华南师范大学实验报告
学生姓名何茂辉学号20062501302
专业生物科学年级、班级06科三
课程名称细胞生物学实验实验项目
实验类型□验证□设计□综合实验时间09 年 6 月9 日
实验指导老师尤蓉、周仁超实验评分
细胞中过氧化物酶的显示
细胞凋亡的形态学检测与观察
实验目的：
1.掌握显示细胞中过氧化物酶反应的原理和方法。
2.了解细胞凋亡的生物学意义
3.掌握凋亡细胞的形态学检测方法
实验原理：
1.细胞内的过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。中间产物蓝色联苯胺是不稳定的，无需酶的参加即可氧化为棕色化合物。
2．细胞凋亡是指细胞在生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的、高度有序的，基因控制的，一系列酶
参与的过程。
3.凋亡细胞形态学特征是:体积变小,细胞质浓缩;细胞核发生染色质凝聚和聚集于核膜周围(边缘化);细胞膜有小泡状形成;晚期细胞膜内陷形成大小不同的凋亡小体;根据细胞凋亡形态学特征进行显微观察是检测细胞凋亡的一种直观、可靠的方法。
实验步骤：
细胞中过氧化物酶的显示
1、在载片上滴一滴PBS缓冲液；
2、取骨髓细胞：用断颈法处死小鼠，立即剪取后肢，去除肌肉，剥出后肢股骨，剪开股骨一端，用牙签尖的一端插入剪开的小孔中，抠取少许骨髓细胞置滴有PBS的载片上；
3、涂片：用另一玻片将骨髓细胞沿一个方向涂布推开，室温晾干；
4、媒染：在涂片上滴0.5％硫酸铜液，以盖满涂片为宜，处理30秒-1分钟。
5、倾去硫酸铜液，直接滴入联苯胺混合液反应6分钟（以盖满涂片为宜）
6、清水冲洗，番红复染2min。
7、镜检：清水冲洗，室温晾干，先低倍镜下观察，后换高倍镜下观察（油镜100×）
细胞凋亡的形态学检测与观察
吉姆萨染色:
1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)
2、生理盐水轻轻漂洗细胞
3、95%乙醇固定5min
4、PBS缓冲液洗2次
5、吉姆萨染色液染色5min
6、蒸馏水轻轻洗去染液
7、普通光学显微镜下观察。
吖啶橙染色:
1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)
2、生理盐水轻轻漂洗细胞
3、甲醇：冰醋酸（3：1）固定5min
4、PBS缓冲液洗2次每次1min
5、 0.01%吖啶橙染色液在避光环境下染色5min
6、蒸馏水轻轻洗去染液
6、选用蓝光激发滤片在荧光显微镜下观察。
结果与分析：
1、根据随机选择的几个视野的统计，该样品的细胞凋亡率=227/506×100﹪=44.9﹪
Hela细胞凋亡过程中核染色质过氧化物酶的分布图示
的形态变化（吖啶橙染色）
思考题：
1、细胞凋亡的调控机制
细胞凋亡是一个受基因调控、众多细胞膜受体和胞浆蛋白参与的细胞主动自杀过程，其触发因素多种多样，包括细胞内诱导因子和抑制因子对细胞凋亡的调控。
2、细胞凋亡的特征
凋亡细胞形态学特征是:体积变小,细胞质浓缩;细胞核发生染色质凝
聚和聚集于核膜周围(边缘化);细胞膜有小泡状形成;晚期细胞膜内陷形
成大小不同的凋亡小体。
3、研究细胞凋亡的方法
定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）
定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳。
实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。
实验目的： 1.了解凋亡细胞的形态学特征，加深对于细胞凋亡现象及本质的理解。 2.了解并掌握细胞凋亡检测的方法和基本原理。 实验原理： 细胞凋亡时，出现一系列形态学变化，包括凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状，染色质的DNA出现缺口甚至断裂，出现DNA碎片，并逐渐形成凋亡小体等，经相应的染色后可以在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察到这些变化。从而把凋亡的细胞和正常的细胞区分开来。
细胞凋亡是指细胞对环境的生理、病理性刺激信号、环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。细胞凋亡是一个主动过程，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下的自体损伤，而是为更好地适应生存环境的一种死亡过程。 1．细胞凋亡与细胞程序性死亡： 细胞程序性死亡的概念是指一个多细胞生物体中某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。例如蝌蚪变成青蛙，其变态过程中尾部的消失伴随大量细胞死亡，高等哺乳类动物指间蹼的消失、颚融合、视网膜发育以及免疫系统的正常发育都必须有细胞死亡的参与。这些形形色色的在机体发育过程中出现的细胞死亡有一个共同特征：即散在的、逐个地从正常组织中死亡和消失，机体没有炎症反应，而且这种死亡对整个机体的发育是有利和必须的。因此认为动物发育过程中存在的细胞程序性死亡是一个发育学概念，而细胞凋亡则是一个形态学的概念，但是一般认为这两个概念可以交互使用，具有同等意义。2．细胞凋亡与坏死的区别： 虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大、胞膜破裂、细胞内容物外溢、核变化较慢、DNA降解不充分、有局部严重的炎症反应。坏死是一个被动的过程，其细胞及组织的变化与凋亡有明显的不同。
