Cloned
Alkaline Phosphatase（CIAP）
（Calf intestine）
使 用 说 明 书
Code No.： D2250
包 装：
Alkaline Phosphatase（10～30 U/μl） 500 Units
10×Alkaline Phosphatase Buffer 1 ml
保 存： -20℃
●制品说明
本酶与大肠杆菌由来的酶同样，催化所有磷酸单酯的水解，不能催化磷酸二酯以及磷酸三酯的水解，对ATP 等的焦磷酸键水解速度较慢。
●酶贮存溶液
Tris-HCl（pH8.0） 10 mM
KCl 50 mM
MgCl2 1 mM
ZnCl20.1 mM
Glycerol 50 %
●起 源
Yeast carrying the plasmid which encodes the gene of calf intestine alkaline phosphatase。
●活性定义
在37℃、pH9.8的条件下，1分钟内水解对硝基苯磷酸盐（p-nitrophenyl phosphate）生成1 μmol 的对硝基苯酚（p-nitrophenol）所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
●纯 度
1） 30 U的本酶和1 μg的λDNA-Hin d III片段在37℃下反应16小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
2）30 U的本酶和1 μg 的Closed circular(RFI)pBR322 DNA 在37℃下反应1小时，DNA的电泳 谱带不发生变化。
3） 18 U的本酶和1μg的16S，23S rRNA在37℃下反应16小时，RNA的电泳谱带不发生变化。
●用 途
去除载体DNA片段的5′-末端的磷酸基。
●使用注意
CIAP在保存条件下极其稳定，而在螯合剂存在的条件下，经65℃、30分钟加热处理，99%的活性不可逆失活（根据反应条件不同有时也有例外）。建议失活处理时使用苯酚，可使酶完全失活。
●添附Buffer组成（保存：-20℃）
10×Alkaline Phosphatase Buffer
苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1）抽提2次。
氯仿/异戊醇（24 ：1）抽提1次。
添加5μl的3 M NaOAC。
添加125 μl的（2.5倍量）冷乙醇，在-20℃下保冷30～60分钟。
离心分离回收沉淀，用200 μl的70％冷乙醇洗净后，减压干燥。
用20μl以下的TE Buffer溶解沉淀。
V2005.09
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)
第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
牛的牛小肠碱性磷酸酶()酶联免疫分析（） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中类牛小肠碱性磷酸酶()的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛的牛小肠碱性磷酸酶()水平。用纯化的牛的牛小肠碱性磷酸酶()抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入类牛小肠碱性磷酸酶()，再与标记的类牛小肠碱性磷酸酶()抗体结合，形成抗体抗原酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物显色。在酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的类牛小肠碱性磷酸酶()呈正相关。用酶标仪在波长下测定吸光度（值），通过标准曲线计算样品中牛的牛小肠碱性磷酸酶()浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成孔配置孔配置保存 说明书份份 封板膜片（）片（） 密封袋个个 酶标包被板××℃保存 标准品：×瓶×瓶℃保存标准品稀释液×瓶×瓶℃保存酶标试剂×瓶×瓶℃保存 样品稀释液×瓶×瓶℃保存 显色剂液×瓶×瓶℃保存 显色剂液×瓶×瓶℃保存 终止液×瓶×瓶℃保存 浓缩洗涤液（×倍）×瓶（×倍）×瓶℃保存 样本处理及要求： . 血清：室温血液自然凝固分钟，离心分钟左右（转分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 . 血浆：应根据标本的要求选择或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合分钟后，离心分钟左右（转分）。 仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 . 尿液：用无菌管收集，离心分钟左右（转分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 . 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心分钟左右（转分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用（）稀释细胞悬液，细胞浓度达到万左右。通过反复冻
血液生化检查各指标及对 应正常值列表 Prepared on 22 November 2020
血液生化检查各指标及对应正常值列表 （二氧化碳结合力） 2O～30 mmol/L （一氧化碳定性）（—） （a羟丁酸脱氨酶） 90～22O IU/L （磷酸肌酶激酶） 25～170 mmol/L （乳酸脱氢酶） 40～100 mmol/L （激肌酸激酶同功酶） 0～16 （血清白/球蛋白）～2-3g （高密度脂蛋白〕～ mmol/L （低密度低蛋白）～ mmol/L （极低密度脂蛋白） 1～3 mmol/L （C反应蛋白）（—） （免疫球蛋白）～ mg/ml （免疫球蛋白） 9～23 mg/ml （免疫球蛋白）～ ml （铁蛋白） 20～200 ng/ml （蛋白电脉） 3～ % （蛋白电脉）～ % （蛋白电脉）～ % （蛋白电脉）～ % （纤维蛋白原） 2～4g/L （） 44～133 µmol/L
