环境微生物的检测与分析
实验报告
实验一土壤微生物拮抗菌的分离与测数
一、实验目的
1、熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。
2、初步掌握从土壤中分离微生物和测数的基本方法。
3、了解培养基的配制原理，掌握其配制过程和方法。
4、掌握实验室几种灭菌方法及技术。
5、掌握无菌操作技术。
6、了解平板菌落计数的原理。
7、识别土壤中几大类微生物的菌落特征。
8、学习拮抗作用的试验方法，观察微生物间的拮抗现象及抗生素的抗菌作用。
二、实验材料
1、器材：电子天平、带有玻璃珠的三角瓶、摇床、1mL的无菌吸管、10mL的刻度试管、无菌水、搪瓷缸、玻璃涂棒、牛角匙、pH试纸、封口膜、记号笔、线绳、纱布、培养皿、高压蒸汽灭菌器、称量纸、药匙、试管架、涂布棒、酒精灯、超净工作台、火柴。
2、试剂和材料：无菌牛皮纸袋、无菌铲、标签、打孔器，镊子，牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、75%酒精、KNO
3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、蒸馏水、新鲜马铃薯、10%酚酞、乳酸。
三、实验步骤
（一）培养基的配制
（1）配制牛肉膏蛋白胨（NA）培养基
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基。
配方如下：牛肉膏 3 g 蛋白胨 10g NaCl 5g 琼脂 15-20g 水 1000 mL pH 7.4-7.6
1、称量药品
按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入搪瓷缸中。牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入搪瓷缸。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2、加热溶解
在搪瓷缸中加入少量少于所需的水量，然后放入锅中，在电磁炉上小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则需先调pH值后再溶解琼脂，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。
3、调pH
用pH试纸或酸碱度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH，边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1 mol/l HCL进行调节。pH调节通常放在加琼脂之前。注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4、过滤
液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。
5、分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约至试管高度的 1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。
6、加棉塞
试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要适合，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长3/5塞入试管口或瓶口内，以防止棉花脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽、塑料塞或封口膜代替棉塞。
7、包扎
加塞后，将三角瓶的棉花外包一层牛皮纸或双层报纸，以防止灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉花塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
8、灭菌
将上述培养基于121摄氏度湿热灭菌30 min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
9、摆斜面
灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜面的
长度不超过试管总长的1/2；待其凝固，
10、无菌检查
将灭菌的培养基放入37摄氏度温箱中培养24~48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱或清洁的橱内，备用。
（2）、配制高氏一号培养基
高氏一号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。
配方如下：可溶性淀粉20g KNO3 1 g NaCl 0.5 g K2HPO4 0.5 g MgSO4·7H2O 0.5g FeSO4·7H2O 0.01 g 琼脂20g 蒸馏水1000mL pH7.4~7.6
1、称量和溶解
先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入搪瓷缸中，并用少量冷水将其调成糊状，再加少许少量少于所需的水量，放入锅中在电磁炉上边加热边搅拌，至其完全溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配制成高浓度的储备液后再加入，方法是先在100 ml 水中加入
1g的FeSO4·7H2O，配成0.01 mg/ml的储备液，再在1000 ml的培养基中加入以上储备液0.1 ml即可。待所有的药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2、pH 调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同上。
（3）配制马铃薯蔗糖培养基
马铃薯蔗糖培养基是用于分离真菌的选择培养基。
配方如下：去皮的马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂20g 蒸馏水1000mL，自然pH
1、称量和溶解
先计算后称量，按用量称取各成分。将去皮的马铃薯切片后放入锅中，然后加少许少
于所需的水量在电磁炉上加热20 min，然后用双层砂布过滤，滤液重新放入锅中煮沸，然
后加入称量好的蔗糖和琼脂，待各成分溶解后，补充水分至所需体积。
2、同（2）2
（二）制备土壤稀释液
（1）取土壤
取表层以下 5~10 cm 处的土壤样品，放入灭菌的牛皮纸袋中，用铅笔填写好标签，袋内外各具一张。
（2）土壤预处理及保存
将采集的样品带回实验室平摊在聚乙烯塑料布上，在室温下阴干，土块捏碎，并检出植物根、茎、叶及石块等杂物，约20号筛筛分。土壤处理好后备用，或放在4摄氏度冰箱暂存。
（3）制备土壤稀释液（要无菌操作）
1、制备土壤悬液
取土样 5 g，迅速倒入带玻璃珠的45 mL无菌三角瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底为最好），置摇床中振荡 5~10 min，使土样充分打散，即成 10-1的土壤悬液。
