碱性磷酸的提取分离纯化及其性质的研究
李小旭，赵彦彦，周晓倩，张林顺，伍红，林亚秋
摘要：从新鲜兔肝中提取碱性磷酸酶，进行分离纯化得到纯度较好的碱性磷酸
酶，然后测定其km，对最适温度及其热稳定性、最适pH及酸碱温度性的研究，最后用KH2PO4进行抑制剂类型鉴别。
关键词：温度、pH、酶、Km、抑制剂
前言：酶是具有生物催化功能的大分子，在一定的条件下，酶可催化各种生化
反应。酶的催化作用具有催化效率高，专一性强和作用条件温和等显著特点，所以酶在医药、食品、轻工、化工、环保、能源和生物工程等领域应用广泛。应用之前要先对酶的性质等进行研究，进行酶活力测定，研究抑制剂对酶活性的影响等等。在抑制剂的的作用下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能。抑制剂有可逆抑制剂和不可逆抑制剂之分。不可逆抑制剂与酶分子结合后，抑制剂难以除去，酶活性不能恢复。可逆抑制剂与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。根据可逆抑制剂作用的机制不同，酶的可逆抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。酶活力测定的方法多种多样，有化学测定法、光学测定法、气体测定法等。对酶活力测定的要求是快速、简便、准确。酶活力测定通常包括连个阶段，首先在一定条件下，酶与底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物的变化量。而酶的活力高低，是以酶的单位数来表示的。1961年国际生物化学与分子生物学联合会规定，在特定条件下（温度可采用25℃，PH等条件均采用最适条件），每1min催化0.001mol的底物转化为产物的酶量定义为一个酶活力单位，这个称为国际单位。由于这个规定没有法律效力所以在现实使用的酶活力单位多种多样。国际上另一个常用的酶活力单位是卡特（kat）。在特定条件下，每秒催化1mol底物转化为产物的酶量定义为1卡特（kat）。
1 材料与方法
1.1材料
1.11碱性磷酸酶的分离纯化实验
本实验使用的原料是新鲜兔肝，仪器有：离心机、搏力匀浆器等，试剂有：（1）0.5mol/L醋酸镁溶液（107.25g醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000ml）、（2）0.1mol/L醋酸钠溶液（8.2g醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000ml）、（3）0.01mol/L 醋酸镁-0.01mol/L醋酸钠溶液（准确吸取20ml 0.5mol/L醋酸镁溶液及100ml 0.14mol/L醋酸钠溶液，混匀后定容至1000ml、（4）Tris-HCl pH8.8缓冲液（称取三羟甲基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，即为0.1mol/L Trls溶液。取100ml10.1mol/LTrls溶液，加蒸馏水约780ml，再加0.1mol/L醋酸镁溶液100ml，混匀后用1%冰醋酸调pH为8.8，用蒸馏水定容至1000ml）、（5）正丁醇、丙酮、95%乙醇。
1.12 碱性磷酸酶的动力学鉴定——Km测定
本实验用的仪器有：水浴锅、721型分光光度计；试剂有：（1）0.04mol/L作用液（称取10.16g磷酸苯二钠C6H5PO4Na.2H2O，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，贮于棕色瓶内，置于冰箱内保存，可用一周）、（2）0.1mol碳酸盐缓冲液pH10.0（称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1000ml）、（3）碱性磷酸酶液、（4）0.5mol/LNaOH 溶液、（5）0.3%4-氨基安替比林（称取3g4氨基安替比林及碳酸氢钠42g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，贮于棕色瓶内，放冰箱保存）、（6）0.5%铁氰化钾（称取10g铁氰化钾及30g硼酸各溶于800ml蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2000ml，置棕色瓶中，放冰箱保存）。
1.13 碱性磷酸酶的最适pH及酸碱稳定性试验
用到的仪器有：水浴锅、721型分光光度计；试剂有：（1）基质液（称取磷酸苯二钠.2H2O 6g，4-氨基安替比林3g，分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中，两液混合后并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，盛于棕色瓶中，临时用着与等量的水混合即可）、（2）各pH值相应缓冲液（用0.2NNaOH、0.2M甘安酸配置成pH 为8、9、10、11、12的缓冲液）。
1.14 碱性磷酸酶的最适温度及热稳定性实验
本实验所用到的仪器、试剂都跟碱性磷酸酶的最适pH及酸碱稳定性实验一样。
1.15 抑制剂类型鉴别实验
本实验用到的仪器有：水浴锅、721型分光光度计，试剂有：（1）0.5mol/L KH2PO4（称取KH2PO4 6.80g，加水溶解并定容至100ml）、（2）0.04M 磷酸氢二钠（称取磷酸氢二钠14.3g，溶解于0.1M pH10的碳酸缓冲液中，并用此液稀释至1000ml）
1.2 方法
1.21 碱性磷酸酶的分离纯化
本实验采用有机溶剂沉定法从肝匀浆中分离纯化碱性磷酸酶（AKP），首先用低浓度醋酸钠（低渗破膜作用）制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定AKP的作用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含AKP在33%是丙酮或30%的乙醇中溶解，而在50%丙酮或60%是乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和乙醇重复分离提取，可从含有AKP的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
实验的操作流程如下：（1）取新鲜兔肝20g剪成组织块（—4℃），加0.01mol/L 醋酸镁—0.01mol/L醋酸钠30ml，在电动匀浆器上匀浆，得到肝匀浆。（2）取肝匀浆体积32.5ml，加10ml正丁醇，用玻璃棒充分搅拌3-5分钟后，置室温30分钟，用两层纱布过滤。（3）在滤液加23.5ml冷丙酮（—10℃）混匀，冰冻离心3000转5分钟。（4）弃上清液，在沉定里加0.5mol/L醋酸镁20ml，量体积为28.5ml。悬液，加96%乙醇12.5ml至30%，离心3500转5分钟。（5）取上清液33.5ml，加96%乙醇27.9ml至65%，离心3500转5分钟。（6）弃上清液，取沉定，加0.01mol/L醋酸镁—0.01mol/L醋酸钠20ml溶解，加96%乙醇9.75ml至30%，离心3500转5分钟。（7）去上清液29.5ml，加96%乙醇24.5ml，至60%，离心3500转5分钟。（8）取沉淀，加0.5mol/L醋酸镁15ml溶解，总体积17.5ml，加99.5%丙酮8.2ml至33%，离心3500转5分钟。（9）取上清液22.5ml，加99.5%丙酮7.65ml至50%，离心5000转10分钟。（10）取沉定，加pH8.8Tris缓冲液10ml，
分装成2ml瓶，置于—60℃低温冰箱保存。
1.22 碱性磷酸酶的动力学鉴定—Km测定
当温度、pH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度[S]增
大而增大，但大到一定限度时，作用物浓度再增加，则反应不再增加，此时反应
速度为最大速度（Vmax）。
V=Vmax[S]/（Km+[S]）或Km=[S][Vmax/V—1]
式中Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度，当V=Vmax/2时，则Km=[S]。实验操作如下：（1）.取8支试管，按下表操作：
试剂管号
（ml） 1 2 3 4 5 6 7 8 0.04mol/L作用物液0.15 0.20 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0 pH10碳酸缓冲液0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90
蒸馏水0.85 0.80 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1.0
