1定义：
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。理论
上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP 都是二等位多态性的。这种变异可能是转换（C T，在其互补链上则为G A），也可能是颠换（C A，G T，C G，A T）。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。Wang等的研究也证明了这一点。转换的几率高，可能是因为CpG二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。
SNP 在动物基因组中分布广泛,每一个核苷酸发生突变的概率大约为10 - 9 。由于选择压力,SNP在单个基因、整个基因组中以及种群间的分布是不均匀的。SNP 在非编码区中要多于编码区,而且在编码区也是非同义突变(有氨基酸序列的改变) 的频率比其他方式突变的频率低得多[4 ] 。而基因间,同一种基因中的编码SNP (coding
SNP ,cSNP) 的数目也不相同,可从0～29 个不等。多项研究同时发现不同种族间SNPs 的数目也是不同的,非洲人群及非裔种族中SNPs
数量最多,而其他种群的SNPs 要少得多,因此通过比较亚群间等位基因的频率将有助于阐明种族的结构和进化。
在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP（coding SNP,cSNP）比较少，因为在外显子内，
其变异率仅及周围序列的1/5.但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注。
从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP又可分为2种：一种是同义cSNP（synonymous cSNP），即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP（non-synonymous cSNP），指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。cSNP中约有一半为非同义cSNP。
先形成的SNP在人群中常有更高的频率，后形成的SNP所占的比率较低。各地各民族人群中特定SNP并非一定都存在，其所占比率也不尽相同，但大约有85%应是共通的。
2.SNP自身的特性：
1）SNP数量多，分布广泛。据估计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs.SNP 遍布于整个人类基因组中，根据SNP在基因中的位置，可分为基因编码区SNPs（Coding-region SNPs，cSNPs）、基因周边SNPs（Perigenic SNPs，pSNPs）以及基因间SNPs（Intergenic SNPs，iSNPs）等三类。2）SNP适于快速、规模化筛查。组成DNA的碱基虽然有4种，但SNP一般只有两种碱基组成，所以它是一种二态的标记，即二等位基
因（biallelic）。由于SNP的二态性，非此即彼，在基因组筛选中SNPs往往只需+/-的分析，而不用分析片段的长度，这就利于发展自动化技术筛选或检测SNPs。
3）SNP等位基因频率的容易估计。采用混和样本估算等位基因的频率是种高效快速的策略。该策略的原理是：首先选择参考样本制作标准曲线，然后将待测的混和样本与标准曲线进行比较，根据所得信号的比例确定混和样本中各种等位基因的频率。
4）易于基因分型。SNPs 的二态性，也有利于对其进行基因分型。对SNP进行基因分型包括三方面的内容：（1）鉴别基因型所采用的化学反应，常用的技术手段包括：DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异的寡核苷酸连接反应、侧翼探针切割反应以及基于这些方法的变通技术；（2）完成这些化学反应所采用的模式，包括液相反应、固相支持物上进行的反应以及二者皆有的反应。（3）化学反应结束后，需要应用生物技术系统检测反应结果。
绝大多数疾病的发生与环境因素和遗传因素的综合作用有关，通常认为是在个体具有遗传易感性的基础上，环境有害因素作用而导致疾病。不同群体和个体对疾病的易感性、抵抗性以及其他生物学性状（如对药物的反应性等）有差别，其遗传学基础是人类基因组DNA 序列的变异性，其中最常见的是SNP.易感基因的特点是基因的变异本身并不直接导致疾病的发生，而只造成机体患病的潜在危险性增加，一
旦外界有害因素介入，即可导致疾病发生。另外在药物治疗中，易感基因的变异造成药物对机体的疗效和副作用不同。
随着人类基因组计划的进展，人们愈来愈相信基因组中的SNP 有助于解释个体的表型差异、不同群体和个体对疾病，特别是对复杂疾病的易感性以及对各种药物的耐受性和对环境因子的反应。因此，寻找和研究SNP 已成为人类基因组计划的内容和目标之一。
多态性与突变的区别
1、多态性是一个群体概念，多态性指这个差异占群体的1%以上。否则就叫突变（小于1%）
2、SNP是多态性中的一种，只是进一步限定了差异只是单碱基。
3、SNP
4、突变一般不是一个个体全部细胞的变化。
5、如果突变发生在生殖细胞，则可以遗传，但是只要这个突变群没有达到总群体的1%，它就只是一个突变株/系。达到了1%就是多态性了。
常用数据库：
Human Gene Mutation Database (HGMD) //
https://www.doczj.com/doc/983055123.html,/uwcm/mg/hgmd0.html // The Genome
Database (GD) //https://www.doczj.com/doc/983055123.html, //Database of Single Nuleotide Polymorphisms (dbSNP) // https://www.doczj.com/doc/983055123.html,/SNP/
//Human Genome Variation Database (HGVbase)
//http://hgvbase.cgb.ki.se/ //The Snp Consortium，LTD.（TSC）
//https://www.doczj.com/doc/983055123.html,/ //https://www.doczj.com/doc/983055123.html,
3.SNP现有检测技术
人们对SNP 的研究方法进行了许多探索和改进。SNP 分析技术按其研究对象主要分为两大类,即: ①对未知SNP 进行分析,即找寻未知的SNP 或确定某一未知SNP 与某遗传病的关系。检测未知SNP 有许多种方法可以使用,如温度梯度凝胶电泳( TGGE) 、变性梯度凝胶电泳(DGGE) 、单链构象多态性(SSCP) 、变性的高效液相色谱检测(DHPLC) 、限制性片段长度多态性(RFL P) 、随机扩增多态性DNA(RAPD) 等,但这些方法只能发现含有SNP 的DNA 链,不能确知突变的位置和碱基类别,要想做到这一点,必须对那些含有SNP 的DNA 链进行测序。②对已知SNP 进行分析,即对不同群体SNP遗传多样性检测或在临床上对已知致病基因的遗传病进行基因诊断。筛查已知SNP 的方法有等位基因特异寡核苷酸片段分析(ASO) 、突变错配扩增检验(MAMA) 、基因芯片技术(gene chips) 等。由于人类基因工程的带动,许多物种都已开始了基因组的项目,并建立了大量数据库,比较这些来自不同实验室不同个体的序列, 就可以检测到
SNP。
SNP位点信息已知的情况下，选择SNP的GENOTYPING的方法，主要根据你的经费情况设计，我分别给你分析一下现状：
A、一般实验室：经费一般，仪器不具备时，最多用的是以下两种方法：
1、基于PCR的方法，也叫AS-PCR，(ALLELE-SPECIFIC PCR)的办法。主要原理是利用引物在扩增时3'端相对高的BASE 要求，进行设计。这个方法是最便宜的，不需要酶切，一次PCR 就可以得到GENOTYPING的信息。
缺点：PCR对于3'端的特异性在不同退火温度时有出入，所以退火温度的摸索很关键，否则假阳性扩增是很容易的。另外，内参照的设置也很重要，这个东西还是很有意思的。而且，所使用的引物位置无法人为调整，只能放在SNP的5'段。