2、稀释
用无菌移液管吸10-1的土壤悬液0.5 mL，放入4.5 mL 无菌水中，震荡混匀即为10-2稀释液，如此重复，可依次制成10-2 ~10-9的稀释液。注意：操作时移液管尖不能接触液面，每一个稀释度换一支移液管，每次吸土液，要将移液管插在液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。
实验三变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析技术及其在微生物
种群多样性研究中的应用
一、实验目的
1、了解并掌握变性梯度凝胶电泳的原理。
2、掌握变性梯度凝胶电泳分析植物内生菌种群多样性。
二、实验材料
1、实验材料
生长健壮的植株。
2、实验仪器
PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、变性梯度凝胶电泳仪（仪器型号：Decode Universal Mutation Detection System）、凝胶成像及分析系统、高速离心机。
3、实验试剂
（1）CTAB-NaCl
4.1 g NaCl称溶解在80 mL水中，再缓慢加入10 g 的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热65℃溶解搅拌，定容至1000 mL。
（2）50×TAE 缓冲液
121 g Tris，18.6 g EDTA，量取28.6 mL冰醋酸，加水至500 mL，pH 8.5。
（3）10% APS（过硫酸铵贮存液）
10 mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL 。
（4）TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)
10% APS：TEMED = 4.5：1
（5）变性剂贮存液(0%)：6%丙烯酰胺
100 mL 溶液：15 mL 40% Arc/Bis，2 mL50×TAE 缓冲液，加水至100 mL。
（6）变性剂贮存液(100%)：6%丙烯酰胺
15 mL 40% Arc/Bis；2 mL 50×TAE 缓冲液；40 mL去离子甲酰胺；42 g尿素，加水
至100 mL。
（7）溴化乙锭EB溶液
50mg溴化乙锭溶于100ml双蒸水，工作浓度为0.5μg/ml，避光保存。
（8）固定液1
50 mL无水乙醇加入去离子水至500 mL。
（9）固定液2
5 mL硝酸加入去离子水至500 mL。
（10）0.12%银染试剂
0.18g AgNO3加入去离子水至150 mL，同时加入110 μL 37%-40%的甲醛混匀即可，需新鲜配制。
（11）显色液
4.5g Na2CO3加入去离子水至150 mL，需新鲜配制，4℃冰箱保存备用，用前加入75 μL甲醛构成显影液。
（12）终止液
15 mL冰乙酸加入去离子水至500 mL。
4、PCR扩增引物
第一轮PCR引物：fM1: 5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’和rC5: 5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’
f515-GC:5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGGTGCCAGCM GCCGCGGTAA-3’和rC5: 5’-TAA TCCTGTTTGCTCCCCAC-3’
三、实验步骤
（一）基因组提取及PCR扩增
1、总基因组的提取
采用改良的CTAB法提取植物样品的总基因组DNA，方法如下：
（1）将预处理后的2 g样品在无菌研钵内用液氮充分研磨至细粉末状，称取0.2 g样品装入1.5 ml 无菌的eppendorf管中。
（2）加入1 mL CTAB提取液（65℃预热），立即混匀，65℃水浴90 min，每间隔20-30 min轻轻颠倒eppendorf管混匀一次，12000 rpm 4℃离心10 min。
（3）取上清，加2/3体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒数次充分混匀，12000 rpm，4℃，离心10 min，如此重复至上层变澄清。
（4）取上清，加2/3体积的氯仿/异戊醇（24：1），颠倒数次充分混匀，12000 rpm，4℃离心10 min。
（5）取上清，加1/10体积的NaAC溶液和1个体积的无水乙醇（-20℃预冷），在-20℃下沉淀30 min以上，8000 rpm离心5 min。
（6）弃上清，用70%酒精洗涤沉淀2次，8000 rpm离心5 min，真空干燥15 min。
（7）加50 μL TE溶液或ddH2O溶解DNA，取5 μL 上样，1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存。
2、16srDNA基因序列的PCR扩增
巢式PCR（Nested PCR）是使用两对PCR引物扩增目的DNA片段，第二对引物称为巢式引物，扩增的目的片段包含在第一次PCR扩增片段的内部，保证第二次PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增。因为第二对引物要用于DGGE电泳分析，根据DGGE电泳的原理，上游引物的5’端加上一段40 bp 左右的GC碱基序列（5’-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG-3’）。
巢式PCR第一次PCR以总基因组为模板，扩增出内生菌的目的基因片段，第二次PCR 以第一次PCR产物为模板，并且退火温度较高。
反应体系如下：
10×PCR Buffer 2.5 μL
dNTP Mixture(10 mM) 0.5 μL
Primer1 (10 pmol/μL) 1.0 μL
Primer2 (10 pmol/μL) 1.0 μL
DNA模板 1.0 μL
Taq （5 U/μL）0.2 μL
ddH2O 18.8 μL
Total 25 μL
反应条件为：
94℃4min
94℃1min
50℃1min 30cycles
72℃1min
72℃8min
8℃∞
（三）DGGE电泳
采用Decode Universal Mutation Detection System（Bio-Rad，USA）对PCR扩增产物进行电泳分离。具体步骤如下：
1、胶槽的组装
先用95%乙醇清洗两块玻璃板及两个间隔条，再用蒸馏水清洗一遍，干燥。将间隔条置于大玻璃板两侧边缘并且缺口处放在内侧，再将小玻璃板放在上面并与之对齐，用夹子将两块玻璃板固定，并调水平及垂直平衡。
2、DGGE胶的制做
采用6%丙烯酰胺凝胶，根据不同目的片段的大小将0%和100%的变性剂按照相应的比例配置不同的高浓度和低浓度的变性缓冲液，分别取高浓度和低浓度的变性剂溶液20 mL，加90 μL的 4.5 μL/mL 10% APS和20 μL的lμL/mL的TEMED（APS：TEMED =4.5:1），立即颠倒混合均匀。将高浓度变性剂溶液和低浓度变性剂溶液分别吸入相应的针筒，并固定在梯度形成器对应的高低浓度两侧，将出胶针头置于胶板之间。推动梯度形成器，将胶灌入两个玻璃板之间，注意避免产生气泡。灌胶结束后，在胶板顶部小心倾斜插入梳子(避免产生气泡)，静置1.5-2 hr待胶凝固。及时将针筒中剩余的溶液排净并清洗干净。