（肌酐清除率） 80～120 ml/分 （血糖）～ mmol/L （血淀粉酶） 40～160 U （补体）～L （抗链O） 1:400以下 （类风湿因子）（—） （肥达氏反应）（—） （外裴氏反应）（—） （癌胚抗原）＜5mg 血生化 项目结果 ----------参考值---------- 谷丙转氨酶-ALT 0 ～ 40 U 尿素～ 7 mmol/L 血肌酐 40 ～ 130 umol/L 血尿酸 180 ～ 410 umol/L 胆固醇～ mmol/L 甘油三脂～ mmol/L 葡萄糖～ mmol/L 总胆红素 3 ～ 24 umol/L 项目谷丙转氨酶-ALT 临床意义正常时，谷-丙主要存在于组织细胞内，以肝细胞含量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释放血中。所以血清中此酶活力很低。当、心肌病变、
1.如何区分重组DNA和空载体自连： （一）检测方法 （1）双抗性筛选：具有四环素和氨苄青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记，一种抗性标记用来正选择转化子，另一种通过插入失活而可以鉴定重组子。Ori位于Amp+和tet+这两个基因之间，在四环素平板上出现的菌落一定是获得了质粒的转化子，在此基础上，如果四环素抗性转化子对氨苄青霉素敏感，则说明在载体中有外源片段的插入而使氨苄青霉素抗性失活，即重组子；若对氨苄青霉素有抗性，则此转化子的质粒是空载体。 （2)抗生素插入失活法：如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，但仍能表达氨苄抗性基因，对四环素是敏感的。筛选重组pBR322 按照以下方法进行，将转化细胞培养于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。 （3）限制性内切酶法：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以通过这些限制性酶酶切重组质粒，电泳分析插入片段长度是否正确。（抗生素+酶切检测+测序） （4）蓝白斑筛选：多克隆位点存在于编码β-半乳糖苷酶的N端的DNA序列中，与pUC载体一起使用的宿主菌携带编码β-半乳糖苷酶的C端序列的基因片段。通过α互补机制，两个片段在体内相互弥补，产生一个有活性的β-半乳糖苷酶。以X-gal作为指示剂。若通过插入外源DNA到多克隆位点中而打断了β-半乳糖苷酶的部分基因，不能产生有活性的β-半乳糖苷酶，X-gal不会反应，重组子菌落为白色，而自连空载体转化的菌落则是蓝色的。 （5）PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通过PCR的方法进行鉴定 （6）菌落原位杂交：把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，然后溶菌，变性并固定DNA，最后用标记的DNA或RNA探针进行杂交来检测这些被转移的菌落或噬菌斑。 （7）测序法：若通过前面这些方法鉴定之后还是有疑虑，不知道是否阳性者确为真阳性而不是空载体自连，可以将其送到生物公司进行测序以最终确定之。 （8）基因产物检测法：如果使用的是表达载体，那么就可以通过鉴定基因产物的方法鉴定正确的克隆。 （二）避免方法： （1）. 碱性磷酸酶处理载体在DNA重组实验中，用碱性磷酸酶对载体DNA的5’末端除磷，可以防止载体自连，提高重组率 （2）. 噬菌体包装蛋白包装下限的限制：选用λ噬菌体或者柯氏载体，含有cos位点，包装35~51kb的片段，空载体片段太小，不会被包装 （3）. 利用某些基因(改基因存在时质粒不能在一定的菌株中存在,而此被基因为外源DNA取代时则能存在)等预防措施. 2.如何在大肠杆菌中高效表达外源基因： 涉及三个方面： （1）强化蛋白质的生物合成（重组质粒的拷贝数，转录水平和翻译速率）； （2）抑制蛋白质产物降解； （3)恢复维持蛋白质特异性空间结构。 （一）．强化蛋白质的生物合成 1）启动子：影响表达效率的主要因素之一是启动子的强度。 高水平表达的最佳启动子必须具备的条件： （1）它必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10％-30％； （2）这种启动子应该是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。 2）终止子：有效的转录终止子的必要性： （1）转录产物越长，所需时间就多，外源基因本身的转录效率下降； （2）转录通读进入质粒功能区，可能干扰质粒的复制和其他生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； （3）转录终止子能增强mRNA分子的稳定从而大大提高了蛋白质产物的水平； （4）转录产物过长影响翻译效率。 3）核糖体结合位点（RBS）的结构要素：外源基因在大肠杆菌中的高效表达不仅取决于转录启动频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌mRNA的翻译起始效率主要由其5‵端的结构序列所决定，即核糖体结合位点（RBS），它包括4个结构要素： （1）起始密码子上游的6-8个核苷酸序列UAAGGAGG,即Shine-Dalgarno (SD)序列； （2）起始密码子AUG； （3）SD与起始密码子之间的距离及碱基组成；
