间充质干细胞在医学中的应用文献综述 学院：生命科学学院 年级：2011 姓名：张胜男
前言:干细胞是具有增殖分化潜能的一种细胞,人体200多种细胞均起源于一个全能干细 胞---受精卵,出生后的机体生存也依赖于不同组织中的干细胞,进行自我更新和损伤修复.追溯到1895年人类第一次临床应用骨髓移植治疗肿瘤疾病,干细胞在临床上的应用已有100多年的历史,间充质干细胞是干细胞家族的重要成员.随着人类技术的发展,人类具备了从成体组织中提取间充质干细胞的能力,并可以在体外进行大量的细胞扩增培养,但是间充质干细胞临床试验研究所面临的基础理论、实验技术、行业法规，法律伦理等问题，使其在真正走向临床应用的道路还很艰难，这条路上还有多少障碍？还有多远？需要的不仅仅是生命科学领域研究人员的努力，也需要相关管理部门同行！ 正文： 1间充质干细胞 间充质干细胞英文缩写MSC，存在于多种组织中。 1.1间充质干细胞的发现过程 间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前, 我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，使用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。 2006年，我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞，这种胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。 鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞, 临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。 最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4~7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC 用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病（GVHD）、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。 然而自体间充质干细胞的应用过程中逐渐暴露了不便之处：例如扩增能力个体差异很大；潜在的肿瘤细胞污染风险；培养需要一定的时间，不能及时适应病情的需要等。这些制约了自体间充质干细胞的使用。间充质干细胞给未来的再生医学带来了新希望, 对间充质干细胞更深入的研究和临床应用必将在不远的将来造福人类。其中，胎盘和脐带来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。 1.2 间充质干细胞的生物学特性 间充质干细胞具有其独特的生物学特性
脐带间充质干细胞治疗技术的临床研究策略 脐带间充质干细胞（UCMSC ）具备药品的“工厂化、规模化、标准化”生产特点，是目前“成药”性最高的成体干细胞（ASC ）之一。UCMSC 还有广泛的生物效应，对各种损伤、退变和炎症性疾病的疗效明确，且具有免疫原性低、异体治疗无免疫排斥反应、临床应用的安全性高、无伦理限制等临床应用优势。UCMSC 的研究与应用受到了国内外研究者的广泛关注，已对其高效制备技术、体内生物学行为、临床疗效与机制及安全性进行了深入研究，解决了临床前关键技术和理论问题，进入了迈向临床验证的最后一公里，即将成为临床疾病治疗的新型“药物”和技术。但如何科学、合理、规范、循序渐进地推进UCMSC 向临床转化，是管理部门和研究者共同面临的问题。笔者在对UCMSC 进行系统性临床前研究的基础上，对UCMSC 治疗系统性损伤和自身免疫性疾病的临床技术及规范进行了探讨。 1 . UCMSC 治疗的临床适应证 UCMSC 制剂可在临床上用于涉及组织细胞损害（变性、坏死、缺失）、自身免疫和炎症反应引起的疾病的治疗，但在同种疾病的不同阶段、不同个体之间，疗效可能不尽相同，其原因在于UCMSC 来源、质量及临床实施方法的差异。根据UCMSC 的生物学特性及疾病治疗机制研究进展，UCMSC 的临床适应证主要有： （1）机械性创伤：包括武器、交通与意外伤害、自然灾害等导致的各种类型的组织器官损伤； （2）退变性疾病：如衰老、器官纤维化、骨质疏松、器官萎缩、动脉硬化等； （3）缺血性疾病：心脑血管意外、血管栓塞等； （4）中毒性疾病：如酒精、食物、药物、毒剂、环境等导致的肝、肾、神经中毒等； （5）自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮，再生障碍性贫血、类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性肝病等； （6）炎症性疾病：慢性炎症、急性系统性炎症综合征等； （7）代谢性疾病：糖尿病、甲状腺功能异常、高血酯症、高血压等； （8）组织残缺性疾病：主要用于组织缺损的局部再生及人工组织构建与移植治疗。 总之，UCMSC 的适应范围很广，可通过多种机制发挥治疗作用，对并发多种疾病的患者有“一药治多病”的效应。