3、电泳
在DGGE电泳槽中加入7L新鲜配置的1×TAE缓冲液，使电泳槽中的缓冲液页面至“Full”和“Run”中间的位置，将胶板固定在黄色的凝胶板架上，放进电泳槽中，最后将温度控制器盖在电泳槽上。接通电源，打开电泳仪预热使缓冲液的温度达到60℃。轻轻将梳子拔出，将加样孔中的缓冲液用加样针吸出，缓缓加入约30 μL 第二次PCR产物与6×Loading Buffer的混合液，100V电压电泳12 hr。
4、染色
DNA染色采用银染试剂盒进行银染，具体过程包括以下步骤：
a) 固定1：将凝胶加入固定液1，轻轻摇动孵育10 min，小心弃掉液体；
b) 固定2：加入固定液2，轻轻摇动孵育3 min，小心弃掉液体；
c）用去离子水漂洗三次，每次5 min；
d）银染：加入0.12%银染试剂暗处孵育20 min，弃液；
e）去离子水冲洗两次，每次2 min，充分倒掉去离子水；
f）显色：加入显色液，轻轻摇动孵育5-20 min，进行显色；
g）终止反应：当显色步骤中凝胶条带清晰时，立即倒掉显色液，加入入终止液。
5、拍照快速银染后，进行DGGE凝胶图片的拍照。
四、实验结果分析与讨论
在提取质粒的环节，我们小组最终提取出来的质粒由于含量较少，所以最终肉眼看不到。我们在做PCR之前稀释的倍数较少，以尽量减少DNA浓度的过度降低。
我们在提取质粒的时候，由于没有带口罩以及消毒的措施，很容易造成所提取的质粒降解，使DNA浓度下降。上图为聚丙烯酰胺凝胶电泳的跑胶图片，从荧光带整体上看，实验结果还不错，由于每个小组提取的DNA的浓度不同，所以PCR和DGGE电泳之后额条带效果会存在差异。
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
中国海洋大学本科生课程大纲 课程属性：公共基础/通识教育/学科基础/专业知识/工作技能，课程性质：必修、选修 一、课程介绍 1.课程描述： 随着各种环境问题的日趋严重，微生物实验技术在环境领域得到广泛应用和迅速发展，为人们改造环境和保护环境提供重要的技术手段。本课程以环境工程领域常用的微生物实验技术的教学为主要内容，并以具体的环境问题为依托，使学生掌握专业知识在实践中的应用，提升学生的实践技能。 Microbiology experimental technology has been widely used and rapidly developed in the environmental field with the increasingly serious environmental problems. It plays an important role in transforming the environment and protecting the environment. The main teaching contents of the course are the common microbiology experimental technologies in various environmental issues. The course will enable students to master the professional skills. 2.设计思路： 本课程主要学习和掌握环境领域常用的微生物实验技术，了解其在环境保护和环境改造过程中的实践应用及其重要作用。课程内容的设置注重实用性和可操作性，分为基础实验部分和综合实验部分。基础实验部分以常用微生物实验技术的学习为重点，并注重实验内容的系统性和连贯性；综合实验部分以具体环境问题为依托，进行微生物实 - 7 -
环境工程微生物学讲义 本课程是环境学院各专业学生的专业基础课；与另一门课《环境微生物学实验》相结合，构成一个完 整的体系；本课程强调每个学生要动手，通过实验，加深对讲课内容的理解和记忆；本课程内容分两大部分：一是微生物学的基础知识；二是微生物学在环境领域中的应用。 绪论 主要内容： 环境微生物学的研究对象和任务研究对象研究任务微生物学概述微生物的定义微生物的特点原核微生物与真核微生物微生物的命名与分类第一节环境工程微生物学的研究对象和任务一、环境微生物学的研究对象定义：环境微生物学是研究与环境领域（包括环境工程、给水排水工程）有关的微生物及其生命活动 规律。?其内容包括：微生物个体形态、群体形态；细胞结构功能、生理特性、生长繁殖、遗传变异 等；微生物与环境的关系（尤其是微生物与污染环境之间的关系）；微生物对物质的转化分解作用（特 别是应用微生物来处理各种污染物质，如废水、废气和固体废弃物）。二、环境工程微生物学的研究任务 总的归纳起来有两大方面的任务： （1）防止或消除有害微生物 （2）充分利用有益的微生物资源 三、微生物在环境污染治理（水处理）中的应用
１）在环境监测方面（水污染的监测） 利用在环境中生存的生物的种类、数量、活性等特征，来判断环境状况的好坏。这些生物称为指示生 物。 生物监测的优缺点： 生物监测的主要优越性： (a)长期性——汇集了生物在整个生活时期中环境因素改变的情况，可以反映 当地的环境变化； (b)综合性——能反映环境诸因子、多成分对生物有机体综合作用的结果； (c)直观性——直接把污染物与其毒性联系起来； (d)灵敏性——有时甚至具有比精密仪器更高的灵敏性，有助于提早发现环境 污染。生物监测的主要缺点： (a)定量化程度不够； (b)需要一定的专业知识和经验。 ２）在环境治理方面 包括水、大气、固体废弃物处理方面其中特别在水处理方面，有着大量成功应用的例子。 第二节微生物概述一、微生物的定义 微生物是指所有形体微小，用肉眼无法看到，须借助于显微镜才能看见的，单细胞或个体结构简单的 多细胞，或无细胞结构的低等生物的统称。 Too small to be seen with naked eyes 二、微生物的特点
环境中微生物的检测和分离纯化 姓名：王韬 班级：生76 组号：7-2组 同组人：袁堂谧 实验日期：2009-11-12 一、实验目的： 1.熟悉常用微生物培养基配置方法。 2.联系无菌操作技术。 3.学习单菌落划线分离法。 4.通过实验认识环境中微生物的分布。 二、实验原理： 1.微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的 过程称微生物的分离与纯化。常用的是平板分离法。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、温度和氧的条件要求不同，而供给他们适宜 的培养条件，或加入某些抑制剂造成一支其他菌生长而利于此菌生长的环境。 2.平板菌落计数法：平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分 分散成单个细菌，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长 繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品的一个单细胞。该计数法 最大的优点是可以获得活菌的信息。 三、实验材料： 土壤悬液（稀释100倍），未知菌菌落平板，无菌水，取液器，培养箱，培养皿，无菌涂棒，接种环，接种针，酒精灯。 四、实验步骤： (一)培养基的制备（提前准备）： 肉汤蛋白胨培养基： 牛肉膏 2g 蛋白胨 4g NaCl 2g 蒸馏水 400mL 琼脂 8g 1.称量：按上述配方称量各类物质。 2.溶解：在400mL水中溶解牛肉膏、蛋白胨和NaCl，混合加热溶解。 3.调pH值：调至7.2-7.4 4.过滤（本实验无需过滤） 5.加凝固剂：加入称量好的琼脂，混合均匀。 6.分装 7.包扎和灭菌 8.倒平板 (二)从土壤中分离微生物 1.采土样（已事先准备）：选择较肥沃的土壤，铲去表层土，挖5-20cm深度的或