碱性磷酸酶米氏常数的测定 [目的与要求] 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定方法及意义。学会运用标准曲线测定酶的活性，加深对酶促反应动力学的理解。 [原理] 在环境的温度、pH和酶的浓度一定时。酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现在反应开始时。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(V max)，如图37所示。 底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。 V = V max[S]/(K m+[S]) 上式中V max为最大反应速度，[S]为底物浓度，K m为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。当V= V max/2时，K m =[S]。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此K m的单位以摩尔浓度(mol／L)表示。 K m是酶的最重要的特征性常数，测定K m值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的K m值在0.01-100(mmol/L)间。 酶促反应的最大速度V max实际上不易准确测定，K m值也就不易准确测出。林-贝(1ineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即： 1/V = （K m +[S]）/ V max[S]或1/V = K m/ V max·（1/[S]）+1/ V max 此式为直线方程，以不同的底物浓度1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成 一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ K m，由此可以正确求得该酶的K m 值，如图38所示。 图37 底物浓度对反应速度的影响图38 Lineweaver-Burk作图法 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的酶活性，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其K m值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的K m值。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。根据吸光度的大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上查知酚的含量，进而算出酶活性的大小。反应式如下：
编号 内蒙古大学生命科学学院生物系 基因工程实验室 本科基因工程实验论文开题报告 论文题目：碱性磷酸酶基因表达载体的 构建及在大肠杆菌中的表达 学生姓名： 年级： 专业： 指导教师： 二〇一三年八月十二日
学生姓名 论文题目 开题时间 项目来源本科生基因工程大实验课 一、立论依据 项目的研究意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP, ALKP) (EC 3.1.3.1)属磷酸单脂酶族，底物专一性较低，广泛应用于表位连锁图谱，探针标记测序和免疫组织化学等领域。分子生物学中，ALP分解寡聚核甘酸的末端单酯化磷酸，是常用的遗传工程酶。1 产碱性磷酸酶的生物有很多，从细菌到高等哺乳动物均有分布。人血液中的碱性磷酸酶含量是重要的指标之一，其检验结果及异位表达对癌症等许多疾病有着指导意义。2，3目前商业碱性磷酸酶主要来源于动物（小牛肠碱性磷酸酶）、植物（麦芽）和微生物（细菌碱性磷酸酶）(Bacterial alkaline phosphatase, BAP)。 在革兰氏阴性细菌中，BAP表达于细胞膜外的周质空间。相比表达于胞内使其更机动和高效。BAP的功能已基本揭示，简单来说BAP是细菌产生摄取应用的自由磷酸基团的一种方式，4被大量的实验证据所支持。然而，缺乏BAP的E. coli 仍然能够存活，所以应该还存在相关的替代机制。5 目前，对BAP的研究热点主要由于其海洋有机磷利用的酶特性等集中于海洋微生物领域。海洋细菌碱性磷酸酶的亚细胞研究揭示了其相关合成基因及表达特性对于海洋有机磷循环及海洋生物多样性的贡献。研究人员证实了3733种BAP序列(包括PhoA, PhoD, and PhoX )，包含胞质分泌及胞外位于不同支载结构。大量的实验数据支持了细菌于海洋表面部分光耦合的磷摄取机制。6鉴于磷对于海洋维持初级产能的重要性，并且考虑到其最主要的来源之一－有机磷分解，海洋生物BAP
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐), BCIP/NBT （四唑硝基蓝）是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。 使用方法 1. 在膜或组织切片，最后一次洗涤完毕后，加入适量BCIP/NBT染色工作液 2. 室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深度. 3. 用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应 4. 膜标本可干燥后避光保存；组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可以用中性红复染染色 干细胞成骨诱导的常用染色方法有几种 碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。 