2、基于酶切分型。依靠限制性内切酶的忠贞性进行单SNP的分型。SNP突变与否，可能影响某个酶识别位点的存在或消失。通过酶切产物的电泳条带，判断SNP的突变的情况，即纯和，野生纯和，和杂和子。
当没有直接可利用的酶切位点时，可以采用突变引物中个别BASE，从而凑成切点的设计，也叫做RG-PCR，restriction site generation PCR。
B、有经费的实验室的方法：
这里我写几个自己曾经涉足过的方法，可行性比较强，但是需要相应的经费支持和相应的仪器，但是通量相对更高，效率更好：
1、直接测序，基于PCR产物的直接sequencing的方法，比对序列结果，就可以进行SNP的识别和分析。
2、分型质谱，华大生物信息平台那边可以外接服务，提供PCR 产物即可。
3、pyro-sequencing，微测序，中科院遗传所王沥研究员那里有可以联系的外接服务。
4、D-HPLC，变性高效液相色谱法。北京可以去联系做的地方不少，北京大学生科院有机器，另外北京大学肿瘤研究所也有机器，国家人类基因组陈标那里也有一台，需要做的话，拿着经费和他们联系就可以，这个方法也很不错，价钱可以商量。
5、还有些方法，如DNA芯片技术适合对于large scale 的SNP 的筛查，一般用于组学领域，可能不适用与您的情况。还有许多如荧光共振能量转移等方法/探针杂交法等，并未在本领域中国内推广，就不一一介绍了。
1）测序
主要发现新的SNP位点和比较集中的SNP位点，如hla区域，但成本较高，工作量大，不适合大样本做疾病关联分析。
2）taqman探针
结果比较可靠，国外文章也大量应用，不过对于国内成本偏高，同类还有snpshot技术，abi和贝克曼都相应试剂盒。成本和成功率都比taqman要低。
3）snp芯片
国外大规模筛查疾病关联分析常用，illumina和affy都有不同密度的成熟产品，单位点成本很低，但点较多，样本多时也会很高花费，但结果准确，适合复杂疾病，有实力的项目组一般大型机器点在384-群基因组可以订制，但成本会高；illumina开发了一台小的芯片，极其适合1-384，可以订制，成本在2-5元/人点，但还没有很成熟的流程，具体效果和成功率要进一步看。
4）剩下的就是传统方法如酶切，PCR-SSCP等，也有杂志接受，但一般需要测序验证。缺点是工作量太大，结果不准确，不是所有位点都可以做，但成本很低。
目前已有多种方法可用于SNP检测，如根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。
传统的SNP检测方法是采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。这些技术虽在某种程度上能完成对SNP的检测，但由于它们必须通过凝胶电泳进行检测，因此，距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。传统的RFLP只能检测到SNP的一部分，测序技术既费时费力，又不易实现自动化，而且DNA链的二级结构还容易造成人工假相，使测序结果出现偏差，不适宜于SNP 的检测；SSCP则很难满足自动化的需要，难以大规模开展工作。因此，这些方法均未被广泛采用。
DNA芯片技术是近年来新开发的一种DNA序列变异检测工具。DNA 芯片(DNA chip),也称生物芯片(biochip),其大小与计算机上的CPU芯片相似，约1 cm2或更大些，以玻璃、硅、聚丙烯等作为载体基片，芯片上铺了一层肉眼看不见的DNA纤维“地毯”，即具有特定碱基序列的探针。待测基因经提取后，被切成长短不一的片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上。由于DNA和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。
目前已有多家公司开展了对芯片的研究，例如美国的Affymetrix公司、NEN生命科学公司等。前者曾开发出BRCA1(乳癌基因1号)芯片、p53芯片等，后者则在1张玻璃芯片上集成了多达2400个已知基因。此外，Research Genetics公司新近开发了1个集成有1500个
SNP的DNA芯片，它涵盖了人类基因组全部24条染色体，所提供的信息量至少等于或优于目前常用的300～400个微卫星标记的图谱，检测时只需0.5μg的DNA样品就可进行1次全基因组的扫描。另外Transgenomic公司的WAVE?核苷酸片段分析系统是高通量且较为准确可靠的筛查未知、已知SNP的新方法。利用Transgenomic 公司的WAVE?核苷酸片段分析系统进行SNP检测平均每个样本的费用为$0.5。
4. 当前SNP功能研究主要有以下几方面：
SNP 的分型技术可分为两个时代，一为凝胶时代，二为高通量时代。凝胶时代的主要技术和方法包括限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）、寡核苷酸连接分析（OLA）、等位基因特异聚合酶链反应分析（AS2PCR）、单链构象多态性分析（SSCP）、变性梯度凝胶电泳分析（DGGE），虽然这些技术与高通量时代的技术原理大致一样，但是由于它不能进行自动化，只能进行小规模的SNP分型测试，所以必然会被淘汰。高通量时代的SNP分型技术按其技术原理可分为:特异位点杂交（ASH）、特异位点引物延伸（ASPE）、单碱基延伸（SBCE）、特异位点切割（ASC）和特异位点连接（ASL）5 种方法。此外，采用特殊的质谱法和高效液相层析法也可以大规模、快速检出SNP 或进行SNP 的初筛。近年来已经在晶体上用“光刻法”实现原位合成，直接合成高密度的可控序列寡核苷酸，使DNA 芯片法显示出强大威力，对SNP 的检测可以自动化、批量化，并已在建
立SNP 图谱方面投入实际应用。DNA 芯片法有望在片刻之间评价整个人类基因组。
1)报告基因转染技术：这一技术主要用于研究启动子SNP对于mRNA 转录效率，是通过观察转录结局来判断SNP是否具有功能。
2)EMSA技术：通过在体外合成含SNP位点的寡核苷酸与转录因子特异性结合，观察结合的强度和效率,但是该技术由于只人工合成较短长度的寡核苷酸，没有考虑SNP周围遗传背景环境的影响,因此在重复性和说服力上不强。
3)ChiP技术：该技术通过超声将染色体碎片化,再将碎片化的核酸与转录因子的结合，最后通过PCR技术观察判断结合的效率和强度，该技术克服了EMSA的一些缺点,当前做的文献较多。
5 SNP产生功能的机制研究的个人之所见
1.对大多数SNP而言，都由于位于一些非编码区域而不产生明显的功能性影响，此时做SNP功能意义不大。
2.启动子SNP研究是做的人最多的，相关实验技术都比较成熟，其产生功能的机制主要是影响TF与启动子的的结合能力，从而调控基因的转录。
3.编码区SNP有同义和非同义2种，非同义突变由于会导致氨基酸的变化，从而影响蛋白质的功能，特别是发生在结构功能区域的SNP
尤其重要，可是这方面的技术还存在瓶颈，做得相当少，据我所知要用什么诱导点突变的方法再去评价蛋白质功能的。至于非同义突变，虽然没有明显的功能的分子机制，但是在遗传学上可能因为与附近的其它致病基因的表达或者SNP连锁，因此在流行病学上形成阳性结果一般以此解释。
4.内含子区域SNP产生功能的分子机制一般是与附近其它基因SNP 连锁或者可能影响mRNA的剪接从而影响蛋白质的功能——很多研究中做INTRON发现有阳性结果解释不了，而且大多只是猜测。PYRO测序用于SNP基因分型
其实是一种段片段焦磷酸测序技术，在测序引物的引导下，完成段片段（含snp）的测序，从而实现基因分型。缺点：不能检测长片段，对于重复序列没有办法。
原理简介
1.测序引物与单链，PCR扩增的DNA模板相结合。然后将其与DNA 聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育。
2.四种dNTP之一被加入反应体系，如与模扳配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。而且释放出来的Ppi的量与和模板结合的dNTP的量成正比。
3.ATP sulfurylase在adenosine 5′ phosphosulfate存在的情况下催化PPi 形成ATP，ATP驱动luciferase介导的Luciferin向oxyluciferin的转化，oxyluciferin发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD 摄像机检测并由pyrogram?反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