脐带间充质干细胞的研究进展 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC S ）是来源于发育早期中胚层 的一类多能干细胞[1-5]，MSC S 由于它的自我更新和多项分化潜能，而具有巨大的 治疗价值 ,日益受到关注。MSC S 有以下特点：(1)多向分化潜能，在适当的诱导条件下可分化为肌细胞[2]、成骨细胞[3、4]、脂肪细胞、神经细胞[9]、肝细胞[6]、心肌细胞[10]和表皮细胞[11, 12]；(2)通过分泌可溶性因子和转分化促进创面愈合；(3) 免疫调控功能，骨髓源（bone marrow ）MSC S 表达MHC-I类分子，不表达MHC-II 类分子，不表达CD80、CD86、CD40等协同刺激分子，体外抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受[11, 15]，在预防和治疗移植物抗宿主病、诱导器官移植免疫耐受等领域有较好的应用前景；(4)连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程和细胞替代治疗。1974年Friedenstein [16] 首先证明了骨髓中存在MSC S ，以后的研究证明MSC S 不仅存在于骨髓中，也存在 于其他一些组织与器官的间质中：如外周血[17]，脐血[5]，松质骨[1, 18]，脂肪组织[1]，滑膜[18]和脐带。在所有这些来源中，脐血(umbilical cord blood)和脐带(umbilical cord)是MSC S 最理想的来源，因为它们可以通过非侵入性手段容易获 得，并且病毒污染的风险低，还可冷冻保存后行自体移植。然而，脐血MSC的培养成功率不高[19, 23-24]，Shetty 的研究认为只有6%，而脐带MSC的培养成功率可 达100%[25]。另外从脐血中分离MSC S ，就浪费了其中的造血干/祖细胞(hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells,HSCs/HPCs) [26, 27]，因此，脐带MSC S (umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC S )就成 为重要来源。 一．概述 人脐带约40 g, 它的长度约60–65 cm, 足月脐带的平均直径约1.5 cm[28, 29]。脐带被覆着鳞状上皮，叫脐带上皮，是单层或复层结构，这层上皮由羊膜延续过来[30, 31]。脐带的内部是两根动脉和一根静脉，血管之间是粘液样的结缔组织，叫做沃顿胶质，充当血管外膜的功能。脐带中无毛细血管和淋巴系统。沃顿胶质的网状系统是糖蛋白微纤维和胶原纤维。沃顿胶质中最多的葡萄糖胺聚糖是透明质酸，它是包绕在成纤维样细胞和胶原纤维周围的并维持脐带形状的水合凝胶，使脐带免受挤压。沃顿胶质的基质细胞是成纤维样细胞[32]，这种中间丝蛋白表达于间充质来源的细胞如成纤维细胞的，而不表达于平滑肌细胞。共表达波形蛋白和索蛋白提示这些细胞本质上肌纤维母细胞。 脐带基质细胞也是一种具有多能干细胞特点的细胞，具有多项分化潜能，其 形态和生物学特点与骨髓源性MSC S 相似[5, 20, 21, 38, 46]，但脐带MSC S 更原始，是介 于成体干细胞和胚胎干细胞之间的一种干细胞，表达Oct-4, Sox-2和Nanog等多
间充质干细胞治疗小脑萎缩（山东干细胞网） 遗传性小脑共济失调，即遗传性小脑萎缩，是一组以共济运动障碍为突出表现的慢性进行性小脑变性疾病，发病年龄多在33—34岁，病情进行性加重。发病机理目前并不清楚，病变主要累及小脑，但脊髓、颅神经、基底节、脑干、大脑皮质等也可受累。遗传方式为常染色体显性遗传，因此，如果有本病家族史的人尽量不要生育。 患者：宋某，男性，40岁，患有遗传性小脑共济失调，即遗传性小脑萎缩。其具有明显的家族遗传性，其外公、姨、母亲、两个哥哥均患有该病。 入院时，患者口齿不清，行走经常跌倒 ，双手动作笨拙，症状逐渐加重，并出现双下肢无力，下蹲后不能自行站起。后经间充质干细胞移植成功治疗，基本恢复正常的生活。 目前采用的治疗方法是给予体外培养扩增的间充质干细注射，每周1次，共4次为一个疗程，同时给予系统功能锻炼。 干细胞治疗后在这位患者出院的时候，已经能行走稳健，未再出现跌倒情况，口齿清楚。后来，这位患者的两位哥哥也来做间充质干细胞治疗，恢复的效果也不错。 干细胞治疗重度颅脑外伤后遗症期 患者，男性，35岁。诊断：重度颅脑外伤后遗症期 重度颅脑外伤术后言语及肢体活动障碍8个月，拟行神经外科行颅骨修补和干细胞移植治疗。 干细胞移植治疗前： 四肢肌张力均高，以左侧为著，右上肢、右下肢活动较灵活，左侧肢体处于肌紧张状态，疼痛刺激后有屈曲。 影像学检查：双侧大脑见多发片状低密度区，CT值10-15Hu，边尚清。左侧侧脑室后部与左脑内低密度区贯通，脑内见引流管影。脑室系统略扩张，右侧脑室后角增大明显。右侧颅骨见巨大缺损区，左侧颅骨呈术后状态。[印象]双侧大脑多发软化灶、脑积水分流术后。 干细胞移植治疗后效果： 颅骨修补并干细胞脑内移植治疗后4天，患者左侧上肢肌张力明显降低，第二次干细胞移植后，次日患者左上肢肌张力进一步降低，左下肢肌力增强，达三级，屈伸自如(之前在强刺激下能才在水平面屈曲)。该患者再经过一阶段锻炼，有望下地行走。
脐带间充质干细胞治疗再生障碍性贫血的护理 发表时间：2015-02-02T16:09:14.103Z 来源：《医药界》2014年11月第11期供稿作者：黄颉[导读] 。患者的病情能够有一定程度的改善，表现为输血间隔时间延长，出血症状明显好转，感染有所减轻等. 黄颉（上海市交通大学附属第一人民医院南院８Ｂ血液科上海２０００００）【中图分类号】Ｒ５５６．５【文献标识码】Ａ【文章编号】１５５０－１８６８（２０１４）１１【摘要】再生障碍性贫血（ａｐｌａｓｔｉｃａｎｅｍｉａ，ＡＡ）是由于物理、化学、生物或不明因素作用使骨髓造血干细胞和骨髓微环境严重受损，造成骨髓造血功能低下或衰竭，以全血细胞减少为主要表现的一组综合征。间充质细胞（ＭＳＣ）是属于中胚层的多能干细胞，不仅具有多向分化潜能，还有多种免疫调节作用，尤其是脐带ＭＳＣ（ＵＣ－ＭＳＣ）具有独特的优势成为干细胞治疗ＡＡ的 新热点。本文是为了探讨此项新治疗方法的护理。 【关键词】脐带；间充质干细胞；再生障碍性贫血；护理１．概述目前普遍认为，ＡＡ是一种主要由于Ｔ淋巴细胞免疫紊乱介导的获得性骨髓造血功能衰竭症，其发生、发展与Ｔ细胞功能亢进引起的造血微环境与造血干细胞的免疫损伤密切相关［２］基于此，目前免疫抑制治疗和造血干细胞移植已成为ＡＡ的主要治疗方法，大大改善了本病的预后。