文章编号(Article ID):1009-2137(2005)01-0158-06?综述?间充质干细胞在免疫治疗中的应用
廖联明,韩钦,赵春华
中国医学科学院基础医学研究所,北京,100730
摘要 近年来对间充质干细胞的研究越来越多,对于间充质干细胞的自我更新和体外扩增的能力及其多向分化的潜能已经被广泛认识。同时,间充质干细胞还具备低免疫原性以及免疫调节活性,使其非常适合用于细胞治疗。目前对间充质干细胞发挥免疫调节的作用机制还不完全了解。本文综述了间充质干细胞免疫调节机制的研究现状及其在免疫治疗中的应用前景。
关键词 间充质干细胞;免疫调节;免疫耐受
中图分类号 R39214;R730.51文献标识码 A
Application of Mesenchymal Stem Cell in Immunotherapy———Review
L IA O L ian2M i ng,HA N Qi n,ZHA O Chun2Hua
Instit nte of Basic Medical Sciences,Chi nese Academy of Medical Sciences,Beiji ng100730,Chi na
Abstract There has been an increasing interest in recent years on mesenchymal stem cell(MSC).It is well known that MSCs are capable of self2renewal and differentiating into many cell lineages.MSC can be expended to a large quantity that is required for clinical trans plantation.Recent studies show that MSC have potential application in immune diseases due to their unique immunologic characteristics,such as low immunogenicity and immunoregulatory function.But their immunoregulatory mechanism is not yet clear.This review discusses the advances in researches on the mechanism of MSCs′immunoregulatory function and potential clinical application in immune disease and organ transplantation.
K ey w ords Mesenchymal stem cell;immune regulation;immune tolerance
J Ex p Hem atol2005;13(1):158-163
免疫抑制剂在器官移植和自身免疫性疾病的临床治疗中起着举足轻重的作用。但是,免疫抑制剂的副作用,包括免疫抑制引起的感染、肿瘤发生率增加等,也一直困扰着临床医生。在器官移植中,诱导受者对异基因移植物的特异性免疫耐受,减少、甚至完全不用免疫抑制剂,一直是免疫学家和临床医生的一个梦想。这是理论上解决异基因移植排斥,骨髓移植中移植物抗宿主病等临床问题的最佳方案。
在器官或组织移植中,稳定嵌合与特异性耐受诱导密切相关1。已有报道,骨髓干细胞移植后在受者体内可检测到稳定的造血系嵌合,并能诱导对供者的特异性耐受2-4。但骨髓移植前预处理的毒性、移植失败的风险和移植后出现的急、慢性移植物抗宿主病等问题,使骨髓移植仍然局限于恶性肿瘤或严重免疫系统疾病的患者,不适合用于特异性免疫耐受的诱导。最近报道,在未作任何预处理的大鼠中,胚胎样干细胞移植后在其体内可建立造血嵌合,并能诱导对随后相同供者来源的心脏移植物的特异耐受5。这一发现对寻找理想的免疫耐受诱导方法的研究者是一个很大的鼓舞。但是,胚胎干细胞存在众所周知的伦理问题和导致胚胎瘤的潜在危险。因此,在器官移植特异性耐受诱导方面,除了骨髓干细胞和胚胎干细胞以外,寻找一个新的细胞群体是非常必需的。最近,我们以及其他实验室都观察到骨髓源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有免疫调节活性。在小鼠6和灵长类动物7中,输注MSC可以延长异基因皮肤移植物的存活。在造血系统恶性肿瘤患者接受骨髓干细胞移植的同时输注供者来源的MSC,观察到MSC移植组的移植物抗宿主病(GV HD)发生率明显低于未移植MSC组8。另一研究小组也报道了相近的实验结果9。虽然结果还只是初步的,但为MSC的免疫调节特性提供了直接的证据。目前,MSC对免疫系统影响还并不十分清楚,它们潜在的临床应用价值,包括诱导异基因移植物耐受和免疫调节作用,还有待于进一步的研究。
通讯作者:赵春华,教授,博士,组织工程中心主任.电话:(086)22-27210060.传真:(086)22-27210060.E2mail:chunhuaz@public. https://www.doczj.com/doc/a38791937.html,
2003-11-26收稿;2004-09-01接受
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MSC的生物学特征
MSC是存在于骨髓中的多潜能干细胞,它在适宜的信号刺激下能够诱导分化成不同的骨髓微环境的组成成分,如骨,脂肪,造血和基质细胞10-13。MSC 能够分泌许多造血因子,包括M2CSF,IL26,IL27, IL28,IL211,IL212,IL214,IL215和白血病抑制因子(L IF),支持造血祖细胞的生长12,14。目前,已经从不同的物种中分离出MSC,它在骨髓中的比例非常低,仅占单个核细胞的104到105分之一。大部分报道的MSC是骨髓来源的,也有报道MSC 是从肌肉15、胰腺16、真皮17、脂肪组织18、肺脏19、肝脏20和脐血21中分离得到的。在单个核细胞中,MSC的分离依赖于它的贴壁能力。MSC 不表达造血细胞的表面标志,包括CD34,CD45, G ly A及T和B细胞表面标志。对于MSC在组织中的确切表型,即培养前的细胞表型,仍然存在争议。Simmoms等22报道了针对骨髓MSC的第一个抗体,Stro21。最近,比较公认的培养的MSC的表型为:SH2+,SH3+和SH4+11。MSC还表达许多黏附分子,其中参与T细胞相互作用的包括VCAM21,ICAM21和L FA23。此外,MSC不表达MHC II分子和FasL,不表达或极低水平表达MHC I分子,也不表达B721,B722,CD40, CD40L12。在我们实验室已经建立了稳定的MSC 的培养体系,包括不同组织来源,如骨髓、胰腺、皮肤和肺脏源的MSC的培养,以及不同物种不同发育阶段,如小鼠、人胎儿和成人来源的MSC的培养。不同组织来源的胎儿MSC的表型非常相似,如CD34,MHCⅠ,MHCⅡ分子不表达;CD44和CD29高表达;CD13低表达。MSC的一些典型的表面标志见附表12。
MSC通过多种机制发挥它的免疫调节功能
MSC通过直接接触和分泌细胞因子抑制T细胞的增殖
骨髓MSC在适宜的条件下可以分化成骨髓微环境的不同组分,它与胸腺基质细胞在表型和功能上有部分相似,提示MSC可能在骨髓微环境的免疫调节作用中起着重要作用。目前对于MSC和免疫系统的关系并不十分清楚,但已有一些证据显示MSC 通过不同的机制调节免疫系统。T able Phenotypic characterization of human MSC Common name CD locus Detection
Adhesion molecules
ALCAM CD166Positive
ICAM21 CD54Positive
ICAM22 CD102Positive
ICAM23 CD50Positive
E2selectin CD62E Negative
L2selectin CD62L Positive
P2selectin CD62P Negative
L FA23 CD58Positive Cadherin5 CD144Negative PECAM21 CD31Negative NCAM CD56Positive HCAM CD44Positive VCAM CD106Positive Hyaluronate receptor CD44Positive Integrins
VLA2α1 CD49a Positive
VLA2α2 CD49b Positive
VLA2α3 CD49c Positive
VLA2α4 CD49d Negative
VLA2α5 CD49e Positive
VLA2α6 CD49f Positive
VLA2βchain CD29Positive
β4integrin CD104Positive
L FA21αchain CD11a Negative
L FA21βchain CD18Negative Vitronectin Rαchain CD51Negative Vitronectin Rβchain CD61Positive
CR4αchain CD11c Negative Mac1 CD11b Negative Additional markers
T6 CD1a Negative
CD3complex CD3Negative
T4,T8 CD4,CD8Negative Tetraspan CD9Positive
L PS receptor CD14Negative Lewis X CD15Negative
