我国大规模细胞培养生物反应器综述
文章比较全面的介绍了我国目前生物反应器的现状,各种品种发酵的特点.提出了反应器的设计要以代
谢流分析为核心,要从系统生物学的角度出发.
1、发展大规模细胞培养及其生物反应器
借助于细胞培养进行各种产品生产已是我国生物技术产业化的重要组成部分，涉及医药、化工、轻工、食品、农业、海洋、环保等行业。培养的细胞不仅只是微生物，用于生物技术产品生产的动物细胞、植物细胞和藻类细胞大规模培养已引起了大家重视，显露出令人鼓舞的前景。而且随着生物技术的发展，在人类今后发现的一切具有生物活性的物质都可以借助于细胞培养方法得到。它们可以是细胞代谢产物、生物转化、酶或某基因表达产物。
此外，随着人类社会经济发展，如果没有基于科技进步的大力开发，能源和资源将难以支撑人类社会进一步发展的目标，人类社会的发展必须将基于碳氢化合物的经济转变为基于碳水化合物的经济。这种能源结构和资源结构的转变将直接关系到我国经济的可持续发展，社会的稳定、和国家安全。解决上述问题的最有效方法就是发展工业微生物，只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再生资源碳水化合物转变为现代社会所需要的化工原料和能源。
显而易见，要进行这些产品的生产，无不涉及到细胞代谢与大规模培养研究。为了提高生产水平，除了获得高生产能力的细胞株外，生物反应器是重要的核心技术，必需提供有利于生物过程研究的装置技术和高效节能的生产装置。但是在生物技术产业化平台中，细胞大规模培养技术等中下游技术是我国最薄弱的技术环节之一，以我国生物医药等领域产业化来说，与先进国家的差距是全面的。滞后的一个重要原因之一就是缺乏相配套工艺的工业化放大技术研究和相应的装备技术支撑。例如以哺乳类细胞培养技术来看，西方国家基因工程抗体的开发已经进入大规模细胞反应阶段，细胞工程研究规模已经达到1000L以上，基因工程抗体的生产反应系统最大规模达到20000L以上。相形之下，我国多数药物开发单位的细胞反应规模仍停留在2-30L 规模，100L的培养技术还不稳定，长期以来都是照抄照搬国外的技术和进口国外设备。国内只能生产一些低档装置, 仅靠科研成果模仿和基础科学的跟随。
与其他各行业的装备制造业一样，生物反应器为生物技术产业再生产和扩大再生产提供共性技术和关键技术，它的发展水平也反映了国家在科学技术、工艺设计、材料、加工制造等方面的综合配套能力。装备制造业和商品化的迫切性可以归纳为如下几点：
l 每年有大量的从摇瓶到不同大小的实验室生物反应器进行生物技术的实验室研究或中试放大的项目，这些项目有的已购买设备，但需要维修，有的则需新添有关装置。
l 每年有相当数量的生物技术工程项目投入，需要大量的用于生产的生物反应器，传统生物技术的生物反应器一般体积较大（几十M3到上百M3），而现代生物技术所需的反应器装置体积较小，但技术要求高。
l 随着不同产品过程优化与放大技术研究的进展，迫切需要新设计原理的生物反应器发挥作用。由此，必需有不断更新技术的生物反应装置推向市场，或者对现有生物反应器生产装置进行新技术改造，这也是包括制药、食品、轻工在内的传统产业现代生物技术改造的主要内容之一。
l 随着生物技术的发展，需要性能更高的生物反应器，例如哺乳类动物细胞大规模培养是当前高附加值的糖基化活性蛋白医药产品的发展趋势，如何开发适应动物细胞特殊需要的生物反应器并商品化就成为迫切需要
解决的问题。
l 生物反应器产业是集中各种高技术含量的机电一体化产品，不能简单的认为是一种机械加工与仪表的结合。随着计算机软硬件技术进展、以及传感技术、化学工程的流型研究技术及其他元器件等技术进步，最后通过生物反应器技术设计实现更新换代，才能形成对生物技术产业化的贡献。
由此可见，建设一个有多种技术支撑的，与生物技术产业化研究密切关联的商品化生物反应器生产，形成生物技术产业的支撑体系和产业链己经是我国发展生物技术产业必不可少的重要措施。
2、生物反应器产业的产品特点
(1) 产值不大作用大
生物反应器产业本身很难有每年达数十亿元的产值，但其在生物技术产业链中却起着再生产和扩大再生产的作用，达上百亿元以上。有时一个新的生物反应器技术的应用和推广，就可能促进某一生物技术产品的产业化形成，提高生产能力，或降低生产成本，可节约能耗达数十亿元之巨。
(2) 产品多样性
目前用于生产的细胞和生物材料有微生物、动植物细胞、藻类、各种酶类等。不同细胞或酶有不同特点，因而有不同生物反应器设计要求。
生物反应器种类有气升式反应器和机械搅拌反应器；常规反应器和光生物反应器；好氧和厌氧反应器；液体深层培养反应器和固体发酵反应器；根据不同机械结构划分的反应器；不同控制原理划分的反应器等。此外，生物反应的规模也可由几十毫升到上百M3不等。
由此可见，很难规定几个通用产品进行大批量生产，大多数用户根据自己的研究或生产特点，提出不同的定货要求，反应器研制厂家必需有足够的技术力量和经验进行非定型化设计，以满足用户要求。
(3) 生物过程优化与放大技术
具有先进的生物过程优化和放大能力是生物反应器设计的核心技术。由于在生物反应器中所发生的反应是在分子水平的遗传特性、细胞水平的代谢调节和反应器工程水平的混和传递等多尺度（水平）上发生的。因此，如何利用生物反应器中的多参数检测技术和在线计算机控制与数据处理技术，把细胞在反应器中各种表型数据与代谢调控有关的基因结构研究关联起来，是反应器过程优化与放大的重要内容，也是当前国内外竞相发展的具有原创性的知识产权技术，对促进生物技术产业化发展具有重要意义。由此可见，提供包含以上功能并具有自主知识产权的商品化生物反应器应是我国生物反应器产业的重点之一。
(4) 生物技术发展要求性能更高的生物反应器
为了适应各种生物技术的实验室成果向产业化转化的需要，对生物反应器的性能要求愈来愈高，目前主要表现为：
l 用于基因工程高密度高表达，符合GMP标准的生物反应器以及一些新技术的应用等。其中关于供氧问题，快速升温、SIP自动灭菌、CIP自动清洗、机械密封、排气处理、取样处理等问题以及培养液成份的流动注
射分析（FIA）分析等都需很好解决。
l 哺乳类动物细胞大规模培养是当前生产高附加值的糖基化活性蛋白医药产品的重要发展趋势。根据动物细胞无细胞壁，对剪切极端敏感，在细胞生长控制上，要防止细胞分化和细胞凋亡，有时还要考虑对产品糖基化质量的要求。所以反应器要具备低剪切效应，混合性能好等特点，要提供细胞形态在线观察和活细胞数量的传感技术，严格控制反应器的操作条件以及有关防污染的灌注系统、取样系统等都需要研究解决。
l 用于细胞过程生理特性和过程传递特性研究的生物反应器研制，其中主要解决用于过程分析的各种传感器选型研制和数据处理软件包的研制。特别是近年来随着微生物基因组测序和系统生物学研究工作的深入展开，发酵过程检测与控测已经从基于参数传感技术的反馈控制发展为以信息处理为基础的生物过程检测与分析。各种谱分析与生物反应器实验数据关联起来，提供各种表型数据具有重要意义。因而对反应器设计提出了新的要求。
l 随着生物技术在各领域的推广应用，用于海洋藻类、微生物肥料、微生态饲料、环境污染处理等大规模细胞培养需要高强度低造价的生物反应器。特别是近年来利用生物质生产燃料乙醇等能源物质的战略部署，需要应用大型高效节能生物反应器降低生产成本。