成骨细胞染色方法 以ALP为目标物的检测方法： 1 Gomori钙钴法 【染色原理】 ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。 【孵育液配制】 3%β-甘油磷酸钠5ml 2%巴比妥钠5ml 蒸馏水10ml 2% CaCl2 10ml 2% MgSO4 1ml 【步骤】 （1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。 （2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。 （3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。 （4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。 （5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。 【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。 2偶氮偶联法： 【孵育液配制】 萘酚AS-BI磷酸盐20mg DMSO 0.5ml 0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml 六偶氮副品红0.5ml
血液生化检查各指标及对应正常值列表 ALT （谷丙转氨酶）0～4O IU/L CO2Cp （二氧化碳结合力）2O～30 mmol/L AST （谷草转氨酶）0～45 IU/L CO （一氧化碳定性）（-） TP （总蛋白）60～80 g/L HBDH （a羟丁酸脱氨酶）90～22O IU/L ALB （白蛋白）35～55 g/L CPK （磷酸肌酶激酶）25～170 mmol/L ALP （碱性磷酸酶）40～160 IU/L LDW （乳酸脱氢酶）40～100 mmol/L GGT （丫.谷氨酪转肽酶）0～50 IU/L CPK-MB （激肌酸激酶同功酶）0～16 TBIL （总胆红素）1.7～17.1μmol/L A/G （血清白/球蛋白）3.5～5.5/2-3g DBIt （直接胆红素）0～6.0 μmol/L HDL （高密度脂蛋白〕1.14～1.91 mmol/L Crea （肌酐）44～133 µmol/L VLDL （低密度低蛋白）0.11～0.34 mmol/L Ua （尿酸）90～360 µmol/L LDL （极低密度脂蛋白）1～3 mmol/L UREA （尿素氮）1.8～7.1 mmol/L CRP （C反应蛋白）（-） GLU （血糖）3.61～6.11 mmol/L IgA （免疫球蛋白）0.9～4.5 mg/ml TG （甘油三脂）0.56～1.7 mmol/L IgG （免疫球蛋白）9～23 mg/ml GHO （胆固醇）2.84～5.68 mmol/L IgM （免疫球蛋白）0.8～2.2 ml Mg （血清镁）0.8～1.2 mmol/L SF （铁蛋白）20～200 ng/ml K （血清钾）3.5～5.5 mmol/L α（蛋白电脉）3～4.9 % Na （血清钠）135～145 mmol/L β（蛋白电脉）3.1～9.6 % Cl（血清氯）96～108 mmol/L γ（蛋白电脉）6.6～13.7 % Ca （血清钙）2.2~2.7 mmol/L δ（蛋白电脉）9.5～20.3 % P （血清磷）0.97～1.61 mmol/L Fdg （纤维蛋白原）2～4g/L
常见化验指标的正常值及临床意义 为了方便朋友们查询医院常见化验指标的正常值，特此整理如下：（如有与下列正常值有差异者，请以所在医院的正常值为准） 谷丙转氨酶(ALT) 正常值 3.00-40.00 u/l 临床意义： (1)ALT活性在下列疾病可见升高 a.肝胆疾病:传染性肝炎、肝癌、肝硬化活动期、中毒性肝炎、脂肪肝、胆管炎和胆囊炎等 b.心血管疾病:心肌梗死、心肌炎、心力衰竭时的肝脏淤血、脑出血等 c.骨骼肌疾病:多发性肌炎、肌营养不良等 (2)一些药物和毒物可引起ALT活性升高,如氯丙嗪、异烟肼、奎宁、水杨酸制剂及酒精、铅、汞、四氯化碳或有机磷等 谷草转氨酶(AST) 正常值3.00-40.00 u/l 临床意义： (1)AST在心肌细胞内含量较多,当心肌梗死时,血清中AST活性增高,在发病后6-12小时之显著增高,在48小时达到高峰,约在3-5天恢复正常 (2)疟疾、流行性出血热、传染性单核细胞增多症、多发性肌炎、肌营养不良、急性胰腺炎、胸膜炎、肾炎及肺炎等也可引起血清AST活性轻度增高 (3)肝炎时,AST和ALT均可明显增高,可高与正常值上限10-30倍,这在其它疾病时少见.在黄疸期间,AST和ALT即可见增高,有助于早期诊断,由于肝中AST含量增高,往往AST>ALT,但由于ALT清除率较慢,所以不久以后即ALT>AST.恢复期一般ALT恢复较慢,持续ALT、AST 增高,往往说明有慢性肝炎.AST/ALT比值如<1,则有可能是慢性迁延性肝炎.如酶活性增高,且AST/ALT比值>1,则很有可能是慢活肝.。 r_谷氨酰转移酶(r_GT) 正常值 11.00-61.00 u/l 临床意义: 人体各器官中r_GT的含量按下列顺序排列:肾、前列腺、胰、肝、盲肠和脑.肾脏中含量较高,但肾脏疾病时,血液中的该酶活性增高不明显.肾单位病变时,r_GT经尿排出,检验尿中酶活性可能有助于诊断肾脏疾病,r_GT主要诊断肝胆疾病.显著增高常见于:原发行肝癌、胰腺癌、阻塞性黄疸、胆汁性肝硬化、胰头癌、肝外胆管癌等.轻度或中度增高见于:传染性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、急慢性胰腺炎、胆石症等 碱性磷酸酶(ALP) 正常值 53.00-140.00 u/l 临床意义： (1)碱性磷酸酶活性增高可见于下列疾病: a.生理性增高:妊娠期、儿童生长发育期、射入性血糖增多及紫外线照射后 b.肝胆疾病:阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌、肝脓肿