- CD34Negative Leukocyte common antigen CD45Negative 5′terminal nucleotidase CD73Positive
B721 CD80Negative HB215 CD83Negative
B722 CD86Negative Thy21 CD90Positive Endoglin CD105Pos
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间充质干细胞在免疫治疗中的应用
在体外,MSC能够抑制淋巴细胞的增殖和一些细胞因子的分泌。在混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,ML R)的初始或第3天,加入狒狒的MSC,能够抑制进行中的异基因ML R,使得增殖活性下降50%以上7。抑制效应随着MSC 数量的增加而逐渐加大,加入外源性IL22后可以降低这种抑制效应。MSC对增殖反应的抑制作用并不依赖于MSC的来源,MSC不论是否与刺激细胞、效应细胞来源相同或是第三者来源的细胞,都能发挥抑制作用。狒狒的MSC还能够抑制T细胞丝裂源ConA、PHA或IL22诱导的T细胞增殖反应23。MSC的这种抑制作用,并不是通过诱导T 细胞发生凋亡起作用的,因为这些增殖受到抑制的T细胞在受到再次刺激时仍能增殖。同时MSC对CD4+和CD8+T细胞也有显著的抑制作用24。Tse 等25在对MSC的免疫原性和抗原呈递能力的研究中发现MSC不能刺激异基因外周血单个核细胞或T淋巴细胞的增殖,在提供CD28介导的共刺激信号或是用IFNγ进行预处理后,MSC仍然不能有效地呈递抗原和诱导异基因T细胞增殖。此外MSC 还能够抑制抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激的T 细胞增殖反应,但是对美洲商陆刺激的细胞增殖几乎没有抑制作用。上述的抑制效应的强度与MSC 的剂量有关。Krampera等26采用小鼠雄性移植抗原H Y激发免疫反应的方法,研究MSC对静息和记忆性T细胞对同源抗原反应的影响。把用雄性细胞免疫后的C57BLΠ6雌性小鼠作为记忆性T细胞的来源,而H Y特异性TCR转基因C57BLΠ6小鼠作为静息T细胞的来源。在雄性脾细胞或H Y肽刺激T细胞下,MSC剂量依赖性地抑制针对H Y 的静息T细胞和记忆性T细胞的增殖、细胞毒反应,以及产生γ2IFN的T细胞的数量。实验还发现,MHC分子,抗原呈递细胞或者是CD4+CD25+调节性T细胞对MSC发挥这种抑制效应都不是必需的。以上资料说明在体外实验中,无论是同基因的还是异基因的MSC都能够强有力的抑制淋巴细胞的增殖反应,包括细胞和非特异性丝裂源刺激的T细胞增殖反应。
在观察到上述MSC的抑制淋巴细胞增殖效应后,许多实验室对这种抑制作用的可能作用机制进行了广泛的研究。除了细胞间的直接接触外,还证实了MSC可能通过产生可溶性因子发挥抑制效应。用Transwell系统将MSC与效应细胞分离后, T淋巴细胞的增殖反应仍然受到了显著的抑制。通过抗体中和实验,证实了TGF2β1和HGF介导了MSC的抑制效应:在加了骨髓基质细胞的ML R中同时加入抗rh TGF2β1和抗rhHGF抗体,T细胞的增殖反应得到一定程度的恢复23。陈健琳等24报道MSC能够分泌TGF2β1,但不分泌IL24和IFNγ。Tse等25也证实了用半透膜分离MSC和外周血单个核细胞后,抑制效应仍然存在,同时这种抑制效应并不能单纯的通过MSC分泌TGF2β或者IL210来解释24。但是也有一些实验室报道的结果与上述的实验结果不同,如有报道在Transwell系统中,或者用MSC的培养上清替代MSC,这种抑制增殖的效应就消失了26,27。这些不同的实验结果可能与采用不同动物来源的刺激细胞或效应细胞有关。
MSC在宿主体内存活并诱导免疫耐受
从MSC的表型可以看出,它不表达MHC II分子和FasL,不表达或极低水平表达MHC I分子,也不表达共刺激分子B721、B722、CD40、CD40L。这提示这类细胞很难被免疫系统识别,因此输注到异基因宿主体内后,MSC可能能够逃避宿主的免疫监视系统,在宿主体内长期存活。同时MSC表达多种不同的黏附分子,能使它们容易迁移并存留在不同的组织中。如将经过基因修饰的MSC移植到同基因和异基因的宿主体内9到21个月后,检测到MSC 在多个组织器官中分布,其中包括胃肠道、肾脏、皮肤、肺脏、胸腺及肝脏28。在没有经过预处理的受者体内,同样观察到MSC的多组织分布,只是在细胞数量上明显减少。我们实验室在最近的研究中也观察到,将异基因小鼠的MSC移植到致死量照射的受者小鼠体内,30天后观察到供者来源的MSC 在多个脏器中广泛分布29。这些发现提示MSC具有多器官归巢能力和可塑性30-33。还有研究报道将MSC直接注射到啮齿动物的大脑后观察到MSC 在大脑内迁移,并能分化成胶质细胞群。当纯化的成人骨髓来源MSC注射到CB17SCIDΠbeige成年小鼠的左心室后,有限的移植细胞存活了下来,并在一段时间后观察到它们的形态与周围的心肌细胞类似。进一步组化实验显示,移植的MSC在宿主体内开始表达心肌细胞特异蛋白31。在另一个异种移植模型中,将C57BLΠ6小鼠来源的骨髓基质细胞移植到有免疫功能的Lewis大鼠体内,1星期以后,结扎受者大鼠的冠状动脉并在结扎后的不同时间点观察移植细胞的情况。至少到移植后13周,在受者大鼠的骨髓腔内还可以观察到标记的小鼠来源细胞。在心脏,一些标记的细胞显示心肌细胞特异性蛋白染色阳性,同时参与了梗塞部位的血管形成。
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这些骨髓基质细胞能够在异种环境中植活,并具有向损伤的心肌部位转移和形成心肌细胞的能力32。类似的报道还有人的MSC能够在胎羊内长期植活,在细胞移植后13个月仍检测到人来源的细胞在受者体内的多脏器分布及组织特异性的分化成软骨细胞,脂肪细胞,肌细胞,心肌细胞,骨髓基质细胞和胸腺基质细胞33。在怀孕75天后,胎羊已经发育到有了免疫能力,这一点可以从该阶段给胎羊移植异基因皮肤移植物产生排斥反应34,同种异基因或异种骨髓移植失败35的实验结果得到有力的证实。但是出人意料的是,人MSC仍然能在孕龄超过75天的胎羊体内长期植活。以上实验结果均显示MSC具有独特的免疫学特征,使它们能在同种异基因,甚至异种的环境中长期存活,并且在移植后MSC能够仍然保持着它的多向分化的潜能。
由于移植的MSC在受者体内能广泛分布和存活,因此可能诱导对同一供者来源的组织器官的耐受。在狒狒中进行的移植实验观察到MSC移植确实可以延长异基因皮肤移植物的存活时间,对照组的存活时间平均为7天,而MSC移植组的存活时间延长到11.3天7。在小鼠异基因移植模型中,我们观察到在异基因MSC移植后,供者来源的异基因皮肤移植物移植成功,并且存活时间超过100天,未观察到任何排斥反应6。但是,到目前为止,对于MSC具有免疫调节能力的机制还不十分清楚。一些实验发现提示我们MSC可能通过中枢途径发挥免疫调节作用。移植后的MSC能够迁移到胸腺,在那里发挥它们的免疫调节功能。最早Li等37报道供者来源的骨髓基质细胞能够迁移到胸腺并参与T细胞的阳性选择。此外,体外实验中也观察到骨髓来源的MSC能够为体外培养中的早期T细胞提供黏附的支架,为胸腺前体细胞的增殖提供适宜的刺激38。此外MSC在体外能够分泌TGF2β1, TGF2β1是IL22和IL24诱导的T细胞增殖的抑制剂39242。TGF2β1在体外还能明显抑制三阴性胸腺细胞(CD3-CD4-CD8-)的增殖41。因此,迁移到胸腺的MSC可能通过分泌TGF2β1抑制T细胞的增殖。基质细胞系统还可能通过提供必需的黏附位点在T淋巴细胞早期成熟中起作用。小鼠的胸腺细胞铺到骨髓基质培养上显示出不同的黏附敏感性43。60%以上的双阴性T细胞(CD4-CD8-)在培养过程中始终黏附在基质细胞上,相对应的双阳性T细胞只有22%是黏附的,而没有单阳性(CD4+或CD8+)细胞显示明显的黏附,提示了骨髓基质可能作为T细胞胸腺外成熟的部位43。此外,在胸腺基质培养诱导T细胞分化的实验中,还可以观察到不成熟N K细胞的优势扩增44。由于MSC与胸腺基质细胞在表型和功能上的相似性,MSC可能与保持淋巴细胞的不成熟状态有关。
MSC应用研究
目前已经认识到MSC具有调节免疫系统的功能,在诱导移植耐受和治疗自身免疫性疾病中存在广泛的应用前景。异基因骨髓移植已经证实在治疗自身免疫病中有切实的疗效。比如在ML RΠlpr狼疮鼠实验中,在骨髓移植前先去除贴壁的细胞,有75%移植组小鼠在90天内死亡。若将去除了贴壁细胞后的骨髓细胞,再辅以基质细胞,移植组小鼠可存活48周,并且自身免疫病有了好转45。这些实验结果显示MSC调节T,B细胞的功能。
有病例报道,1个患有高危急性粒细胞白血病的20岁女性患者经清髓处理后成功接受了她父亲HLA不匹配的外周血CD34+造血干细胞以及骨髓来源MSC,并没有出现急、慢性GV HD。移植后31个月也没有观察到白血病复发46。此外,在造血组织恶性肿瘤患者,在接受造血干细胞移植的同时移植供者MSC的患者发生急、慢性GV HD的发病率显著低于没有进行MSC共移植的患者8。另一个异基因骨髓移植实验的初步结果也得到了类似的结果9。
结论和展望
我们已经观察MSC能够成功地移植入具有免疫能力的异基因或异种的宿主体内,而产生这一现象的机制可能是多因素的。体外扩增的MSC广泛用于减轻异基因移植的移植前处理、降低GV HD、促进移植物存活以及造血干祖细胞增殖,其中包括移植失败率较高的HLA不匹配的挛生子及HLA匹配的非亲缘供者的骨髓或脐血移植中的应用。MSC 在体外能够传40代,数量扩增104倍,并且仍然保持稳定的表型和它的多向分化的潜能,这一点非常适合临床移植应用。此外,MSC不表达异基因抗原,在发挥它的免疫调节作用时也不受MHC的限制,因此MSC来源可以不受限制,不需要考虑供者的MHC配型。但是目前的问题还是在于没有明确的证据能够证实与临床相关的MSC介导T细胞抑制作用。它对免疫系统的影响机制以及直接的免疫调节疗效也还不明确,这些都有待于进一步研究。