万方数据
万方数据
万方数据
线粒体与细胞凋亡 作者：周艺群， 谷志远， ZHOU Yi-qun， GU Zhi-yuan 作者单位：浙江大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科,浙江,杭州,310006 刊名： 解剖科学进展 英文刊名：PROGRESS OF ANATOMICAL SCIENCES 年，卷(期)：2006,12(1) 被引用次数：14次 参考文献(17条) 1.樊廷俊;夏兰;韩贻仁线粒体与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理学报 2001(01) 2.赵云罡;徐建兴线粒体,活性氧和细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(02) 3.蔡循;陈国强;陈竺线粒体跨膜电位与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(01) 4.Hortelano S;Dallaporte B;Zamzami N Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition[外文期刊] 1997(2-3) 5.Marchetti P;Hirsch T;Zamzami N Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis 1996(11) 6.Marchetti P;Castodo M;Susin SA Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis[外文期刊] 1996(03) 7.Susin SA;Zamzami N;Castedo M Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease [外文期刊] 1996(04) 8.Chou JJ;Li H;Salvesen GS Solution structure of BID,an intracellular amplifier of apoptotic signaling[外文期刊] 1999 9.Ji HB;Zhai QW;Liu XY Transcription regulation of bcl-2gene 2000(02) 10.Tsujimoto Y;Shimizu S Bcl-2 family:Life or death switch 2000(01) 11.Zamzami N;Susin SA;Marchetti P Mitochondrial control of nuclear apoptosis 1996(04) 12.Ruth MK;Ella BW;Douglas RG The release of cytochrome c from apoptosis[外文期刊] 1997(5303) 13.Narita M;Shimizu S;ItoT Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome c release in isolated mitochondrial 1998(25) 14.Cosulich SC;Savory PJ;Clarke PR Bcl-2 regulates amplification of caspase activation by cytochrome C[外文期刊] 1999(03) 15.Bossy-Wetzel E;Green DR Caspases induce cytochrome C release from mitochondria by activating cytosolic factors[外文期刊] 1999(25) 16.Sutton VR;Davis JE;Cancilla M Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid,but not direct granzyme B-mediated caspase activation[外文期刊] 2000(10) 17.Stoka V;Turk B;Schendel SL Lysosomal protease pathways to apoptosis.Cleavage of bid,not pro-caspases,is the most likely route[外文期刊] 2001(05) 本文读者也读过(10条) 1.杨胜细胞凋亡机制简述[期刊论文]-科技信息（学术版）2007(26) 2.冯俊奇.李秀兰.白人骁.FENG Jun-qi.LI Xiu-lan.BAI Ren-xiao细胞凋亡机制研究进展[期刊论文]-国际生物医学工程杂志2006,29(1)