(一)、概述 食用被微生物污染的食品而导致的疾病，称作食源性疾病。导致这类疾病的微生物叫食源性致病菌。随着人们居住和卫生条件的不断改善，以及抗生素的滥用，人类对病菌的抵抗能力却在不断下降，食源性疾病一直呈上升的趋势。因此，对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性，常规的检验大多依靠培养目标微生物的方法来确定食品是否受到此微生物的污染，这些方法需要一定的培养时间，少则2～3天，多至数周，才能确定。而现行有效的一些快速检测方法不仅可以大大缩短检测时间提高微生物检出率并可用于微生物计数、早期诊断、鉴定等方面，以做到快速、简便、准确。快速方法包括了微生物学、分子化学、生物化学、生物物理学、免疫学和血清学等领域。 （二）、常见、常用的快速、简便的检测微生物数量的方法如下： 1、活细胞计数的改进方法 （1）、旋转平皿计数方法 （2）、疏水性栅格滤膜法（HGMF）或等格法（isogrid method） （3）、血膜系统（Pertrifilm） （4）、酶底物技术（ColiComplete） （5）、直接外荧光滤过技术（DEFT） （6）、“即用胶”系统（SimPlate） 2、用于估计微生物数量的新方法 （1）、阻抗法 （2）、A TP生物发光技术 3、其他方法 （1）、微量量热法 （2）、接触酶测定仪 （3）、放射测定法 （三）、食品中沙门氏菌的快速筛检方法 1、沙门氏菌显色培养基法 2、免疫学方法 3、分子生物学方法 4、自动传导法 （四）、大肠杆菌O157：H7快速检测方法 大肠杆菌O157：H7肠出血性大肠杆菌的主要血清型，自1982年在美国被分离并命名以来，陆续发现本菌与轻度腹泻、溶血性尿毒综合症、出血性肠炎、婴儿猝死综合症等多种人类病症密切相关，是食源性疾病的一种重要致病菌。E.coli O157：H7属于肠杆菌科埃希氏菌属，为革兰氏阴性杆菌，有鞭毛。近年来作为食品卫生及流行病学的研究热点，E.coli O157：H7的分离和鉴定方法已取得了较大进展。利用其生化特征、免疫原性建立的方法以及现代分子生物学技术的应用，可以从多方面对E.coli O157：H7进行检测。 1、E.coli O157：H7鉴别培养基及显色培养基 2、免疫学检测方法 3、分子生物学方法 （五）、金黄色葡萄球菌的快速检测方法 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈普通串状排列无芽孢，无鞭毛，不能运动。该菌在自然界中分布广泛，如空气、水、土壤、饲料和一些物品上，是最常见的化脓性球菌之一，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌食物中毒是其肠毒引起的，目前已确认的肠毒素至少有A,B,C1,C2,C3,D,E和F8个型。由金黄色葡萄球菌肠毒素引发的中毒爆发事件，近年来
实验三环境微生物的检测 一、实验目的 1.了解周围环境中微生物的分布情况。 2.懂得无菌操作在微生物实验中的重要性。 3.了解四大类微生物的菌落特征。 二、实验原理 在我们周围的环境中存在着种类繁多的、数量庞大的微生物。土壤、江河湖海、尘埃、空气、各种物体的表面以及人和动物体的口腔、呼吸道、消化道等都存在着各种微生物。由于它们体积微小，人们用肉眼无法观察到它们个体的存在。但是只要稍加留意，我们就可以在发霉的面包、朽木上看到某些微生物群体。这些现象表明，自然界只要有微生物可以利用的物质和环境条件，微生物就可以在其上生长繁殖。据此，我们在实验室里就可以用培养基来培养微生物。 培养基是用人工配制的、适合微生物生长繁殖和产生代谢产物用的混合养料。其中含有微生物所需要的六大营养要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、气体和水分。此外，根据不同的微生物的要求，在配制培养基时还需用酸液或碱液调节至适宜的pH。配制好的培养基必须进行灭菌。所谓灭菌是指采用各类的物理或化学因素，使物体内外的所有微生物丧失其生长繁殖能力的措施。经过灭菌后的物体是无菌的。消毒是与灭菌完全不同的概念，它是指用较温和的物理因素杀死物体表面和内部病原微生物的一种常用的卫生措施。 灭菌的方法较多，广泛使用的是高温灭菌，其中最常用的是高压蒸汽灭菌法。此法是把待灭菌的物品放在一个可密闭的加压蒸汽灭菌锅中进行的。在1.05kg/cm2的蒸汽压力下，温度可达121℃。一般只要维持15~20min，就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。 微生物的接种技术是生物科学研究中的一项最基本操作技术。为了确保纯种不被杂菌污染，在整个接种过程中，必须进行严格的无菌操作。在实验过程中必须牢固树立无菌概念，经常保持实验台及周围环境的清洁，严格无菌操作，避免杂菌的污染，这是保证实验成功的必要条件。
江苏自考环境工程大纲-环境微生物学 河海大学编 (高纲号 0727) 一、课程性质及其设置目的与要求 （一）课程性质和特点 《环境微生物学》课程是江苏省高等教育自学考试环境工程专业（独立本科段）的一门基础专业课程，它的特点是包括了生物化学、有机化学和生态学等多学科交叉的一门课程。本课程系统地介绍环境微生物学的基本知识和理论、基本技术和方法。 本课程在内容上分为四篇，第一篇是介绍了环境微生物学基础，包括特点、任务、分类、生长与代谢、遗传与变异、分布及其相关关系和微生物在物质循环中的作用。第二篇是介绍了微生物治理环境，包括降解与转化、污水的生物处理、废渣与废气的生物处理、生物修复、开发应用和资源化。第三篇是介绍了微生物环境污染，包括致病微生物、代谢产物与环境污染和微生物与水体富营养化。第四篇是介绍了微生物环境监测，包括指示微生物、污染物生物毒性的微生物学检测方法、污染物致突变性的微生物检测方法和微生物监测技术的新发展。 通过学习应考者可以了解环境微生物学的基本理论，掌握微生物学在治理环境污染中的基本技术和基本方法，并能够应用在具体的科学研究和实际工作中，为环境微生物学的发展培养专业人才。 （二）本课程的基本要求 通过本课程的学习，应考者应达到以下要求： 1、了解环境微生物学的基本知识； 2、理解微生物学在治理环境污染中基本作用； 3、掌握微生物学在治理环境污染中基本方法和技术； 4、熟练掌握微生物学中常见术语的名称和意义。 （三）本课程与相关课程的联系 本课程的前修课程是生物化学、有机化学和生态学。这三门课程可以帮助学生理解环境微生物学的基本知识，更好地掌握微生物学在治理环境污染中的基本方法和技术。同时为在工作和研究中的具体应用打下良好的基础。 二、课程内容与考核目标