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间充质干细胞在免疫治疗中的应用
参考文献
1Wekerle T,Sykes M.Mixed chimerism and transplantation tole2 rance.Annu Rev Med,2001;52:353-370
2Sayegh MH,Fine NA,Smith JL,et al.Immunologic tolerance to renal allografts after bone marrow transplants from the same do2 nors.Ann Intern Med,1991;114:954-955
3Helg C,Chapuis B,Bolle J F,et al.Renal transplantation without immunosuppression in a host with tolerance induced by allogeneic bone marrow transplantation.Transplantation,1994;58:1420-1422
4Sorof J M,K oerper MA,Portale AA,et al.Renal transplantation without chronic immunosuppression after T cell2depleted,HLA2mi2 smatched bone marrow transplantation.Transplantation,1995;
59:1633-1635
5Fandrich F,Lin X,Chai GX,et al.Preimplantation2stage stem cells induce long2term allogeneic graft acceptance without supple2 mentary host conditioning.Nat Med,2002;8:171-178
6Han Q,Deng W,Zhao RC,et al.Allogeneic adult stem cells es2 tablish long2term residence in recipient tissues and facilitate skin transplantation.Exp Hematol,2003;31:158
7Bartholomew A,Sturgeon C,Siatskas M,et al.Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation i n vit ro and prolong skin graft survival i n vivo.Exp Hematol,2002;30:42-48
8Frassoni FLM,Bacigalupo A,G luckman E.Expanded mesen2 chymal stem cells(MSC),coinfused with HLA identical hemopoi2 etic stem cell transplants,reduce acute and chronic graft versus host disease:a matched pair analysis.Bone Marrow Transplant,2002;
29:75
9Lazarus H,Curtin P,Devine S.Role of mesenchymal stem cells in allogeneic transplantation:early phase1clincial results.Blood, 2000;96:392
10Fridenstein A.Stromal bone marrow cells and the hematopoietic mi2 croenvironment.Arkh Patol,1982;41:3-11
11Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage poten2 tial of adult human mesenchymal stem cells.Science,1999;284: 143-147
12Deans RJ,Moseley AB.Mesenchymal stem cells:biology and po2 tential clinical uses.Exp Hematol,2000;28:875-884
13Guo H,Fang B,Liao L,et al.Hemangioblastic characteristics of fetal bone marrow2derived Flk1+CD31-CD34-cells.Exp Hema2 tol,2003,31:650-658
14Deans RJ.Mesenchymal stem cells:cell and gene therapy applica2 tions.Eur Cytokine Networks,2000;11:323-324
15Asakura A,K omaki M,Rudnicki M.Muscle satellite cells are mul2 tipotential stem cells that exhibit myogenic,osteogenic,and adipo2 genic differentiation.Differentiation,2001;68:245-253
16Hu Y,Liao L,Wang Q,et al.Isolation and identification of mes2 enchymal stem cells from human fetal pancreas.J Lab Clin Med, 2003;141:342-34917Y oung HE,Steele TA,Bray RA,et al.Human reserve pluripo2 tent mesenchymal stem cells are present in the connective tissues of skeletal muscle and dermis derived from fetal,adult,and geriatric donors.Anat Rec,2001;264:51-62
18Zuk PA,Zhu M,Mizuno H,et al.Multilineage cells from human adipose tissue:implications for cell2based therapies.Tissue Eng, 2001;7:211-228
19Noort WA,Kruisselbrink AB,in′t Anker PS,et al.Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord blood2de2 rived CD34+cells in NODΠSCID mice.Exp Hematol,2002;30: 870-878
20呼莹,张丽艳,赵春华等.胎儿骨髓和肝脏间充质干细胞的表型和生物学性状研究.中国实验血液学杂志,2001;9:289-293
21Erices A,Conget P,Minguell JJ.Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood.Br J Haematol,2000;109:235-242
22Simons PG,Torok2Storb B.Identification pf stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody STRO21.
Blood,1991;78:55-62
23Di Nicola M,Carlo2Stella C,Magni M,et al.Human bone mar2 row stromal cells suppress T2lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli.Blood,2002;99:3838-3843
24陈健琳,郭子宽,徐晨等.间充质干细胞分泌TGF2β1抑制异体T细胞反应性.中国实验血液学杂志,2002;10:285-288
25Tse WT,Pendleton JD,Beyer WM,et al.Suppression of alloge2 neic T2cell proliferation by human marrow stromal cells:implica2 tions in transplantation.Transplantation,2003;75:389-397
26Krampera M,G lennie S,Dyson J,et al.Bone marrow mesen2 chymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen2 specific T cells to their cognate peptide.Blood,2003;101:3722-3729
27Le Blanc K,Tammik L,Sundberg B,et al.Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex.