4.TP和未掺入的dNTP由Apyrase降解，淬灭光信号，并再生反应体系。
5.然后加入下一种dNTP。最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。在此过程之中有几点值得注意的是，在体系中使用的是dATPS而非dATP，因为dATPS不是荧光素酶的底物，而且DNA聚合酶对dATPS的催化效率更高。而且在系统之中，底物的浓度已经最佳化，使得dNTP的降解速度慢于它的掺入速度，ATP的合成速度快于水解速度，其中三磷酸腺苷双磷酸酶的特异浓度，可以保证降解完全，使系统复原。
Real time PCR检测SNP的方法是：
针对目标基因片段的突变位点，设计两条引物，这两条引物的区别仅仅是末端的1-2个碱基不同，分别与突变位点匹配。共同的下游引物和探针。然后扩增。就可以得到不同的CT值，根据CT值的不同，来确定基因类型。
1 、把蛋白序列对应的核酸序列找到。
2 、根据核酸序列做BLAST （对dbSNP数据库
https://www.doczj.com/doc/983055123.html,/SNP/snpblastByChr.html）。
3 、结果中，可以得到你的序列上所以已知的SNP。
以编码5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor的HTR1A基因为例，先进入entrez，选择gene选项，在NCBI中搜HTR1A基因，到如下图界面，点基因缩略图，然后点graphics。
点击后的界面如下。这里已经很清楚地标明了SNP所在的位置以及对应的核酸与蛋白序列。但有一点要说明，我注意到这个基因编码的蛋白序列与swissprot的序列有一些差别，很可能是收录的版本不同，或是有些序列是NCBI直接根据orf形成的.
1，如果是检测基因的所有已知的SNP，那么首先要去了解并查询到这些SNP位点，SNP位点可以通过查询dbSNP数据库
（https://www.doczj.com/doc/983055123.html,/SNP/）和TSC（The SNP Consortium）数据库（https://www.doczj.com/doc/983055123.html,/），可以获知基因及上下游邻近序列的SNP 位点。
2，至于挑选的原则，可以介绍一下Hap Map的正规化标准：
SNP Selection Criteria
Category 1 "verified"
This contains all SNPs for which we have allele frequency or genotyping data. This includes SNPs from the TSC allele frequency project, as well as SNPs characterized by JSNP. These SNPs were generated from those rs clusters in which at least one of the SNPs in the cluster contains genotype or allele frequency data and the minor allele must have been seen in at least two individuals.
Category 2 "two-hit"
These are true double-hit SNPs, produced in collaboration with Jim Mullikin and Sarah Hunt. A double-hit SNP must be seen twice, in two different DNA samples which must have produced two alleles. TSC trace data was only allowed to contribute one hit per allele because the individual source DNA for a trace could not be identified.
Category 3 "jsnp-verified/perlegen-verified”
This category contains two groups: SNPs that JSNP certifies are likely to be real based on manual inspection of their data (but have not been genotyped)，and SNPs that Perlegen verified independently. Category 4 "bac-overlap"
These are SNPs from BAC overlaps that do not fall into category 1 or 2 above
基因芯片与SNP分析
基因芯片技术作为一种新兴的生物技术，近年来得到迅速发展，其应用具有巨大的潜力。单核苷酸多态性（SNP）作为新的遗传标记对基因定位及相关疾病研究的意义亦非常重大。本文主要介绍了DNA 芯片技术的原理和分类、单核苷酸多态性检测方法及DNA 芯片技术在单核苷酸多态性检测方面的应用。
生物芯片技术是90 年代初发展起来的，集分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技术和计算机科学等于一身的一门新型技术。目前发展的生物芯片种类繁多，如蛋白质芯片、基因芯片、激素芯片、药物芯片等。但最初的生物芯片主要用于对DNA 的测序，基因表达谱的鉴定及基因突变体的检测、分析等方面。迄今为止，使用最多的也是DNA 芯片。DNA 水平遗传多态性标记至今已经历了3 个阶段:限制性酶切片段长度多态性标记（RFLP）、DNA 重复序列的多态性标记（包括小卫星、微卫星DNA 重复序列）、单核苷酸多态性标记（single nucleotide polymorphisms ，SNPs）。
SNP 具有数量多，分布广泛，易于快速、规模化筛查，便于基因分型等特点。伴随着SNP 检测和分析技术的进一步发展，尤其是与DNA 芯片等技术的结合，SNPs 在基因定位中具有巨大优势和潜力，并为DNA芯片应用于遗传作图提供了基础。由于基因芯片具有携带信息量大和检测方便的特点，使得用DNA 芯片对SNP 进行分析具有广阔的前景。DNA 芯片和SNP 分析已日益成为研究功能
基因组学的工具。
1 、基因芯片
基因芯片的基本原理是应用已知的核苷酸序列作为探针与标记的靶核苷酸序列进行杂交，通过对信号的检测进行定性与定量分析。基因芯片可在一微小的基片（硅片、玻片等）表面集成大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量基因，进行大信息量的检测分析。基因芯片应用很广，根据所用探针类型不同分为cDNA 微阵列（或cDNA微阵列芯片）和寡核苷酸阵列（或芯片），根据应用领域不同而制备的专用芯片如毒理学芯片（toxchip）、病毒检测芯片（如肝炎病毒检测芯片）、p53 基因检测芯片等。根据其作用可分为检测基因质和量的芯片。量的检测包括:检测mRNA 水平、病原体的有无及比较基因组基因的拷贝数，既可用寡核苷酸芯片，又可用cDNA 芯片完成，但cDNA 芯片更具优势。质的检测包括:DNA 测序及再测序、基因突变和SNP 检测等，主要用寡核苷酸芯片完成。
巢式PCR-RFLP技术
“巢式PCR-RFLP是针对任意的基因分型技术，使任何位点最终都能进行常规限制性内切酶鉴定；同时该SNP分型技术利用巢式PCR技术，使得多个位点同时进行分析成为可能。即使低浓度的DNA也能够进行快速准确的分型工作。与现有常规的分型技术相比，其最大的优势包括：
(一)所需DNA浓度低。1-2ng/uL也能完成检测工作，而Taqman技术所需的DNA含量至少5ng/uL。
(二)价格低。由于不需要合成荧光探针，使得该技术比Taqman技术价格低，该优势在对多个位点同时进行分型时更明显。
技术基本原理和实例