(5) 产品型号更新换代与部件技术研究
生物反应器是多专业技术发展的综合体，由于反应器零部件技术的进步，必须及时更新产品设计，为用户提供性能更好且价格合理的反应器产品。这些零部件技术包括计算机软硬件技术、各种传感技术、反应器流型设计，新机械结构和材料等等。此外，随着信息处理技术的发展，如何实现大批量数据处理、贮存与通信，把生物信息学与过程信息结合起来实现复杂生物系统的分析与控制，也以软件包的形式逐渐从实验室研究走向商品化。
(6) 产品生产的标准化、规范化
作为商品化装置的市场化，建立生物反应器生产标准，实施IS09001管理是发展生物反应器产业的重要内容，只有这样才能提供合符用户要求及质量稳定的产品。主要内容有：
l 产品装置成套加工的工艺技术路线的确定与质量控制研究。在生物反应器制造过程中，如材料、焊接、表面处理、零部件机加工、外购件、易耗品…、直到安装流程工艺、器材仓库管理…等都要严格实施质量检验；
l 原材料、半成品、成品标准等的确立与实施。如有关传感器及一些如空气过滤器、阀件、质量流量计等关键部件的测试标准的建立与研究，整机性能测试标准的建立与研究；
l 产品质量过程控制程序的确立与实施等；整机性能测试标准的建立与研究。
(6) 高品质的售后技术支持
由于生物反应器中的反应是在基因、细胞和反应器工程水平上多尺度发生的，因而真正利用生物反应器实现过程优化是有难度的，从理论到实践的提高，并进一步在生物技术产品生产中发挥作用，需要有一个过程，应该把售前宣传和售后服务等与整体应用技术提高结合起来才能取得好的效果。
3、我国发展生物反应器产业的现状和今后发展
3.1 现状
我国生物反应器的研究一直受到国家有关部门的重视，在国家攻关“七五”、“八五”期间先后立题，并集中国内有关单位攻关，解决了在生物反应器研制中的几个关键技术问题，并形成了早期产品。但由于计划经济时代国家攻关计划与产品开发脱节，再由于当时国内配套基础差，以及各种体制和观念上的问题，严重影响产品质量，故长期来未能在我国形成规模化的产业。我国商品化生物反应器的市场相当大的一部分被几家国外公司占领。主要有德国B.Braun、美国NBS、瑞士Bio Engineering、日本丸菱以及韩国等，占据了我国市场的70%左右以上。
近年来，国内有关生物反应器产业发展较快，有关产品生产的公司企业已达十多家，在这些公司的努力下，一改过去基本由国外产品统治国内市场的局面，特别在低端产品上已基本由国内控制。但是这些公司大都主要从事中低档产品生产，企业技术力量以仿制为主，着重于以降低生产成本为目标的零部件替换研究，虽然产品的标准有所下降，但也能满足一般用户的需要，特别对生物技术产业刚起步的或优化放大要求不高的企业或教学单位，低价的产品己可以适应他们的要求。但是对一些性能要求高的商品化生物反应器，如SIP自动灭菌与CIP清洗的全自动生物反应器、生物反应器的自动取样与分析系统等，一些重要器件如耐高温灭菌的隔膜阀的抗疲劳、抗澎胀性以及器件加工工艺与标准都有差距，特别是一些符合GMP要求的高端生物技术产品所需的装备或成套设备主要还是由国外公司提供。由于这些国内公司缺乏生物过程技术的研究力量以及工艺、工程、装备一体化的研究体系，因而不能随着生物技术发展有同步生物反应器的开发能力，例如对于大规模动物细胞生物反应器，至今国内还没有符合要求的定型产品推出。此外，对与生物技术深度结合的高度自动化的实验室装置缺乏试制能力，因而只能是简单的外型仿制和跟踪，缺乏创新的自主知识产权产品。
由此可见，面临着生物技术的深入发展，如何解决提高生产能力为目标的行业技术改造，以及加入WTO后和国外高档产品的市场竞争，我们必须大力开发具有自主知识产权的性能优越的反应器技术并商品化，以适应推动生物技术产业化的进一步发展需要。
3.2国内生物反应器设计与制造发展趋势
3.2.1以代谢流分析为核心的生物反应器
长期来发酵过程优化与放大所依据的基本思想和方法是采用经典动力学为基础的最佳工艺控制点为依据的静态操作方法，实质上这只是化学工程宏观动力学概念在发酵工程上的延伸。例如，用氨水调节pH时，关心的是最佳pH值，却不注意氨水加量的动态变化及其与其他参数的关系。在溶解氧浓度（DO）测量与控制时，关心的是最佳DO值或临界值，不注意细胞代谢时的耗氧率。显而易见，用在以活细胞代谢为主体的发酵过程就有很大的局限性，应该重视细胞代谢流的存在。
作者在研究了生物反应器中的细胞过程特点后，提出了细胞过程的多尺度问题研究[ ]，认为活细胞为主体的细胞大规模培养的生物反应过程，可以分为基因分子尺度、细胞尺度与生物反应器尺度的网络结构，是不同尺度的网络状态的输入输出关系，存在着信息流、物质流与能量流。发酵过程优化不能只是从单一尺度（基因、细胞、生物反应器）上去解决，要注意他们之间的关系和瓶颈问题，其中跨尺度观察与控制是微生物过程优化的关键，由此形成了一套基于参数相关的发酵过程多水平问题研究的优化技术和发酵过程多参数调整的放大技术。
随着过程传感技术和计算机技术的发展，国家生化工程技术研究中心（上海）设计了一种用于生物过程多尺度研究的新概念发酵装置（已由上海国强生化工程装备有限公司组织生产，定型为FUS-50L（A））[ ]，该装置以生物反应器中物料流检测的观点，具有十四个以上在线参数检测或控制，并集中力量开发了一个适应
多种反应器特点，融合多种过程理论和控制理论，便于发酵过程工艺分析和优化操作的软件包。在鸟苷发酵过程中，从反应器测量参数上发现了细胞代谢流迁移，由此实现了过程优化[ ]。该产品先后成功地在青霉素、红霉素、饲料金霉素、链霉素、黄霉素、泰乐霉素、棒酸、鸟苷、肌苷、基因工程白蛋白、基因工程疟疾疫苗、基因工程植酸酶、胰岛素原（PIP）、基因工程必特螺旋霉素等多种产品上发酵优化应用取得了大幅提高发酵单位能力，其优化结果一般可由几十升发酵罐直接放大到上百立方的工业生产发酵罐。
3.2.2动物细胞大规模培养生物反应器研制
由于细菌等原核细胞表达系统在转录及修饰方面的缺陷，许多重要价值的蛋白质，特别是基因工程药物、疫苗、抗体等糖基化的需要，使哺乳类动物细胞表达系统成了一个更合适的工具，因此，哺乳类动物细胞表达系统引起了大家重视。以哺乳动物大规模培养技术为基础的生物制药产业在美国等西方国家得到了迅速发展，数十种产品已进入市场，取得了巨大的经济和社会效益。
国外用于生产的动物细胞生物反应器已趋于大型化（最大到吨级规模）、多参数与高度自动化的计算机控制系统、以及适应动物细胞对大型环境因子高敏感性的反应器精巧设计制造，并形成商品化供应用户。我国自“七五”至“八五”攻关期间立题开展有关动物细胞生物反应器研究，取得了较大进展，但哺乳类细胞培养技术要求高，技术壁垒大，有关公司在未能掌握核心技术的情况下，单凭模拟很难开展工作。抗体等其他细胞表达产品，装药量大，我国科研单位已经掌握的早期生物药开发技术很难应用到新型药物生产工艺上，需要重新摸索；由于细胞株等上游配套技术的落后、反应器研制技术的差距、以及有关缺乏生化工程的研究等原因，因而缺乏必要的条件去掌握高表达细胞株构建和大规模细胞培养技术，难以突破技术瓶颈，我国有关动物细胞生物反应器产业仍近乎空白。