Scand J Immunol,2003;57:11-20
28何津,张毅,江小霞等.人骨髓间充质干细胞对脐血T淋巴细胞转化的影响.中国实验血液学杂志,2003;11:11-14
29Deng W,Han Q,Zhao RC,et al.Long2term Distribution of Adult Stem Cells in Different Tissues after Transplantation.Stem Cell and Cellular Therapy,2003;1:62-65
30Devine SM,Cobbs C,Jennings M.Mesenchymal stem cells distrib2 ute to a wide range of tissues following systemic infusion into nonhu2 man primates.Blood,2003;101:2999-3001
31Azizi SA,Stokes D,Augelli BJ,et al.Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albi2 no rats2similarities to astrocyte grafts.Proc Natl Acad Sci USA, 1998;95:3908-3913
32Toma C,Pittenger MF,Cahill KS,et al.Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart.Circulation,2002;105:93-98
?
2
6
1
?中国实验血液学杂志 J Ex p Hem atol2005;13(1)
33Saito T,Kuang J Q,Bittira B,et al.Xenotransplant cardiac chime2 ra:immune tolerance of adult stem cells.Ann Thorac Surg,2002;
74:19-24
34Liechty KW,Mac K enzie TC,Shaaban AF,et al.Human mesen2 chymal stem cells engraft and demonstrate site2specific differentia2 tion after in utero transplantation in sheep.Nat Med,2000;6: 1282-1286
35Silverstein AM,Prendergast RA,Kraner K L.Fetal response to an2 tigenic stimulusⅣ.Rejection of skin homografts by the fetal lamb.
J Exp Med,1964;119:955-964
36Zanjani ED,Almeida2Porada G,Ascensao JL,et al.Transplanta2 tion of hematopoietic stem cells in utero.Stem cells,1997;15 (Suppl):79-92
37Li Y,Hisha H,Inaba M,et al.Evidence for migration of donor bone marrow stromal cells into recipient thymus after bone marrow transplantation plus bone grafts:a role of stromal cells in positive se2 lection.Exp Hematol,2000;28:950-960
38Barda2Saad M,Rozenszajn LA,Ashush H,et al.Adhesion mole2 cules involved in the interactions between early T cells and mesen2 chymal bone marrow stromal cells.Exp Hematol,1999;27:834-844
39Ruegemer JJ,Ho SN,Augustine JA,et al.Regulatory effects of transforming growth factor2βon IL222and IL242dependent T cell cycle progression.J Immunol,1990;144:1769-1776
40Ahuja SS,Paliogianni F,Y arnada H,et al.Effect of transforming growth factor2βon early and late activation events in human T cells.
J Immunol,1993;150:3109-3118
41Fox FE,Ford HC,Douglas R,et al.Evidence that TGF2βcan in2 hibit T2lymphocyte proliferation through paracrine and autocrine mechanisms.Cell lmmunol,1993;150:45-58
42Mossalayi MD,Mentz F,Ouaaz F,et al.Early human thymocyte proliferation is regulated by an externally controlled autocrine trans2 forming growth factor2β1mechanism.Blood,1995;85:3594-3601
43Barda2Saad M,Rozenszajn LA,G loberson A,et al.Selective ad2 hesion of immature thymocytes to bone marrowstromal cells:rele2 vance to T cell lymphopoiesis.Exp Hematol,1996;4:386-391
44Sarun S,Dalloul AH,Laurent C,et al.Human CD34+thymocyte maturation:pre2T and N K cell differentiation on neonatal thymic stromal cell culture.Cell Immunol,1998;190:23-32
45Ishida T,Inaba M,Hisha H,et al.Requirement of donor2derived stromal cells in the bone marrow for successful allogeneic bone mar2 row https://www.doczj.com/doc/a38791937.html,plete prevention of recurrence of autoim2 mune diseases in MRLΠMP2IprΠIpr mice by transplantation of bone marrow plus bones(stromal cells)from the same donor.J Immu2 nol,1994;152:3119-3127
46Lee ST,Jang J H,Cheong J W,et al.Treatment of high2risk acute myelogenous leukaemia by myeloablative chemoradiotherapy fol2 lowed by co2infusion of T cell2depleted haematopoietic stem cells and culture2expanded marrow mesenchymal stem cells from a related do2 nor with one fully mismatched human leucocyte antigen haplotype.
Br J Haematol,2002;118:1128-1131
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6
1
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间充质干细胞在免疫治疗中的应用
间充质干细胞在医学中的应用文献综述 学院：生命科学学院 年级：2011 姓名：张胜男