混匀，37℃预热5min
酶液0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
加入酶液，混匀后立即计时，各管在37℃水浴中准确保温15min后，立即加入
0.5molNaOH液1.0ml以终止反应。（2）.显色：各管中加入0.3%4氨基安替比林
1.0ml和0.5%铁氰化钾
2.0ml，充分混匀放置10min，以0管为对照，在波长510nm
下比色，记录各管吸光度。
1.23 碱性磷酸酶的最适pH及酸碱性稳定性实验
pH对酶活性的影响极为显著，通常各种酶只有在一定的范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH条件下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH
值为最适pH。pH对酶的稳定性也有很大的影响，一般实验方法是将酶液分成若
干份，分别置于一系列不同的pH的溶液中保温处理一定时间，然后再调至某一
标准的pH或直接在最适pH条件下进行活力测定。实验操作如下：（1）pH—活
性曲线的制作：取6支试管，按下表操作：
管号 1 2 3 4 5
反应pH 8 9 10 11 12
12
相应pH缓冲液各加0.5ml
酶液各加0.1ml（0号管酶液在铁氰化钾之后加）
37℃预热5min
预热的基质液各加3.0ml
37℃精确保温15min各加1.0ml碱性溶液终止反应
0.5%铁氰化钾各加2.0ml
静置10min后比色
以反应pH值为横坐标，A510为纵坐标绘制pH—活性曲线，求出碱性磷酸酶在
本实验条件下的最适pH值。（2）酸碱稳定性范围的测定：取6支试管，按下表
操作：
管号 1 2 3 4 5
处理pH 8 9 10 11 12
12
相应pH缓冲液各加0.1ml
酶液各加0.1ml
37℃保温处理1hr
0.1MPH10碳酸盐缓冲液各加0.5ml
预热的基质液各加3.0ml（0号管基质液在铁氰化钾之后加）
37℃精确保温15min，各加1.0ml碱性溶液终止反应
0.5%铁氰化钾各加2.0ml
静置10min后比色
以pH为横坐标，A510为纵坐标，绘制酸碱稳定曲线。
1.24 碱性磷酸酶的最适温度及热温度性实验
保持其他反应条件恒定，在一系列变化的温度条件下测定酶活力。由于酶受热后易变性失活，因此各种酶对热都有一个温度的范围。一般的实验方法是在一定条件下先将酶在不同的温度下处理一段时间，迅速降温，然后再在一定温度下测定酶活力。实验操作如下：(1)温度—活性曲线的制作：取4支试管，按下表操作：
管号 1 2 3
反应温度（℃）25 37 80
80
稀释酶液各加0.1ml（0号管酶液在铁氰化钾
之后加）
预热基质液各加3.0ml
分别在不用温度下精确反应15min，各加1.0ml碱性溶液
终止反应
各加0.5%铁氰化钾2.0ml
静置10min后比色
以反应温度为横坐标，A510为纵坐标，绘制温度—活性曲线图，求出碱性磷酸酶在本实验条件下的最适温度。(2)热稳定：取4支试管，按下表操作：
管号 1 2 3
以处理温
度为横坐标，A510为纵坐标，绘制热稳定曲线。
1.25 抑制剂类型鉴别实验
抑制剂可分为竞争性抑制、非竞争性抑制剂、反竞争性抑制剂。在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合，即不能形成EIS ，其动力学特征是：米氏常数的表现值Km 增加，酶的最大反应速度Vm 不变。在非竞争性抑制中，抑制剂、底物都能同时和酶结合形成EIS ，但是EIS 不能进一步转变为产物，其动力学特征是：Vm 降低而Km 不变。在反竞争抑制中，抑制剂必须在酶和底物结合以后才能和酶结合形成EIS ，其动力学特征是：Km 和Vm 都发生了变化。本实验取KH2PO4作为碱性磷酸酶的抑制物，验证其抑制作用并判断抑制反应型别。实验操作如下，(1)取6支试管，按下表操作：
管 号 1 2 3 4 5 0
40mmol/L 底物溶液 0.10 0.20 0.30 0.40 0.80 0
碳酸盐缓冲液 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9
蒸馏水 0.8 0.7 0.6 0.5 0.1 0.9
0.25MKH2PO4 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
混匀，37℃预热5min
酶液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
最终底物浓度 2 4 6 8 16 0
（mmol/L ）
37℃精确保温15min
按顺序各加1.0ml 碱性溶液，1ml4—氨基安替吡林，2ml 铁氰化钾
静止10min 后比色
(2)以反应速度倒数1/V 或1/A510作纵坐标，以底物浓度倒数1/[S]为横坐标，作图，观察直线早纵轴和横轴上的交点位置并计算其Km 值，与未加抑制剂时的Km 值比较。
处理温度（℃） 25 37 80 80 处理时间（min ） 15 15 15 15 酶液 各加0.1ml （0号管在铁氰化钾之后加） 在上述相应温度的恒温水浴锅内放置15min 后取出，立即以流水冷 却并置于37℃恒温水浴锅中预热2min 。
37℃预热的复合基质液 各加3.0ml
37℃精确反应15min ，各加1.0nl 碱性溶液终止反应
各加0.5%铁氰化钾2.0ml
静置10min 后比色
2.结果与分析
2.1碱性磷酸酶的动力学—Km测定
表1：碱性磷酸酶的A510表
管号 1 2 3 4 5 6 7
1/ [S] 033 0.250 0.200 0.170 0.125 0.083 0.0625
1/A510 2.08 1.83 1.23 6.25 1.57 1.48 1.47
以表1中A510的倒数为纵轴，以作用物浓度[S]的倒数为横轴作图，如图1：
图1：A510倒数与[S]倒数关系图
由图1得出函数1/V=0.103/[S]+1.927，函数在横轴上的截距即为—1/Km，所以由函数得出Km=0.835mmol/L。
2.2 碱性磷酸酶的最适pH及酸碱稳定性实验
表2：碱性磷酸酶pH活性的A510表
管号 1 2 3 4
A510 0.032 0.054 0.108 0.316
反应pH 8 9 10 11
12
以表2中A510的倒数为纵坐标，以反应pH值为横坐标作图，如图2：
图2：碱性磷酸酶的最适pH
由图2可知，当pH为10时，A510值最高，即酶活性最高，所以碱性磷酸酶的最适pH为10。
表3：碱性磷酸酶酸碱稳定性的A510表
管号 1 2 3 4
A510 0.078 0.199 0.203 0.183
处理pH 8 9 10 11
以表3中A510的倒数为纵坐标，以pH为横坐标作图，如图3：
图3：碱性磷酸酶的酸碱稳定性
由图3可知：直线段说明酶的活性较为稳定，即为碱性磷酸酶的酸碱稳定范围，对应的pH为8~10，所以碱性磷酸酶的酸碱稳定范围是8~10。
2.3 碱性磷酸酶的最适温度及热稳定性实验
表4：碱性磷酸酶温度—活性的A510表
以表4中A510为纵坐标，以反应温度为横坐标，作温度—活性曲线图，如图4：
图4：碱性磷酸酶的最适温度
如图4所示，在温度为37℃时，酶活性最高，所以碱性磷酸酶的最适温度为37℃。 表5：碱性磷酸酶的热温度性
以表5中的处理温度为横坐标，A510为纵坐标作图，如图
5
管号 1 2 3 0 反应温度（℃） 25 37 80 80 A510 0.217 0.300 0.062 0.135 管号 1 2 3 0 热处理温度（℃） 25 37 80 80 A510 0.116 0136 0.025
图5：碱性磷酸酶的热稳定性
由图5可知，温度达到37℃以后酶活性急剧下降，所以碱性磷酸的热稳定范围是25℃~37℃。
2.4 抑制剂类型鉴别实验
表6：在KH2PO4作用下碱性磷酸酶的A510表
管号 1 2 3 4 5
1/ [S] 0.5 0.25 0.17 0.125 0.0625
1/A510 2.91 4.03 1.79 1.75 3.42
以表6中的1/A510为纵坐标，以底物浓度倒数1/[S]为横坐标作图，如图6：
图6：在KH2PO4下碱性磷酸酶的A510与底物浓度关系图
由图6得出函数3.75/A510=0.603/[S]+9.693，横轴的截距即为—1/Km，所以Km=0.409mmol/L，所以加抑制剂之后的Km值较小，再由图1可看出加抑制剂后函数在纵轴上的截距增大，可判断出该抑制剂属于反竞争抑制剂。
3. 结论及讨论
实验得到的A510值较低，即Km值较小，酶活性较低，可能是提取分离纯化碱性磷酸酶的时候操作有些问题。从实验数据得知，碱性磷酸酶的最适pH为10、酸碱稳定范围为8~10、最适温度为37℃、热温度范围为25℃~37℃，KH2PO4为反竞争抑制剂。
参考文献：郭勇.酶工程.科技出版社，2009.
