标记，可以用来构建番茄的指纹图谱。因此，一均匀分布在全基因的SNP Affymetrix芯片相对应的SNP标记是必不可少的。套完整能够与
2006年5月第16卷 第5期 中国比较医学杂志 CHINESE J OURNAL OF COMPAR ATIVE MEDICINE May ,2006Vol .16 No .5 研究报告 4个近交系小鼠SNP 位点的测定 胡培丽,范昌发,岳秉飞,邢瑞昌 (中国药品生物制品检定所,北京 100050) 【摘要】 目的 将新近建立的单管双向等位基因专一性扩增(single _tube bi _d irectional allele specific amplification ,SB _ASA )方法用于分析国内近交系小鼠基因组中的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphis m ,SNP )。方法 以国内4个近交系小鼠为研究对象,采用SB _ASA 方法对其16个SNP 位点进行检测,并通过测序进行验证。结果 16个SNP 位点,SB _ASA 都成功地对4个品系小鼠进行了分型,与测序结果完全一致。结论 SB _ASA 方法可以准确地检测国内近交系小鼠SNP 位点等位基因型。 【关键词】 单核苷酸多态性;单管双向等位基因专一性扩增;小鼠;近交系;遗传检测【中图分类号】Q78 【文献标识码】A 【文章编号】1671-7856(2006)05-0278-03 Monitoring the S NP Loci of 4Inbred Mice HU Pei _li ,FAN Chang _fa ,YUE Bing _fei ,XING Rui _chang (National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products ,Beijing 100050,China ) 【Abstract 】 Objective T o analyse S NP (s ingle n ucleotide polymorp his m )loci of the domestic inbred mouse gen e by the lately establis hed method (single _tube bi _directional allele specific amplification (SB _ASA )).Method Four domestic inbred mouse strains were detected by 16SNP loci with the method of SB _ASA ,and seq uencing was designed to validate the reliab ility of the method .Results SB _AS A was successfully used to type 4inbred mous e strains for 16SNP loci ,and th e res ults were completely consistent with s equencin g .C onclusion SB _ASA could be us ed to exactly inspect genotype of the domes tic in bred mous e . 【Key words 】 Single nucleotide polymorphis m ;Single _tube bi _directional allele specific amplification ;Mouse ;Inbred ;Genetic monitoring [基金项目]北京实验动物法制管理与科技支撑平台(编号:Z0004100040691)。 [作者简介]胡培丽(1981-),女,硕士研究生,研究方向:免疫遗传检测。E _mail :hupeili -1981@https://www.doczj.com/doc/bd12418449.html, [通迅作者]岳秉飞(1960-),男,研究员,博士。研究方向:动物遗传学。E _mail :yue _bingfei @nicpbp .org .cn 自从Jenson 等于上世纪初应用一个闭锁繁育的 小白鼠品系成功地进行了肿瘤转移试验以来,近交系实验动物在医学研究(特别是肿瘤研究)中显示了潜在的价值。尔后,关于培育近交系动物的理论及实践工作得到了较快的发展。高度近交系实验动物能为生物学、医学及农业科研工作提供敏感、特异性 强和重复性好的试验材料[1] 。 目前,已培育出了大量的小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、家兔、鸡等实验动物的近交系。在我国,随着生物科学的发展,培育大量的、具有各种特殊用途的、符合遗传质量标准近交系实验动物,满足科学研究的需要,已经刻不容缓。对于近交系小鼠,在从国外不断引进的同时,我国也先后培育出一些具有一定 特征的品系,并逐步应用于各个科学领域。 近交系小鼠具有同基因性、长期遗传稳定性、均一性、个体性、背景资料和数据较完善等特点,随着生命科学的不断发展,对其遗传品质要求越来越高。传统的小鼠遗传检测方法有形态学方法、免疫学方法、生物化学方法 [2-3] 。随着一系列分子遗传标记 的发现,产生了分子生物学检测方法,应用于实验动物遗传检测,如基于限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism ,RFLP )[4] 、随机引物多态性(Random a mplified polymorphic DNA , RAPD )[5-7]、微卫星(Microsatellite )[8-11] 和DNA 指纹(DNA Fingerprints )[12-13] 等。近来单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism ,SNP )技术也被用于
1定义： 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。理论