前言:干细胞是具有增殖分化潜能的一种细胞,人体200多种细胞均起源于一个全能干细 胞---受精卵,出生后的机体生存也依赖于不同组织中的干细胞,进行自我更新和损伤修复.追溯到1895年人类第一次临床应用骨髓移植治疗肿瘤疾病,干细胞在临床上的应用已有100多年的历史,间充质干细胞是干细胞家族的重要成员.随着人类技术的发展,人类具备了从成体组织中提取间充质干细胞的能力,并可以在体外进行大量的细胞扩增培养,但是间充质干细胞临床试验研究所面临的基础理论、实验技术、行业法规，法律伦理等问题，使其在真正走向临床应用的道路还很艰难，这条路上还有多少障碍？还有多远？需要的不仅仅是生命科学领域研究人员的努力，也需要相关管理部门同行！ 正文： 1间充质干细胞 间充质干细胞英文缩写MSC，存在于多种组织中。 1.1间充质干细胞的发现过程 间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前, 我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，使用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。 2006年，我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞，这种胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。 鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞, 临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。 最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4~7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC 用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病（GVHD）、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。 然而自体间充质干细胞的应用过程中逐渐暴露了不便之处：例如扩增能力个体差异很大；潜在的肿瘤细胞污染风险；培养需要一定的时间，不能及时适应病情的需要等。这些制约了自体间充质干细胞的使用。间充质干细胞给未来的再生医学带来了新希望, 对间充质干细胞更深入的研究和临床应用必将在不远的将来造福人类。其中，胎盘和脐带来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。 1.2 间充质干细胞的生物学特性 间充质干细胞具有其独特的生物学特性
脐带间充质干细胞治疗技术的临床研究策略 脐带间充质干细胞（UCMSC ）具备药品的“工厂化、规模化、标准化”生产特点，是目前“成药”性最高的成体干细胞（ASC ）之一。UCMSC 还有广泛的生物效应，对各种损伤、退变和炎症性疾病的疗效明确，且具有免疫原性低、异体治疗无免疫排斥反应、临床应用的安全性高、无伦理限制等临床应用优势。UCMSC 的研究与应用受到了国内外研究者的广泛关注，已对其高效制备技术、体内生物学行为、临床疗效与机制及安全性进行了深入研究，解决了临床前关键技术和理论问题，进入了迈向临床验证的最后一公里，即将成为临床疾病治疗的新型“药物”和技术。但如何科学、合理、规范、循序渐进地推进UCMSC 向临床转化，是管理部门和研究者共同面临的问题。笔者在对UCMSC 进行系统性临床前研究的基础上，对UCMSC 治疗系统性损伤和自身免疫性疾病的临床技术及规范进行了探讨。 1 . UCMSC 治疗的临床适应证 UCMSC 制剂可在临床上用于涉及组织细胞损害（变性、坏死、缺失）、自身免疫和炎症反应引起的疾病的治疗，但在同种疾病的不同阶段、不同个体之间，疗效可能不尽相同，其原因在于UCMSC 来源、质量及临床实施方法的差异。根据UCMSC 的生物学特性及疾病治疗机制研究进展，UCMSC 的临床适应证主要有： （1）机械性创伤：包括武器、交通与意外伤害、自然灾害等导致的各种类型的组织器官损伤； （2）退变性疾病：如衰老、器官纤维化、骨质疏松、器官萎缩、动脉硬化等； （3）缺血性疾病：心脑血管意外、血管栓塞等； （4）中毒性疾病：如酒精、食物、药物、毒剂、环境等导致的肝、肾、神经中毒等； （5）自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮，再生障碍性贫血、类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性肝病等； （6）炎症性疾病：慢性炎症、急性系统性炎症综合征等； （7）代谢性疾病：糖尿病、甲状腺功能异常、高血酯症、高血压等； （8）组织残缺性疾病：主要用于组织缺损的局部再生及人工组织构建与移植治疗。 总之，UCMSC 的适应范围很广，可通过多种机制发挥治疗作用，对并发多种疾病的患者有“一药治多病”的效应。
脐带间充质干细胞的研究进展 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC S ）是来源于发育早期中胚层 的一类多能干细胞[1-5]，MSC S 由于它的自我更新和多项分化潜能，而具有巨大的 治疗价值 ,日益受到关注。MSC S 有以下特点：(1)多向分化潜能，在适当的诱导条件下可分化为肌细胞[2]、成骨细胞[3、4]、脂肪细胞、神经细胞[9]、肝细胞[6]、心肌细胞[10]和表皮细胞[11, 12]；(2)通过分泌可溶性因子和转分化促进创面愈合；(3) 免疫调控功能，骨髓源（bone marrow ）MSC S 表达MHC-I类分子，不表达MHC-II 类分子，不表达CD80、CD86、CD40等协同刺激分子，体外抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受[11, 15]，在预防和治疗移植物抗宿主病、诱导器官移植免疫耐受等领域有较好的应用前景；(4)连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程和细胞替代治疗。1974年Friedenstein [16] 首先证明了骨髓中存在MSC S ，以后的研究证明MSC S 不仅存在于骨髓中，也存在 于其他一些组织与器官的间质中：如外周血[17]，脐血[5]，松质骨[1, 18]，脂肪组织[1]，滑膜[18]和脐带。在所有这些来源中，脐血(umbilical cord blood)和脐带(umbilical cord)是MSC S 最理想的来源，因为它们可以通过非侵入性手段容易获 得，并且病毒污染的风险低，还可冷冻保存后行自体移植。然而，脐血MSC的培养成功率不高[19, 23-24]，Shetty 的研究认为只有6%，而脐带MSC的培养成功率可 达100%[25]。另外从脐血中分离MSC S ，就浪费了其中的造血干/祖细胞(hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells,HSCs/HPCs) [26, 27]，因此，脐带MSC S (umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC S )就成 为重要来源。 一．概述 人脐带约40 g, 它的长度约60–65 cm, 足月脐带的平均直径约1.5 cm[28, 29]。脐带被覆着鳞状上皮，叫脐带上皮，是单层或复层结构，这层上皮由羊膜延续过来[30, 31]。脐带的内部是两根动脉和一根静脉，血管之间是粘液样的结缔组织，叫做沃顿胶质，充当血管外膜的功能。脐带中无毛细血管和淋巴系统。沃顿胶质的网状系统是糖蛋白微纤维和胶原纤维。沃顿胶质中最多的葡萄糖胺聚糖是透明质酸，它是包绕在成纤维样细胞和胶原纤维周围的并维持脐带形状的水合凝胶，使脐带免受挤压。沃顿胶质的基质细胞是成纤维样细胞[32]，这种中间丝蛋白表达于间充质来源的细胞如成纤维细胞的，而不表达于平滑肌细胞。共表达波形蛋白和索蛋白提示这些细胞本质上肌纤维母细胞。 脐带基质细胞也是一种具有多能干细胞特点的细胞，具有多项分化潜能，其 形态和生物学特点与骨髓源性MSC S 相似[5, 20, 21, 38, 46]，但脐带MSC S 更原始，是介 于成体干细胞和胚胎干细胞之间的一种干细胞，表达Oct-4, Sox-2和Nanog等多
间充质干细胞治疗小脑萎缩（山东干细胞网） 遗传性小脑共济失调，即遗传性小脑萎缩，是一组以共济运动障碍为突出表现的慢性进行性小脑变性疾病，发病年龄多在33—34岁，病情进行性加重。发病机理目前并不清楚，病变主要累及小脑，但脊髓、颅神经、基底节、脑干、大脑皮质等也可受累。遗传方式为常染色体显性遗传，因此，如果有本病家族史的人尽量不要生育。 患者：宋某，男性，40岁，患有遗传性小脑共济失调，即遗传性小脑萎缩。其具有明显的家族遗传性，其外公、姨、母亲、两个哥哥均患有该病。 入院时，患者口齿不清，行走经常跌倒 ，双手动作笨拙，症状逐渐加重，并出现双下肢无力，下蹲后不能自行站起。后经间充质干细胞移植成功治疗，基本恢复正常的生活。 目前采用的治疗方法是给予体外培养扩增的间充质干细注射，每周1次，共4次为一个疗程，同时给予系统功能锻炼。 干细胞治疗后在这位患者出院的时候，已经能行走稳健，未再出现跌倒情况，口齿清楚。后来，这位患者的两位哥哥也来做间充质干细胞治疗，恢复的效果也不错。 干细胞治疗重度颅脑外伤后遗症期 患者，男性，35岁。诊断：重度颅脑外伤后遗症期 重度颅脑外伤术后言语及肢体活动障碍8个月，拟行神经外科行颅骨修补和干细胞移植治疗。 干细胞移植治疗前： 四肢肌张力均高，以左侧为著，右上肢、右下肢活动较灵活，左侧肢体处于肌紧张状态，疼痛刺激后有屈曲。 影像学检查：双侧大脑见多发片状低密度区，CT值10-15Hu，边尚清。左侧侧脑室后部与左脑内低密度区贯通，脑内见引流管影。脑室系统略扩张，右侧脑室后角增大明显。右侧颅骨见巨大缺损区，左侧颅骨呈术后状态。[印象]双侧大脑多发软化灶、脑积水分流术后。 干细胞移植治疗后效果： 颅骨修补并干细胞脑内移植治疗后4天，患者左侧上肢肌张力明显降低，第二次干细胞移植后，次日患者左上肢肌张力进一步降低，左下肢肌力增强，达三级，屈伸自如(之前在强刺激下能才在水平面屈曲)。该患者再经过一阶段锻炼，有望下地行走。