但免疫抑制治疗疗程较长，复发率高，副作用较大，有的抑制剂价格昂贵；异基因造血干细胞移植可望彻底治愈ＡＡ，但同样费用高、移植相关风险高，干细胞来源有限。目前免疫抑制治疗无效、不适合移植或不能耐受相关副作用的ＡＡ患者的治疗仍然是个棘手的问题。 ＭＳＣ是一类起源于中胚层的成体干细胞，除具备自我更新及多向分化潜能外，还有很强的免疫调节及支持造血双重作用。众多实验研究证实，ＭＳＣ可以通过多种途径发挥免疫调节及支持造血作用，应用于异基因造血干细胞移植，能有效治疗移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）和促进造血重建，这些均提示，ＭＳＣ在ＡＡ患者的细胞治疗中可能发挥重要作用。 ２．案例本例患者为男性，１４岁，于２０１２年１２月在无明显诱因下出现头晕乏力，牙龈出血，全身散在瘀点瘀斑，当地医院行骨髓穿刺后确诊为再生障碍性贫血。 予以输血、止血治疗后予以环孢素（ＣＳＡ）１５０ｍｇ／ｄ治疗，治疗中血常规ＷＢＣ（２－３）×１０９／Ｌ，ＨＢ５０－８８ｇ／Ｌ，ＰＬＴ（１０－７０）×１０９／Ｌ。２０１３年３月因症状反复加重予以强的松６０ｍｇ／ｄ治疗效果不佳，ＰＬＴ长期＜１０×１０９／Ｌ，期间平均每周输少浆血４００ｍｌ，单采血小板１个单位。由于无合适的异基因造血干细胞移植配对故考虑进行脐带间充质细胞治疗。患者分别于２０１３年５月和２０１３年６月两次输注脐带间充质共计８０ｍｌ。输注２个月后复查血象均有所上升ＷＢＣ５．１×１０９／Ｌ，ＨＢ８６ｇ／Ｌ，ＰＬＴ３０×１０９／Ｌ。２０１３年８月至今输血频率大大下降，患者目前仍予随访中，病情稳定。 ３．护理３．１输注中的护理３．１．１病情观察输注过程中密切监测生命体征和一般情况特别是血压及心率的变化。输注过程予以心电监护２小时，该患者输注时出现血压骤升，立即予以速尿２０ｍｇ静脉推注，甘露醇１００ｍｌ静脉快滴后症状有所缓解。输注过程中，患者若出现寒战、发热、恶心、呕吐、气促、心悸等不适，立即停止输注，按输血反应处理。 ３．１．２输注的技巧间充质细胞在送至病房后应立即输予患者，注意控制输入速度，应快速输注一般在２０—３０ｍｉｎ输完。由于间充质干细胞体外易贴壁生长的特性，输注前摇晃细胞悬液．输注中需每３ｍｉｎ摇晃细胞悬液及轻弹输血器管路，防止干细胞贴壁。输注前后生理盐水冲洗输液管道。输注时应暂停所有补液，不得与其他药物一同输注。 ３．２心理护理由于目前ＵＣ－ＭＳＣ在临床应用较少，患者对ＵＣ－ＭＳＣ知识也了解甚少，加上其在对治疗有效的强烈期盼和实施过程的过分担心使之产生了异常的复杂心理。因此，我们在护理上应充分讲解ＵＣ－ＭＳＣ的特性、来源、培养、传代、冻存和目前临床应用效果，在使用前充分预防可能发生的不良反应，通过以上心理护理，患者依从性好，积极配合治疗。 ３．３并发症的预防及处理３．３．１感染向患者做好宣教，严格注意感染的预防，如：定时使用漱口水防止口腔溃疡的发生，晚上睡觉前使用金霉素眼膏涂鼻腔保护鼻腔黏膜，使用信立妥眼药水滴眼防止眼睛干涩及感染。告知患者勤洗手，注意保持大便通畅，便后睡前使用痔疾洗液坐浴预防肛周感染，食物应选择干净、清淡饮食，防止腹泻的发生。同时要做好患者静脉穿刺点（如ＰＩＣＣ、深静脉穿刺、ＰＯＲＴ等）消毒护理，严格执行无菌操作防止穿刺点的感染。保持病室环境整洁，定时通风。限制探视人数及次数，避免到人多的地方，避免与有呼吸道感染的人接触，必要时戴口罩。 ３．３．２出血密切观察患者皮肤黏膜情况，观察有无瘀点瘀斑。观察患者呕吐物、尿液及粪便的色、质、量，如有立即异常留取标本送检。密切观察患者有无头痛、喷射性呕吐、视物模糊等颅内出血症状。做好患者相关宣教，如嘱患者要剪去指甲，不得用手挖鼻防止鼻出血，不要用力排便，血小板底下时要卧床休息，下床时要有人搀扶。如有头痛、视物模糊时立即告诉医护人员采取相应措施。 ４．小结ＵＣ－ＭＡＣ可促进造血重建，使造血功能得到有效、稳定的恢复，暂无明显不良反应。患者的病情能够有一定程度的改善，表现为输血间隔时间延长，出血症状明显好转，感染有所减轻等。其费用比骨髓移植少是再障患者较经济、理想的治疗方法之一。但该方法目前仍处于起步阶段，并没有大量开展于临床，相信在不久的将来便会用于造福广大患者，护理在其中起到了关键的作用，护士应做好观察及护理来提高该病种治疗的成功率。 参考文献［１］叶红高，陆再英．内科学［Ｍ］．第６版．北京：人民卫生出版社，２００４：７８７［２］ＹｏｕｎｇＮＳ，ＳｃｈｅｉｎｂｅｒｇＰ，ＣａｌａｄｏＲＴ．Ａｐｌａｓｔｉｃａｎｅｍｉａ［Ｊ］．ＣｕｒｔＯｐｉｎＨｅｍａｔｏｌ，２００８，１５（３）：１６２－１６８
文章编号(Article ID):1009-2137(2005)01-0158-06?综述?间充质干细胞在免疫治疗中的应用 廖联明,韩钦,赵春华 中国医学科学院基础医学研究所,北京,100730 摘要 近年来对间充质干细胞的研究越来越多,对于间充质干细胞的自我更新和体外扩增的能力及其多向分化的潜能已经被广泛认识。同时,间充质干细胞还具备低免疫原性以及免疫调节活性,使其非常适合用于细胞治疗。目前对间充质干细胞发挥免疫调节的作用机制还不完全了解。本文综述了间充质干细胞免疫调节机制的研究现状及其在免疫治疗中的应用前景。 