细胞凋亡的检测 细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着
细胞生物学实验报告 淋巴细胞分离和细胞凋亡诱导及形态学观察lymphocyte isolation and morphological observation of apoptosis induction 2012年6月2日
淋巴细胞分离和细胞凋亡诱导及形态学观察 lymphocyte isolation and morphological observation of apoptosis induction 摘要：目的了解细胞凋亡的原理，掌握离体诱导细胞凋亡的方法，及用普通光学显微镜和荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学变化，并从观察结果初步推断和识别凋亡细胞具体阶段。方法实验所用Hoechst 33342/PI双染检测细胞凋亡、Giemsa染色。结果实验结束后得到了染色的结果以及照片。结论所提取的淋巴细胞发生凋亡。 Abstract：Objective Understand the principles of cell apoptosis, master the methods of cell apoptosis induced by in vitro, and by ordinary optical microscopy and fluorescence microscopy observation of morphological changes of apoptotic cells and preliminary inferred from observations and identifying apoptotic cells specific stages. Method Experimental method used in,Hoechst 33342/PI double dye test and the Giemsa stain. Results Be dyed after the end of the experiment results and photos. Conclusions The extraction of lymphocyte apoptosis. 关键词：细胞凋亡、Giemsa染色、Hoechst 33342/PI双染。 Keyword：cell apoptosis、Giemsa stain、Hoechst 33342/PI double staining 1.实验原理 1.1 关于淋巴细胞的分离 外周血中淋巴细胞比重约为1.070，而红细胞和粒细胞的比重较大，为1.902左右。因此，利用相对密度为1.077±0.002的淋巴细胞分离液（称为分层液）离心，可使一定比重的细胞按相应密度梯度分布（使比重中较大的红细胞和粒细胞沉于管底，淋巴细胞浮于分层液与血浆的界面上），从而将淋巴细胞分离出来。 1.2 关于细胞凋亡 细胞凋亡又称编程性死亡或程序性死亡。细胞凋亡是多细胞生物体在发育过程中或在某些环境因子的作用下发生的受基因调控的主动的死亡方式。细胞凋亡对于多细胞生物个体的正常发育、保持自稳平衡、抵御外界各种因素的干扰及多种病理过程具有极其重要的意义，起着非常重要的作用。细胞凋亡是多种生理、病理因子参与的由凋亡相关基因启动的细胞程序性死亡过程，其中由氧应激造成大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生以及继发性细胞损伤过程在细胞凋亡中起着重要作用，如电离辐射或紫外线照射产生大量H2O2、OH-等。 细胞凋亡的诱导因子包括三大类： 1.物理因子：包括射线、较温和的温度刺激（如热激或冷激）等； 2.化学因子：包括活性氧基团和分子、重金属离子等； 3.生物因子：肿瘤坏死因子、生物毒素、抗肿瘤药物、DNA和蛋白质合成的抑制剂等。 细胞凋亡的主要特征包括： 1.染色质凝集、质膜出芽、核裂解及凋亡小体的形成。 2.DNA特异性降解成200bp或其整数倍片断，通过凝胶电泳形成梯状条带，称为DNA Ladder。 3.由于DNA特异性降解而产生大量3’-OH末端，可被末端脱氧核糖核苷酸移换酶介导的dUTP 缺口末端原位标记法（TUNEL）标记，从而产生亮绿色荧光等。
细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发
生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，
常用细胞凋亡检测方法（图） 转载请注明来自丁香园 发布日期：2012-02-16 13:41 文章来源：丁香通 关键词：丁香园生物专题义翘神州细胞培养点击次数：951 一、细胞凋亡的形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜 ①未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 ②染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3、透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细核红染。因此将Annexin-V 与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 方法