脐带间充质干细胞概述 医学实验班70080103 王雪彤 脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构,其外被羊膜,内含2条脐动脉、1条脐静脉,在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织———华尔通氏胶(Whartonps Jelly) ,从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 。 1人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的形貌分析: 倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长, 为形态相对均一的梭形细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长,低密度时较扁平, 密度增加趋于融合时细胞变细长。扫描电镜下观察呈长条状纤维样, 细胞膜表面不光滑, 有小结节状物, 细胞无明显突起,细胞间无网络状连接。透射电镜观察核大, 不规则, 核仁明显, 常染色质多, 异染色质少, 胞浆少。胞质内细胞器较少, 以粗面内质网和线粒体为主, 内有大量游离核糖体, 部分细胞可见内质网肿胀。 ——植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(×200) 例如三代细胞的形态学特征——人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1，2；并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3；细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。 图1图
2图3 图4 2人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的生物学特性： HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞,是别于两者之间的一类新的多能间充质细胞,它们之间既有联系又有差异。根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会( the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the Internation2 al Society for Cellular Therapy)制定的最低标准, 脐带间充质干细胞（MSCs）需满足以下条件: 1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长; 2 )MSCs表达CD105, CD73和CD90,不表达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA2DR; 3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。和其他来源的 MSCs一样HUMSCs呈长条梭形贴壁生长,表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44 及HLA2ABC ,不表达CD34、CD45、CD31等造血干细胞标记或CD33、CD14、CD56及HLA2DR、2DA、2DP、2DQ ,体外诱导培养能向多种成体细胞分化。比照这些条件,表明华尔通氏胶来源的间质细胞具有MSCs特性。HUMSCs还表达原始干细胞标记,如白血病抑制因子受体通路、胚胎干细胞特异基因Ⅰ及端粒逆转录酶及Nanog、STAT3、AP、Oct24、BMP4、PAX6、ADAM12、Nestin、HLA2Ⅰ。另外, HUMSCs低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40 和CD40 l等。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制,并抑制T细胞的增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性,表明其为一类免疫缺陷细胞,异基因移植不会发生免疫排斥反应。 3脐带间充质干细胞(UMSCs)的移植治疗作用: 骨髓MSCs用于改善心、脑功能的机制主要在于其分泌SDF一1和VEGF 等局部细胞因子, 诱导微血管的生成, 改善缺血组织微环境。UMSCs表达SDF 一1和VEGF, 提示了UMSCs治疗心脑梗塞、脊髓损伤的可能。 1)UMSCs对脑损伤的治疗作用 外源性UMSCs对脑组织的修复机理可能涉及到诱导内源性VEGF表达, 局部微血管增生, 抑制细胞凋亡等。利用液压冲击脑损伤模型, 证明
人脐带间充质干细胞操作规范 一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2， 有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min; 2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1# 培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带 转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min; 5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿); 6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿; 7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液，将胶 体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有 血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中 须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动); 11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25% 胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min; 13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即 得到P0代脐带间充质干细胞;
脐带间充质干细胞治疗再生障碍性贫血的护理 发表时间：2015-02-02T16:09:14.103Z 来源：《医药界》2014年11月第11期供稿作者：黄颉[导读] 。患者的病情能够有一定程度的改善，表现为输血间隔时间延长，出血症状明显好转，感染有所减轻等. 黄颉（上海市交通大学附属第一人民医院南院８Ｂ血液科上海２０００００）【中图分类号】Ｒ５５６．５【文献标识码】Ａ【文章编号】１５５０－１８６８（２０１４）１１【摘要】再生障碍性贫血（ａｐｌａｓｔｉｃａｎｅｍｉａ，ＡＡ）是由于物理、化学、生物或不明因素作用使骨髓造血干细胞和骨髓微环境严重受损，造成骨髓造血功能低下或衰竭，以全血细胞减少为主要表现的一组综合征。间充质细胞（ＭＳＣ）是属于中胚层的多能干细胞，不仅具有多向分化潜能，还有多种免疫调节作用，尤其是脐带ＭＳＣ（ＵＣ－ＭＳＣ）具有独特的优势成为干细胞治疗ＡＡ的 新热点。本文是为了探讨此项新治疗方法的护理。 【关键词】脐带；间充质干细胞；再生障碍性贫血；护理１．概述目前普遍认为，ＡＡ是一种主要由于Ｔ淋巴细胞免疫紊乱介导的获得性骨髓造血功能衰竭症，其发生、发展与Ｔ细胞功能亢进引起的造血微环境与造血干细胞的免疫损伤密切相关［２］基于此，目前免疫抑制治疗和造血干细胞移植已成为ＡＡ的主要治疗方法，大大改善了本病的预后。但免疫抑制治疗疗程较长，复发率高，副作用较大，有的抑制剂价格昂贵；异基因造血干细胞移植可望彻底治愈ＡＡ，但同样费用高、移植相关风险高，干细胞来源有限。目前免疫抑制治疗无效、不适合移植或不能耐受相关副作用的ＡＡ患者的治疗仍然是个棘手的问题。 ＭＳＣ是一类起源于中胚层的成体干细胞，除具备自我更新及多向分化潜能外，还有很强的免疫调节及支持造血双重作用。众多实验研究证实，ＭＳＣ可以通过多种途径发挥免疫调节及支持造血作用，应用于异基因造血干细胞移植，能有效治疗移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）和促进造血重建，这些均提示，ＭＳＣ在ＡＡ患者的细胞治疗中可能发挥重要作用。 ２．案例本例患者为男性，１４岁，于２０１２年１２月在无明显诱因下出现头晕乏力，牙龈出血，全身散在瘀点瘀斑，当地医院行骨髓穿刺后确诊为再生障碍性贫血。 予以输血、止血治疗后予以环孢素（ＣＳＡ）１５０ｍｇ／ｄ治疗，治疗中血常规ＷＢＣ（２－３）×１０９／Ｌ，ＨＢ５０－８８ｇ／Ｌ，ＰＬＴ（１０－７０）×１０９／Ｌ。２０１３年３月因症状反复加重予以强的松６０ｍｇ／ｄ治疗效果不佳，ＰＬＴ长期＜１０×１０９／Ｌ，期间平均每周输少浆血４００ｍｌ，单采血小板１个单位。由于无合适的异基因造血干细胞移植配对故考虑进行脐带间充质细胞治疗。患者分别于２０１３年５月和２０１３年６月两次输注脐带间充质共计８０ｍｌ。输注２个月后复查血象均有所上升ＷＢＣ５．１×１０９／Ｌ，ＨＢ８６ｇ／Ｌ，ＰＬＴ３０×１０９／Ｌ。２０１３年８月至今输血频率大大下降，患者目前仍予随访中，病情稳定。 ３．护理３．１输注中的护理３．１．１病情观察输注过程中密切监测生命体征和一般情况特别是血压及心率的变化。输注过程予以心电监护２小时，该患者输注时出现血压骤升，立即予以速尿２０ｍｇ静脉推注，甘露醇１００ｍｌ静脉快滴后症状有所缓解。输注过程中，患者若出现寒战、发热、恶心、呕吐、气促、心悸等不适，立即停止输注，按输血反应处理。 ３．１．２输注的技巧间充质细胞在送至病房后应立即输予患者，注意控制输入速度，应快速输注一般在２０—３０ｍｉｎ输完。