关键词 间充质干细胞;免疫调节;免疫耐受 中图分类号 R39214;R730.51文献标识码 A Application of Mesenchymal Stem Cell in Immunotherapy———Review L IA O L ian2M i ng,HA N Qi n,ZHA O Chun2Hua Instit nte of Basic Medical Sciences,Chi nese Academy of Medical Sciences,Beiji ng100730,Chi na Abstract There has been an increasing interest in recent years on mesenchymal stem cell(MSC).It is well known that MSCs are capable of self2renewal and differentiating into many cell lineages.MSC can be expended to a large quantity that is required for clinical trans plantation.Recent studies show that MSC have potential application in immune diseases due to their unique immunologic characteristics,such as low immunogenicity and immunoregulatory function.But their immunoregulatory mechanism is not yet clear.This review discusses the advances in researches on the mechanism of MSCs′immunoregulatory function and potential clinical application in immune disease and organ transplantation. K ey w ords Mesenchymal stem cell;immune regulation;immune tolerance J Ex p Hem atol2005;13(1):158-163 免疫抑制剂在器官移植和自身免疫性疾病的临床治疗中起着举足轻重的作用。但是,免疫抑制剂的副作用,包括免疫抑制引起的感染、肿瘤发生率增加等,也一直困扰着临床医生。在器官移植中,诱导受者对异基因移植物的特异性免疫耐受,减少、甚至完全不用免疫抑制剂,一直是免疫学家和临床医生的一个梦想。这是理论上解决异基因移植排斥,骨髓移植中移植物抗宿主病等临床问题的最佳方案。 在器官或组织移植中,稳定嵌合与特异性耐受诱导密切相关1。已有报道,骨髓干细胞移植后在受者体内可检测到稳定的造血系嵌合,并能诱导对供者的特异性耐受2-4。但骨髓移植前预处理的毒性、移植失败的风险和移植后出现的急、慢性移植物抗宿主病等问题,使骨髓移植仍然局限于恶性肿瘤或严重免疫系统疾病的患者,不适合用于特异性免疫耐受的诱导。最近报道,在未作任何预处理的大鼠中,胚胎样干细胞移植后在其体内可建立造血嵌合,并能诱导对随后相同供者来源的心脏移植物的特异耐受5。这一发现对寻找理想的免疫耐受诱导方法的研究者是一个很大的鼓舞。但是,胚胎干细胞存在众所周知的伦理问题和导致胚胎瘤的潜在危险。因此,在器官移植特异性耐受诱导方面,除了骨髓干细胞和胚胎干细胞以外,寻找一个新的细胞群体是非常必需的。最近,我们以及其他实验室都观察到骨髓源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有免疫调节活性。在小鼠6和灵长类动物7中,输注MSC可以延长异基因皮肤移植物的存活。在造血系统恶性肿瘤患者接受骨髓干细胞移植的同时输注供者来源的MSC,观察到MSC移植组的移植物抗宿主病(GV HD)发生率明显低于未移植MSC组8。另一研究小组也报道了相近的实验结果9。虽然结果还只是初步的,但为MSC的免疫调节特性提供了直接的证据。目前,MSC对免疫系统影响还并不十分清楚,它们潜在的临床应用价值,包括诱导异基因移植物耐受和免疫调节作用,还有待于进一步的研究。 通讯作者:赵春华,教授,博士,组织工程中心主任.电话:(086)22-27210060.传真:(086)22-27210060.E2mail:chunhuaz@public. https://www.doczj.com/doc/b68431290.html, 2003-11-26收稿;2004-09-01接受 ? 8 5 1 ?中国实验血液学杂志 Journal of Ex perimental Hem atology2005;13(1):158-163
间充质干细胞药物开发策略 干细胞药物开发的目的是，从“一对一”的个体化干细胞临床应用转向“一对多”的临床治疗方案，为临床提供标准化的干细胞制品。药物的开发需要遵循常规药物开发的流程，包括：药学研究、非临床研究、临床试验申请、早期临床试验、确证性临床试验、新药申请和批准上市等过程。 1干细胞制剂开发要点概述 干细胞制剂药学研究，主要包括工艺开发与质量评价： ①干细胞库与工作细胞库建立： 供者筛查、组织采集，细胞分离、纯化、培养、保藏、鉴别、效力检测，以及生物学特性、遗传学稳定性研究，干细胞库技术标准及工作标准建立； ②干细胞制剂工艺开发与药学研究： 大规模细胞扩增、细胞制备工艺、剂型选择、包装选择、处方筛选、制剂冻存/复苏工艺，体外操作对干细胞生物学特性的影响，过程质量控制，干细胞药物放行标准建立； ③干细胞制剂冷链运输和稳定性研究： 产品冻存与复苏、冷链运输技术、临床快速检验、稳定性研究等，稳定性研究包括冻存条件下制剂影响因素试验、长期试验，模拟临床应用条件的试验等，通过这些实验获得的药品稳定性信息来确定药物的储存运输条件、包装以及有效期。 干细胞制剂开发原则 干细胞制剂开发过程服从GMP原则，但应充分考虑活的药物与传统药物区别： ①供者细胞的合理性及筛查； ②生产材料应考虑，供者细胞、生产过程细胞分类分级管理，生产用原材料的风险评估， 外源因子去除，限制动物及人来源材料，基因修饰/改造按高风险管控，辅料使用考虑必要性、安全性和合理性； ③制备工艺与过程控制应证明可行性与稳健性，生产工艺的设计（QbD）应避免细胞发生 非预期的或异常的变化，全过程监控、持续改进，用连续自动化、全封闭手段减少污染； ④强调过程控制与制品放行互补，高风险操作评估，细胞制剂与回输制剂转换验证； ⑤质量研究取代表批次及生产阶段细胞的特性、功能性、纯度和安全性等分析； ⑥质量控制基于过程理解，兼顾认知，逐步完善，确证性与商业化保持一致； ⑦临床质量核准，方法验证与药典适用性验证，快速微量方法相互验证； ⑧稳定性研究应采取连续工艺，适用包装密封性研究、冷冻储存适应性研究等，运输条件，