环境微生物学知识点 教材：环境工程微生物周凤霞白京生主编化学工业出版社 单元知识一绪论 1.环境问题与可持续发展 概念现状 2.微生物作用 微生物概念微生物作用（有益、有害） 3.微生物特点 个体小繁殖快种类多结构简单易变异 单元知识二环境微生物主要类群 1.原核微生物 ①细菌（形态结构及作用 ②放线菌（形态菌落培养污泥丝状膨胀的类型） ③蓝细菌（特征作用水华、赤潮类别） 2.真核微生物 ①酵母菌（类型结构特征应用 ②霉菌（类型结构特征应用特种污水处理优势 ③真核微型藻类（分类作用水华、赤潮类别） 3.原生动物 ①鞭毛虫（形状特征指示性作用） ②肉足虫（形状特征分类指示性作用） ③纤毛虫（形状特征分类 ④包囊（形成原因过程指示性作用） 4.微型后生动物 ①轮虫（形状特征分类指示性作用） ②线虫（形状特征分类指示性作用） ③水蚤（形状特征分类指示性作用） 5.病毒 ①病毒特征 ②病毒结构 ③繁殖（5 ④溶原性 单元知识三微生物原理 1.微生物营养 ①营养要素（5大要素 ②营养类型（4个） ③培养基（原则分类作用生化营养保证） 2.生长曲线（曲线多周期过程及对比分析 3.环境因素影响（温度ph 4.微生物代谢（酶 5.遗传变异（遗传变异污泥驯化） 单元知识四微生物生态
1.微生物环境分布（土壤大气水体） 2.微生物间关系（共生互生寄生拮抗 3.微生物与物质循环（C N P 循环污水处理中应用）单元知识五微生物的环境污染 1.水体富营养化（水华赤潮） 2.产生毒素 单元知识六微生物在水污染治理中的作用 1.污水生物处理分类（好氧厌氧兼氧） 2.活性污泥法（微生物组成净化机理培养驯化） 3.生物膜法（微生物组成净化机理培养驯化）
微生物检验（完整版） 名解 微生物：是一群个体微小结构简单肉眼不能看见的微小生物的总称 种：亲缘关系较近的微生物群体在进化发育阶段上有一定的共同形态和生理特征 微生物学：生物学的一个分支是研究微生物在一定条件下的形态结构生理生化遗传变异特性及微生物的进化分类生态等生命活动规律以及微生物之间与人类动植物自然界互相关系的一门科学 抗生素：是由某些微生物在代谢过程中产生的能抑制或杀灭某些其他微生物和肿瘤细胞的微量生物活性物质 细菌素：是某些细菌菌株产生的一类具有抗菌作用的蛋白质 条件致病菌：正常菌群在宿主体内具有相对稳定性一般不致病 消毒：指杀死物体上的病原微生物但不一定能杀死细菌芽孢的方法 灭菌：指杀灭物体上所有的微生物的方法 防腐：指防止或抑制微生物生长繁殖的方法 无菌：指没有货的微生物的存在 质粒：是细菌染色体外的遗传物质也是环状闭合的双联DNA分子比染色体小存在于细胞质中可自主复制 突变：是指细菌遗传物质的机构发生突然而稳定的改变所致的变异现象可遗传给后代 基因转移：外源性物质由供体菌转入受体细胞内的过程 基因重组：供体菌的基因进入受体菌细胞并在其中自行复制与表达或矛受体菌DNA整合在一起的过程 病毒：是一类个体微小结构简单只含一种核酸只能在活的易感细胞内以复制方式增殖的
非细胞型微生物 复制周期：病毒的增殖被人为分成吸附穿入脱壳生物合成装配成熟与释放七个步骤的完整过程 缺陷病毒：是指因病毒基因组不完整或因基因某一点改变而不能进行正常增殖的病毒 顿挫感染：病毒进入宿主细胞若细胞缺乏病毒复制所需的酶能量和必要成分等则病毒无法合成自身成分不能够装配和释放子代病毒的现象 干扰现象：两种病毒感染同一种细胞时可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象 人工自动免疫：是将疫苗等免疫原接种于人体刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答使机体获得特异性免疫力 人工被动免疫：是指注射含某种病毒特异性中和抗体的免疫血清等一系列细胞因子是机体立即获得特异性免疫 干扰素：是由病毒或干扰素诱生剂作用于中性粒细胞成纤维细胞或免疫细胞产生的一种糖蛋白 致病性：一定种类的病原微生物在一定的条件下能在特殊的宿主体内引起特定疾病的能力半数致死量：在规定时间内通过一定途径能使一定体重或年龄的某种动物半数死亡或感染需要的最小病原体数量或毒素量 急性感染：发作突然病程较短一般是数天或数周 局部感染：病原体侵入机体后局限就在一定部位生长繁殖引起病变的一种感染类型 毒血症：致病菌侵入宿主体后只在机体局部生长繁殖病菌不进入血液循环但其产生的外毒素入血引起特殊的毒性症状 败血症：致病菌侵入血流后在其中大量繁殖并产生毒性产物引起全身性毒性症状 内毒素血症：革兰阴性菌侵入血流并在其中大量繁殖崩解后释放出大量毒素也可有病灶
环境微生物学实验报告 一、实验目的 （1）了解普通光学显微镜的构造及原理，掌握显微镜的操作及保养方法。（2）观察、识别几种原核微生物。真核微生物的个体形态，学会生物图的绘制。 二、实验器皿与材料 （1）器皿：显微镜、擦镜纸、二甲苯。 （2）材料：示范片：细菌三形（球状、杆状、螺旋状）、弧状（硫酸盐还原菌）、丝状（浮游球衣菌等）、细菌鞭毛及细菌荚膜。放线菌、颤蓝细菌、微囊蓝细菌或念珠蓝细菌等。 三、实验步骤 （1）将标本片放在载物台上，使观察的目的物置于圆孔正中央。（2）将镜头换成低倍镜，将粗调节器向下旋转（或载物台向上旋转），眼睛注视物镜。当物镜的尖端距离载玻片约0.5cm 处时停止旋转。 （3）左眼对着目镜观察，将粗调节器向上旋转，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细调节器调节，直至目的物清晰。此时找到目的物并移至中央。（4）换成高倍镜，观察目的物，旋转细调节钮，直至视野清晰。（5）观察示范片，绘出其形态图。 四、思考题 （1）使用油镜时，为什么要先用低倍镜观察？答：为了
找到目的物并移动到中央。 （2）要使视野明亮，除采用光源外，还可采取哪些措施？ 答：调大孔径光阑，调整光源。如果是用反光镜的显微镜，用凹面镜可使视野明亮。 五、生物图 实验二、微生物培养基的配制与灭菌 一、实验目的 （1）熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。 （2）了解配置微生物培养基的基本原理，掌握配置、分装培养基的方法。（3）学会各类物品的包装、配置（稀释水等）和灭菌技术。 二、实验器皿与材料 （1）实验器皿：高压蒸汽灭菌器、干燥箱、煤气灯、培养皿、试管、刻度移液管、锥形瓶、烧杯、两桶、药物天平、玻璃棒、玻璃珠、石棉网、药匙、铁架、表面皿、pH试纸和棉花等。 （2）材料：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、NaOH和琼脂等。 三、实验原理 培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，由碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁及微量元素和水，按一定的体积分数配置而成。调整合适的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。由于微生物种类及代谢类型