由于间充质干细胞体外易贴壁生长的特性，输注前摇晃细胞悬液．输注中需每３ｍｉｎ摇晃细胞悬液及轻弹输血器管路，防止干细胞贴壁。输注前后生理盐水冲洗输液管道。输注时应暂停所有补液，不得与其他药物一同输注。 ３．２心理护理由于目前ＵＣ－ＭＳＣ在临床应用较少，患者对ＵＣ－ＭＳＣ知识也了解甚少，加上其在对治疗有效的强烈期盼和实施过程的过分担心使之产生了异常的复杂心理。因此，我们在护理上应充分讲解ＵＣ－ＭＳＣ的特性、来源、培养、传代、冻存和目前临床应用效果，在使用前充分预防可能发生的不良反应，通过以上心理护理，患者依从性好，积极配合治疗。 ３．３并发症的预防及处理３．３．１感染向患者做好宣教，严格注意感染的预防，如：定时使用漱口水防止口腔溃疡的发生，晚上睡觉前使用金霉素眼膏涂鼻腔保护鼻腔黏膜，使用信立妥眼药水滴眼防止眼睛干涩及感染。告知患者勤洗手，注意保持大便通畅，便后睡前使用痔疾洗液坐浴预防肛周感染，食物应选择干净、清淡饮食，防止腹泻的发生。同时要做好患者静脉穿刺点（如ＰＩＣＣ、深静脉穿刺、ＰＯＲＴ等）消毒护理，严格执行无菌操作防止穿刺点的感染。保持病室环境整洁，定时通风。限制探视人数及次数，避免到人多的地方，避免与有呼吸道感染的人接触，必要时戴口罩。 ３．３．２出血密切观察患者皮肤黏膜情况，观察有无瘀点瘀斑。观察患者呕吐物、尿液及粪便的色、质、量，如有立即异常留取标本送检。密切观察患者有无头痛、喷射性呕吐、视物模糊等颅内出血症状。做好患者相关宣教，如嘱患者要剪去指甲，不得用手挖鼻防止鼻出血，不要用力排便，血小板底下时要卧床休息，下床时要有人搀扶。如有头痛、视物模糊时立即告诉医护人员采取相应措施。 ４．小结ＵＣ－ＭＡＣ可促进造血重建，使造血功能得到有效、稳定的恢复，暂无明显不良反应。患者的病情能够有一定程度的改善，表现为输血间隔时间延长，出血症状明显好转，感染有所减轻等。其费用比骨髓移植少是再障患者较经济、理想的治疗方法之一。但该方法目前仍处于起步阶段，并没有大量开展于临床，相信在不久的将来便会用于造福广大患者，护理在其中起到了关键的作用，护士应做好观察及护理来提高该病种治疗的成功率。 参考文献［１］叶红高，陆再英．内科学［Ｍ］．第６版．北京：人民卫生出版社，２００４：７８７［２］ＹｏｕｎｇＮＳ，ＳｃｈｅｉｎｂｅｒｇＰ，ＣａｌａｄｏＲＴ．Ａｐｌａｓｔｉｃａｎｅｍｉａ［Ｊ］．ＣｕｒｔＯｐｉｎＨｅｍａｔｏｌ，２００８，１５（３）：１６２－１６８
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.doczj.com/doc/a38791937.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.doczj.com/doc/a38791937.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化
文章编号(Article ID):1009-2137(2005)01-0158-06?综述?间充质干细胞在免疫治疗中的应用 廖联明,韩钦,赵春华 中国医学科学院基础医学研究所,北京,100730 摘要 近年来对间充质干细胞的研究越来越多,对于间充质干细胞的自我更新和体外扩增的能力及其多向分化的潜能已经被广泛认识。同时,间充质干细胞还具备低免疫原性以及免疫调节活性,使其非常适合用于细胞治疗。目前对间充质干细胞发挥免疫调节的作用机制还不完全了解。本文综述了间充质干细胞免疫调节机制的研究现状及其在免疫治疗中的应用前景。 关键词 间充质干细胞;免疫调节;免疫耐受 中图分类号 R39214;R730.51文献标识码 A Application of Mesenchymal Stem Cell in Immunotherapy———Review L IA O L ian2M i ng,HA N Qi n,ZHA O Chun2Hua Instit nte of Basic Medical Sciences,Chi nese Academy of Medical Sciences,Beiji ng100730,Chi na Abstract There has been an increasing interest in recent years on mesenchymal stem cell(MSC).It is well known that MSCs are capable of self2renewal and differentiating into many cell lineages.MSC can be expended to a large quantity that is required for clinical trans plantation.Recent studies show that MSC have potential application in immune diseases due to their unique immunologic characteristics,such as low immunogenicity and immunoregulatory function.But their immunoregulatory mechanism is not yet clear.This review discusses the advances in researches on the mechanism of MSCs′immunoregulatory function and potential clinical application in immune disease and organ transplantation. K ey w ords Mesenchymal stem cell;immune regulation;immune tolerance J Ex p Hem atol2005;13(1):158-163 免疫抑制剂在器官移植和自身免疫性疾病的临床治疗中起着举足轻重的作用。但是,免疫抑制剂的副作用,包括免疫抑制引起的感染、肿瘤发生率增加等,也一直困扰着临床医生。在器官移植中,诱导受者对异基因移植物的特异性免疫耐受,减少、甚至完全不用免疫抑制剂,一直是免疫学家和临床医生的一个梦想。这是理论上解决异基因移植排斥,骨髓移植中移植物抗宿主病等临床问题的最佳方案。 在器官或组织移植中,稳定嵌合与特异性耐受诱导密切相关1。已有报道,骨髓干细胞移植后在受者体内可检测到稳定的造血系嵌合,并能诱导对供者的特异性耐受2-4。但骨髓移植前预处理的毒性、移植失败的风险和移植后出现的急、慢性移植物抗宿主病等问题,使骨髓移植仍然局限于恶性肿瘤或严重免疫系统疾病的患者,不适合用于特异性免疫耐受的诱导。最近报道,在未作任何预处理的大鼠中,胚胎样干细胞移植后在其体内可建立造血嵌合,并能诱导对随后相同供者来源的心脏移植物的特异耐受5。这一发现对寻找理想的免疫耐受诱导方法的研究者是一个很大的鼓舞。但是,胚胎干细胞存在众所周知的伦理问题和导致胚胎瘤的潜在危险。因此,在器官移植特异性耐受诱导方面,除了骨髓干细胞和胚胎干细胞以外,寻找一个新的细胞群体是非常必需的。最近,我们以及其他实验室都观察到骨髓源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有免疫调节活性。在小鼠6和灵长类动物7中,输注MSC可以延长异基因皮肤移植物的存活。在造血系统恶性肿瘤患者接受骨髓干细胞移植的同时输注供者来源的MSC,观察到MSC移植组的移植物抗宿主病(GV HD)发生率明显低于未移植MSC组8。另一研究小组也报道了相近的实验结果9。虽然结果还只是初步的,但为MSC的免疫调节特性提供了直接的证据。目前,MSC对免疫系统影响还并不十分清楚,它们潜在的临床应用价值,包括诱导异基因移植物耐受和免疫调节作用,还有待于进一步的研究。 通讯作者:赵春华,教授,博士,组织工程中心主任.电话:(086)22-27210060.传真:(086)22-27210060.E2mail:chunhuaz@public. https://www.doczj.com/doc/a38791937.html, 2003-11-26收稿;2004-09-01接受 ? 8 5 1 ?中国实验血液学杂志 Journal of Ex perimental Hem atology2005;13(1):158-163
脐带间充质干细胞（MSCS）抗衰老的临床实验 作者：Simon Sun Isa Li 【摘要】目的：观察脐带间充质干细胞对人体衰老的影响和安全性，对比观察脐带间充质干细胞对衰老的逆转现象。方法：抽取20名健康人作为志愿者，进行脐带间充质干细胞静脉回输（其中男性6人，女性14人，年龄为50-80岁），实验组10名志愿者进行静脉滴注3个疗程脐带间充质干细胞，对照组滴注生理盐水。实验组和对照组志愿者均为双盲实验，疗程结束后3个月、6个月、12个月的对比观察。结论：治疗组有效率为90%，从外表、内分泌、精神状态、体能、睡眠均表现出有效性。 Abstract: Objective: To observe the effect and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) on human aging. Methods: a total of 20 healthy volunteers, of umbilical cord mesenchymal stem cells reinfusion (6 males, 14 females, aged 50-80 years old), the experimental group of 10 volunteers were intravenous infusion of 3 cycles of umbilical cord mesenchymal stem cells, the control group of normal saline drip. The experimental group and the control group were double blind experiment, 3 months after the end of treatment, and the observation of 6 months and 12 months. Conclusion: the effective rate of the treatment group was 90%, which was effective from the appearance, endocrine, mental state, physical fitness and sleep. 