由于动物细胞无细胞壁，对营养要求严格，因此细胞是否附着于固体或半固体表面生长（贴壁培养）、培养基中血清的使用、抑制因子的积聚度、渗透压等等问题一直是动物细胞大规模培养的关键技术。此外，动物细胞对pH、溶氧、温度、剪切应力、抗污染等环境因子的高敏感性，实现动物细胞生化反应器的大型化、自动化和精巧化也成为大家关注的问题。
从当前发展趋势来看，悬浮细胞、无血清培养，是目前世界范围内各大生物公司产业化生产的发展方向。悬浮细胞、无血清培养在规模化生产提高单位产量、细胞的高密度培养、高密度表达、简化生产工艺、降低生产成本、保证大规模生产的产品质量等方面，都起到非常重要的作用。是高度生产化的最有效的途径。是目前世界各大生物公司竞相开发的前沿课题。也是美国FDA要求各生物公司建立的规模化生产技术平台。
从反应器类型来看，早期动物细胞反应器较多采用贴壁培养反应器，其中微载体的使用可使贴壁细胞的培养像悬浮培养那样进行，但近年来特别是血液、淋巴组织、许多肿瘤细胞（包括杂交瘤），以及一些其他转化细胞系都采用悬浮培养反应器，形成各种类型，其中推广较多的有美国NBS公司的填充床生物反应器，但大多只能在实验室规模应用，一些适合于生产规模的更新类型的悬浮培养反应器也正在开发，如瑞典的BIO公司和德国的B.Braun公司。
此外，从代谢流分析来看，动物细胞对营养的严格要求都是与胞内代谢有关，不同途径消耗的各种营养物的比例实质上是细胞代谢状态迁移的结果，特别是近年来细胞代谢工程的研究，有关代谢流的分布，基因水平和细胞水平的代谢调控研究文献大量报导。因此，以过程代谢物质流检测为目标研究动物细胞生物反应器的多参数传感技术，通过计算机的数据采集系统，实现过程参数相关的优化技术研究，有可能取得过程优化技术的重大突破。
我国有关商品化大规模动物细胞反应器产品还处于空白，必需迅速组织力量发展。可以首先对于动物细胞反应器的关键技术的有关部件和材料研制出发，加强装备制造工艺研究力量，然后结合动物细胞过程工艺特性，形成装备设计与工艺要求的统一。此外，在研制过程中要注意及时吸收最新的各领域技术进步，如计算机软硬件技术、新材料技术和生物技术等，形成具有自主知识产权的装备产品。
3.2.3带pH测量与补料控制的摇床── 摇床应用技术的发展
20世纪三十年代摇床问世以来，摇床就作为生物反应过程中必备的一种专用设备，用于微生物、动植物细胞菌种筛选、种子扩大培养等。由于摇床设备的特点，不能实时测量培养过程中的有关参数以及过程补料控制，因此长期以来一直以摇床的放瓶结果作为实验数据。当用来作为诸如菌种生理特性变化、培养基成分的作用以及温度、pH等环境条件变化等研究的依据时, 实际上是一种缺乏过程研究的静态分析方法。这种方法的局限性是很显然的，例如以这种方法作为菌种选育后技术时，传统摇瓶筛选方法往往缺乏补料或供氧不足，并不一定处于代谢流分配最合理的状态，由此将出现严重的高产菌株漏筛现象。因此，国内外有关公司己注意开发带pH测量的摇床，并形成产品。
如上海国强生化工程装备有限公司开发的系列摇床，就是根据菌种在FUS-50L（A）进行发酵操作时，可以很明显地观察到过程pH值与其他参数变化（如菌体生长、OUR、CER、RQ、各种补料操作…等）的相关性，这种随不同发酵时间的相关性变化可以反映菌体生理状态的变化，对发酵过程优化与放大研究具有极重要的意义。与过去把发酵pH值作为最佳条件的概念不同，可以通过该装置pH检测功能，根据发酵过程参数相关的原理观察到菌体生理特性的变化。带pH测量的摇床既克服摇瓶中多参数测量的困难，又不失为代谢流分析的基本原理。为了进一步实现对培养过程的控制，还精心设计用于摇瓶的微量补料技术，实现各种碳氮源的流加、pH控制或微量元素控制等。把pH实时测量与流加技术相结合，对实现以代谢流为核心的动态研究具有重要意义。
由于摇瓶的多瓶以及不同工艺的组合对照操作，可以大大缩短研究进度。由此可见，带pH测量与补料控制的摇床实质上不仅只是一个简易型生物反应器，而且特别适合于各种微生物和基因工程菌的菌种筛选和培养的早期大批量工作，高通量筛选能力明显优于常规的摇床和生物反应器。其装备制造的难点就是研制稳定的pH测量装置和精细的补料系统。由于耐高压灭菌锅的高温灭菌以及摇床振荡时的高阻抗输入特性的抗干扰要求，pH电极装置及导线仪表系统必需作精细设计；补料系统必需微量、有效、并可人工任意程序设定。
3.2.4生物反应器中试系统设计
对于生产量大的传统生物技术产品，为了对已经通过前期研究（实验室研究和市场分析）的产品进行过程优化研究，在中试规模上达到高生产水平或质量，并进而为车间生产提供工艺放大依据和设备设计依据，必要时还可进行小批量生产，提供应用试验样品、或供市场销售的部分产品。为此，近年来许多有关发酵产品生产的企业迫切需要建立一个多功能的中试发酵车间。
随着以"多尺度"观点的发酵研究技术的发展，中试车间的有关装备的软硬件技术和研究方法以上述内容为核心进行建设，以便有效地解决发酵过程的优化与放大问题。考虑到装置系统的通用性以及为生产用罐的设计提供数据，其中一些关键设计参数如搅拌功率及搅拌桨型式、发酵热及高效传热装置设计、通气流量设计等必需有足够的调节余量或选择。此外，参数检测必需配置较完整传感（约14个参数以上）与数据处理系统，发酵罐结构与制造技术（如罐体材料、焊接、抛光、夹套结构与制造、搅拌装置制造技术等）应先进，为今后的发酵过程优化与放大设计提供重要的工程设计数据。
在中试系统中，一个重要的设计目标就是生物反应器群控技术的过程控制与数据处理，这不是通常意义的下位计算机所能实现的。因此，如何根据不同情况选用计算机系统就成为一个重要问题。近年来，随着计算机技术的发展，在生物反应器系统中可以选用的计算机系统有单片计算机、PLC、工业控制计算机、现场总线计算机控制系统和DCS系统等，其中现场总线系统与大容量计算机相结合可以很好地适应发酵中试系统的控制与数据处理要求。可以采用将智能嵌入式计算机系列的智能模块技术、高性能网络通信技术、信息处理技术、综合自动化控制技术与生物反应控制有机结合。设计成每个罐使用一块现场总线模块独立控制，各个罐相互独立，用分散的虚拟控制站取代了集中的控制站，增加了系统的可靠性。同时多个罐的控制回路用以太网连到一个IPC组成的操作站，组成小型的局域网。采用常规控制系统软件包对所有发酵罐进行控制，具有高安全性和连续操作的特点。又以上位计算机进行数据通讯的集中显示系统，具有贮存量大、数据处理使用方便和直观的人机界面特点。
3.2.5大型生物反应器设计与制造技术研究
几十年来随着发酵工业的快速发展，发酵工程趋向设备大型化、高效和自动化。以传统生物技术产品来说，一些氨基酸、抗生素或发酵轻化工产品都在几十到几百M3以上发展，一些原来是小规模发酵罐的老厂搬迁新厂区，发酵罐的规模也普遍要求放大。基因工程产品一般附加值高，不需要大型生物反应器，但近年来随着基因工程酶生产技术的发展，如基因工程植酸酶的研究成功，又由于饲料添加剂的需求量大，用于基因工程高密度高表达的大型生物反应器研制已势在必行。特别是今后随着矿物质能源的耗竭，利用生物质生产燃料乙醇等已提到重要战略议事日程，高效节能的大型发酵装置的应用是降低生产成本的不可缺少的关键技术，如美国、巴西等国家已达2000M3以上发酵装置。