环境微生物监测标准操作规程 一、监测指征 1．感染暴发或感染流行时，环境因素在感染传播中有流行病学意义。 2．监测潜在的危险环境状况，证明有危险的病原体存在或证明危险的病原体已被成功清除。 3．当某项感染控制措施改变时，评估其效果；或者根据规范要求，仪器设备或系统启用时监测。 4．目标性监测的需要。 5．循证医学证据支持。 二、空气监测(沉降法) (一)采样时间：消毒处理后与进行医疗活动之前。 (二)采样高度：距地面垂直高度80～150 cm。 (三)采样点设置 1．非洁净房间：室内面积≤30 ㎡，在对角线上设里、中、外3点。里、外两点位置各距墙1 m；室内面积>30 ㎡，设东、西、南、北、中5点。其中东、西、南、北4点均距墙1 m。9 cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露5 min后送检培养。 2．洁净房间：清洁房间在空态或静态条件下，根据房间的不同清洁级别进行布点，操作按照GB 50333—2002。9cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露30 min后送检培养。 (四)采样注意事项 1．采样人员做好手部卫生，佩戴口罩、帽子等个人防护装备。进入清洁房间采样须穿洁服。 2．皿盖打开顺序应先内后外；手臂及头不可越过培养皿上方；行走及放置动作要轻，尽量减少对空气流动状态的影响；皿盖应扣放，以防污染。 3．采样结束后，由外向内合上皿盖。 4．采样完毕的培养皿应在6 h内培养。 (五)实验室检验 1．培养皿在37℃培养48 h后，进行菌落计数和致病菌检验。普通营养琼脂培养基的配制按照GB／T 4789．28—2003；菌落计数方法按照GB\T 7918．2—1987；致病菌检验：溶血性链球菌检验按照GB／T 4789．11—2003，沙门菌检验按照CB\T 4789．4—2003，铜绿假单胞菌检验按照GB／T7918．4—1987，金黄色葡萄球菌检验按照CB\T 7918．5—1987,， 2．计算结果：非洁净房间以100 c㎡的平皿在空气中暴露5 min即相当于10 L 空气中的细菌数，计算公式为： 细菌数(cfu／m3)=1 000÷(A／100×t×10／5)×N=50 000N／At 式中：t——平皿暴露于空气中的时间(min)；N—一培养后平皿上的菌落数(cfu／平皿)；A——所用平皿的面积(c㎡)。 洁净房间直接以“个／(30 min·Φ90)”平皿为单位计算结果。 (六)结果判断： 参照GB 15982—1995《医院消毒卫生标准》。 三、物体表面监测 (一)采样时间： 消毒处理后4 h内。 (二)采样方法 被采样本面积<100 c㎡取全部表面；如采样面积≥100 c㎡，连续采样4个位置(不可有重叠)，每个位置采5 cm×5 cm的大小，用浸有无菌生理盐水的棉拭子1支，在规格板内横竖往返均匀涂擦各5次，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子投入10 ml无菌生理盐水试管内。不规则的物体表面，用棉拭子直接涂擦，采样面积≥30 c㎡ (三)采样注意事项
绪论 一、名词解释 1、微生物 微生物是所有形体微小，用肉眼无法看到，需借助显微镜才能看见的单细胞或个体结构简单的多细胞或无细胞结构的低等生物的统称。 “微生物”不是一个分类学上的概念，而是一切细小的、肉眼看不见的微小生物的总称。 2、原核微生物 原核生物：①细胞核发育不完善，只有DNA链高度折叠形成的一个核区，仅有核质，没有定形的细胞核，称为拟核或拟核。②没有特异的细胞器。③不进行有丝分裂。 二、选择题 1．微生物分类中基本的分类单位是（ D ）。 A、科 B、属 C、目 D、种 2．各种微生物具有一些共同点，下列选项中描述错误的是（ C ） A．分布广，种类多B．适应强，易变异C．体积小，表面积小D．生长速，繁殖旺 5．所有微生物的共同特征是（ C ）。 A、单细胞 B、没有真正的细胞核 C、个体微小 D、细胞结构简单 6．在分类系统中，细菌和蓝细菌皆属于（ A ）。 A、原核生物 B、真核生物 C、多细胞 D、单细胞 三、填空题 1. 微生物的命名采用双名法，即由一个___属名____和一个___种名____构成；书写排列上，____属___名在前，___种___名在后。 四、简答题 1. 真核微生物与原核微生物的差异表现在哪些方面？它们各自包括哪些主要类群？ 原核生物：①细胞核发育不完善，只有DNA链高度折叠形成的一个核区，仅有核质，没有定形的细胞核，称为拟核或拟核。②没有特异的细胞器。③不进行有丝分裂。 真核生物：①细胞核发育完善，有核膜将细胞核和细胞质分开，核内有核仁和染色质。②有高度分化的细胞器，如线粒体、中心体、高尔基体、内质网、溶酶体和叶绿体等。③能进行有丝分裂。原核微生物：细菌、古菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体 真核微生物：藻类、真菌（酵母菌、霉菌）、原生动物、微型后生动物 五、论述题 3. 结合微生物的特点，分析微生物在环境保护和环境治理中起着举足轻重的作用。 1、微生物在环境保护和治理中的作用： 保持生态平衡 污染物的降解 废水、废气、废渣的处理 污染水体、土壤的生物修复 2、研究内容包括： 微生物学基础知识 环境工程中的微生物原理 饮用水卫生细菌学 自然环境物质循环与转化 水体和土壤的自净作用 污染水体治理、污染土壤的修复等环境工程净化
微生物学实验总结 高熹 1120152430 时间如清风般从你我指间滑过,无声无息,快得我们都不曾驻足一望,莫然回首间,本学期的微生物学实验已接近尾声。一学期的时间虽短，但老师的谆谆教诲、同学们的良好配合和严格的实验操作，都将为微生物学实验课程画上一个完美的句号。 众所周知，微生物学是一门实验与理论高度结合的科目，是一门以实验为基础与生活生产息息相关的课程。需要我们不断地做实验，在实验中观察、分析相应的结果。所以我认为，要做好微生物学实验要有以下的四个能力： 1、独立思考能力 我想，在这个过程中，其中一个重要的感悟就是独立思考的重要性。当在试验中发现与预料过程所不符，那么必定是过程中出现错误，而寻找并解决的这个过程是书本中无法给予的。做实验绝对不能人云亦云，要有自己的看法，这样就要有充分的准备，若是做了也不知道是个什么实验，那么做了也是白做。在实验过程中，自己看书，独立思考，最终解决问题，从而也就加深了我们对课本理论知识的理解，达到了“双赢”的效果。 2、突破创新能力 实际上，在弄懂了实验原理的基础上，我们的时间是充分的，做实验应该是游刃有余的，如果说创新对于我们来说是件难事，那改良总是有可能的。试着通过自己现有的知识，多想，多做，多总结，我想首先是作为一个求知者在追求知识的道路上必须坚守的原则，其次就是要敢于突破，我们都站在巨人的肩膀上，踮起脚尖即使触不到天空，也可以更加拓宽自己的视野。 3、现代信息技术的使用能力 在微生物学实验学习中，有很多特殊的、特定的实验，如有毒有害物质参与且不易排污的实验、不易操作或难以成功的实验、需要反复观察的实验、反应慢导致单位课时中难以完成的实验等。我们在研究改进措施的同时，也可以借助于现代信息技术手段制作视频资料或多媒体课件进行辅助学习。 4、动手能力 动手操作对激发微生物学学习兴趣、帮助理解微生物学知识、培养解决问题能力、创新能力等具有重要作用。尤其是微生物学这样一种学科，动手能力的强弱与知识的掌握其实是同等重要的。如果动手能力太弱，所学习到的知识就无法通过有效的方式真正组织起来，那么学到的知识就只是输入而没有输出，只有理论而没有实践，对于这样一门学科，这样的缺陷是致命的，而这样的能力是必须具备的。 本学期我们一共完成了十个实验，分别是：显微镜油镜的使用、细菌形态观察和细菌的革兰氏染色、放线菌、酵母菌、霉菌的形态观察和微生物的显微镜计数法、培养基的制备、周围环境中微生物的观察以及从土壤中分离纯化微生物、 细菌生长曲线的测定、环境因素对微生物生长发育的影响、细菌鉴定中常 用的生理生化反应、微生物的诱变育种、水中大肠菌群的计数—MPN法、乳酸菌发酵实验、甜酒酿发酵实验、固定化酵母细胞发酵啤酒实验。 通过这些微生物学实验，不仅是对我理论课程的加深，更是对我实验能力的