对抗衰老延长寿命是人类的梦想，但以往的方法以失败见终，究其原因均是不能针对衰老的根本原因所致。而人类衰老的原因一是衰老的细胞不能被代替，正常的新陈代谢因为干细胞的补充不足所致。随着干细胞和研究的发展，以及进行临床治疗中所带来的抗衰老表现，提示脐带间充质干细胞会对衰老的过程产生正影响，具有良好的市场应用价值。本实验就是采取双盲实验的方法来进行对证，验证MSCS对衰老的逆转影响。 脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910216830.0 (22)申请日 2019.03.21 (71)申请人 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公 司 地址 510000 广东省广州市开发区广州国 际生物岛螺旋四路一号生产区第五层 502单元 (72)发明人 陈海佳 葛啸虎 王小燕 杨祖婷 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 温可睿 赵青朵 (51)Int.Cl. A01N 1/02(2006.01) A61K 35/28(2015.01) A61P 19/02(2006.01) A61P 19/08(2006.01) (54)发明名称 冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的 应用 (57)摘要 本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及冻存 液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用。 本发明提供的组合物，能够显著性的提高脐带间充质 干细胞在冻存条件下的活性，而以其制得的干细 胞制剂，具有良好的成骨分化、成软骨分化的潜 能，从而能够具有良好的修复软骨损伤的作用， 从而起到治疗骨关节炎的效果。权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 110050780 A 2019.07.26 C N 110050780 A
1.一种冻存液， 其由如下体积份的液体组成： 2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于， 由如下体积份的液体组成； 3.根据权利要求1或2所述的冻存液，其特征在于， 所述人血白蛋白注射液中人血白蛋白的质量分数为20％； 所述葡萄糖注射液中葡萄糖的质量分数为5％； 所述羟乙基淀粉注射液中羟乙基淀粉的质量分数为6％。 4.权利要求1～3任一项所述的冻存液在脐带间充质干细胞冻存中的应用。 5.一种脐带间充质干细胞冻存方法，其特征在于，以权利要求1～3任一项所述的冻存液重悬脐带间充质干细胞。 6.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，所述重悬至细胞密度为5×107cells/mL。 7.权利要求1～3任一项所述的冻存液在制备干细胞制剂中的应用。 8.一种干细胞制剂，其包括：脐带间充质干细胞和权利要求1～3任一项所述的冻存液。 9.根据权利要求8所述的干细胞制剂，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的密度为5×107cells/mL。 10.权利要求7～9任一项所述的干细胞制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。 权 利 要 求 书1/1页2CN 110050780 A
以往，新生儿出生后的脐带一直被人们视作废弃物。近些年，随着科技的进步和医学知识的普及，已有不少人知道从脐带血中提取脐带血造血干细胞可用于血液系统疾病的治疗，而提取血液后的脐带同样被当作医疗废弃物处理掉。 其实，脐带组织中蕴含丰富的干细胞资源，其中间充质干细胞最为丰富，间充质干细胞是一种具有奇特功能的干细胞，被认为最具临床应用价值，除了支持造血功能之外，还可用于心血管疾病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑及脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病及自身免疫性疾病等的治疗，并在美容、保健、抗衰老等方面显示了巨大的应用潜力。从脐带组织中提取的间充质细胞均一性好、活性强、免疫原性低，扩增数量巨大，可供多次使用，是理想的间充质干细胞来源。 孩子出生时是唯一一次获取高质量、高纯度的间充质干细胞的机会，储存脐带间充质干细胞，给孩子和家人一份健康保障！ 储存干细胞能够帮助您什么？ 治疗疾病，拯救生命 宝宝出生时的脐带（过去通常被废弃）中存在造血干细胞和间充质干细胞，可以拯救生命。干细胞能够治疗的重大疾病很多，如白血病、糖尿病、肝硬化、心脑血管疾病、进行性肌营养不良、系统性硬化症等等，到目前为止，干细胞已经可以治疗近100种疾病。 储存健康，有备无患 相当于成人脊髓或脂肪中的干细胞，脐带干细胞更纯洁、更健康、更容易采集。将脐带干细胞储存，是对生命健康的一大保障。脐带干细胞是在宝宝出生时采集，机会只有一次。 宝宝储存，全家可用 脐带间充质干细胞（存在于脐带中的一种干细胞），是一类免疫原性比较低的细胞，家庭成员也可以使用。间充质干细胞数量多，可扩展（使数量增多），满足全家的需要 自体储存，安全放心 自体储存的脐带间充质干细胞具有完美的组织相容性，不需配型，移植后细胞更容易存活，用自己的干细胞治疗更安全，更可靠。 健康投资，性价比高 干细胞是非常昂贵的，国外一份干细胞的价格要1.5—2万美元，国内的也价格不菲，如果使用自己的干细胞治病或保健，会节约大量的费用。 随着科技的发展脐带间充质干细胞作用会越来越广泛。现阶段在美容和抗衰老方面也都取得重要进展。
疾病解析 “疾”，一个病字框，里面是一个“有的放矢”的“矢”。这个“矢”就是“射箭”的“箭”。它告诉你，那些从外而来侵害你身体的东西，就像一个人朝你放的冷箭，比如，感冒、风寒、传染病这些外来因素引起的不适就叫“疾”。 再看这个“病”字怎么写?“病”字里面是一个“丙”。在中国文化当中，“丙”是火的意思。在五脏器官里，丙又代表心。所以，“丙火”又可以叫“心火”。心里感到不适有火，人就得病了，就这么简单。 免疫细胞 免疫细胞是白细胞的俗称，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等，也特指能识别抗原，产生特异性免疫应答的淋巴细胞，淋巴细胞是免疫系统的基本成分。 CIK(cytokine-induced killer，中文名：[自体细胞免疫疗法]多种细胞因子诱导的杀伤细胞)，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3 单克隆抗体，IL-2 和IFN-γ 等)，共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案，CIK细胞中的效应细胞CD3+和CD56+细胞在正常人外周血中叫少，仅1%-5%。 干细胞 干细胞在2018年得到了“两会”的关注，表示：“干细胞是人类最重要的生命资源，谁拥有资源谁就拥有未来”，干细胞就像是生命的种子，是一种可以自我更新和再生的多功能细胞而且干细胞对多种疾病的干预治疗效果显著，也被医学称为“万能细胞”，干细胞治疗与以下的9种疾病到底有什么关系? 改善和预防糖尿病 干细胞治疗糖尿病的原理主要是将提取的干细胞进行体外分离、纯化、扩增后输注到患者体内。干细胞在胰腺组织微环境的诱导下分化增殖为胰岛细胞，替代受损的胰岛β细胞，分泌胰岛素，从而达到改善糖尿病的作用。 改善和预防“三高” 干细胞治疗中能提高机体应对各种脂蛋白的代谢功能;能有效降低血糖中低胆固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白浓度;能显著提高机体糖代谢功能，有效降低血糖水平;能提高机体能量的供给和消耗平衡功能，具有减少血脂、降低血糖等功效，对原发性高血压、高血糖、高血脂有明显的治疗效果。 改善脑功能衰退 人体的大脑是支配整个人体的司令部，脑功能衰退会出现记忆力减退，思维敏捷度下降，严重者会患上老年痴呆，因为随着年龄的增长凋亡和衰老的脑细胞越来越多，导致大脑衰退，而干细胞可通过诱导分化成脑细胞的干细胞，可取代衰老凋亡的脑细胞，改善记忆力，提高思维能力，有效地防止老年痴呆症的发生。 改善心脏功能衰退 心脏是我们人体最重要的器官，随着年龄的增长加上外界环境的影响，容易出现心肌梗塞，研究表明，通过定向诱导分化的干细胞，能再生梗死的心脏细胞，会让心脏重新充满活力。 改善肝功能衰退 肝脏是人体解毒的重要器官，现如今随着科技的发展，经常熬夜或者加班，不良的生活习惯容易造成肝功能早衰。干细胞治疗肝硬化，一方面能根据周围微环境分化成新的肝脏功能细胞;一方面能“催醒”自身肝脏细胞“再生”;另一方面通过干细胞分泌的各种细胞因子，修复和营养受损的细胞。 改善免疫系统衰退