碱性磷酸酶测定 一、试剂配制 1、甲苯 2、pH9.8氯化铵-氢氧化铵缓冲液：称取20g纯氯化铵，溶于 少量水（我配200ml，用一百多毫升水溶40g氯化铵）， 然后加入浓氨水润洗烧杯和定容至100ml，用pH试纸测 pH，pH为10即可，不用刻意调pH。（氨水很臭，需要带 口罩在通风橱配） 3、8%铁氰化钾溶液（只能用一周，放冰箱保存）：取8g铁氰 化钾，用水定容至100ml。 4、2%4-氨基安替比林（只能用一周，放冰箱保存）：取2g4- 氨基安替比林，用水定容至100ml。 5、0.5%磷酸苯二钠溶液（用pH9.4硼酸缓冲液配） （1）先配制pH9.4硼酸盐缓冲液：称取4.768g硼砂（十 水合四硼酸钠）和0.44g纯氢氧化钠，用蒸馏水定容至 1000ml。（硼砂需要用电炉加热配制，硼砂用称量纸称量， 氢氧化钠需要用烧杯称量,基本不用配pH，pH试纸测为9） （2）称取5.05g磷酸苯二钠，用pH9.4硼酸缓冲液定容 至1000ml。 6、酚标准溶液： 酚溶液：称取1g苯酚用水溶至1L，保存于暗色瓶中。（苯酚还是需要水浴加热，详细配法看脲酶测定，但由于1g很难准确称量，
并在我配完发现天平托盘上结了一层苯酚，但测量后不影响标线的准确程度，R值为三个9） 酚工作液：取10ml原液用水稀释至1L(1ml中含0.01mg/mL) 二、测定过程 1、称取5g过1mm筛的土样于绿色塑料瓶（每个样需要3个 重复，前两个重复和第三个重复分开放，第三个重复为 无基质重复，每天做两个无土样重复，此重复加甲苯、 磷酸苯二钠溶液），加5滴甲苯（用滴管加5滴），盖盖 盖子后用震荡机低速震荡15min（我选择160的速度）， 然后给第三个重复加入20ml蒸馏水，给前两个重复加入 20ml磷酸苯二钠，盖上盖子后充分摇匀后在37摄氏度恒 温箱培养2小时。 2、培养结束后过滤，过滤后取5ml滤液加入50ml容量瓶（用 5ml枪加，由于过滤液体没那么多，每加一个样用两遍蒸 馏水润洗枪），加水至大概20ml，再加0.25ml氯化铵-氢 氧化铵缓冲液，0.5ml4-氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾 溶液（用1ml枪加），每加一种都要充分摇匀。立即显色， 立即定容。 3、标准液是吸取1,3,5,7,9,11,13ml氮的工作液，移至50ml容 量瓶，加水加水至大概20ml，再加0.25ml氯化铵-氢氧 化铵缓冲液，0.5ml4-氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾溶 液。（和第二条同步）
医院常见化验指标的正常值及临床意义 一、谷丙转氨酶(ALT) 临床意义： (1)ALT活性在下列疾病可见升高 a.肝胆疾病:传染性肝炎、肝癌、肝硬化活动期、中毒性肝炎、脂肪肝、胆管炎和胆囊炎等 b.心血管疾病:心肌梗死、心肌炎、心力衰竭时的肝脏淤血、脑出血等 c.骨骼肌疾病:多发性肌炎、肌营养不良等 (2)一些药物和毒物可引起ALT活性升高,如氯丙嗪、异烟肼、奎宁、水杨酸制剂及酒精、铅、汞、四氯化碳或有机磷等 二、谷草转氨酶(AST) 临床意义： (1)AST在心肌细胞内含量较多,当心肌梗死时,血清中AST活性增高,在发病后6-12小时之显著增高,在48小时达到高峰,约在3-5天恢复正常 (2)疟疾、流行性出血热、传染性单核细胞增多症、多发性肌炎、肌营养不良、急性胰腺炎、胸膜炎、肾炎及肺炎等也可引起血清AST 活性轻度增高
(3)肝炎时,AST和ALT均可明显增高,可高与正常值上限10-30倍,这在其它疾病时少见.在黄疸期间,AST和ALT即可见增高,有助于早期诊断,由于肝中AST含量增高,往往AST>ALT,但由于ALT清除率较慢,所以不久以后即ALT>AST.恢复期一般ALT恢复较慢,持续ALT、AST增高,往往说明有慢性肝炎.AST/ALT比值如<1,则有可能是慢性迁延性肝炎.如酶活性增高,且AST/ALT比值>1,则很有可能是慢活肝.。 三、r_谷氨酰转移酶(r_GT) 临床意义: 人体各器官中r_GT的含量按下列顺序排列:肾、前列腺、胰、肝、盲肠和脑.肾脏中含量较高,但肾脏疾病时,血液中的该酶活性增高不明显.肾单位病变时,r_GT经尿排出,检验尿中酶活性可能有助于诊断肾脏疾病,r_GT主要诊断肝胆疾病.显著增高常见于:原发行肝癌、胰腺癌、阻塞性黄疸、胆汁性肝硬化、胰头癌、肝外胆管癌等.轻度或中度增高见于:传染性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、急慢性胰腺炎、胆石症等 四、碱性磷酸酶(ALP) 临床意义： (1)碱性磷酸酶活性增高可见于下列疾病: a.生理性增高:妊娠期、儿童生长发育期、射入性血糖增多及紫外线照射后
International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC) Scientific Division Committee on Reference Systems for Enzymes (C-RSE) IFCC Primary Reference Procedures for the Measurement of Catalytic Activity Concentrations of Enzymes at 37 °C Part 9. Reference Procedure for the Measurement of Catalytic Concentration of Alkaline Phosphatase [Orthophosphoric-Monoester Phosphohydrolase, Alkaline Optimum, EC 3.1.3.1] Gerhard Schumann1, Rainer Klauke1, Francesca Canalias2, Steffen Bossert-Reuther3, Paul F.H. Franck4, F.