大型装置的利用也带来新的技术问题。目前国内发酵过程工业放大主要是根据经验放大，例如单位体积功率相等、单位体积通气比相同或选用相同的搅拌桨型式等，实际情况很难把握。后来又引进了化学工程的冷态试验方法，对罐内流型进行了充分研究，最后根据这些混和传递特点，进行大型生物反应器设计，但实际情况有时偏差也很大。
发酵过程放大困难的原因就在放大时不可能同时做到几何相似、流体运动学相似和流体动力学相似，当在小试研究时某一个对生产产生影响的重要因素没有被观察到，而这个因素恰恰在放大时成为关键因子时，就会造成整个发酵过程的失败。为此，我们在发酵过程放大研究时，提出了在以代谢流分析与控制为核心的发酵实验装置上进行研究，由此可得到用于过程放大的状态参数或生理参数，只要我们在放大的设备上得到完全相同的反映代谢流等生理数据变化曲线，就可以较好地克服上述放大过程中的问题，因而提出了发酵过程参数调整的放大技术。
但是以上工作还只是生理代谢参数相似的放大原则，并不能代表大型发酵罐的几何结构和动力结构等可设计参数的确定，也就是说在放大规模的状态参数转化为操作或设计参数又有一个研究过程，需要在积累性的工作基础上提升到理论和方法。例如根据OUR、KLa以及所选用的搅拌桨特性测算不同发酵罐规模所需的搅拌功率研究；根据OUR与菌体细胞剪切适应量选择不同规模发酵罐的搅拌器形式、转速或其他结构的研究；搅拌器的混和与剪切特性的冷态研究，计算流体力学的应用研究；大型发酵罐高功率搅拌器的加工与动平衡研究，以及传动装置技术和整体罐结构设计研究；根据耗氧率进行发热量估计及传热面积的研究：不同传热结构（夹套、蛇管、半圆管和激光焊接膨胀型蜂窝夹套）的传热效果、强度、无菌性能研究和造价；放大效应的计算机控制补偿的设计研究以及具有补偿控制能力的计算机数据采集与控制系统；以及上述研究的数据库建立与推广应用。
因此，如何在放大的罐体上实现达到相同代谢流参数的目标的设计，需要从生物学、化学工程、机械制造、传感技术到计算机控制技术的协同努力。
4. 后语── 细胞过程的系统生物学研究与生物反应器
长期来以微生物等为代表的过程研究，是基于经典的以动力学为基础的工程学概念和经典的以化学计量学和热力学研统为基础的生物学概念。随着过程工程技术和生物技术的进展，对过程系统的认识由宏观到微观，由还原论到综合论，必需引入现代的工程学和生物学基础，特别是在深入开展微生物过程研究中如何整体性看待遗传和生理就成为过程优化与放大的重要问题。在现有的生物反应过程研究中往往是先进行遗传育种，然后进行发酵条件优化，在过程中忽略遗传和蛋白信息流的改变，也就是说把菌种改造的基因特性与发酵过程优化研究分割开来。在研究过程中，我们还经常发现由单一生理调控机制出发做出的解释往往缺乏全局性的概念，只揭示了生理调控的局部和某一时段的特点，因此难于对整个过程控制和优化起决定性作用。
以上情况，实际上提出了发酵过程系统生物学研究的重要性问题。系统生物学不同于以往的仅关心个别的基因和蛋白质的实验生物学，它要研究所有的基因、蛋白质以及组分间的所有相互关系。显然，系统生物学是以整体性研究为特征的一种大科学。工业微生物过程的系统生物学研究的主要内容是：把生物反应器体系作为相对封闭的生态系统，用系统生物学的方法来研究微生物内在的生理活动、微生物之间的相互作用、微生物与外在环境相互作用关系。这种全域性研究可以发掘微生物生物合成调控基因，为代谢工程改造菌种、重构微生物基因组及表达调控系统提供理论基础；发掘发酵过程参数优化的分子机制，为进一步优化发酵过程参数提供理性依据。
在研究方法上，我们强调宏观的差异分析法。这种研究方法以系统生物学为背景，直接把代谢产物或途径与转录谱相关联建立高通量筛选平台，有可能产生跳越式而不是递增式改良，并且把菌种改良与发酵过程开发统一起来，提供的研究基础还可以用于其他工业生产菌株，可以加快菌种高效筛选与过程开发。
以上研究理论的深入和技术方法的进步，必定反映在生物反应器结构与功能的变化，特别是提出了从基于参数传感技术的反馈控制发展为以信息处理为基础的生物过程检测与分析[ ]。提供了大量的过程检测数据，但不是pH和DO电极那样只是提供了一个单变量的方法，而是以各种谱分析为主要内容的可以同时测量很多变量的多变量方法。这些谱分析有各种质谱仪(MS)，其中包括用于发酵尾气成分分析的气体质谱仪和测定各种微生物系统的有机物的热裂解质谱仪(PyMS)；各种红外谱分祈(IR)，某中包括用于营养成分消耗和产物形成的的近红外(NIR)以及在红外指纹区应用的中红外(MIR)；用于生物细胞或生物有机物分析的拉曼振动谱(Raman spectroscopy)；研究生物系统电极极化性能的非线性双电极谱的双电报系统(Dielectric spectro.) 。对这些谱图测量所得到的海量数据，在数据处理时必需有功能强而粗犷的高维快速分析功能，可以采用多元化学计量学方法。
此外，有关工业微生物过程的系统生物学的研究方法，在转录水平上可采用基因芯片分析转录组，在翻译水平上采用2D电泳、时间飞行质谱分析蛋白质组，在调控网络上采用染色体免疫沉降方法分析所有的转录调控位点等。由此可见，用于生命科学测定技术与分析仪器所得到信息已开始作为重要的发酵过程检测参数，如何解决生物过程的信息处理以及与控制系统之间的关系就成为一个值得关注的问题。
我国大规模细胞培养生物反应器综述 文章比较全面的介绍了我国目前生物反应器的现状,各种品种发酵的特点.提出了反应器的设计要以代 谢流分析为核心,要从系统生物学的角度出发. 1、发展大规模细胞培养及其生物反应器 借助于细胞培养进行各种产品生产已是我国生物技术产业化的重要组成部分，涉及医药、化工、轻工、食品、农业、海洋、环保等行业。培养的细胞不仅只是微生物，用于生物技术产品生产的动物细胞、植物细胞和藻类细胞大规模培养已引起了大家重视，显露出令人鼓舞的前景。而且随着生物技术的发展，在人类今后发现的一切具有生物活性的物质都可以借助于细胞培养方法得到。它们可以是细胞代谢产物、生物转化、酶或某基因表达产物。 此外，随着人类社会经济发展，如果没有基于科技进步的大力开发，能源和资源将难以支撑人类社会进一步发展的目标，人类社会的发展必须将基于碳氢化合物的经济转变为基于碳水化合物的经济。这种能源结构和资源结构的转变将直接关系到我国经济的可持续发展，社会的稳定、和国家安全。解决上述问题的最有效方法就是发展工业微生物，只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再生资源碳水化合物转变为现代社会所需要的化工原料和能源。 显而易见，要进行这些产品的生产，无不涉及到细胞代谢与大规模培养研究。为了提高生产水平，除了获得高生产能力的细胞株外，生物反应器是重要的核心技术，必需提供有利于生物过程研究的装置技术和高效节能的生产装置。但是在生物技术产业化平台中，细胞大规模培养技术等中下游技术是我国最薄弱的技术环节之一，以我国生物医药等领域产业化来说，与先进国家的差距是全面的。滞后的一个重要原因之一就是缺乏相配套工艺的工业化放大技术研究和相应的装备技术支撑。例如以哺乳类细胞培养技术来看，西方国家基因工程抗体的开发已经进入大规模细胞反应阶段，细胞工程研究规模已经达到1000L以上，基因工程抗体的生产反应系统最大规模达到20000L以上。