致谢：实验过程中我学习到更专业详细的知识，感谢老师的指导，感谢组员的
合作。
碱性磷酸酶的分离纯化及性质探究
姓名：李小旭
班级：生物技术1101班
学号：201131301007
碱性磷酸酶偏高的原因 当受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。[1] 碱性磷酸酶偏高的原因可以分为生理性原因和病理性原因，具体讨论如下： 1、生理性原因儿童骨骼发育期、孕妇、骨折愈合期，这些情况下骨组织中的碱性磷酸酶很活跃，所以检测时值会偏高。 2、病理性原因当人体患有阻塞性黄疸、、继发性肝癌、性等时，过度制造ALP，经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于胆汁排泄障碍，反流入血，引起中的碱性磷酸酶偏高。 3、骨骼有病时，例如佝偻病、骨上肿瘤、软骨病等。 4、其他不是很常见的疾病，例如肾病、严重性贫血、甲状腺机能不全、白血病等[2]。 有何影响 碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、、、胆汁淤积性肝炎等的检查。它主要经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。但由于骨组织中此酶亦很活跃。因此，孕妇、骨折愈合期、骨软化症。佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、、、时，血清碱性磷酸酶亦可升高，所以对人体的危害是比较大的。 酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）主要存在于，定位于溶酶体内。ACP测定主要用于前列腺癌的辅助诊断。ACP测定主要用于前列腺癌的辅助诊断。
(1)前列腺癌：尤其是转移癌ACP明显升高。PAP对的诊断较ACP敏感，二者对晚期前列腺的诊断、疗效观察及预后监测价值更大。 (2)血液病：白血病、、匹克病、、溶血性贫血等ACP活性亦增高。 (3)非恶性前列腺疾病：前列腺炎、前列腺肥大、前列腺梗死等ACP活性也增高。 (4)骨疾病：变形性骨炎、成骨不全、软骨病、骨肉瘤、及某些非前列腺恶性肿瘤的骨转移，ACP活性也可升高。[1] (5)其他：，急、慢性肾炎、尿潴留等ACP活性可增高。 是一种糖酵解酶。存在于机体所有组织细胞的胞质内，其中以肾脏含量较高。是能催化乳酸脱氢生成的酶，几乎存在于所有组织中。同功酶有五种形式，即LDH－1（H4）、LDH-2（H3M）、LDH－3（H2M2）、LDH-4（HM3）及LDH-5（M4），可用方法将其分离。LDH同功酶的分布有明显的组织特异性，所以可以根据其组织特异性来协用诊断疾病。正常人血清中LDH2，〉LDH1。如有释放入血则LDH1〉LDH2，利用此指标可以观察诊断心肌疾病。乳酸脱氢酶大于300，属于增高，600，高出1倍，有参考价值。如果排除急性心肌梗死、巨幼细胞性贫血及溶血性疾病后，首先要考虑恶性肿瘤。虽不是恶性肿瘤唯一的诊断，但确实对肿瘤诊断有重要的临床意义，最好做进一步检查，防患于未然。 糖的吸收途径： 小肠绒毛吸收小肠内葡萄糖的方式为二级。小肠内钠离子浓度高于小肠绒毛内的钠离子浓度，因而两者之间存在钠离子浓度差的，通过该钠离子的浓度差，葡萄糖和钠离子可以从小肠内通过离子通道进入小肠绒毛；
一、尿酸过高的原因: 尿酸是指人体内嘌呤(purine)代谢的最终产物。如果体内积聚过多尿酸，造成代谢失调，就是尿酸过高。通常，嘌呤在肝脏氧化代谢后才变成尿酸，再由肾脏和肠道排出。基本上，嘌呤的生产量和排泄量大约相等。嘌呤的生产量，三分之一来自食物，其余是体内自行合成；排泄量则是三分之一由肠道排出，三分之二从肾脏排出。如果生产过多或排泄不出，尿酸囤积体内，会导致血液中尿酸值升高。运动过长时间没有喝水，抗利尿激素分泌，使尿液中的水分减少；食用含有大量嘌呤的食物，如红肉、动物内脏等等。这些都会使尿酸浓度短时增高，但是属于正常的现象，无需紧张。并不是所有的尿酸过高都是痛风！肾脏疾病、年纪过大引起器官老化、痛风、血液病、高血压、肥胖、糖尿病、铅中毒等都会引起尿酸增高。 食物中嘌呤过高也会引起尿酸增高。现在很多人都有尿酸偏高的症状，但又没有痛风的表现，这很可能是代谢综合征。所以当病人的血尿酸过高时，应该先请医生确认引起过高的原因，再适当治疗！ 二、碱性磷酸酶升高的原因 很多人在肝功能检查后发现自己碱性磷酸酶偏高，很慌张，不知道是怎么回事？如果我们找到了碱性磷酸酶偏高的原因，那么就可以对症治疗了。那碱性磷酸酶偏高的原因是什么呢？碱性磷酸酶偏高有病理性因素和非病理性因素两种，具体我们可以看看下文的详细介绍。 步骤/方法
1.病理性因素之骨骼疾病：像骨折愈合期、骨软化症、佝偻病、成骨肉瘤、转移性骨 瘤等，都有可能导致碱性磷酸酶偏高。 2.病理性因素之肝脏疾病：出现排泄功能障碍，如各种肝炎、肝硬化、肝纤维化、毛 细胆管性肝炎、肝癌等，亦会导致碱性磷酸酶偏高。 3.病理性因素之其它疾病：如肾病、严重性贫血、白血病、甲状腺机能亢进时，血清 碱性磷酸酶亦可升高。 4.非病理性因素之药物导致：如巴比妥类、抗生素类如红霉素、庆大霉素、氯霉素、 卡那霉素、氨苄青霉素等。 5.非病理性因素之成长期的生理现象：尤其在骨骼生理性发育期，其血清中的碱性磷 酸酶活力较高，血清内的大多数碱性磷酸酶来自成骨细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝脏，一般是正常人的1-2倍。 6.非病理性因素之怀孕期间：孕妇在怀宝宝期间，由于自身缺钙而导致的碱性磷酸酶 偏高
碱性磷酸酶米氏常数的测定 [目的与要求] 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。 [原理] 在环境的温度、pH和酶的浓度一定时。酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图37所示。 底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。 V = V max[S]/(K m+[S]) 上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。当V= V max/2时，K m =[S]。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。 K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。 酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即： 1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max 此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成 一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m 值，如图38所示。 图37 底物浓度对反应速度的影响图38 Lineweaver-Burk作图法 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K m值。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小。反应式如下：
编号 内蒙古大学生命科学学院生物系 基因工程实验室 本科基因工程实验论文开题报告 论文题目：碱性磷酸酶基因表达载体的 构建及在大肠杆菌中的表达 学生姓名： 年级： 专业： 指导教师： 二〇一三年八月十二日