-Javier Gella5, Poul J. J?rgensen6, Dongchon Kang7, Jean-Marc Lessinger8, Mauro Panteghini9, Ferruccio Ceriotti10 1Medizinische Hochschule Hannover, Institut für Klinische Chemie, Hannover, Germany 2Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Laboratori de Referència d'Enzimologia Clínica, Universitat Autònoma de Barcelona, Cerdanyola del Vallès, Spain 3 Roche Diagnostics GmbH, Research & Development Department, Mannheim, Germany 4Klinisch Chemisch en Hematologisch Laboratorium, HagaZiekenhuis, Den Haag, The Netherlands 5BioSystems S.A., Barcelona, Spain 6Department of Clinical Chemistry, Kolding Hospital, Kolding, Denmark
收稿日期：2016-04-30 修订日期: xxxx 基金项目：国家自然科学基金委项目（21373101）、吉林省教育厅“十三五”科研项目（2016137）、吉林化工学院博士启动基金（2016002）资助。作者简介：任重远，原吉林大学博士生；现工作于吉林化工学院讲师 *通讯联系人E-mail: yqwu@https://www.doczj.com/doc/ea419769.html, 组织非特异性碱性磷酸酶活力的原位红外光谱检测 任重远1, 3，Saida Mebarek 2，René Buchet 2，吴玉清3* 1 吉林化工学院生物与食品工程学院，吉林，132022 2 Laboratory ODMB UMR 5246, UniversitéLyon I, Villeurbanne France 69622 3 吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室，长春，130012 摘要 本文以孵育17天的小鸡胚胎中，富含组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)的细胞外微结构——基质囊泡(MVs)作为研究模型，利用焦磷酸盐(PP i )作为TNAP 酶的天然底物，在近生理条件下，以红外(IR)光谱为监测工具，原位检测MVs 水解PP i 的反应过程，根据红外谱图特征吸收峰的变化，计算TNAP 酶活力值。 关键词：基质囊泡；生物底物；IR 光谱；原位检测；酶活力 中图分类号：O657.3 文献标识码：A 文章编号： 组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)是人体骨骼矿化形成的生物标志物，其酶活力的高低能够直接反映矿化形成能力的强弱。目前，测试TNAP 酶活力的主要方法是利用其外源性荧光底物——4-硝基苯磷酸(p -NPP)、在碱性条件下(pH=10.4)监测405 nm 处荧光强度来检测TNAP 的酶活力值。但是，这种测试条件与人体生理环境下的pH 值相距甚远。因此，开发一种在生理条件下、以生理化合物作为检测底物的快速、经济的检测碱性磷酸酶活性的方法，将作为热点研究。在骨骼中，具有矿化能力的成骨细胞、成牙细胞以及肥大的软骨细胞等，能够将含有高TNAP 活性表达的基质囊泡（MVs ）释放至细胞外环境中，并从而引发矿化形成[1]；MVs 是细胞外微观结构，能够为无机磷酸离子及钙离子提供沉积位点，是矿化产物羟磷灰石（HA ）晶体形成的场所，因此MVs 也可视为新骨骼产生矿化的基本单位[2]。本文选择孵育17天的小鸡胚胎中所提取并纯化的细胞外微结构——基质囊泡(MVs)，并将其作为研究模型，红外光谱技术为检测工具，利用焦磷酸盐(PP i )作为TNAP 酶的天然底物，在近生理条件下，监测MVs 水解PP i 的反应过程。同时，根据红外谱图特征吸收峰的变化，计算TNAP 酶活力值。 PP i 作为TNAP 酶的底物，水解过程中产生2个无机磷酸盐(P i )分子，因此，我们首先对反应过程中的反应物(PP i )及产物(P i )进行红外表征。实验结果显示，在红外指纹区(1300-900 cm -1)，相同浓度(50 mM)的PP i 与无 P i 的红外光谱谱图存在明显的差异，而且它们相互之间不发生重叠。PP i 在1107 cm -1位置存在一个明显特征峰，而P i 在1076及990 cm -1分别存在两处明显的吸收峰，这是由于磷酸盐分子中HPO 42-反对称伸缩振动与对称伸缩振动所引起的[3]。 在37 °C ，pH 8.0反应条件下，利用红外光谱技术对MVs 水解PP i 过程实时监测，每隔5min 红外扫描一次，并持续60分钟。红外光谱检测结果显示，4000-1300 cm -1的光谱范围在整个水解过程中并未明显特征峰的变化。然而，在1300-900 cm -1的红外区域内却发生了明显的特征峰的变化(Fig.1)。 Fig. 1 Difference IR spectra of MVs with PP i (spectrum recorded at the indicated time minus that recorded immediately). Significant variation in the intensity of