相形之下，我国多数药物开发单位的细胞反应规模仍停留在2-30L 规模，100L的培养技术还不稳定，长期以来都是照抄照搬国外的技术和进口国外设备。国内只能生产一些低档装置, 仅靠科研成果模仿和基础科学的跟随。 与其他各行业的装备制造业一样，生物反应器为生物技术产业再生产和扩大再生产提供共性技术和关键技术，它的发展水平也反映了国家在科学技术、工艺设计、材料、加工制造等方面的综合配套能力。装备制造业和商品化的迫切性可以归纳为如下几点： l 每年有大量的从摇瓶到不同大小的实验室生物反应器进行生物技术的实验室研究或中试放大的项目，这些项目有的已购买设备，但需要维修，有的则需新添有关装置。 l 每年有相当数量的生物技术工程项目投入，需要大量的用于生产的生物反应器，传统生物技术的生物反应器一般体积较大（几十M3到上百M3），而现代生物技术所需的反应器装置体积较小，但技术要求高。 l 随着不同产品过程优化与放大技术研究的进展，迫切需要新设计原理的生物反应器发挥作用。由此，必需有不断更新技术的生物反应装置推向市场，或者对现有生物反应器生产装置进行新技术改造，这也是包括制药、食品、轻工在内的传统产业现代生物技术改造的主要内容之一。 l 随着生物技术的发展，需要性能更高的生物反应器，例如哺乳类动物细胞大规模培养是当前高附加值的糖基化活性蛋白医药产品的发展趋势，如何开发适应动物细胞特殊需要的生物反应器并商品化就成为迫切需要
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
细胞培养综述 摘要：为了模拟机体生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。培养出的活细胞具有量大、均一和可重复性的特点，可以通过各种物理、化学、生物等因素进行调控，并且可以通过倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记等多样的方法进行研究，已广泛运用在不同科学研究领域。 关键词：分化，细胞分型，生长增殖过程，传代 一、体、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系[1]。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并未失去研究的意义。且不论其有许多性状仍与体相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（Cyto－genetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启
引起的现象，这并非是绝对缺陷。恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。 2、分化；体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体不同。细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为[2]。 二、体外培养细胞的分型 （一）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能接体组织学标推判定，仅大致分成以下四型： 1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。 2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态[3]。 3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其
细胞破碎方法综述 细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。结合重组DNA 技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。 关键词：细胞破碎；细胞壁；细胞膜；细胞破碎方法 1前言 目标产物的分离纯化在现代生物技术工业中占有十分重要的位置，它决定着产品的纯度和安全性，也决定着产品的收率与成本。许多生物产物在细胞培养过程中不能分泌到胞外，而保留在细胞内。破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，释放其中的目标产物。 自20世纪80年代初重组DNA技术得到广泛应用以来,生物技术发生了质的飞跃,生物产品的数量越来越多,许多具有重大应用价值的产品应运而生,如具有显著医疗作用的胰岛素、干扰素、生长激素、白细胞介素一2等,它们的基因分别在宿主细胞(如大肠杆菌或酵母细胞)内克隆表达成为基因工程产物,从而提高了产量,降低了成本。很多基因工程产物都是胞内物质 (如上述药物经克隆表达后都属胞内物质),分离提取这类产物时,必须将细胞破壁,使产物得以释放,才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤,破碎技术的研究更加引起基因工程专家和生化工程学者的关注。 2细胞破碎技术 2．1高压匀浆破碎法（homogenization） 高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20℃左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。 2．2振荡珠击破碎法 (Skaking Bead) 将等体积的小量组织样品与高密度的ZircoBeads放入可密封的2ml螺旋盖微量管中,再加入缓冲液与稳定成份到1.5ml的体积, 用6500RPM振汤机高速上下振动8秒,休息8秒,再振动8秒即可.此方法是目前最快且一次可处理最多样品的方法. 一台机器最多可以在一天处理2400支样品.对小量且多样的人很方便. 2．3高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding） 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机。 2．4超声波破碎法（ultrasonication）