学生姓名 论文题目 开题时间 项目来源本科生基因工程大实验课 一、立论依据 项目的研究意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP, ALKP) (EC 3.1.3.1)属磷酸单脂酶族，底物专一性较低，广泛应用于表位连锁图谱，探针标记测序和免疫组织化学等领域。分子生物学中，ALP分解寡聚核甘酸的末端单酯化磷酸，是常用的遗传工程酶。1 产碱性磷酸酶的生物有很多，从细菌到高等哺乳动物均有分布。人血液中的碱性磷酸酶含量是重要的指标之一，其检验结果及异位表达对癌症等许多疾病有着指导意义。2，3目前商业碱性磷酸酶主要来源于动物（小牛肠碱性磷酸酶）、植物（麦芽）和微生物（细菌碱性磷酸酶）(Bacterial alkaline phosphatase, BAP)。 在革兰氏阴性细菌中，BAP表达于细胞膜外的周质空间。相比表达于胞内使其更机动和高效。BAP的功能已基本揭示，简单来说BAP是细菌产生摄取应用的自由磷酸基团的一种方式，4被大量的实验证据所支持。然而，缺乏BAP的E. coli 仍然能够存活，所以应该还存在相关的替代机制。5 目前，对BAP的研究热点主要由于其海洋有机磷利用的酶特性等集中于海洋微生物领域。海洋细菌碱性磷酸酶的亚细胞研究揭示了其相关合成基因及表达特性对于海洋有机磷循环及海洋生物多样性的贡献。研究人员证实了3733种BAP序列(包括PhoA, PhoD, and PhoX )，包含胞质分泌及胞外位于不同支载结构。大量的实验数据支持了细菌于海洋表面部分光耦合的磷摄取机制。6鉴于磷对于海洋维持初级产能的重要性，并且考虑到其最主要的来源之一－有机磷分解，海洋生物BAP
1、详细介绍碱性磷酸酶（SOD、木瓜凝乳蛋白酶、精氨酸激酶）的提取、分离纯 化方案及采用每种技术（如：如果采用阴离子交换层析，那为什么不采用阳离子交换层析呢，要解释清楚）的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度？ 一、精氨酸激酶的介绍 无脊椎动物的精氨酸激酶类似于脊椎动物中的肌酸激酶，是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+和ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸、Mg2+和ADP，是无脊椎动物体内能量代谢的关键调控酶[1]。它不仅在对墨鱼的能量代谢过程中具有重要作用，而且在墨鱼体内的表达量也很高。因此，对精氨酸激酶深入研究十分必要。本实验主要对墨鱼肌肉组织的精氨酸激酶进行分离、纯化及部分酶学性质的鉴定。对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降；pH8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用。 二、工艺路线
三、研究内容与方案 1.对虾精氨酸激酶的提取、分离 取10g于-20℃贮存的新鲜对虾肌肉,高速组织捣碎机2000r·min-1匀浆5min,加入40mL预冷的缓冲液A(0.1mmol·L-1Tris-HCl,10mmo l·L-1巯基乙醇,5mmol·L-1叠氮化钠,20mmo l·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF),pH8.0),搅拌均匀,把悬液放置于预冷的离心管中,4℃,5000×g离心20min后保存上清。＊选择使用巯基乙醇和PMSF的原因： 巯基乙醇可以防止蛋白酶在分离提取过程中的氧化、 PMSF是蛋白酶抑制剂，可以防止蛋白酶水解 ＊注意事项 该步骤完成后，要对粗酶液进行酶活力的测定 2.对虾精氨酸激酶的纯化 1）DEAE-纤维素柱层析 装柱直接取商品DEAE cellulose DE-52装柱(2.5x40cm)装柱前，先在柱中加入一定量的层析柱平衡液（约10cm高），然后倒入凝胶，打开柱底部的出口，使其自然沉降，当柱中形成明显分界面时，放入两层大小合适的滤纸片与凝胶顶部，接上恒流泵，流速选用2.5ml/min，当柱不再进一步压缩时，保持柱顶部缓冲液1-2cm高[4]。平衡使用DEAE cellulose DE-52阴离子交换层析柱平衡液洗脱2-3个柱体积，平衡12h。加样打开柱顶，用吸管吸出多余的缓冲液至柱床上薄薄一层，然后加入酶液，加样量一般不超过约2-3ml。洗脱采用NaCl浓度梯度洗脱法，将DEAE cellulose DE-52层析柱洗脱液A液和B液分别加到梯度混合仪两容器内，将B液150ml加入左杯，A液150ml加入右杯，打开梯度混合仪两容器内，流速1.5ml/min，通过波长280nm的核酸蛋白检测仪后，由自动收集器收集。 ＊选择阴、阳离子交换层析的原则： 蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH有较大关系。以用阴离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的pH条件下，等电点pI
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐), BCIP/NBT （四唑硝基蓝）是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。 使用方法 1. 在膜或组织切片，最后一次洗涤完毕后，加入适量BCIP/NBT染色工作液 2. 室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深度. 3. 用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应 4. 膜标本可干燥后避光保存；组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可以用中性红复染染色 干细胞成骨诱导的常用染色方法有几种 碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。 成骨细胞染色方法 以ALP为目标物的检测方法： 1 Gomori钙钴法 【染色原理】 ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。 【孵育液配制】 3%β-甘油磷酸钠5ml 2%巴比妥钠5ml 蒸馏水10ml 2% CaCl2 10ml 2% MgSO4 1ml 【步骤】 （1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。 （2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。 （3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。 （4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。 （5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。 【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。 2偶氮偶联法： 【孵育液配制】 萘酚AS-BI磷酸盐20mg DMSO 0.5ml 0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml 六偶氮副品红0.5ml