碱性磷酸酶染色（NAP） 碱性磷酸酶染色（NAP）在临床的应用基本属于常规筛查的染色法。 （1）原理（偶氮偶联法）：血细胞内的碱性磷酸酶在pH 9.4～9.6的条件下将基质液中的α-磷酸萘酚钠水解，产生α-萘酚与重氮盐偶联形成不溶性灰黑色沉淀，定位于酶活性所在之处。 （2）结果判断：阳性结果为胞质内出现灰褐色至深黑色颗粒状或片状沉淀 ①（一）灰褐色沉淀，为0分。 ②（+）胞质出现灰褐色沉淀，为1分。 ③（++）胞质深褐色沉淀，为2分。 ④（+++）胞质中已基本充满棕黑色颗粒状沉淀，但密度较低，为3分。 ⑤（++++）胞质全被深黑色团块沉淀所充满，密度高，甚至遮盖胞核，为4分。 （3）参考值：成熟中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）的积分值为7～51。由于各实验室的实验条件不同，正常值也有差异，应建立本实验室的正常值。这里的正常值仅供参考。 （4）临床意义: ①生理变化： ①年龄变化：新生儿NAP活性增高，以后下降。儿童期各年龄大致相似，成年期较儿童期活性减低，老年期更低。 ②应激状态下的变化：紧张、恐惧、激烈运动等NAP活性可增高。 ③月经周期中的变化：经前期增高，行经后降低，经后期恢复。 ④妊娠期的变化：妊娠2～3个月的NAP积分值轻度增高，以后逐月增高，分娩时达高峰，产后则恢复正常。 ②病理性变化： ①感染：细菌性感染时NAP积分值增高。在细菌性感染中球菌性感染较杆菌性感染为高；在球菌性感染中，急性较慢性为高。病毒性感染时，NAP积分值一般无明显变化。因此本染色法有时可帮助鉴别细菌性感染和病毒性感染； ②血液病：慢性粒细胞白血病的NAP积分值明显减低，常为“0”，缓解时NAP
碱性磷酸酶(ALP或AKP) 正常范围（连续监测法） 女性，1-12岁小于500U/L；大于15岁，40-150U/L； 男性，1-12岁小于500U/L；12-15岁，小于750U/L；大于15岁，40-150U/L。 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P 末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与AKP6 六种同功酶。其中第1 、2 、6 种均来自肝脏，第3 种来自骨细胞，第 4 种产生于胎盘及癌细胞，而第 5 种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。生长期儿童血清内的大多数来自成骨细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。 化学特征 碱性磷酸酶名字 alkaline phosphatase (ALP 或AKP) 碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。磷酸酶的作用与激酶的作用正相反，激酶是磷酸化酶，可以利用能量分子，如A TP，将磷酸基团加到对应底物分子上。碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，对来源于细菌中的ALP来说，其最适pH是8.0，而对来源于牛的ALP则是8.5。 ALP是一种含锌的糖蛋白，在碱性环境中（最适Ph为10左右）可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物底物。 碱性磷酸酶偏高的原因 当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。 碱性磷酸酶偏高的原因可以分为生理性原因和病理性原因，具体讨论如下： 1、生理性原因儿童骨骼发育期、孕妇、骨折愈合期，这些情况下骨组织中的碱性磷酸酶很活跃，所以检测时值会偏高。 2、病理性原因当人体患有阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等时，肝细胞过度制造ALP，经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于胆汁排泄障碍，反流入血，引起血清中的碱性磷酸酶偏高。 3、骨骼有病时，例如佝偻病、骨上肿瘤、软骨病等。 4、其他不是很常见的疾病，例如肾病、严重性贫血、甲状腺机能不全、白血病等。 有何影响 碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查。它主要经淋巴道和肝窦进入血液，同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升高。但由于骨组织中此酶亦很活跃。因此，孕妇、骨折愈合期、骨软化症。佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、肝硬变、白血病、甲状腺机能亢进
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骨代谢生化指标在乳腺癌骨转移中的意义 作者：李淑兰， 李靖若， LI Shu-lan， LI Jing-ruo 作者单位：450052,郑州大学第一附属医院乳腺外科 刊名： 中国实用医刊 英文刊名：Chinese Journal of Practical Medicine 年，卷(期)：2013,40(12) 参考文献(20条) 1.Mundy GR Metastasis to bone:causes,consequences and therapeutic opportunities 2002(08) 2.Chen C An approach to the relevance between variations in hormone secretion and the incidence of hyperplasia of mammary glands and mammary cancer 2004 3.Berruti A;Dogliotti L;Gorzegno G Differential patterns of bone turnover in relation to bone