细胞培养技术原理及应用研究进展 姓名：赵鹏学号：158033038 专业：流行病与卫生统计学 摘要：细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术，已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法。文章对细胞培养技术的应用作一综述。 关键词：细胞培养；应用；研究进展 细胞是构成机体的基本单位，是生命活动的基本单位。一切有机体（除病毒）都是由细胞组成的。细胞具有独立的、有序的自控代谢体系。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、征服疾病的关键。细胞培养是指将采集体内组织的细胞模拟体内生长环境，放置在无菌、一定营养条件、适宜的温度及酸碱度下，使其生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种技术。细胞培养技术的优点是可以直接观察活细胞的形态结构、生命活动及其变化；提供大量生物性状相似的试验对象，特别是研究大型动物（奶牛）时具有耗资少的优点。但模拟体内环境仍与实际有很大的差异，因此利用细胞培养技术的试验结果不可以轻易做出与体内等同的结论。 动物组织（细胞）培养开始于20世纪初，现已成为生物、医学研究及应用广泛采用的技术方法[1 ]。随着细胞培养技术的不断发展，现在也广泛应用于动物生产研究。20 世纪60 年代，该技术应用于水产动物的病毒分离和纯化，对于鱼类疾病的防治具有重要作用。近年来研究发现单一种子细胞难以完成构建复杂组织的需要，因此产生了联合培养细胞技术。联合培养下的细胞之间存在着精细的相互调控关系，因而更符合仿生学的原理且更有利于种子细胞的增殖与分化，为复杂的细胞诱导分化以及体外组织构建提供了新思路、新方法[2 ]。 1 细胞培养 细胞培养是将活体组织或细胞从试验动物体内取出，放在模拟体内生存环境的体外环境（无菌、适温、营养丰富）中，使高体细胞生长、发育的一种方法。按照培养的结构成分不同，将其分为组织培养、细胞培养及器官培养等。根据细胞是否在支持物上生长，将其分为贴壁型和悬浮型。一般来说，圆形细胞如淋巴细胞属于悬浮型，而胞体梭型（成纤维型细胞）、扁平不规则（上皮型细胞）等属于贴壁型，贴壁型细胞必需贴附在支持物表面生长。细胞培养开始于1906 年，Harrison 用蛙新鲜淋巴液培养蛙胚神经组织4 周，首次成功地利用体外培养液培养神经元，标志着组织细胞的体外培养模式的基本建立。随着细胞培养技术的不断发展和完善，20 世纪50 年代进入繁盛阶段，细胞培养逐渐被基础研究与应用领域所应用，特别是在医学领域得到迅速的发展。目前，细胞培养技术已经涉及到生物学、农业、环境保护等领域[ 3 ]。 目前，在细胞培养过程中，只能根据离体细胞的特点和培养条件，提供满足其生长和发育的一些基本生理条件。必须在无菌条件下进行，细胞感染微生物后，会因被夺营养物质而导致细胞生长缓慢或停滞，甚至死亡。需要提供适宜的温度和pH，一般哺乳动物细胞培养的温度控制在37 ℃，鱼类的温度要低一些。温度过高或过低时，均不利于细胞生长甚至会导致细胞死亡。动物细胞最适宜pH一般控制在7.2~7.4，在此范围细胞生长活跃，增殖速度快，如果过低或过高性，细胞会因为细胞膜受损而死亡。细胞离体培养技术的关键是细胞培养液的设计，理想的细胞培养液可以同时解决细胞离体培养所需要的pH、渗透压、营养物质、调节物质的全部需要。细胞培养液中需含有细胞增殖、生长所需要的各种营养物质。如提供能量的物质（N源、C源）、代谢调节控制的物质（无机盐、维生素、激素）。另外，在细胞培养过程中需要提供一定量的气体（O2和CO2）。CO2具有调节pH和缓冲的作用，一般提供5% CO2。
新疆农业大学 专业文献综述 题目: 细胞和分子水平上动物细胞培养的研究进展 姓名: 郑峰 学院: 食品科学与药学学院 专业: 食品科学 班级: 13级研究生 学号: 1340020279 成绩： 指导教师: 武运教授 2014年2 月20 日
细胞和分子水平上动物细胞培养的研究进展 摘要：利用动物细胞大规模培养技术可生产多种生物制品，为提高细胞活力和细胞生长密度，采用有多种添加成分的无血清培养基培养细胞，选择既有利于细胞生长又可提高培养细胞密度的微载体和条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器，在线监控细胞生存环境和生理活动，减少培养过程中培养基的抑制因素，从而给细胞提供更好的生存环境;另外通过向细胞中导入抗凋亡基因，可减缓细胞凋亡的发生，提高细胞活性和蛋白产量，本文从分子水平和细胞水平两方面进行综述。 关键词：动物细胞;培养环境;DNA;微载体 Research advance in large-scale culture of animal cells at the level of Molecule and Single Cell Abstract:Many biological products were manufactured by means of large -scale culture of animal cells. To increase cell-specific productivity and cell density, serum-free media supplemented with several nutriments were used for cell culture, and micro carriers were chosen in favor of cell growth and high cell density. Bioreactors with simple manipulation, good qualification and aeration were adopted. More suitable conditions for cell growth could be given through on-line supervising the environment for cell growth and restraint factors in cell culturing. Furthermore, the anti -apoptosis genes using recombinant DNA technology can increase cell viability and productivity. Porous micro carriers was emphasized in large -scale culture of animal cells. Key words:animal cell; culture environment; DNA; micro carrier 组织培养技术是19世纪末由胚胎学技术衍生而来。近一个世纪以来，从能维持组织存活到生长出新细胞，从少数组织到各种组织细胞的培养，从精细的实验室培养技术到大规模的生产工艺，组织培养技术已成为生物制品生产以及基因工程等领域必不可少的工具之一。目前，动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、细胞培养环境的优化、生物反应器的改良、改变细胞特性、提高产品的产出率与保证其质量上。在动物细胞大规模培养的过程中，最根本的是使细胞的培养条件达到最优化，尽可能消除或减轻环境对细胞的
?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
基因工程与生物药物 姓名：李华龙 班级：生物制药1301 学号：1302150003