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910216830.0 (22)申请日 2019.03.21 (71)申请人 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公 司 地址 510000 广东省广州市开发区广州国 际生物岛螺旋四路一号生产区第五层 502单元 (72)发明人 陈海佳 葛啸虎 王小燕 杨祖婷 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 温可睿 赵青朵 (51)Int.Cl. A01N 1/02(2006.01) A61K 35/28(2015.01) A61P 19/02(2006.01) A61P 19/08(2006.01) (54)发明名称 冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的 应用 (57)摘要 本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及冻存 液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用。 本发明提供的组合物，能够显著性的提高脐带间充质 干细胞在冻存条件下的活性，而以其制得的干细 胞制剂，具有良好的成骨分化、成软骨分化的潜 能，从而能够具有良好的修复软骨损伤的作用， 从而起到治疗骨关节炎的效果。权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 110050780 A 2019.07.26 C N 110050780 A
1.一种冻存液， 其由如下体积份的液体组成： 2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于， 由如下体积份的液体组成； 3.根据权利要求1或2所述的冻存液，其特征在于， 所述人血白蛋白注射液中人血白蛋白的质量分数为20％； 所述葡萄糖注射液中葡萄糖的质量分数为5％； 所述羟乙基淀粉注射液中羟乙基淀粉的质量分数为6％。 4.权利要求1～3任一项所述的冻存液在脐带间充质干细胞冻存中的应用。 5.一种脐带间充质干细胞冻存方法，其特征在于，以权利要求1～3任一项所述的冻存液重悬脐带间充质干细胞。 6.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，所述重悬至细胞密度为5×107cells/mL。 7.权利要求1～3任一项所述的冻存液在制备干细胞制剂中的应用。 8.一种干细胞制剂，其包括：脐带间充质干细胞和权利要求1～3任一项所述的冻存液。 9.根据权利要求8所述的干细胞制剂，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的密度为5×107cells/mL。 10.权利要求7～9任一项所述的干细胞制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。 权 利 要 求 书1/1页2CN 110050780 A
544 中国医药生物技术2018年12月第13卷第6期Chin Med Biotechnol, December 2018, V ol. 13, No. 6 DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.011· 综述·间充质干细胞临床前安全性研究概况 张澄，霍艳，黄瑛，高阳，侯田田，肖亚妮，汪巨峰 间充质干细胞（MSC）于1974 年被第一次定义，而后在20 世纪90 年代得到推广[1]。2006 年，细胞疗法国际协会针对细胞表面阳性标志物为MSC 建立了一个最低标准，即CD90+、CD105+、CD73+、CD45–、CD34–、CD14–、CD79–、HLA–、DR–[2]。最初的临床试验中，MSC 主要是用于成骨不全[3]或黏多糖症的研究。近年来研究表明，MSC 也具备促血管生成、免疫调节、抗炎、营养支持等生物活性，这为其用于缺血性、炎性疾病等方面的治疗提供了可能性[4]。另外MSC 在实验中易于获得、可在体外大量扩增及有多系分化潜能的性质也表明其可成为组织工程的一个强有力工具[5]。 1 治疗机制及研究进展 临床前研究表明，MSC 一般通过自身分化、营养支持、免疫调节等机制发挥治疗作用[6]。间充质干细胞可由一系列组织分离得到，同时在一定条件下可分化成不同的祖细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及造血支持基质细胞，这些细胞进一步可分化为心肌细胞、神经细胞等。同时，MSC 可通过自分泌或旁分泌途径释放细胞因子，这些活性物质可定向聚集于特定部位起到抑制细胞凋亡、纤维化，促进血管生成或缓解炎性反应等作用[7]。另外，MSC 在体内可通过免疫调节来调节机体的免疫系统，借此治疗一些炎性疾病。最新研究表明，干细胞可能并没有免疫豁免的机制，其可能是通过免疫逃逸机制来实现相关治疗作用的[8]。 MSC 虽然在很多领域展现出极大潜力，但现今的研究仍面临很多挑战。临床试验虽然正在大力进行，但数据仍较为缺乏。临床前研究中，动物模型、干细胞来源、体外培养条件的优化选择目前都没有一个明确的规定。不同来源的人源干细胞分泌的细胞因子、分化方向也有很大差异。 