细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞： 姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调
亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别
(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 编辑整理： 尊敬的读者朋友们： 这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项）的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。 本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项的全部内容。
常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆,其实两者是不同的细胞死亡形式，大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来，细胞凋亡检测的方法不少，这里就总结下几种常用的检测方法. 细胞凋亡检测更多详情，点击查看不可不知的细胞检测方法——MTT 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落. (2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等.凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ～1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1）。 3 透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro—apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations)的空泡结构(图2）；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 图2
细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法 一、定性和定量研究 只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜） 进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。 二、区分凋亡和坏死 可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。 不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。 三、样品来源不同选择 组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。 四、细胞凋亡检测 1、早期检测: 1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4) 线粒体膜电位变化的检测 2、晚期检测： 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在 180-200 bp 的DNA片段。 对于晚期检测通常有以下方法： 1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记) 2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 3) T elemerase Detection (端粒酶检测) 3、生化检测： 1）典型的生化特征：DNA 片段化 2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记） 4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。 4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 植物凋亡细胞的形态学观察 实验二植物凋亡细胞的形态学观察一、实验目的 1、掌握细胞凋亡的概念、生物学意义。 2、掌握细胞凋亡与细胞坏死的区别。 3、掌握诱导和观察细胞凋亡的方法。 二、实验原理（一）概念凋亡(apoptosis) 一词来自希腊语， apo 指分离， ptosis 指落下。 凋亡的原意是枯萎的树叶或花瓣自然凋落。 1972 年澳大利亚昆士兰大学的 kerr 等人在许多组织中发现了一种散在的自发的细胞死亡现象，认为这是一种不同于细胞坏死的细胞生理性死亡，并首次提出了细胞凋亡的新概念。 多细胞生物在发生、发展过程中，为了保持正常的生理机能，一部分的细胞发生自发性细胞死亡，这种细胞死亡是被细胞内一系列相关的分子所调控，并伴随有典型的形态学改变，这种现象被称为细胞凋亡。 细胞坏死是细胞受到化学因素（如强酸、强碱、有毒物质）、物理因素（如热、辐射）和生物因素（如病原体）等环境因素的伤害，引起细胞死亡的现象。 细胞凋亡和细胞坏死的区别区别细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性病理性变化或剧烈损伤范围少数散在细胞大片组织或成群细胞细胞膜保持完整破损染色质凝聚在核膜下呈半月 1 / 4