骨软化症。佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、肝硬变、白血病、甲状腺机能亢进时，血清碱性磷酸酶亦可升高，应加以鉴别。 研究应用 碱性磷酸酶也是目前免疫诊断试剂产品最常用的标记酶之一。与辣根过氧化物酶（HRP)相比，ALP用作标记酶的优点是，稳定性高、灵敏度高，缺点是成本高，标记困难。 在研究中最常用的ALP如下： ◇细菌碱性磷酸酶Bacterial alkaline phosphatase (BAP), 来源：Escherichia coli C4 ； ◇ Shrimp alkaline phosphatase (SAP), 来源：一种北极虾 (Pandalus borealis) ; ◇ 小牛肠碱性磷酸酶Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP); ◇ 胎盘碱性磷酸酶Placental alkaline phosphatase (PALP)和分泌性碱性磷酸酶the secreted alkaline phosphatase (SEAP)，后者是前者的C末端短缺版——与PALP相比，SEAP没有PALP的C末端最后24个氨基酸(这24个氨基酸构成了与糖基化磷脂酰肌醇靶向锚定的区域) ALP主要应用于分子生物学和酶免分析中： ★分子生物学中主要用作核酸的去磷酸化。因为DNA通常会在5'端结合磷酸基团，用ALP去磷酸化能防止DNA分子5'端与3'端连接，从而在后续步骤准备好之前让DNA分子抑制处于线性化状态;同样，通过去磷酸化可用作放射标记示踪。通常用作这些目的用的最多的是Shrimp alkaline phosphatase (SAP)，因为在反应完成之后它是最容易灭活的。 ★酶免分析中应用最多的是ELISA，以竞争法测小分子抗原为例，抗体先与固相载体结合，然后让待测样品与事先经ALP标记过的该抗原竞争地与抗体结合，洗去未反应的过量ALP-抗原，加入显色底物。则可以通过与按梯度浓度变化的标准品绘出的标准曲线对比从而知道待测样品中抗原的浓度。ELISA中用的比较多的是辣根过氧化物酶(HRP)，底物为OPD，深桔黄色，检测波长492nm；TMB，蓝绿色，检测波长450nm 碱性磷酸酶，底物为PNPP（对－消基苯磷酸酯），黄色，检测波长405nm ★目前工业上一个普遍的应用是作为检验牛奶的巴斯的灭菌的标志：被巴斯德过高温灭菌的分子会被灭活，向其中和未巴斯灭菌的牛奶中加入ALP的底物，2分钟后未灭菌的样品应该显黄色，如果待测样品(指被巴斯灭菌过的牛奶)也能呈现相同颜色，则说明巴斯灭菌温度未过度。当然总有例外，因为有少数细菌会产生耐热的ALP。 测定方法 有很多种，我国曾应用较广的为磷酸苯二钠比色法，但现在应用较多的是连续检测法。 原理为以磷酸对硝基酚为底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇或二乙醇胺为磷酸酰基的受体。在碱性环境下，ALP催化4-NPP水解产生游离的对硝基酚，在碱性溶液中转变成黄色。根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位。 正常范围 正常范围（连续监测法） 女性，1-12岁小于500U/L；大于15岁，40-150U/L； 男性，1-12岁小于500U/L；12-15岁，小于750U/L；大于15岁，40-150U/L。
碱性磷酸酶(ALP或AKP) 正常范围（连续监测法） 女性，1-12岁小于500U/L；大于15岁，40-150U/L； 男性，1-12岁小于500U/L；12-15岁，小于750U/L；大于15岁，40-150U/L。 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P 末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与AKP6 六种同功酶。其中第1 、2 、6 种均来自肝脏，第3 种来自骨细胞，第 4 种产生于胎盘及癌细胞，而第 5 种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。生长期儿童血清内的大多数来自成骨细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。 化学特征 碱性磷酸酶名字 alkaline phosphatase (ALP 或AKP) 碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如A TP，将磷酸基团加到对应底物分子上。碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，对来源于细菌中的ALP来说，其最适pH是8.0，而对来源于牛的ALP则是8.5。 ALP是一种含锌的糖蛋白，在碱性环境中（最适Ph为10左右）可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物底物。 碱性磷酸酶偏高的原因 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。 碱性磷酸酶偏高的原因可以分为生理性原因和病理性原因，具体讨论如下： 1、生理性原因儿童骨骼发育期、孕妇、骨折愈合期，这些情况下骨组织中的碱性磷酸酶很活跃，所以检测时值会偏高。 2、病理性原因当人体患有阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等时，肝细胞过度制造ALP，经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于胆汁排泄障碍，反流入血，引起血清中的碱性磷酸酶偏高。 3、骨骼有病时，例如佝偻病、骨上肿瘤、软骨病等。 4、其他不是很常见的疾病，例如肾病、严重性贫血、甲状腺机能不全、白血病等。 有何影响 碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。它主要经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。但由于骨组织中此酶亦很活跃。因此，孕妇、骨折愈合期、骨软化症。佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、肝硬变、白血病、甲状腺机能亢进
碱性磷酸酶标记方法(戊二醛两部法) 将100uL碱性磷酸酯酶加入到300uL10mM PBS（pH7.2），再加入40uL 25%的戊二醛，混匀，4摄氏度活化20小时； 透析至10mM PBS（pH7.2），24小时，换液4次； 将目的蛋白用10mM PBS（pH7.2）配成4mg/mL； 将125uL目的蛋白加入活化过的碱性磷酸酶中（终浓度为5000U AP/mg蛋白），混匀，4摄氏度反应24小时。 参考文献：A蛋白碱性磷酸醋酶的标记及酶联测试 Enzyme Linked Immunosorbent Assay Using Alkaline Phosphatase Conjugated with Streptococcal Protein G 使用200mgAP/mg 蛋白 2.5mg AP（50IU/mg），加入200uL含1.25%戊二醛的100mM 的PB（pH6.8），混匀，室温反应过夜； 4摄氏度条件下，电磁搅动，透析至50mM PBS（pH7.2），12小时，换液4次； 1.5mg目的蛋白溶于100uL 1M的CB（pH9.5）； 将活化的AP加入配好的蛋白质液体中，混匀，4摄氏度条件下反应24小时； 加入10uL 200mM的赖氨酸溶液，混匀，22摄氏度条件下反应2小时； 4摄氏度条件下透析至50mM PBS（pH7.2），12小时，换液4次； 离心，取上清，用50mM TB7.4+0.6% BSA+0.05% NaN3稀释10倍，-20摄氏度保存。 