2 安全风险因素 由于细胞自身生物学或实验操作等各种因素，干细胞在应用于临床或基础实验的过程中存在一定安全风险，主要可分为内源性风险、外源性风险及其他生物风险。 内源性风险主要包括：①干细胞肿瘤形成相关风险。干细胞具有不断增殖、对凋亡诱导不敏感等与肿瘤细胞相似的生长调控机制。有研究表明，胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）可引发良性或恶性的畸胎瘤，同时有研究表明高代次的鼠源MSC 可自发恶性转化。干细胞也可能影响体内已存在的肿瘤细胞的生长和扩增，即干细胞的“促瘤性”[9]。②干细胞免疫学相关风险。实验中需要考虑细胞的免疫原性和免疫调节性质带来的生物学风险。ESC 未分化前的免疫原性很低，但在分化后由于MHC 分子的表达可表现出较高的免疫原性。同时体外实验表明，ESC 和MSC 可通过调控T 细胞、单核细胞及NK 细胞等的增殖分化来调节生物免疫能力。③干细胞由于自身携带的传染性疾病、未知或罕见的病原体、遗传性疾病等而产生的风险。外源性风险主要包括：细菌、真菌、支原体及病毒污染[10]，一般来自于实验操作、细胞库污染和动物基质细胞污染等方面[11]。与内源性风险相比，外源性风险污染途径多，防控更为复杂。 另外由于干细胞的体内归巢和分化机制仍不明确[12]，干细胞进入机体内可能存在非靶向部位转移、目标以外的分化或去分化等风险。同时当大剂量的细胞被注射进入体内，可能阻塞在注射区域，严重的可导致注射区域组织坏死等情况。 3 临床前安全性研究概况 MSC 临床前安全评价一般分为两部分：一般毒性评价和干细胞特定安全评价。一般毒性评价包括行为观察、临床症状、血液生化测定、死亡率、组织病理检查等。干细胞特定安全评价包括致瘤性、生物分布等。其中一般毒性评价和一般生物制品的评价方式相似。另外目前针对干细胞特定的安全评价也已有一定的研究，但仍缺乏专门针对干细胞评价的相关文件规范进行指导。 干细胞安全评价实验设计中需考虑动物模型、给药途径、实验周期等相关因素。①动物模型：考虑到异种排斥，建议选择免疫缺陷或免疫抑制类动物，如NOD/SCID 小鼠、nu/nu 小鼠等，但也需考虑到该类动物寿命较短（12 ~ 18 个月），且可能产生自发肿瘤影响实验结果[13]。同时也有研究选择食蟹猴、狒狒等非人灵长类动物，这类动物模型存在数据采集困难、需进行免疫抑制操作等缺点。②给药途径：尽量和临床保持一致，实验中采用的给药途径主要有静脉注射、皮下注射和肌肉注射等方式。③实验周期：依据实验目的和动物种类的不同，需制定不同的实验周期。免疫缺陷的啮齿类动物的实验周期自8 d ~ 8 个月不等，但需考虑到超过 6 个月时动物可能产生自发性肿瘤，影响实 基金项目：国家重点研发计划课题（2016YFA0101503）；中国食品药品检定研究院学科带头人培养基金（2015X1）；“重大新药创制”国家科技重大专项（2015ZX09501007-004） 作者单位：100176 北京，中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心/药物非临床安全评价研究北京市重点实验室 通信作者：霍艳，Email：yanhuo@https://www.doczj.com/doc/b68431290.html, 收稿日期：2018-05-24
脐带间充质干细胞概述 医学实验班70080103 王雪彤 脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构,其外被羊膜,内含2条脐动脉、1条脐静脉,在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织———华尔通氏胶(Whartonps Jelly) ,从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 。 1人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的形貌分析: 倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长, 为形态相对均一的梭形细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长,低密度时较扁平, 密度增加趋于融合时细胞变细长。扫描电镜下观察呈长条状纤维样, 细胞膜表面不光滑, 有小结节状物, 细胞无明显突起,细胞间无网络状连接。透射电镜观察核大, 不规则, 核仁明显, 常染色质多, 异染色质少, 胞浆少。胞质内细胞器较少, 以粗面内质网和线粒体为主, 内有大量游离核糖体, 部分细胞可见内质网肿胀。 ——植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(×200) 例如三代细胞的形态学特征——人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1，2；并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3；细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。 图1图