采用的巢式PCR－RFLP分型技术，其基本原来是利用PCR引物的3’端，对SNP位点附近的碱基进行人为改造，产生一个常规的限制性内切酶识别序列，如SNP rs1321425（rs1321425－来自NCBI的refSNP 数据库）的C/G，其任何一个碱基和上下游碱基无法形成一个可直接被限制性内切酶识别的序列，于是我们对SNP位点前的上游碱基进行改造，通过对序列的分析和PCR效果的计算，我们将原本四个碱基AGAT改成CTGC，结合后一个碱基A以及SNP位点G，形成CTGCAG（PstI）酶切识别位点，经测序和序列对比，改造成功。又比如rs9309462和rs4646642，成功的将2个碱基，3个碱基进行成功的改造。rs1321425TCACAAAAAATAAAAAATTTTAATTTTAAAGGAGATA C/G ACAAGAAATGAGCATGTGTGAAAGCAC TTCTGTAAACTACATGCACTAAT
与Taqman技术和普通技术的详细对比
分型技术PCR-RFLP技术Taqman技术普通PCR-RFLP技术最佳运用时机200-600样本，任何DNA多态位点样本量大于500人份仅适合含有现成酶切位点的多态位点的分型
试剂投入低荧光探针，需3000-4000元。有可能实验失败需重新花钱设计荧光探针。低
技术的适用性可适合任何多态位点的分型基本适合任何多态
位点的分型，但有时若干位点不能成功进行试验；当分型位点过于接近也不能用该方法。仅适合含有现成酶切位点的多态位点的分型，有时出现的是一些稀有酶的酶切位点，导致效率低下或费用昂贵；结果判断直观，明确，稳定间接，每管反应必须加荧光参照ROX，否则结果判断不确定一般直观，明确；有时酶切位点出现在非主频等位基因上，导致结果判读困难
结果稳定性稳定一般稳定
结果准确性准确度高一般准确度高
样本消耗量1-2ng 5-10ng 50－100ng
实验耗时2-3周由于要定制MGB荧光探针，和预实验，也需要2-3周2-3周
操作流程
1．基本信息收集具体内容包括客户信息、样本数(case,control)数、位点信息等。
2 位点信息的查询主要包括：2.1 位点上下游各300bp的确切序列，
A f f y m e t r i x全基因组S N P芯片检测 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP) 指基因组单个核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。单核苷酸多态性是基因组上高密度的遗传标志，在人类基因组中已发现的SNP数量超过3000万。作为第三代遗传标记，SNP数量众多、分布密集、易于检测，因而是理想的基因分型目标。SNP分型检测在疾病基因组（如疾病易感性），药物基因组（药效、药物代谢差异和不良反应）和群体进化等研究中具有重大意义。在人研究方面，Affymetrix 公司有分别基于GeneChip和GeneTitan平台的SNP 6.0 芯片和针对中国人群设计的CHB1＆2 Array，既可用于全基因组SNP分析，又可用于CNV分析，极大地方便了中国人类疾病GWAS研究。Affymetrix公司针对多个农业物种也开发了多款商品化的基因分型芯片，如鸡、牛、水牛、鲑鱼、水稻、小麦、辣椒、草莓等，为农业育种研究、遗传图谱构建、群体基因组学研究提供研究手段。此外，Affymetrix公司还支持定制芯片，最低起订量为480个样品。 检测原理|?技术优势|?产品列表|?定制芯片|?数据分析| 基于GeneChip平台的人SNP 6.0 芯片实验流程： 基于GeneTitan平台的Axiom基因分型芯片检测流程： 从SNP原理谈SNP分析技术之SNP芯片 日期：2012-05-21 ? ? 来源：网络 标签：?SNP原理?SNP分析?SNP芯片 摘要:?SNP是近年来基因突变的热点研究之一。它是指在单个的核苷酸上发生了变异，有四种不同的变异形式，而实际上只发生转换和颠换这两种。当科学家弄清了SNP的突变原理以后，他们就着手对SNP进行分析，以求找到疾病相对应的突变位点或者是进行个性化药物治疗研究。其中应用到的技术多达上百余种，其中包括有测序技术、质谱分析技术、HRM技术、Taqman技术以及SNP芯片技术。 恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 SNP是近年来基因突变的热点研究之一。它是指在单个的核苷酸上发生了变异，有四种不同的变异形式，而实际上只发生转换和颠换这两种。当科学家弄清了SNP的突变原理以后，他们就着手对SNP进行分析，以求找到疾病相对应的突变位点或者是进行个性化药物治疗研究。其中应用到的技术多达上百余种，其中包括有测序技术、质谱分析技术、HRM 技术、Taqman技术以及SNP芯片技术。
现在SNP的常用检测方法主要有：Taqman法、质谱法、芯片法、测序法。 Taqman法：准确性高，适合于大样本、少位点，价格比较贵；质谱法：准确性高，适合于大样本、多位点（能检测25个位点）；芯片法：准确性较低，适合于超多位点分析；测序法：非常准确，但是价格也非常的高，但是对于少样本、超多位点还是非常好的选择。 SNP检测方法汇总 分析SNP的方法有许多种，本文收集目前还在用的方法，按通量从高到低排列： 全基因组测序 这是最贵的方法，但也是看SNP最全的方法 大概一个人样本，花2万元 外显子组测序 外显子组测序，也可以得到较全面的SNP信息
大概一个人样本，花1.5万元 随着人全基因组测序的价格降到2万元左右，外显子组测序会很快退出市场 全基因组SNP芯片 原理，核酸杂交，荧光扫描 Illumina和Affymetrix都有很著名的全基因组SNP芯片，例如： Affymetrix: CytoScan，SNP 6.0， Illumina: 660，中华，450K等 SNP芯片，在2000~5000元每样本，还是比全基因组测序的2万元一个样本的价格要低质谱法
原理，精确测量PCR产物的分子量，就可以知道SNP位点上是A/C/G/T中的哪一个Sequenome MassArray法测中等通量的SNP位点是十分准确的 单个位点、单个样本的费用约2元人民币 无需预制芯片、预订荧光探针,只要合成常规的PCR引物就可以做实验了 如果测几十个点，到上百个点，是很方便的方法 SNPseq法 此方法为天昊公司所创，一次测几百个位点 原理：
用Goldgate法做出针对某些位点的多重PCR片段高通量测序，数据分析得到SNP位点结果SNPlex 中等偏高通量的方法，一次几十个位点 原理： 用末端特异的引物做多重PCR，把模板进行扩增基于毛细管电泳，把片段分离开，读颜色SNaPshot
SNP检测(中文) Part I：样本基因组DNA的提取 1.取50 μl血样于离心管中，加PBS缓冲液至1.5mL，轻轻地摇匀。冷冻离心机6500 rpm离心10 min，去掉上清液，保留沉淀物。重复洗2次。 2.向保留沉淀物的离心管中加入DNA提取液500 μl，15 μl的蛋白酶K，混匀放入55℃水浴锅中消化过夜。 3.将消化过夜的反应液冷却至室温，加入等体积冰冷的饱和酚溶液，盖紧离心管盖，缓慢地来回颠倒10 min（在冰上进行），形成均匀的乳浊液。 4.冷冻离心机12000 rpm离心10min。 5.小心地吸取上层水相至新管，用等体积饱和酚再抽提一次。 6.用等体积的氯仿再抽提一次。 7.离心后再取上清液于另一离心管中，加入1∕10体积3mol/L的NaAc使终浓度达到0.3mol/L，并加2倍体积冷无水乙醇，上下倒置混匀，置-20℃冰箱沉淀30-60min。 8.冷冻离心机12000 rpm离心10 min，弃上清液。 9.加入500 μl 70%冷乙醇小心洗涤沉淀。冷冻离心机6500 rpm离心5 min，弃上清，用干净的吸水纸或用吸头将管壁残留的乙醇去除，干燥10～15 min，不要等沉淀完全干燥，否则难以溶解。 10.沉淀于100 μl超纯水中。 11.将提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳及浓度的测定。 Part II：SNP分型检测 1.引物的设计与合成 (1)查阅文献，参考文献中的引物，直接合成； (2)根据SNP的位置找到其序列，设计引物并合成 2.PCR扩增片段 (1)PCR扩增体系： Components Volume (μl)