微生物检测手段及注意事项
微生物检测手段及注意事项 微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文对生长量测定法、微生物计数法、生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常用的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其他生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，通常情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长通常指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和他们的生长抑制紧密相关。所以有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而
测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，可以从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 1. 微生物计量法 1.1 体积测量法 又称测菌丝浓度法，通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10 mL）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5 min）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法 可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10~20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1~5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40 ℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（Activity Dry Yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。
空气、物表、器械、医务人员手微生物检测参考标准 一、空气微生物污染检验方法 采用平板暴露法操作 结果计算：按平均每皿的菌落数报告：CFU/(皿·暴露时间)。 结果判断： Ⅱ环境： 手术室、供应室、计生手术室、产房、眼科治疗室 、婴儿室、 ≤4.0cfu/皿（15min ） Ⅲ环境 各科治疗室、处置室、ICU 、胃肠镜室、儿科病房、妇科检查室、急救室、 化验室血库、口腔科。 ≤4.0cfu/皿（5min ） 二、物体表面微生物污染检查方法 检测方法： 把采样管充分震荡后，取不同稀释倍数的洗脱液1.0ml ，接种平皿，将冷至40℃~45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15~20ml,36℃±1℃恒温培养箱48h ，计数菌落数，必要时分离致病性微生物。（采样面积都为100cm 2） 结果计算： 物体表面菌落总数（CFU/cm 2）= 结果判断： Ⅱ环境： 手术室、供应室、计生手术室、产房、眼科治疗室 、婴儿室。 ≤5.0cfu/cm 2 平均每皿菌落数×采样液稀释倍数 采样面积（cm 2)
Ⅲ环境各科治疗室、处置室、ICU、胃肠镜室、儿科病房、妇科检查室、急救室、化验室血库、口腔科。≤10.0cfu/cm2 三、消毒医疗器材的检验方法 检验方法： 把采样管充分震荡后，取不同稀释倍数的洗脱液1.0ml，接种平皿，将冷至40℃~45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15~20ml,36℃±1℃恒温培养箱48h，计数菌落数，必要时分离致病性微生物。 检验标准 1、高度危险性医疗器材应无菌 2、中度危险性医疗器材的菌落数应≤20 CFU/件（CFU/g或CFU/100cm2）,不得检 出致病性微生物。 3、低度危险性医疗器材的菌落数应≤200 CFU/件（CFU/g或CFU/100cm2）,不得 检出致病性微生物。 （1）、高度危险性物品： 手术器械、穿刺针、腹腔镜、活检钳、心脏导管、植入物等。 （2）、中度危险性物品： 胃肠道内镜、气管镜、喉镜、肛表、口表、呼吸机管、麻醉机管道、压舌板、肛门压力测量导管、直肠压力测量导管等。 （3）、低度危险性物品： 听诊器、血压计、袖带、病床围栏、床面以及床头柜、被褥、墙面、地面、痰盂（杯）和便器等。 四：医务人员手卫生
微生物学实验报告 （格式标准参考） (生命科学专业，生物技术专业) 教师：黎勇
目录索引 实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 (3) 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 (4) 实验三常用培养基的配制 (6) 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别 (7) 实验五、微生物大小的测定与显微计数 (9) 实验六环境中微生物的检测和分离纯化 (10) 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应 (12) 实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化 (13) 课程名称：微生物学实验班级：化生系生命科学本科