2图3 图4 2人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的生物学特性： HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞,是别于两者之间的一类新的多能间充质细胞,它们之间既有联系又有差异。根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会( the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the Internation2 al Society for Cellular Therapy)制定的最低标准, 脐带间充质干细胞（MSCs）需满足以下条件: 1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长; 2 )MSCs表达CD105, CD73和CD90,不表达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA2DR; 3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。和其他来源的 MSCs一样HUMSCs呈长条梭形贴壁生长,表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44 及HLA2ABC ,不表达CD34、CD45、CD31等造血干细胞标记或CD33、CD14、CD56及HLA2DR、2DA、2DP、2DQ ,体外诱导培养能向多种成体细胞分化。比照这些条件,表明华尔通氏胶来源的间质细胞具有MSCs特性。HUMSCs还表达原始干细胞标记,如白血病抑制因子受体通路、胚胎干细胞特异基因Ⅰ及端粒逆转录酶及Nanog、STAT3、AP、Oct24、BMP4、PAX6、ADAM12、Nestin、HLA2Ⅰ。另外, HUMSCs低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40 和CD40 l等。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制,并抑制T细胞的增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性,表明其为一类免疫缺陷细胞,异基因移植不会发生免疫排斥反应。 3脐带间充质干细胞(UMSCs)的移植治疗作用: 骨髓MSCs用于改善心、脑功能的机制主要在于其分泌SDF一1和VEGF 等局部细胞因子, 诱导微血管的生成, 改善缺血组织微环境。UMSCs表达SDF 一1和VEGF, 提示了UMSCs治疗心脑梗塞、脊髓损伤的可能。 1)UMSCs对脑损伤的治疗作用 外源性UMSCs对脑组织的修复机理可能涉及到诱导内源性VEGF表达, 局部微血管增生, 抑制细胞凋亡等。利用液压冲击脑损伤模型, 证明
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 间充质干细胞临床研究进展 间充质干细胞临床研究进展自 1867 年德国病理学家Cohnheim 在研究伤口愈合过程时，首次提出成纤维细胞可能来源于骨髓，即骨髓可能含有非造血干细胞的观点。 1869年，Goujon 发现自体红骨髓异位移植后具有成骨作用，也证实了骨髓具有成骨能力。 但直到 1976 年，Friedenstein 和 Petrakova 首先报道，通过帖壁培养的方法分离得到间充质干细胞（MSCs）。 1987 年，Friedenstein 等将骨髓放置在塑料培养皿中培养，发现骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，由于能分化为多种中胚层来源的间充质细胞，因此被称之为间充质干细胞。 1991 年 Caplan 把骨髓中具有黏附于塑料培养皿表面、在体外能高度扩增、并可多向分化的细胞群命名为骨髓间充质干细胞。 1999 年，Pittenger 等在《Science》（科学）杂志上发表文章，对从骨髓标本中分离得到 MSC，应用流式细胞分析术分析 MSC，结果表明分离的细胞群体表型单一，在体外不同分化条件诱导下，可以形成成骨细胞、成软骨细胞或脂肪细胞，而且克隆化得到的细胞具有类似的分化特性，这充分证明骨髓基质中的间充质干细胞是多能干细胞。 一系列的研究已经证明 MSC 可以分化为神经、心脏、肝脏、 1 / 4
以往，新生儿出生后的脐带一直被人们视作废弃物。近些年，随着科技的进步和医学知识的普及，已有不少人知道从脐带血中提取脐带血造血干细胞可用于血液系统疾病的治疗，而提取血液后的脐带同样被当作医疗废弃物处理掉。 其实，脐带组织中蕴含丰富的干细胞资源，其中间充质干细胞最为丰富，间充质干细胞是一种具有奇特功能的干细胞，被认为最具临床应用价值，除了支持造血功能之外，还可用于心血管疾病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑及脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病及自身免疫性疾病等的治疗，并在美容、保健、抗衰老等方面显示了巨大的应用潜力。从脐带组织中提取的间充质细胞均一性好、活性强、免疫原性低，扩增数量巨大，可供多次使用，是理想的间充质干细胞来源。 孩子出生时是唯一一次获取高质量、高纯度的间充质干细胞的机会，储存脐带间充质干细胞，给孩子和家人一份健康保障！ 储存干细胞能够帮助您什么？ 治疗疾病，拯救生命 宝宝出生时的脐带（过去通常被废弃）中存在造血干细胞和间充质干细胞，可以拯救生命。干细胞能够治疗的重大疾病很多，如白血病、糖尿病、肝硬化、心脑血管疾病、进行性肌营养不良、系统性硬化症等等，到目前为止，干细胞已经可以治疗近100种疾病。 储存健康，有备无患 相当于成人脊髓或脂肪中的干细胞，脐带干细胞更纯洁、更健康、更容易采集。将脐带干细胞储存，是对生命健康的一大保障。脐带干细胞是在宝宝出生时采集，机会只有一次。 宝宝储存，全家可用 脐带间充质干细胞（存在于脐带中的一种干细胞），是一类免疫原性比较低的细胞，家庭成员也可以使用。间充质干细胞数量多，可扩展（使数量增多），满足全家的需要 自体储存，安全放心 自体储存的脐带间充质干细胞具有完美的组织相容性，不需配型，移植后细胞更容易存活，用自己的干细胞治疗更安全，更可靠。 健康投资，性价比高 干细胞是非常昂贵的，国外一份干细胞的价格要1.5—2万美元，国内的也价格不菲，如果使用自己的干细胞治病或保健，会节约大量的费用。 随着科技的发展脐带间充质干细胞作用会越来越广泛。现阶段在美容和抗衰老方面也都取得重要进展。