DNA template1 PrimeSTAR0.5 dNTPs (2.5 mM)1 Primer-F (10 μM)1 Primer-R (10 μM)1 5*PS buffer(Mg2+)10 ddH2O1 (2)PCR扩增程序： (3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。 (4)A. 测序法：对目的条带进行切胶回收纯化测序，根据测序结果统计分析各个样本下该SNP的基因型。 B. 酶切法：一般这种方法都有文献支持，在前期可以确定好对应的内 切酶。根据内切酶的反应体系将PCR产物进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。根据酶切条带来统计分析各个样本下该SNP的基因型。 Part II 标签SNP检测 1.引物的设计与合成 根据基因的序列设计扩增片段引物并合成。 2.PCR扩增片段 (1)PCR扩增体系： Components Volume (μl) DNA template1 PrimeSTAR0.5 dNTPs (2.5 mM)1 Primer-F (10 μM)1 Primer-R (10 μM)1 5*PS buffer(Mg2+)10 ddH2O1
1定义：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP 并不包括后两种情况。单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。这种变异可能是转换（C T，在其互补链上则为G A），也可能是颠换（C A，G T，C G，A T）。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有
1分子标记： 分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。即使想要验证已经定位的QTLs，我们也需要相对应的区间内的分子标记，尤其是SNP标记。 全基因组SNP—Affymetrix芯片： 一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单，高通量。可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。在国家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型检测的芯片。 目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。而Affymetrix公司目前并没有相应的产品。但是通过跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的结果进行开发。 番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，但是他们包括的基因数目~30,000个，整体情况相近。另外，番茄作为自交植物，其LD 的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。因此，综合考虑，我建议我们可以开发~3k芯片，应该可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。总之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高的应用价值。即使像玉米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。 全基因组SNP—Douglas： 当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）对于优良的QTLs或是基因，我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行Douglas 系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也而不需要再一次利用系统只检测材料覆盖定位区间的基因型，Douglas可以利用． ）对于一些高信息量，。3Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图）一套可以用来构建番茄的指纹图谱。因此，均匀分布在全基因的SNP分子标记，SNP标记是必不可少的。完整能够与Affymetrix芯片相对应的 SNP标记分布图图 QTL区间上的注：蓝色为深入片段，棕色为背景染色体。SNP标记的开发Douglas系统下筛选具有一PCR反应体系，通过建立稳定、可靠的番茄DNA提取流程与优化致性、稳定性与多态性SNP分子标记引物，从而构建番茄全基因组SNP分子标记。全基因组的SNP分子标记，可以用于番茄QTL定位群体的检测，分子标记辅助育种的选择以及全基因组选择的群体基因型的检测。同时，从中挑选高质量，高信息量的分子标记用于构建一套完成的番茄指纹图谱，检测品种一致性。 供试材料： 22份材料的DNA用作特异性引物筛选，2份水作为NTC（None Template Control），共计24份模板作为SNP引物的初期筛选。以上实验在Q6仪器上进行。对于筛选获得的一致性引物，在利用94株番茄自交系与2份水作为模板，进一步在Douglas仪器上验证。 DNA提取：
Affymetrix 全基因组SNP 芯片检测 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP) 指基因组单个核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。单核苷酸多态性是基因组上高密度的遗传标志，在人类基因组中已发现的SNP数量超过3000万。作为第三代遗传标记，SNP数量众多、分布密集、易于检测，因而是理想的基因分型目标。SNP分型检测在疾病基因组（如疾病易感性），药物基因组（药效、药物代谢差异和不良反应）和群体进化等研究中具有重大意义。在人研究方面，Affymetrix 公司有分别基于GeneChip和GeneTitan平台的SNP 6.0 芯片和针对中国人群设计的CHB1＆2 Array，既可用于全基因组SNP分析，又可用于CNV分析，极大地方便了中国人类疾病GWAS研究。Affymetrix公司针对多个农业物种也开发了多款商品化的基因分型芯片，如鸡、牛、水牛、鲑鱼、水稻、小麦、辣椒、草莓等，为农业育种研究、遗传图谱构建、群体基因组学研究提供研究手段。此外，Affymetrix公司还支持定制芯片，最低起订量为480个样品。 检测原理| 技术优势| 产品列表| 定制芯片| 数据分析| 基于GeneChip平台的人SNP 6.0 芯片实验流程： 基于GeneTitan平台的Axiom基因分型芯片检测流程：
从SNP原理谈SNP分析技术之SNP芯片 日期：2012-05-21 来源：网络 标签：SNP原理SNP分析SNP芯片 摘要: SNP是近年来基因突变的热点研究之一。它是指在单个的核苷酸上发生了变异，有四种不同的变异形式，而实际上只发生转换和颠换这两种。当科学家弄清了SNP的突变原理以后，他们就着手对SNP进行分析，以求找到疾病相对应的突变位点或者是进行个性化药物治疗研究。其中应用到的技术多达上百余种，其中包括有测序技术、质谱分析技术、HRM技术、Taqman技术以及SNP芯片技术。 恩必美生物新一轮2-5折生物试剂大促销！ Ibidi细胞灌流培养系统-模拟血管血液流动状态下的细胞培养系统 广州赛诚生物基因表达调控专题 SNP是近年来基因突变的热点研究之一。它是指在单个的核苷酸上发生了变异，有四种不同的变异形式，而实际上只发生转换和颠换这两种。当科学家弄清了SNP的突变原理以后，他们就着手对SNP进行分析，以求找到疾病相对应的突变位点或者是进行个性化药物治疗研究。其中应用到的技术多达上百余种，其中包括有测序技术、质谱分析技术、HRM 技术、Taqman技术以及SNP芯片技术。 SNP 的分型技术可分为两个时代，一为凝胶时代，二为高通量时代。凝胶时代的主要技术和方法包括限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)、寡核苷酸连接分析(OLA)、等位基因特异聚合酶链反应分析(AS2PCR)、单链构象多态性分析(SSCP)、变性梯度凝胶电泳分析(DGGE)，虽然这些技术与高通量时代的技术原理大致一样，但是由于它不能进行自动化，只能进行小规模的SNP分型测试，所以必然会被淘汰。