摘要 自1972 年DNA重组技术诞生以来,生命科学进入了一个崭新的发展时期。以基因工程为核心的现代生物技术已应用到农业、医药、轻工、化工、环境等各个领域。它与微电子技术、新材料和新能源技术一起,并列为影响未来国计民生的四大科学技术支柱, 而利用基因工程技术开发新型生物药物更是当前最活跃和发展迅猛的领域[ 1]。从1982年美国Lilly 公司首先将重组人胰岛素投放市场,标志着世界第一个基因工程药物的诞生。基因工程制药作为一个新兴行业得到各国政府的大力支持, 各国都积极研究和开发各种基因工程药物,并取得了丰硕成果。本文通过对基因工程药物的开发、应用和研究方法等研究进展进行综述。Abstract Since 1972, DNA recombinant technology was born, life science has entered a new period of development.Gene engineering as the core of modern biotechnology has been applied to agriculture, medicine, light industry, chemical industry, environment and other fields . It and microelectronic technology, new materials and new energy technologies together, tied for the four future beneficial to the people's livelihood the big pillar of science and technology, and using genetic engineering technology to develop new biological drugs is the most active and rapidly developing field. From the United States in 1982 Lilly's first recombinant human insulin on the market, marking the birth of the world's first gene engineering medicine. Genetic engineering pharmaceutical as an emerging industry has received great support from governments the countries are actively research and development of various genetic engineering drugs, and achieved fruitful results. In this paper, through the development of gene engineering medicine, research and Application Research progress is reviewed in this paper. 关键词 基因工程、生物药物、研究进展、应用 Genetic engineering、biological medicine、research progress,、application
一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
多克隆细胞系的研究价值 J6-1人白血病细胞系30年的研究 【摘要】 J6-1细胞系是我国建立的第一株人白血病细胞系，是EBV和HHV-6双重感染的多克隆细胞系。J6-1细胞系建系30年来，从J6-1细胞克隆了许多细胞因子、受体及其他基因，提供了许多有关白血病细胞性质和功能的信息，从而衍生出多项研究课题，而所有这些显示出多克隆细胞系特有的研究价值。本文就30年来J6-1人白血病细胞系的研究作一评述，包括J6-1细胞系的异质性和多克隆性，J6-1细胞群体的生存机制和J6-1细胞系的异常细胞间通讯及其意义，以及J6-1细胞系的启示。 【关键词】白血病细胞系、细胞克隆 Research Value of Multi clone Cell Line： A Comment for the 30th Anniversary of J6 1 Human Leukemic Cell Line ——Editorial Abstract J6-1 cell line is the first leukemic cell line established in China. It is a multi clone cell line infected with both EBV and HHV-6. Many cytokines, receptors and other genes were cloned from J6-1 cell line since its establishment 30 years ago. Valuable information on leukemic characteristics and functions were obtained from the studies on this cell line, which could be categorized into several research subjects. These achievements implied the unique research value of multi clone cell lines.This comment focuses attention on research advance of the J6-1 leukemic cell line in 30 years, including heterogeneity and multi cloning of J60-1 cells, survival mechanism of J6-1 cell populations, abnormal intercellalar communication of J6-1 cells with its significance and inspiration from J6-1 cell line. Key words leukemic cell line; multi clone cell line; herpes virus infection; leukemic cells characterization、Cells cloned J6-1细胞系为EBV和人类疱疹病毒 6型(HHV-6)双重感染的多克隆细胞系，30年来J6-1细胞系提供了大量有关白血病细胞性质和功能的信息，在长期研究中我们体会到多克隆细胞系有其独特的性质，应该继续发挥其研究价值。J6-1细胞系的研究带动了对于白血病等一系列疾病的治疗，在疾病治疗领域奠定了一定的基础。 1、J6-1细胞系的异质性和多克隆性 1.1 J6-1细胞系的异质性