底物缓冲液：100mM TB9.0+100mM NaCl+1mM MgCl2 参考文献：碱性磷酸酶标记链霉亲和素 2．戊二醛交联标记法： 此法是以双功能交联剂为桥，使酶与抗体(抗原)结合。最常用的交联剂是戊二醛。它具有两个活性醛基，可分别与酶分子和抗体(抗原)分子上的氨基结合。戊二醛法又根据试剂加入的方法分为一步法和二步法。 一步法将抗体(抗原)、酶和戊二醛同时混合。此法操作简便，广泛用于；HRP、AP与抗体(抗原)的交联。但酶标记物的产率低，由于结合物立体构型障碍，酶和抗体容易失活；酶和抗体易发生自身交联，影响标记效果。 二步法先将过量的戊二醛与酶反应，让酶分子上的氨基仅与戊二醛分子上的醛基结合，不发生酶与酶的结合，除去未与酶结合的多余戊二醛后，再加入抗体(抗原)，形成酶—戊二醛—抗体(抗原)结合物。其优点是酶标记物均一，无自身聚合，分子量小易穿透细胞膜，灵敏度与活性均较高，但其产率更低。 戊二醛标记法： 酶结合量(mg／ml)=OD403X0.4 IgG含量(mg／m1)= （OD280 －OD403 X 0.42）X 0.94X0.62 过碘酸钠标记法 IgG含量(mg／m1)＝(OD280－OD403 X 0.3)X0.62。 计算克分子比或摩尔比(E／P) HRP／IgG＝HRP(mg／m1)／HRP分子量÷IgG(mg／m1)／IgG分子量 =HRP(mg／m1)／40 000÷IgG (mg／m1)／160 000
碱性磷酸酶测定 一、试剂配制 1、甲苯 2、pH9.8氯化铵-氢氧化铵缓冲液：称取20g纯氯化铵，溶于 少量水（我配200ml，用一百多毫升水溶40g氯化铵）， 然后加入浓氨水润洗烧杯和定容至100ml，用pH试纸测 pH，pH为10即可，不用刻意调pH。（氨水很臭，需要带 口罩在通风橱配） 3、8%铁氰化钾溶液（只能用一周，放冰箱保存）：取8g铁氰 化钾，用水定容至100ml。 4、2%4-氨基安替比林（只能用一周，放冰箱保存）：取2g4- 氨基安替比林，用水定容至100ml。 5、0.5%磷酸苯二钠溶液（用pH9.4硼酸缓冲液配） （1）先配制pH9.4硼酸盐缓冲液：称取4.768g硼砂（十 水合四硼酸钠）和0.44g纯氢氧化钠，用蒸馏水定容至 1000ml。（硼砂需要用电炉加热配制，硼砂用称量纸称量， 氢氧化钠需要用烧杯称量,基本不用配pH，pH试纸测为9） （2）称取5.05g磷酸苯二钠，用pH9.4硼酸缓冲液定容 至1000ml。 6、酚标准溶液： 酚溶液：称取1g苯酚用水溶至1L，保存于暗色瓶中。（苯酚还是需要水浴加热，详细配法看脲酶测定，但由于1g很难准确称量，
并在我配完发现天平托盘上结了一层苯酚，但测量后不影响标线的准确程度，R值为三个9） 酚工作液：取10ml原液用水稀释至1L(1ml中含0.01mg/mL) 二、测定过程 1、称取5g过1mm筛的土样于绿色塑料瓶（每个样需要3个 重复，前两个重复和第三个重复分开放，第三个重复为 无基质重复，每天做两个无土样重复，此重复加甲苯、 磷酸苯二钠溶液），加5滴甲苯（用滴管加5滴），盖盖 盖子后用震荡机低速震荡15min（我选择160的速度）， 然后给第三个重复加入20ml蒸馏水，给前两个重复加入 20ml磷酸苯二钠，盖上盖子后充分摇匀后在37摄氏度恒 温箱培养2小时。 2、培养结束后过滤，过滤后取5ml滤液加入50ml容量瓶（用 5ml枪加，由于过滤液体没那么多，每加一个样用两遍蒸 馏水润洗枪），加水至大概20ml，再加0.25ml氯化铵-氢 氧化铵缓冲液，0.5ml4-氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾 溶液（用1ml枪加），每加一种都要充分摇匀。立即显色， 立即定容。 3、标准液是吸取1,3,5,7,9,11,13ml氮的工作液，移至50ml容 量瓶，加水加水至大概20ml，再加0.25ml氯化铵-氢氧 化铵缓冲液，0.5ml4-氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾溶 液。（和第二条同步）
碱性磷酸酶偏高的原因 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。[1] 碱性磷酸酶偏高的原因可以分为生理性原因和病理性原因，具体讨论如下： 1、生理性原因儿童骨骼发育期、孕妇、骨折愈合期，这些情况下骨组织中的碱性磷酸酶很活跃，所以检测时值会偏高。 2、病理性原因当人体患有阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等时，肝细胞过度制造ALP，经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于胆汁排泄障碍，反流入血，引起血清中的碱性磷酸酶偏高。 3、骨骼有病时，例如佝偻病、骨上肿瘤、软骨病等。 4、其他不是很常见的疾病，例如肾病、严重性贫血、甲状腺机能不全、白血病等[2]。 有何影响 心肌梗死、巨幼细胞性贫血及溶血性疾病后，首先要考虑恶性肿瘤。虽不是恶性肿瘤唯一的诊断，但确实对肿瘤诊断有重要的临床意义，最好做进一步检查，防患于未然。 糖的吸收途径：
小肠绒毛上皮细胞吸收小肠内葡萄糖的方式为二级主动运输。小肠内钠离子浓度高于小肠绒毛上皮细胞内的钠离子浓度，因而两者之间存在钠离子浓度差的梯度，通过该钠离子的浓度梯度差，葡萄糖和钠离子可以从小肠内通过离子通道进入小肠绒毛上皮细胞；随着钠离子的不断流入，造成钠离子浓度梯度逐渐减小，为了维持钠离子内外的浓度梯度差以便于吸收葡萄糖，此时，小肠绒毛上皮细胞内钠离子--钾离子泵打开，消耗ATP，使小肠绒毛上皮细胞内的钠离子流回小肠中，再次形成运输葡糖糖所需要的钠离子浓度梯度。依次循环。 食物中的淀粉经唾液中的α淀粉酶作用，催化淀粉中α-1，4-糖苷键的水解，产物是葡萄糖、麦芽糖、麦芽寡糖及糊精。由于食物在口腔中停留时间短，淀粉的主要消化部位在小肠。小肠中含有胰腺分泌的α淀粉酶，催化淀粉水解成麦芽糖、麦芽三糖、α糊精和少量葡萄糖。在小肠黏膜刷状缘上，含有α糊精酶，此酶催化α极限糊精的α-1，4-糖苷键及α-1，6-糖苷键水解，使α-糊精水解成葡萄糖；刷状缘上还有麦芽糖酶可将麦芽三糖及麦芽糖水解为葡萄糖。小肠黏膜还有蔗糖酶和乳糖酶，前者将蔗糖分解成葡萄糖和果糖，后者将乳糖分解成葡萄糖和半乳糖。 糖被消化成单糖后的主要吸收部位是小肠上段，己糖尤其是葡萄糖被小肠上皮细胞摄取是一个依赖Na+的耗能的主动摄取过程，有特定的载体参与：在小肠上皮细胞刷状缘上，存在着与细胞膜结合的Na+-葡萄糖联合转运体，当Na+经转运体顺浓度梯度进入小肠上皮细胞时，葡萄糖随Na+一起被移入细胞内，这时对葡萄糖而言是逆浓度梯度转运。这个过程的能量是由Na+的浓度梯度（化学势能）提供的，它足以将葡萄糖从低浓度转运到高浓度。当小肠上皮细胞内的葡萄糖浓度增高到一定程度，葡萄糖经小肠上皮细胞基底面单向葡萄糖转运体（unidirectional glucose transporter）顺浓度梯度被动扩散到血液中。小肠上皮细胞内增多的Na+通过钠钾泵(Na+-K+ ATP酶)，利用ATP提供的能量，从基底面被泵出小肠上皮细胞外,进入血液，从而降低小肠上皮细胞内Na+浓度，维持刷状缘两侧Na+的浓度梯度,使葡萄糖能不断地被转运。