干细胞临床试验研究管理办法 干细胞临床试验研究管理办法（试行） （征求意见稿） 第一章总则 第一条为保证干细胞临床试验研究过程规范，结果科学可靠，保护受试者的权益并保障其安全，根据《中华人民共和国药品管理法》、《医疗机构管理条例》和《药物临床试验质量管理规范》等相关法律法规，制定本办法。 第二条本办法所指干细胞是一类具有不同分化潜能，并在非分化状态下自我更新的细胞。干细胞临床试验研究，是指在临床前研究基础上，应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后回输（或植入）人体，用于疾病预防和治疗的临床试验研究。这种体外操作包括干细胞在体外的分离、纯化、培养、扩增、修饰、干细胞（系）的建立、诱导分化、冻存及冻存后的复苏等过程。用于干细胞治疗的干细胞主要包括成体干细胞、胚胎干细胞以及诱导的多能性干细胞。成体干细胞包括自体或异体、胎儿或成人不同分化组织，以及发育相伴随的组织（如脐带、羊膜、胎盘等）来源的造血干细胞、间充质干细胞、各种类型的祖细胞或前体细胞等。 第三条干细胞临床试验研究必须具备充分的科学依据，其预防和治疗疾病的预期优于现有的手段，或用于尚无有效干预措施的疾病，优先考虑威胁生命和严重影响生存质量的重大疾病，以及重大医疗卫生需求。第四条干细胞临床试验研究必须在干细胞临床研究基地进行，干细胞临床试验研究基地由卫生部和国家食品药品监督管理局组织进行遴选和确定。 第五条干细胞临床试验研究基地（法人单位）是干细胞临床试验研究的责任主体。申报单位对干细胞制剂质量及相关研究活动负责。 第六条干细胞临床试验研究应当按照《药物临床试验质量管理规范》要求，遵守以下原则： （一）符合临床试验研究伦理原则，保护受试者、捐献者生命健康权益； （二）符合技术安全性、有效性原则，即风险最小化； （三）符合干细胞制剂质量要求的原则； （四）认真履行有效知情同意的原则； （五）有益于促进公众健康的原则； （六）干细胞临床试验研究透明化原则； （七）保护个人隐私的原则。 第七条开展干细胞临床试验研究，不得向受试者收取费用，不得市场化运作,不得发布干细胞治疗广告。第八条在中华人民共和国境内从事干细胞临床试验研究，包括境外机构以合作或投资等形式在中国开展的干细胞临床试验研究，必须遵守本办法。 本办法不包括已有规定的造血干细胞移植和以产品注册为目的的临床试验。 中国干细胞研究机构或人员在境外以合作或投资形式开展干细胞临床试验研究，应当遵守当地政府制定的相关法律法规。 第二章申报与备案
疾病解析 “疾”，一个病字框，里面是一个“有的放矢”的“矢”。这个“矢”就是“射箭”的“箭”。它告诉你，那些从外而来侵害你身体的东西，就像一个人朝你放的冷箭，比如，感冒、风寒、传染病这些外来因素引起的不适就叫“疾”。 再看这个“病”字怎么写?“病”字里面是一个“丙”。在中国文化当中，“丙”是火的意思。在五脏器官里，丙又代表心。所以，“丙火”又可以叫“心火”。心里感到不适有火，人就得病了，就这么简单。 免疫细胞 免疫细胞是白细胞的俗称，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等，也特指能识别抗原，产生特异性免疫应答的淋巴细胞，淋巴细胞是免疫系统的基本成分。 CIK(cytokine-induced killer，中文名：[自体细胞免疫疗法]多种细胞因子诱导的杀伤细胞)，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3 单克隆抗体，IL-2 和IFN-γ 等)，共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案，CIK细胞中的效应细胞CD3+和CD56+细胞在正常人外周血中叫少，仅1%-5%。 干细胞 干细胞在2018年得到了“两会”的关注，表示：“干细胞是人类最重要的生命资源，谁拥有资源谁就拥有未来”，干细胞就像是生命的种子，是一种可以自我更新和再生的多功能细胞而且干细胞对多种疾病的干预治疗效果显著，也被医学称为“万能细胞”，干细胞治疗与以下的9种疾病到底有什么关系? 改善和预防糖尿病 干细胞治疗糖尿病的原理主要是将提取的干细胞进行体外分离、纯化、扩增后输注到患者体内。干细胞在胰腺组织微环境的诱导下分化增殖为胰岛细胞，替代受损的胰岛β细胞，分泌胰岛素，从而达到改善糖尿病的作用。 改善和预防“三高” 干细胞治疗中能提高机体应对各种脂蛋白的代谢功能;能有效降低血糖中低胆固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白浓度;能显著提高机体糖代谢功能，有效降低血糖水平;能提高机体能量的供给和消耗平衡功能，具有减少血脂、降低血糖等功效，对原发性高血压、高血糖、高血脂有明显的治疗效果。 改善脑功能衰退 人体的大脑是支配整个人体的司令部，脑功能衰退会出现记忆力减退，思维敏捷度下降，严重者会患上老年痴呆，因为随着年龄的增长凋亡和衰老的脑细胞越来越多，导致大脑衰退，而干细胞可通过诱导分化成脑细胞的干细胞，可取代衰老凋亡的脑细胞，改善记忆力，提高思维能力，有效地防止老年痴呆症的发生。 改善心脏功能衰退 心脏是我们人体最重要的器官，随着年龄的增长加上外界环境的影响，容易出现心肌梗塞，研究表明，通过定向诱导分化的干细胞，能再生梗死的心脏细胞，会让心脏重新充满活力。 改善肝功能衰退 肝脏是人体解毒的重要器官，现如今随着科技的发展，经常熬夜或者加班，不良的生活习惯容易造成肝功能早衰。干细胞治疗肝硬化，一方面能根据周围微环境分化成新的肝脏功能细胞;一方面能“催醒”自身肝脏细胞“再生”;另一方面通过干细胞分泌的各种细胞因子，修复和营养受损的细胞。 改善免疫系统衰退