SNP的检测方法（直接测序法与PCR-SSCP） 人类基因组中存在着广泛的多态性，最简单的多态形式是发生在基因组中的单个核苷酸的替代，即单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）。SNP通常是一种二等位基因的（biallelic），即二态的遗传变异，SNP的数量大、分布广，在组成人类基因组的30亿个碱基中，平均每1000个就有一个SNP。SNP作为第三代遗传标记，在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体疾病易感性分析与药物基因组学的研究中发挥着愈来愈重要的作用。 1.直接测序法进行SNP分析 在所有SNP的检测方法中，对欲检测片段进行直接扩增、测序是最为准确的方法。通常情况下，纯合型SNP位点的测序峰为单一峰型，而杂合型SNP位点的测序峰为套峰，因而很容易将其区分开来。通过直接测序方法进行SNP检测的检出率接近100%。 2. PCR-SSCP方法 单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism，SSCP）是一种简单、高效地检测DNA或RNA序列中点突变的技术，由于实验成本较低，也是一种目前较为常用的方法。 检测原理： 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。 需要注意的问题：
A．PCR-SSCP只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步 测序。 B．由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。 C．经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现。
现在SNP得常用检测方法主要有：Taqman法、质谱法、芯片法、测序法。Taqman法：准确性高，适合于大样本、少位点，价格比较贵；质谱法：准确性高，适合于大样本、多位点（能检测25个位点）；芯片法：准确性较低，适合于超多位点分析；测序法：非常准确，但就是价格也非常得高，但就是对于少样本、超多位点还就是非常好得选择。 SNP检测方法汇总 分析SNP得方法有许多种，本文收集目前还在用得方法，按通量从高到低排列： 全基因组测序 这就是最贵得方法，但也就是瞧SNP最全得方法 大概一个人样本，花2万元 外显子组测序 外显子组测序，也可以得到较全面得SNP信息 大概一个人样本，花1、5万元 随着人全基因组测序得价格降到2万元左右，外显子组测序会很快退出市场 全基因组SNP芯片 原理，核酸杂交，荧光扫描 Illumina与Affymetrix都有很著名得全基因组SNP芯片，例如： Affymetrix: CytoScan，SNP 6、0， Illumina: 660，中华，450K等 SNP芯片，在2000~5000元每样本，还就是比全基因组测序得2万元一个样本得价格要低质谱法 原理，精确测量PCR产物得分子量，就可以知道SNP位点上就是A/C/G/T中得哪一个Sequenome MassArray法测中等通量得SNP位点就是十分准确得 单个位点、单个样本得费用约2元人民币 无需预制芯片、预订荧光探针,只要合成常规得PCR引物就可以做实验了
如果测几十个点，到上百个点，就是很方便得方法 SNPseq法 此方法为天昊公司所创，一次测几百个位点 原理： 用Goldgate法做出针对某些位点得多重PCR片段 高通量测序，数据分析得到SNP位点结果 SNPlex 中等偏高通量得方法，一次几十个位点 原理： 用末端特异得引物做多重PCR，把模板进行扩增 基于毛细管电泳，把片段分离开，读颜色 SNaPshot 中等通量得方法 设计3'位挨着目标位点得探针 用双脱氧得荧光标记ddNTP做一个碱基得延伸 毛细管电泳，瞧延伸得这个碱基就是什么颜色 Taqman法 Taqman原理，如果要找原理，请回复“荧光”两字 Taqman方法，一次一管测一个位点 通量最低，但就是结果可靠 原理： 设计与SNP位点互补得荧光探针，其中一个标VIC（红色荧光基团）,另一个标FAM（绿色荧光基团），同时分别有淬来基团吸光 Taq酶有5'-->3'得外切酶活性，如果探针粘有模板上，就被切碎 探针被切碎后，荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。瞧荧光颜色，就可以知道SNP位点上就是什么碱基
SNP与疾病的关联研究 摘要：SNP作为一门新兴技术，一般而言,SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP 总量大概是300万个。 SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。 关键词：SNP 疾病脑出血冠心病 正文：激肽释放酶基因多态性与人群脑出血的关联研究 流行病学研究表明高血压患者尿液中激肽释放酶的活性与其血压水平呈负相关，提示KLK1基因可能在血压的调节中起到一定的作用；在人类疾病研究领域，有研究表明KLK1基因遗传变异与血管重构相关，同时发现了激肽释放酶基因启动子及编码区多态性与人类原发性高血压的发生有关。 KLK1基因位于染色体19q3.2-q13.4,全长包括5个外显子和4个内含子。其编码蛋白KLK1是一种丝氨酸蛋白酶，广泛分布在心血管系统。肾脏及中枢神经系统中，以旁分泌形式发挥其生物学作用。在心血管系统中，组织型激肽释放酶被分泌到细胞外，并迅速转化为活性激肽释放酶，作用于其底物激肽原释放缓激肽，缓激肽与受体结合后可调节一系列具有生物活性介质的释放，如一氧化氮，前列腺素和血小板活化因子等，从而会发扩张血管，调节血流等多种生物学效应，参与平滑肌收缩，细胞增殖，血管重构等多种生理和病理生理过程。 通过手机273例散发性脑出血患者和140名正常对照着的外周血标本。采用多重单碱基延伸SNP分型技术和DNA测序来检测KLK1基因rs5516及rs5517多态性位点在2组人群中的分布。结果发现：(1)脑出血组织型KLK1基因rs5516多态和等位基因频率分布差异无统计学意义（P>0.05）,脑出血组织型KLK1基因rs5517多态A 等位基因频率显著高于对照组（P<0.05）。（2）对照组rs5517多态AA及GA基因型携带者舒张压水平显著高于GC基因型携带者（P<0.05）；而rs5516位点各基因型亚组间血压水平差异无统计学意义（P>0.05），从而得出结论，组织型激肽释放酶基因rs5516多态性与脑出血无关，而组织型激肽释放酶基因rs5517多态性与脑出血存在关联，可能通过影响血压水平而参与脑出血发生发展。 SNP 用于冠心病相关基因的研究 许多研究结果表明血浆中脂蛋白的相对水平在动脉粥样硬化性心脏病发病机理的起重要作用，脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)与肝脂酶(hepatic lipase, HL)对脂蛋白的代谢起重要作用，编码它们的基因成为重要的致动脉粥样硬化性心脏病的危险因素。 本研究通过对中国人群(95％为汉族)LPL、HL等基因SNPs的研究，揭示它们在中国人群