International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) Scientific Division Committee on Reference Systems for Enzymes (C-RSE) IFCC Primary Reference Procedures for the Measurement of Catalytic Activity Concentrations of Enzymes at 37 °C Part 9. Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Concentration of Alkaline Phosphatase [Orthophosphoric-Monoester Phosphohydrolase, Alkaline Optimum, EC 3.1.3.1] Gerhard Schumann1, Rainer Klauke1, Francesca Canalias2, Steffen Bossert-Reuther3, Paul F.H. Franck4, F.-Javier Gella5, Poul J. J?rgensen6, Dongchon Kang7, Jean-Marc Lessinger8, Mauro Panteghini9, Ferruccio Ceriotti10 1Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Klinische Chemie, Hannover, Germany 2Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Laboratori de Referència d'Enzimologia Clínica, Universitat Autònoma de Barcelona, Cerdanyola del Vallès, Spain 3 Roche Diagnostics GmbH, Research & Development Department, Mannheim, Germany 4Klinisch Chemisch en Hematologisch Laboratorium, HagaZiekenhuis, Den Haag, The Netherlands 5BioSystems S.A., Barcelona, Spain 6Department of Clinical Chemistry, Kolding Hospital, Kolding, Denmark
生化学检测指标的临床意义 1.ALT（丙氨酸转氨酶） 肝细胞损伤释放到血液中的酶。丙氨酸转氨酶一般称为GPT，肝、肾、心肌等几乎所有的脏器组织细胞中都有，特别在肝脏含量较高。与AST相比，在其它脏器中的分布量较少，可以用于肝损伤的特征指标。但数值大小并不一定能够反映细胞坏死或肝脏损伤程度。ALT中存在CK或ALP的脏器特异性，没有同工酶。ALT常用于肝炎的过程观察，肝细胞损伤导致ALT数值上升，有时可达1000IU/L。肝硬化呈现轻度上升。 2.AST（天门冬氨酸转氨酶） 代表性的肝功能指标。天门冬氨酸转氨酶有时也称GOT，肝细胞损伤后释放到血中，骨骼肌、心肌、红细胞等破损可引起升高。 AST在肝脏含量最高，主要用于诊断肝脏疾病。但发生骨骼肌、心肌疾病或溶血性疾病时AST也上升，而ALT（GPT）为肝脏特有。因此只有AST，难以鉴别诊断肝脏疾病，而通过计算AST/ALT可以提高特异性。 AST中没有CK类的脏器特异同工酶，细胞内存在不同的m-AST（线粒体成分）、s-AST （细胞上清成分）。脏器细胞受损，通常s-AST首先释放，但如果细胞损伤到线粒体，血中将出现m-AST。骨骼肌也可以释放AST，肌肉运动后数值上升。另外发生溶血将产生正误差。 3.ALP（碱性磷酸酶） ALP是发生肝脏损伤、胆汁淤滞或骨坏死、妊娠等上升的酶。碱性磷酸酶广泛分布在生物体的细胞膜，通过碱性端的PH可分解各种磷酸化合物的酶。ALP为糖蛋白分子，因糖链不同，存在来自于数种不同的脏器的同工酶。ALP异常时，可以检查同工酶以及由来的脏器。 ALP升高的主要原因：肝胆系统疾病，骨代谢系统疾病，妊娠或恶性肿瘤出现的胎盘性的ALP。青春期骨生长旺盛，ALP可为成年期的2-3倍。 4.GLU（血糖） 糖尿病的基本检查项目。饭前、饭后变化较大，空腹时126mg/dl以上可能患有糖尿病。 血糖通过食物摄取外，肝脏也产生、释放葡萄糖，与脑、肌肉、红细胞等末梢组织的消耗呈平衡状态。特别是中枢神经系统，葡萄糖是唯一的能源。 高血糖的代表性疾病为糖尿病。胰脏β细胞损伤缺乏胰岛素导致以下4个类型糖尿病：胰岛素依赖性糖尿病（1型糖尿病）、非胰岛素依赖性糖尿病（2型糖尿病）、胰岛素受体等遗传因子异常导致的糖尿病、妊娠糖尿病。 低血糖可引起异常空腹感或冷汗，血糖数值低于30mg/ml表现为睡眠倾向，20mg/ml以下表现为痉挛、昏睡。 在取血后如果室温放置，葡萄糖在血细胞中被糖酶分解代谢，数值降低。为抑制分解糖酶的作用，在试管中加入氟化钠后取血。血糖数值的顺序依次为：动脉血、毛细血管血、静脉血。 5.T.CHO（总胆固醇） 原发性、继发性高胆固醇血症的筛选。
碱性磷酸酶染色（NAP） 碱性磷酸酶染色（NAP）在临床的应用基本属于常规筛查的染色法。 （1）原理（偶氮偶联法）：血细胞内的碱性磷酸酶在pH 9.4～9.6的条件下将基质液中的α-磷酸萘酚钠水解，产生α-萘酚与重氮盐偶联形成不溶性灰黑色沉淀，定位于酶活性所在之处。 （2）结果判断：阳性结果为胞质内出现灰褐色至深黑色颗粒状或片状沉淀 ①（一）灰褐色沉淀，为0分。 ②（+）胞质出现灰褐色沉淀，为1分。 ③（++）胞质深褐色沉淀，为2分。 ④（+++）胞质中已基本充满棕黑色颗粒状沉淀，但密度较低，为3分。 ⑤（++++）胞质全被深黑色团块沉淀所充满，密度高，甚至遮盖胞核，为4分。 （3）参考值：成熟中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）的积分值为7～51。由于各实验室的实验条件不同，正常值也有差异，应建立本实验室的正常值。这里的正常值仅供参考。 （4）临床意义: ①生理变化： ①年龄变化：新生儿NAP活性增高，以后下降。儿童期各年龄大致相似，成年期较儿童期活性减低，老年期更低。 ②应激状态下的变化：紧张、恐惧、激烈运动等NAP活性可增高。 ③月经周期中的变化：经前期增高，行经后降低，经后期恢复。 ④妊娠期的变化：妊娠2～3个月的NAP积分值轻度增高，以后逐月增高，分娩时达高峰，产后则恢复正常。 ②病理性变化： ①感染：细菌性感染时NAP积分值增高。在细菌性感染中球菌性感染较杆菌性感染为高；在球菌性感染中，急性较慢性为高。病毒性感染时，NAP积分值一般无明显变化。因此本染色法有时可帮助鉴别细菌性感染和病毒性感染； ②血液病：慢性粒细胞白血病的NAP积分值明显减低，常为“0”，缓解时NAP
中性粒细胞百分比偏高的原因竟然是这样 中性粒细胞百分比偏高是血常规检查中经常会出现的状况，可是到底是什么原因导致的人们出现中性粒细胞百分比偏高的 状况？这个问题大多数人却并不是很了解。其实日常生活中能够引起中性粒细胞百分比偏高的因素是有很多种的，其中感冒就是最常见的一种。 中性粒细胞百分比偏高的原因 通常拿到一张血常规化验单，医生主要看三个数据：白细胞计数（WBC）、淋巴细胞百分比和中性粒细胞百分比，而白细胞计数就是常说的血象，后两者则是白细胞的分类。众所周知，白细胞是人体的“卫士”，专门帮助人体抵御细菌等外来入侵。不过，其实在这些卫兵里，有一队“精兵强将”更需要关注，那就是中性粒细胞。中性粒细胞进行战斗时总是冲在最前面，在人体免疫系统里有着举足轻重的作用，对于医生来说，看血液化验单不仅仅看白细胞有没有低于正常值，还要关注中性粒细胞的数量。