实验日期：指导教师：黎勇 实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1.N·A=n·sinα 2.D=λ/2N.A 3.目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。 4.用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis. S.arueus菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕： （一）油镜的使用 镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）仔细观察并绘图取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。 （二）细菌的简单染色法：涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察（三）细菌运动性的观察取洁净盖玻片，四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。（描绘时按视野实际大小5－10倍绘制） 菌名：大肠杆菌菌名：金黄色葡萄球菌 放大倍数：100×10（×5）放大倍数：100×10（×5） 特殊结构：无特殊结构：无 视野观察下微生物的形态 2、油镜使用时为什么必须干燥装片？
环境中微生物的检测和分离纯化 一．实验原理 1.微生物的分离与纯化 土壤中含有丰富的微生物，可以从中分离纯化得到很多有价值的菌株。 微生物常用的分离方法是平板分离法，根据某种微生物对生长条件的不同要求供给它适宜的培养环境，再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直到得到纯菌株。 2.平板菌落计数法 将待测样品经适当稀释后，其中微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中含的菌落数。 二．实验材料与试剂 1.土壤稀释溶液 2.取液器（1000ml 1支），培养箱，培养皿（12个），无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂 棒，接种环，1000ml无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架。 三．实验步骤 （一）.无菌平板制备 1.采用叠皿法把牛肉冻蛋白膏培养基倒入灭好菌的培养皿中，制作无菌平板 （二）.周围环境中微生物的检测 2.取一平板，分成6个区，做好标记。同一个人同一根手指头按如下要求用力一致进 行操作：分别用未洗过的手指头，自来水打湿的手指头，自来水认真洗过的手指头，洗手液洗过一遍的手指头，洗过两遍的，洗手液洗过又用酒精棉球消毒后的手指头 在六个区上涂抹。（平板1） 3.取一平板，分区，分别用使用过的纸巾，硬币，旧纸币，餐卡在不同区拖动。（平 板2） 4.在培养基上方抖动头发数次。（平板3） 5.取一平板，分区，用无菌接种环分别蘸一滴自来水，河水，豆浆在不同区划线。（平 板4） 6.用无菌牙签取一点牙垢在培养基上划线。（平板5） 7.取两个平板，一个打开在实验台上放置30分钟，另一个在酒精灯火焰边打开皿盖1 分钟。（平板6） 8.取一平板，打开盖，咳几下。（平板7） （三）.从土壤中分离微生物 1.采土样 2.制备土壤稀溶液 3.涂布 吸取100ml稀释好的土壤稀溶液，较均匀地滴在平板上，再用无菌涂棒涂布均匀，涂1—2分钟 4.培养 将培养基平板倒置于37℃下培养24小时 5.菌落计数 四．实验结果
学习指南一、预修课程 环境学、生物化学。 二、授课对象 环境工程、环境科学以及其相关专业本科生。 三、课程结构 （一）理论课结构 （二）实验课结构
四、课程内容 环境微生物学是微生物学与环境科学相互渗透而产生的一门交叉学科。该课程拟系统论述环境微生物学的主要类群、基本理论及其在环境领域的重要作用。以微生物的起源与进化为线索，介绍病毒和亚病毒、细菌、放线菌、蓝细菌、古菌、真菌、原生动物、微型藻类等微生物类群；讨论微生物的营养与代谢、微生物的生长繁殖与遗传变异、微生物生态、微生物与物质循环等基本理论；探析微生物与环境污染、微生物与环境净化、微生物与环境工程、微生物与环境监测等环境微生物的重要作用。 环境微生物学也是一门实践性很强的学科。该课程拟通过验证性实验，使学生巩固课堂知识，掌握单元操作技术（如显微镜观察技术、细胞染色技术、无菌操作技术等）；通过综合实验，使学生学会“组合拳”，联合运用多种单元技术（土壤微生物分离与纯化、微生物对含氮和不含氮有机物的降解与转化、活性污泥或生物膜中生物相的观察等）；通过设计性实验，使学生熟悉科研过程，善用微生物学理论和实验解决实际问题（水质细菌学检查、空气中微生物检测、发光细菌急性毒性试验等）；并通过示范性实验、参观性实验和多媒体演示性实验，使学生了解现代微生物技术，拓宽专业视野。 五、学习方法 [课堂学习] 按教学日历，课前做好课程内容的预习；课中认真听课，做好关键知识点的记录。遇到不理解的问题，及时向教师请教。 [课后学习] 根据课堂内容、教师课件以及课程网站，及时整理笔记，搞清知识点，使课堂所学内容系统化。 [授课练习] 根据课程内容，查阅资料，检索文献，确定重点，制作PPT，预习演讲，通过授课和讨论，培养自主学习能力，拓展专业知识面。
《环境微生物检测——采样方法》场景剧本题目：环境微生物检测——采样方法 主题曲、插曲待定 影片主要角色： 男1号梁总，25岁，业务主管（西装革履） 男或女2号小李，20岁，采样组组长（休闲） 女3号小黄，20岁，前台靓女（时尚的靓女） 男3号** 客户，25岁，（带领的衣服）（演成搞笑的土豪人物） 男或女4号：小王，19岁，某学校的顶岗实习生 第一场： 场景：公司前台（汇标公司的前台，甲在埋头做报表，乙在打电话和客户沟通，前台靓女在接水） 时间：上午 人物：前台靓女、客户，前台靓女以及同事两三个。 从门外来了一个大约25岁男性在张望。前台靓女赶紧走出来打开门。 前台靓女：您好。 客户：这里是汇标检测公司吗？ 前台靓女：是啊，有什么可以帮到您？ 客户：我是来自大中国建筑集团有限公司的××。最近我们一个大楼要竣工验收，需要对水质进行检测，你们能做吗？我们不差钱。 前台靓女指引客户坐下，倒一杯水。 前台靓女：这些业务我们做过很多。我们是第三方检测公司，有对该项目进行检测的资质，严格按照国家标准做的。 客户：对水质都监测什么呀？ 前台靓女：《建筑给水排水及采暖工程施工质量验收规范》GB50242-2002中明文规定：
“4.2.3 生活给水系统管道在交付使用前必须冲洗和消毒，并经有关部门取样检验，符合国家《生活饮用水标准检验方法》方可使用。 生活饮用水标准检验方法GB/T5750 – 2006，具体包括13个分项。包括水样采集和保存、感官性状和物理指标、有机物指标、消毒副产品指标、金属指标和微生物指标等等。 对建筑工程竣工验收水质检测，我们一般取pH、色度、浑浊度、臭味、肉眼可见物、总游离氯、耗氧量、菌落总数、大肠菌群等指标。 客户：听起来很专业，好！我信赖你们公司。 前台靓女：那麻烦您去我们主管办公室对签订合同有关事宜进行协商。 第二场： 场景：办公室 时间：某上午 人物：业务主管梁总、采样组组长小李 梁总：小李，这里刚接和大中国建筑集团有限公司签了一个合同。这可是一个大客户，你们要认真对待。你赶紧安排人过去采样吧。 小李：好的。我会尽快安排人过去采样。您放心吧。 第三场： 场景：公司走廊 时间：某上午 人物：采样组组长小李，实习生小王 小李：小王，我们明天要去广州海珠区琶洲那边对一个大楼的自来水进行采样，你准备一下。 小王：好的。我会马上去做。 第四场： 场景：实验室 时间：任意 人物：小李