·530·检验医学2018年6月第33卷第6期 Laboratory Medicine ，June 2018，V ol. 33，No. 6 作者简介：单洪波，女，1979年生，硕士，主管技师，主要从事临床检验工作。基于PCR 和位点特异性引物延伸反应的SNP 检测方法的建立 单洪波1， 金亚南2 （1. 杭州艾迪康医学检验中心，浙江 杭州 310023； 2. 杭州优思达生物技术有限公司，浙江 杭州 310053） 摘要：目的 建立一种基于聚合酶链反应（PCR ）、位点特异性引物延伸反应（ASE ）和核酸试纸条检测 技术的单核苷酸多态性（SNP ）检测方法。方法 先通过PCR 对包含SNP 位点的特异基因序列进行扩增；然后通过带有A 标记的ASE 引物针对SNP 位点的不同基因类型进行特异性延伸；延伸后的产物可以与B 标记的探针进行杂交结合，形成同时携带A 和B 标记的杂交产物；而该杂交产物可以通过核酸试纸条进行目视化检测，从而完成对SNP 基因型的检测。结果 通过对10倍浓度梯度稀释的人类基因组DNA 进行检测，PCR-ASE 的检测敏感性为88 ng/反应；通过在同一条核酸试纸条上针对同一SNP 位点2种不同基因型的检测，达到了多重检测的目的；PCR-ASE 对19名志愿者的5个不同SNP 位点的检测结果与基因测序法完全一致。结论 PCR-ASE 是一种简单、准确的SNP 基因型检测方法。 关键词：引物特异性延伸反应；单核苷酸多态性；核酸试纸条检测技术 Establishment of PCR and ASE-based detection for SNP SHAN Hongbo 1，JIN Yanan 2. （1. Adicon Clinical Laboratories ，Hangzhou 310023，Zhejiang ，China ；2. Ustar Biotechnologies （Hangzhou ） Ltd.，Hangzhou 310053，Zhejiang ，China ） Abstract ：Objective To establish polymerase chain reaction （PCR ），allele-specific extension （ASE ） and nucleic acid detection strip-based detection for single nucleotide polymorphisms （SNP ）. Methods The specific gene sequence containing SNP sites was ampli?ed by PCR. For each SNP site ，ASE primers labeled with A were extended. The ASE reaction products can bind to probe labeled with B ，and hybridization products containing A and B simultaneously were formed. The products can be detected by disposable amplicon cross-contamination proof device containing a nucleic acid detection strip ，and the detection of SNP genotypes can be accomplished. Results Ten-fold serial dilutions of quanti?ed human genomic DNA were used to determine the sensitivity of PCR-ASE （88 ng/reaction ）. The ability of duplex PCR-ASE with the products can be detected by a single nucleic acid detection strip. A total of 19 samples representing 5 common SNP were detected by PCR-ASE ，and the results had the consistency of 100% with DNA sequencing. Conclusions PCR-ASE is simple and accurate detection for SNP. Key words ：Allele-specific extension ；Single nucleotide polymorphism ；Nucleic acid detection strip-based detection 文章编号：1673-8640（2018）06-0530-06 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI ：10.3969/j.issn.1673-8640.2018.06.015单核苷酸多态性（s i n g l e n u c l e o t i d e polymorphism ，SNP ）是指在基因组水平上， 特定核苷酸位置上存在2种或2种以上不同的碱 基，且其中任何一种等位基因在群体中的频率 不<1%。SNP 是一种单碱基水平的分子遗传标 记，不仅可通过连锁或关联分析来定位疾病易 感基因，而且有些SNP 本身就可能会导致某些疾 病或引起个体对药物反应的差异[1]。同时，SNP 图谱的建立还能有效地帮助破解人类生理学密码，了解人类进化的起源以及对患者进行有效的治疗[2]。因此，SNP 检测对疾病的风险性评估、诊断、预防和治疗等各方面均有很大的价值。目前已报道了多种检测S N P 的方法用于基因检测和药物基因组学的研究[1]。引物特异性聚合酶链反应（allele-specific polymerase chain reaction ，AS-PCR ）是目前比较常见的