中性粒细胞是什么？中性粒细胞（neutrophilicgranulocyte）在瑞氏（Wright）染色血涂片中，胞质呈无色或极浅的淡红色，有许多弥散分布的细小的（0、2～0、4微米）浅红或浅紫色的特有颗粒。细胞核呈杆状或2～5分叶状，叶与叶间有细丝相连。其颗粒表面有一层膜包裹，可分1～4型，颗粒中含髓过氧化物酶（myeloperoxidase）、酸性磷酸酶、吞噬素（phagocytin）、溶菌酶、β葡糖苷酸酶、碱性磷酸酶等。中性粒细胞具趋化作用、吞噬作用和杀菌作用。 专家说，如果白细胞数量高于1万，炎症比较厉害，可以使用消炎药物、打吊瓶，白细胞数量低于4000，说明抵抗力比较低，退烧药等要少用。如果淋巴细胞百分比高，则是病毒感染；中性粒细胞百分比高，则是细菌感染。白细胞主要为中性粒细胞，中性粒细胞高的话一般白细胞也高，常见为感染，一般感冒都会导致增高。
肝功能检查碱性磷酸酶偏高的原因是什么 肝功能检查碱性磷酸酶偏高的原因是什么？肝功能检查碱性磷酸酶偏高是怎么回事？全面认识肝功能检查碱性磷酸酶偏高。碱性磷酸酶是肝功能检查中判断乙肝病情的一项重要指标，碱性磷酸酶在人体的正常值是0-500U/L，临床上有很多乙肝患者检查中出现碱性磷酸酶偏高超出正常值范围的情况，这让人十分不解，为什么肝功能检查碱性磷酸酶偏高呢？出现碱性磷酸酶偏高怎样处理好呢？ 郑州中大肝病医院专家介绍，碱性磷酸酶通常是用来诊断和鉴别肝胆系统及骨骼等疾病的，其中黄疸的鉴别诊断最为常见。研究发现，肝脏中存在碱性磷酸酶，当肝脏受到损伤，肝功能代谢异常，肝内胆道胆汁排泄障碍，碱性磷酸酶反流入血，就会出现肝功能检查碱性磷酸酶偏高的情况。推荐：肝功能检查碱性磷酸酶_偏高/低的原因_正常值_怎么办https://www.doczj.com/doc/b94292654.html,/zhuanti/jianxinglinsuanmei/ 碱性磷酸酶的正常值： 女性，1-12岁小于500U/L；大于15岁，40-150U/L； 男性，1-12岁小于500U/L；12-15岁，小于750U/L；大于15岁，40-150U/L。 需要注意的是：在生理性骨骼发育期间，碱性磷酸酶可比正常人高1-2。碱性磷酸酶是肝炎、阻塞性黄疸的判断的重要指标，当肝功能检查碱性磷酸酶指标不稳定的时候，一定要及时去专业医院检查，以免延误了病情。 肝功能检查碱性磷酸酶偏高有很多原因，有生理性的也有病理性的，一些生理因素，儿童骨骼发育期、孕妇、骨折愈合期，这些情况下骨组织中的碱性磷酸酶很活跃，也会出现碱性磷酸酶高的情况。病理方面，肝功能检查碱性磷酸酶偏高的原因主要与阻塞性黄疸、胆汁淤积性肝炎、原发性肝癌和继发性肝癌等疾病有关，一旦发现磷酸酶偏高往往表明肝脏受损，需要及时进行治疗。尤其是肝脏受损引起的碱性磷酸酶偏高，建议去大型的肝病医院，比如河南首家肝病专科医院郑州中大肝病医院，专业治疗肝病，治疗独到。 另外，肝功能检查碱性磷酸酶偏高与不常见的疾病如肾病、严重性贫血、白血病等也有关；而骨骼疾病诸如骨上肿瘤、佝偻病、软骨病等等，也会引起碱性磷酸酶高。
碱性磷酸酶是检查什么 很多人都不是专业的医疗人员，很难明白一些治疗的意义，或是一些医生的做法。有时候自己由于自己不明白自己的情况，就会呆滞一些问题的产生，容易导致和医生发生冲突。所以大家还是要增长一些医生的知识。下面小编带大家去关注一个问题，碱性磷酸酶是检查什么？碱性磷酸酶是检查什么 碱性磷酸酶（ALP或AKP）是一种磷酸单酯酶，血清中ALP来源于不同的组织（肝、骨、肾、小肠、胎盘等），主要以游离形式存在，极少量与脂蛋白和免疫球蛋白结合。正常情况下，体内ALP是来源于肝（肝ALP）和骨（骨ALP）各半。某些病理原因（如各种肝、骨等疾病）和生理性原因（如儿童生长发育期、妊娠2个月后等）均可引起血清ALP水平改变，临床主要为肝胆和骨骼疾病所引起。 碱性磷酸酶检查偏高怎么回事 1、代谢异常原因 主要用于阻塞性黄疸、肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查，阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎都会使碱性磷酸酶偏高。 胆道排泄异常碱性磷酸酶是需要经过肝脏，然后由胆汁排出，当排泄过程中出现异常，那就会引起碱性磷酸酶偏高。 2、骨骼组织原因 由于骨组织中此酶亦很活跃。因此，孕妇、骨折愈合期、骨软化症。佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松等血清碱性磷酸酶会升高。 3、肝胆疾病：血清总ALP病理性升高，机会60%是由肝脏和胆道疾病引起的。ALP是胆汁淤积性疾病的敏感指标。其他肿瘤如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、骨细胞瘤、骨肉瘤等，碱性磷酸酶增高时，提示可能有肝脏转移。 以上就是小编对于碱性磷酸酶是检查什么这一问题的有关资料整理。一些定期的体检也是可以体现这样的一个问题，在体检中也可以发现一些小的问题，检查就是为了发现问题，也可以起到一个预防的作用，所以大家一定要多多注意。小编祝大家身体健康！
碱性磷酸酶 （英语：Alkaline phosphatase，简称ALP或ALKP）(EC 3.1.3.1) 是一类水解酶，可在核苷酸、蛋白质、生物碱等分子上去除磷酸基，进行去磷酸化作用，在碱性环境下最为有效，故得名碱性磷酸酶。碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。 目 录 1化学特征 2存在影响 3物质来源 4相关信息 1 化学特征 碱性磷酸酶 碱性磷酸酶名字 alkaline phosphatase (ALP 或AKP)现多用ALP 系统名phosphate-monoester phosphohydrolase (alkaline optimum) 其他名称还有alkaline phosphomonoesterase; phosphomonoesterase; glycerophosphatase; alkaline phosphohydrolase; alkaline phenyl phosphatase; orthophosphoric-monoester phosphohydrolase (alkaline optimum);basic phosphatase CAS 号: 9001-78-9 碱性磷酸酶(AKP或ALP) 属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。每个单体由449个氨基酸组成，完整的AKP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心，活性中心区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。AKP 被phoA基因编码，与很多分泌蛋白一样，在细胞质内合成氨基末端带有信号肽的单体前体，信号肽引导前体跨内膜运输后被切除，同源二聚体形成。 碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。碱性磷酸酶是磷酸酶的一种，磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如A TP，将磷酸基团加到对应底物分子上。碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，对来源于细菌中的ALP来说，其最适pH 是8.0，而对来源于牛的ALP则是8.5。