高通量时代的SNP分型技术按其技术原理可分为:特异位点杂交(ASH)、特异位点引物延伸(ASPE)、单碱基延伸(SBCE)、特异位点切割(ASC)和特异位点连接(ASL)5 种方法。此外，采用特殊的质谱法和高效液相层析法也可以大规模、快速检出SNP 或进行SNP 的初筛。近年来已经在晶体上用“光刻法”实现原位合成，直接合成高密度的可控序列寡核苷酸，使DNA 芯片法显示出强大威力，对SNP 的检测可以自动化、批量化，并已在建立SNP 图谱方面投入实际应用。DNA 芯片法有望在片刻之间评价整个人类基因组。 2007 年5月份，Affymetrix公司发布了Genome-wide SNP 6.0 芯片，除包括90多万个用于单核苷酸多态性(SNP)检测探针外，还有90多万个用于拷贝数变化(CNV)检测的探针，可使全基因组平均分辨率达3 kb，既可用于全基因组SNP分析，又可用于CNV分析，真正实现了一种芯片两种用途，方便研究者挖掘基因组序列变异信息。通过基因分型信息还可以鉴别中性拷贝数的杂合性缺失(copy neutral LOH)、单亲二体病(UPD)及嵌合现象(可以精确检测到20% 嵌合体)。近来Affymetrix 公司又陆续发布了多款针对东亚、中国、
. SNP开发/验证的研究方法和技术路线 1分子标记： 分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。即使想要验证已经定位的QTLs，我们也需要相对应的区间内的分子标记，尤其是SNP标记。 1.1 全基因组SNP—Affymetrix芯片： 一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单，高通量。可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。在国家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型检测的芯片。 目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。而Affymetrix公司目前并没有相应的产品。但是通过跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的结果进行开发。 番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，但是他们包括的基因数目~30,000个，整体情况相近。另外，番茄作为自交植物，其LD 的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。因此，综合考虑，我建议我们可以开发~3k芯片，应该可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。总之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高的应用价值。即使像玉米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。 1.2全基因组SNP—Douglas： 当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）对于优良的QTLs或是基因，我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行Douglas 系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也. . 而不需要再一次利用系统只检测材料覆盖定位区间的基因型，可以利用Douglas 对于一些高信息量，）。3）Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图1.1分子标记，可以用来构建番茄的指纹图谱。因此，一均匀分布在全基因的SNP Affymetrix芯片相对应的SNP标记是必不可少的。套完整能够与
1定义： 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。理论
SNP的检测方法（直接测序法与PCR-SSCP） 人类基因组中存在着广泛的多态性，最简单的多态形式是发生在基因组中的单个核苷酸的替代，即单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）。SNP通常是一种二等位基因的（biallelic），即二态的遗传变异，SNP的数量大、分布广，在组成人类基因组的30亿个碱基中，平均每1000个就有一个SNP。SNP作为第三代遗传标记，在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体疾病易感性分析与药物基因组学的研究中发挥着愈来愈重要的作用。 1.直接测序法进行SNP分析 在所有SNP的检测方法中，对欲检测片段进行直接扩增、测序是最为准确的方法。通常情况下，纯合型SNP位点的测序峰为单一峰型，而杂合型SNP位点的测序峰为套峰，因而很容易将其区分开来。通过直接测序方法进行SNP检测的检出率接近100%。 2. PCR-SSCP方法 单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism，SSCP）是一种简单、高效地检测DNA或RNA序列中点突变的技术，由于实验成本较低，也是一种目前较为常用的方法。 检测原理： 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。 需要注意的问题：
A．PCR-SSCP只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步 测序。 B．由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。 C．经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现。
现在SNP得常用检测方法主要有：Taqman法、质谱法、芯片法、测序法。Taqman法：准确性高，适合于大样本、少位点，价格比较贵；质谱法：准确性高，适合于大样本、多位点（能检测25个位点）；芯片法：准确性较低，适合于超多位点分析；测序法：非常准确，但就是价格也非常得高，但就是对于少样本、超多位点还就是非常好得选择。 SNP检测方法汇总 分析SNP得方法有许多种，本文收集目前还在用得方法，按通量从高到低排列： 全基因组测序 这就是最贵得方法，但也就是瞧SNP最全得方法 大概一个人样本，花2万元 外显子组测序 外显子组测序，也可以得到较全面得SNP信息 大概一个人样本，花1、5万元 随着人全基因组测序得价格降到2万元左右，外显子组测序会很快退出市场 全基因组SNP芯片 原理，核酸杂交，荧光扫描 Illumina与Affymetrix都有很著名得全基因组SNP芯片，例如： Affymetrix: CytoScan，SNP 6、0， Illumina: 660，中华，450K等 SNP芯片，在2000~5000元每样本，还就是比全基因组测序得2万元一个样本得价格要低质谱法 原理，精确测量PCR产物得分子量，就可以知道SNP位点上就是A/C/G/T中得哪一个Sequenome MassArray法测中等通量得SNP位点就是十分准确得 单个位点、单个样本得费用约2元人民币 无需预制芯片、预订荧光探针,只要合成常规得PCR引物就可以做实验了
如果测几十个点，到上百个点，就是很方便得方法 SNPseq法 此方法为天昊公司所创，一次测几百个位点 原理： 用Goldgate法做出针对某些位点得多重PCR片段 高通量测序，数据分析得到SNP位点结果 SNPlex 中等偏高通量得方法，一次几十个位点 原理： 用末端特异得引物做多重PCR，把模板进行扩增 基于毛细管电泳，把片段分离开，读颜色 SNaPshot 中等通量得方法 设计3'位挨着目标位点得探针 用双脱氧得荧光标记ddNTP做一个碱基得延伸 毛细管电泳，瞧延伸得这个碱基就是什么颜色 Taqman法 Taqman原理，如果要找原理，请回复“荧光”两字 Taqman方法，一次一管测一个位点 通量最低，但就是结果可靠 原理： 设计与SNP位点互补得荧光探针，其中一个标VIC（红色荧光基团）,另一个标FAM（绿色荧光基团），同时分别有淬来基团吸光 Taq酶有5'-->3'得外切酶活性，如果探针粘有模板上，就被切碎 探针被切碎后，荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。瞧荧光颜色，就可以知道SNP位点上就是什么碱基