pain and disease extent in bone in cancer patients with skeletal metastases 1999(8pt1) 4.Pratap J;Javed A;Languino LR The Runx2 osteogenic transcription factor regulates matrix metalloproteinase 9 in bone metastatic cancer cells and controls cell invasion[外文期刊] 2005(19) 5.Halleen JM;Alatalo SL;Janckila AJ Tartrate-resistant acid phosphatase 5 b is a specific and sensitive marker of bone resorption[外文期刊] 2003(2A) 6.Halleen JM;Alatalo SL;Suominen H Tartrate-resistant acid phosphatase 5b:a novel serum marker of bone resorption 2000(07) 7.Takahashi S Evaluation of cancer-induced bone diseases by bone metabolic marker 2006(04) 8.章火祥;谢鑫友;于小妹血清工型胶原吡啶交联终肽、骨钙素在肿瘤骨转移中的应用[期刊论文]-国际检验医学杂志 2008(11) 9.Maemura M;Iino Y;Yokoe T Serum concentration of pyridinoline cross-linked carboxyterminal telopeptide of type Ⅰcollagen in patients with metastatic breast cancer 2000(06) 10.Izumi M;Nakanishi Y;Takayama K Diagnostic value of boneturnover metabolites in the diagnosis of bone metastases in patients with lung carcinoma 2001(08) 11.Pectasides D;Farmakis D;Nikolaou M Diagnostic value of bone remodeling markers in the diagnosis of bone metastases in patients with breast cancer[外文期刊] 2005(01) 12.Bricon TL;Cay-Bellile C;Cottu P Lectin affinity electrophoresis of serum alkaline phosphatase in metastasized breast cancer 2010(01) 13.Jukkola A;Bloigu R;Holli K Postoperative PINP in serum reflects metastatic potential and poor survival in node-positive breast cancer[外文期刊] 2001(4B) 14.王抒;张军宁;乔田奎血清Ⅰ型前胶原氨基端前肽、Ⅰ型前胶原羧基端前肽、Ⅰ型胶原羧基端肽在骨转移性癌诊断中的应用[期刊论文]-中国临床医学 2011(18) 15.Tu Q;Zhang J;Fix A Targeted overexpression of BSP in osteoclasts promotes bone metastasis of breast cancer cells [外文期刊] 2009(01) 16.Zhang JH;Tang J;Wang J Over-expression of bone sialoprotein enhances bone metastasis of human breast cancer cells in a mouse model[外文期刊] 2003(04) 17.Gordon JA;Sodek J;Hunter GK Bone sialoprotein stimulates focal adhesion-related signaling pathways:role in migration and survival of breast and prostate cancer cells[外文期刊] 2009(06) 18.Bellahcène A;Bonjean K;Fohr B Bone sialoprotein mediates human endothelial cell attachment and migration and promotes angiogenesis[外文期刊] 2000(08) 19.Tang Y;Nakada MT;Kesavan P Extracelluar mtrix metalloproteinase inducer stimulates tumor angiogenesis by elevating vascular endothelial growth factor and matrix metalloproteinases[外文期刊] 2005(08) 20.Wright LM;Maloney W;Yu X Stromal cell-derived factor-1binding to its chemokine receptor CXCR4 on precursor cells promotes the chemotactic recruitment,development and survival of human osteoclasts[外文期刊] 2005(05)