细胞工程在生物制药中的应用 摘要：细胞工程是生物制药工业中的关键技术，它是利用动物细胞体外培养和扩增来生产生物产品，或者作为发现和测试新药的工具。本文综述了细胞工程发展的历史、现状和未来，以及它在生物制药领域中的应用和局限。 关键词细胞工程；生物制药 Abstract: Cell Engineering biopharmaceutical industry is a key technology, which is the use of animal cells in vitro and amplified to produce biological products, or as a tool for discovering and testing new drugs. This article reviews the history, present and future, as well as its applications and limitations of cell engineering development in the biopharmaceutical field. Keywords: cell engineering; biopharmaceutical 1.动物细胞技术的历史 在疫苗产业早期，往往利用动物来生产疫苗，如用家兔人工感染狂犬病毒生产狂犬疫苗，用奶牛来生产天花疫苗，用某些细菌接种到动物身上来生产抵抗该种细菌的疫苗。在1920年至1950年，已经开发了多种病毒或细菌疫苗，如伤寒疫苗、肺结核疫苗、破伤风疫苗、霍乱疫苗、百日咳疫苗、流感疫苗和黄热病疫苗等。 早在1950年代，已经能够利用动物细胞培养技术来生产病毒。先在反应器中大规模培养动物细胞，待细胞长到一定密度后，接种病毒，病毒利用培养的细胞进行复制，从而生产大量的病毒，这一突破
大规模培养细胞技术
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大规模培养细胞技术 摘要：细胞培养工作始于20世纪初，现已广泛应用于生物学、医学各个领域，成为细胞与组织研究的重要技术之一。近年来，随着基因工程和细胞工程技术的不断发展，动物细胞培养已成为大规模生产一系列有商品价值的生物制品的重要宿主，当前人们已经能够生产多种单克隆抗体、激素、细胞因子、病毒疫苗和具有特殊功能的效应细胞等。但是，实验室采用的细胞培养技术获得的细胞量有限，不能满足生产的需求，必修改用超产培养技术方法方可获得大量细胞，目前这种技术种类繁多，归纳起来有三大类：①贴壁培养法；②悬浮培养法；③固定化培养法。细胞体外培养技术的不断发展和完善，为组织和器官培养以及现代生物技术前沿的转基因动物技术、克隆技术、干细胞定向分化、体外受精、性别控制等一系列技术的发展奠定了基础。 关键词：细胞培养；贴壁；悬浮；固定化 前言 动物细胞培养开始于本世纪初1962年，动物细胞培养规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，动物细胞培养已成为医药生物高技术产业的重要部分。利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。本文对细胞的培养工艺做一综述。 1.细胞培养的定义 细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。 在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤成纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无限制制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的细胞系其这一特征可以不明显。
细胞培养用生物反应器 细胞培养用生物反应器 2010年12月22日 1、发展大规模细胞培养及其生物反应器 借助于细胞培养进行各种产品生产已是我国生物技术产业化的重要组成部分，涉及医药、化工、轻工、食品、农业、海洋、环保等行业。培养的细胞不仅只是微生物，用于生物技术产品生产的动物细胞、植物细胞和藻类细胞大规模培养已引起了大家重视，显露出令人鼓舞的前景。而且随着生物技术的发展，在人类今后发现的一切具有生物活性的物质都可以借助于细胞培养方法得到。它们可以是细胞代谢产物、生物转化、酶或某基因表达产物。 此外，随着人类社会经济发展，如果没有基于科技进步的大力开发，能源和资源将难以支撑人类社会进一步发展的目标，人类社会的发展必须将基于碳氢化合物的经济转变为基于碳水化合物的经济。这种能源结构和资源结构的转变将直接关系到我国经济的可持续发展，社会的稳定、和国家安全。解决上述问题的最有效方法就是发展工业微生物，只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再生资源碳水化合物转变为现代社会所需要的化工原料和能源。 显而易见，要进行这些产品的生产，无不涉及到细胞代谢与大规模培养研究。为了提高生产水平，除了获得高生产能力的细胞株外，生物反应器是重要的核心技术，必需提供有利于生物过程研究的装置技术和高效节能的生产装置。但是在生物技术产业化平台中，细胞大规模培养技术等中下游技术是我国最薄弱的技术环节之一，以我国生物医药等领域产业化来说，与先进国家的差距是全面的。滞后的一个重要原因之一就是缺乏相配套工艺的工业化放大技术研究和相应的装备技术支撑。例如以哺乳类细胞培养技术来看，西方国家基因工程抗体的开发已经进入大规模细胞反应阶段，细胞工程研究规模已经达到1000L以上，基因工程抗体的生产反应系统最大规模达到20000L以上。相形之下，我国多数药物开发单位的细胞反应规模仍停留在2-30L规模，100L 的培养技术还不稳定，长期以来都是照抄照搬国外的技术和进口国外设备。国内只能生产一些低档装置, 仅靠科研成果模仿和基础科学的跟随。 与其他各行业的装备制造业一样，生物反应器为生物技术产业再生产和扩大再生产提供共性技术和关键技术，它的发展水平也反映了国家在科学
动物细胞培养生物反应器的操作模式 米力 第四军医大学细胞工程中心，国家863西安细胞工程基地 陕西西安，710032 动物细胞培养工艺的选择首先考虑的重要一点是该产品所涉及的生物反应器系统。选择反应器系统也就是选择产品的操作模式，操作模式选择将决定该产品工艺的产物浓度、杂质量和形式、底物转换度、添加形式、产量和成本，工艺可靠性等。与许多传统的化学工艺不同，动物细胞反应器设备占整个工艺资金总投入的主要部分（＞50%），也就是说动物细胞培养工艺的选择主要部分是生物反应器系统的选择。选择反应器系统及培养工艺时，必须对工艺的整体性进行全面考虑，主要包括以下几个方面：细胞株及生长形式、产物表达量和稳定性，培养基质及代谢物，产物分离和纯化难度等。 动物细胞大规模培养的生物反应器操作模式，一般分为分批式操作（batch）、流加式操作（Fed-batch）、半连续式操作（semi-continuous）、连续式操作（continuous）和灌流式操作（perfusion）五种操作模式。 1. 批式操作（batch culture） 批式操作是动物细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。 该方式的特点:(1) 操作简单。培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，