SNP与疾病的关联研究 摘要：SNP作为一门新兴技术，一般而言,SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP 总量大概是300万个。 SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。 关键词：SNP 疾病脑出血冠心病 正文：激肽释放酶基因多态性与人群脑出血的关联研究 流行病学研究表明高血压患者尿液中激肽释放酶的活性与其血压水平呈负相关，提示KLK1基因可能在血压的调节中起到一定的作用；在人类疾病研究领域，有研究表明KLK1基因遗传变异与血管重构相关，同时发现了激肽释放酶基因启动子及编码区多态性与人类原发性高血压的发生有关。 KLK1基因位于染色体19q3.2-q13.4,全长包括5个外显子和4个内含子。其编码蛋白KLK1是一种丝氨酸蛋白酶，广泛分布在心血管系统。肾脏及中枢神经系统中，以旁分泌形式发挥其生物学作用。在心血管系统中，组织型激肽释放酶被分泌到细胞外，并迅速转化为活性激肽释放酶，作用于其底物激肽原释放缓激肽，缓激肽与受体结合后可调节一系列具有生物活性介质的释放，如一氧化氮，前列腺素和血小板活化因子等，从而会发扩张血管，调节血流等多种生物学效应，参与平滑肌收缩，细胞增殖，血管重构等多种生理和病理生理过程。 通过手机273例散发性脑出血患者和140名正常对照着的外周血标本。采用多重单碱基延伸SNP分型技术和DNA测序来检测KLK1基因rs5516及rs5517多态性位点在2组人群中的分布。结果发现：(1)脑出血组织型KLK1基因rs5516多态和等位基因频率分布差异无统计学意义（P>0.05）,脑出血组织型KLK1基因rs5517多态A 等位基因频率显著高于对照组（P<0.05）。（2）对照组rs5517多态AA及GA基因型携带者舒张压水平显著高于GC基因型携带者（P<0.05）；而rs5516位点各基因型亚组间血压水平差异无统计学意义（P>0.05），从而得出结论，组织型激肽释放酶基因rs5516多态性与脑出血无关，而组织型激肽释放酶基因rs5517多态性与脑出血存在关联，可能通过影响血压水平而参与脑出血发生发展。 SNP 用于冠心病相关基因的研究 许多研究结果表明血浆中脂蛋白的相对水平在动脉粥样硬化性心脏病发病机理的起重要作用，脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)与肝脂酶(hepatic lipase, HL)对脂蛋白的代谢起重要作用，编码它们的基因成为重要的致动脉粥样硬化性心脏病的危险因素。 本研究通过对中国人群(95％为汉族)LPL、HL等基因SNPs的研究，揭示它们在中国人群
·530·检验医学2018年6月第33卷第6期 Laboratory Medicine ，June 2018，V ol. 33，No. 6 作者简介：单洪波，女，1979年生，硕士，主管技师，主要从事临床检验工作。基于PCR 和位点特异性引物延伸反应的SNP 检测方法的建立 单洪波1， 金亚南2 （1. 杭州艾迪康医学检验中心，浙江 杭州 310023； 2. 杭州优思达生物技术有限公司，浙江 杭州 310053） 摘要：目的 建立一种基于聚合酶链反应（PCR ）、位点特异性引物延伸反应（ASE ）和核酸试纸条检测 技术的单核苷酸多态性（SNP ）检测方法。方法 先通过PCR 对包含SNP 位点的特异基因序列进行扩增；然后通过带有A 标记的ASE 引物针对SNP 位点的不同基因类型进行特异性延伸；延伸后的产物可以与B 标记的探针进行杂交结合，形成同时携带A 和B 标记的杂交产物；而该杂交产物可以通过核酸试纸条进行目视化检测，从而完成对SNP 基因型的检测。结果 通过对10倍浓度梯度稀释的人类基因组DNA 进行检测，PCR-ASE 的检测敏感性为88 ng/反应；通过在同一条核酸试纸条上针对同一SNP 位点2种不同基因型的检测，达到了多重检测的目的；PCR-ASE 对19名志愿者的5个不同SNP 位点的检测结果与基因测序法完全一致。结论 PCR-ASE 是一种简单、准确的SNP 基因型检测方法。 关键词：引物特异性延伸反应；单核苷酸多态性；核酸试纸条检测技术 Establishment of PCR and ASE-based detection for SNP SHAN Hongbo 1，JIN Yanan 2. （1. Adicon Clinical Laboratories ，Hangzhou 310023，Zhejiang ，China ；2. Ustar Biotechnologies （Hangzhou ） Ltd.，Hangzhou 310053，Zhejiang ，China ） Abstract ：Objective To establish polymerase chain reaction （PCR ），allele-specific extension （ASE ） and nucleic acid detection strip-based detection for single nucleotide polymorphisms （SNP ）. Methods The specific gene sequence containing SNP sites was ampli?ed by PCR. For each SNP site ，ASE primers labeled with A were extended. The ASE reaction products can bind to probe labeled with B ，and hybridization products containing A and B simultaneously were formed. The products can be detected by disposable amplicon cross-contamination proof device containing a nucleic acid detection strip ，and the detection of SNP genotypes can be accomplished. Results Ten-fold serial dilutions of quanti?ed human genomic DNA were used to determine the sensitivity of PCR-ASE （88 ng/reaction ）. The ability of duplex PCR-ASE with the products can be detected by a single nucleic acid detection strip. A total of 19 samples representing 5 common SNP were detected by PCR-ASE ，and the results had the consistency of 100% with DNA sequencing. Conclusions PCR-ASE is simple and accurate detection for SNP. Key words ：Allele-specific extension ；Single nucleotide polymorphism ；Nucleic acid detection strip-based detection 文章编号：1673-8640（2018）06-0530-06 中图分类号：R446.1 文献标志码：A DOI ：10.3969/j.issn.1673-8640.2018.06.015单核苷酸多态性（s i n g l e n u c l e o t i d e polymorphism ，SNP ）是指在基因组水平上， 特定核苷酸位置上存在2种或2种以上不同的碱 基，且其中任何一种等位基因在群体中的频率 不<1%。SNP 是一种单碱基水平的分子遗传标 记，不仅可通过连锁或关联分析来定位疾病易 感基因，而且有些SNP 本身就可能会导致某些疾 病或引起个体对药物反应的差异[1]。同时，SNP 图谱的建立还能有效地帮助破解人类生理学密码，了解人类进化的起源以及对患者进行有效的治疗[2]。因此，SNP 检测对疾病的风险性评估、诊断、预防和治疗等各方面均有很大的价值。目前已报道了多种检测S N P 的方法用于基因检测和药物基因组学的研究[1]。引物特异性聚合酶链反应（allele-specific polymerase chain reaction ，AS-PCR ）是目前比较常见的
一大类是以单链构象多态性(SSCP) 、变性梯度凝胶电泳(DDGE) 、酶切扩增多态性序列(CAPS) 、等位基因特异性PCR (allele-specific PCR,AS-PCR)等为代表的以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法 另一大类是以直接测序DNA芯片变性、高效液相色谱(DHPLC)、质谱检测技术高分辨率溶解曲线(HRM)等为代表的高通量自动化程度较高的检测方法。 1.单链构象多态性(SSCP) 方法的原理是PCR扩增的DNA片段在变性剂条件下，通过高温处理使双链DNA扩增片段解旋并且维持单链状态，进一步进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。由于DNA单链的空间构象决定着其迁移率，相同长度的DNA单链，若某单个碱基存在差异，则形成迥然不同的空间构象，就会显示出带型的差异(多态型) 。优点：该方法简便灵敏快速成本低 缺点：PCR-SSCP适用于小的DNA片段，长度小于500 bp，如果DNA片段太长，DNA单链很难形成稳定发夹结构。但是该方法只能对突变进行较为粗略地检测，不能确定突变的具体位置和类型；而且对电泳条件的要求非常严格。 2.变性梯度凝胶电泳(DDGE) 在DNA序列中，4种碱基的组成和排列存在差异，致使不同序列的DNA双链有着不同的解旋温度当DNA分子在含浓度梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，由于解旋的状况与其序列高度相关，使得不同DNA片段形成相互分开的条带。 DGGE利用双链DNA分子在含有一定浓度梯度变性剂的凝胶中进行电泳时，由于存在突变的双链DNA分子和不存在突变的双链DNA分子在不同的部位解旋而区分即使只有一个碱基对的不同，两个双链DNA分子在不同的时间发生部分解旋，随之形成有差异的电泳条带。由于存在突变DNA片段和正常DNA 片段的Tm值有差异，从而发生迥然不同的解旋行为，TGGE通过设置温度梯度在聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离DNA差异片段。 优点：DGGE能够检测长达1 kb的DNA片段，若SNP恰好出现在发生部分解旋的DNA区域内，其检出率可以高达100%，特别是100~500 bp长度的片段。 缺点：该方法也只能对突变进行较为粗略地检测，一般不能确定突变位置和类型。 3.酶切扩增多态性序列(CAPS) CAPS又称为PCR-RFLP CAPS是将PCR技术与RFLP技术相结合，利用DNA片段在酶切位点上碱基的变异，采用相应的限制性内切酶，对该DNA 片段的PCR扩增产物进行酶切，因而产生多态性。CAPS首先是对目标SNP所在的DNA片段设计特异性引物并对其进行扩增，然后用限制性内切酶对该DNA 片段的PCR扩增产物进行酶切，再通过凝胶电泳进行检测，形成分子标记。对于那些不能转化成为CAPS的SNP，可以将其转化为衍生酶切扩增多态性。 优点：如共显性、位点特异性高、操作较简单和成本较低等。 缺点：仅仅能够检测出位于酶切位点处的SNP，对位于酶切位点以外的SNP的检测则无法实现。
SNP开发/验证的研究方法和技术路线 1分子标记： 分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。即使想要验证已经定位的QTLs，我们也需要相对应的区间的分子标记，尤其是SNP标记。 1.1 全基因组SNP—Affymetrix芯片： 一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单，高通量。可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。在国家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型检测的芯片。 目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。而Affymetrix公司目前并没有相应的产品。但是通过跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的结果进行开发。 番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，但是他们包括的基因数目~30,000个，整体情况相近。另外，番茄作为自交植物，其LD的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。因此，综合考虑，我建议我们可以开发~3k芯片，应该可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。总之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高的应用价值。即使像玉米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。 1.2全基因组SNP—Douglas： 当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）对于优良的QTLs或是基因，我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行Douglas系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也
TaqMan SNP基因分型 技术方法： 此技术是由美国Life technologies公司研发的SNP分型技术，其技术原理如下简介。PCR 反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团(quencher)。PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的淬灭作用(quench)，从而发出荧光。两个探针的5’端标有不同的荧光(FAM或VIC)，3’端标有MGB 淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP 等位基因型。 整个技术的示意图如下： 应用领域：本方法适用于多个涉及到SNP分型的遗传研究领域。尤其适合针对全基因组SNP 关联研究获得的初步阳性位点，以及全基因组测序得到的大量初筛突变位点进行进一步的大样品验证研究。 RFLP (多重荧光)SNP分型技术 已知的很多SNP位点正好位于限制性内切酶的识别区域，针对这些SNP位点我们就可以使用此方法进行SNP分型。尤其是对于大样品量的多个SNP分型来说，此方法的优势较为明显。 技术方法： RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。它是第一代DNA分子标记技术。Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，通过电泳将其区分。现在我们用荧光标记其PCR引物，通过测序毛细管电泳来精确区分酶切片
S N P及检测技术 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
1定义： 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤 ( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热