状呈絮状细胞器无明显变化肿胀、内质网崩解细胞体积固缩变小肿胀变大凋亡小体有无基因组 DNA 有控降解，电泳图谱呈梯状随机降解，电泳图谱呈涂抹状蛋白质合成有无调节过程受基因调控被动进行（二）生物学意义①清除无用的、多余的细胞。 无用的细胞大多在发育早期阶段即发生凋亡。 如果发育过程中某些细胞产生过多，也会发生凋亡。 例如，人胚胎肢芽发育过程中指(趾) 间组织，通过细胞凋亡机制被清除而形成指(趾) 间隙。 ②清除受损、突变或衰老的细胞。 受损不能修复的细胞通过凋亡而被清除。 受病毒感染的细胞通过凋亡使DNA发生降解，整合于其中的病毒 DNA也随之破坏，阻止了病毒复制。 （三）主要特征凋亡细胞的主要特征是： ①染色质聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；②凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内溶物释放，故不会引起炎症；③凋亡细胞中仍需要合成一些蛋白质，但是在坏死细胞中 ATP 和蛋白质合成受阻或终止；④核酸内切酶活化，导致染色质 DNA 在核小体连接部位断裂，形成约 200bp 整数倍的核酸片段，凝胶电泳图谱呈梯状； ⑤凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。
线粒体与细胞凋亡 苑金香(潍坊学院生物系山东潍坊261043) 摘要 细胞凋亡是一种由基因控制的自主性死亡过程。近年来研究发现,线粒体在细胞凋亡过程中起重要作用,它可以通过改变膜通透性、释放凋亡活性物质等介导细胞凋亡。 关键词 线粒体 细胞凋亡 线粒体作为真核细胞能量代谢中心已为人熟知,然而近年来的研究发现,线粒体在细胞的另一重要生理活动 细胞凋亡中还扮演着重要角色。细胞凋亡即细胞程序性死亡(programmed cell death),是一种由基因编程调控的细胞主动自杀过程,细胞凋亡在胚胎发育、机体内环境的稳定、细菌和病毒感染细胞的清除过程中起重要作用,许多疾病的发生与细胞凋亡失控有关,而线粒体在细胞凋亡过程中起着重要作用。 1 线粒体膜的通透性改变与细胞凋亡 线粒体起着启动细胞凋亡的重要作用,其主要机制与线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transi tion pore,mtPTP)开放有关,mtPTP位于线粒体内膜和外膜的交界处,是一种由多种蛋白组成的复合体。mtPTP参与调节线粒体基质中的Ca2+、pH值电荷等,维持线粒体内环境的稳定性,保持氧化还原通路的畅通。mtPTP平时允许不大于0.15 104的小分子物质通过。当线粒体内Ca2+超载、自由基对线粒体膜造成氧化损伤,或者是能量产生下降时,均可引起mtPTP开放。在细胞凋亡发生早期,线粒体膜mtPTP打开,线粒体内膜电位( m)降低,一方面使得线粒体内的死亡促进因子(deathe-promoting factor,DPF)释放出来,促进凋亡的进行;另一方面,又使得细胞质进入线粒体基质,由此引起膜质子的转运异常,导致线粒体处于高渗状态,线粒体基质扩张,细胞骨架蛋白受压,直接导致细胞凋亡。 2 线粒体释放物与细胞凋亡 研究发现,线粒体内含有许多促死亡因子,包括细胞色素C,凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF),胱冬酶原及其他线粒体蛋白等。这些因子从线粒体中释放出来以后,以不同的方式参与到细胞凋亡的过程,影响细胞凋亡的进程。 2.1 细胞色素C的释放与细胞凋亡 1996年德克萨斯西南医学院研究中心王晓东研究小组发现细胞色素C参与细胞凋亡的过程。当细胞受凋亡信号刺激后,细胞色素C能迅速从线粒体释放到胞浆中,在细胞色素C含量丰富的细胞中,细胞将进入快速凋亡机制,释放出来的细胞色素C参与激活凋亡的酶通路,细胞内仍有许多未释放的细胞色素C,它们维持电子传递和有氧呼吸,从而产生足够的ATP,为细胞凋亡提供足够的能量。而在细胞色素C含量较少的细胞中,由于细胞色素C的大量释放,使电子传递链受阻,ATP产量骤减,无法提供足够的能量,因而使细胞走向与凋亡完全不同的坏死过程。 72h,凋亡细胞数从6.65%增加到16.42%;若处理96h 后,凋亡细胞数从4.71%增加到21.94%,这说明染料木黄酮可诱导前裂腺癌细胞的凋亡,通过这种办法可预防前列腺癌的发生。 另外,许多不同种类的化学物质(如亚硝胺类、杂环胺类、多环氮氢化物和糖醛核呋喃等)、外界微生物的侵袭、高温和放射线等化学的、物理的和生物的因素是影响癌细胞的生长和凋亡的外源性调节因素。还有一些常规使用的肿瘤化疗药物(如顺铂、维甲酸、羟基脲等)和 射线都可诱导多种肿瘤细胞凋亡。 4 结论 在正常机体内,细胞增殖和细胞凋亡处于一种动态平衡。故癌的发生和细胞的生与死密切相关。一方面,细胞的过度增殖导致了癌的发生,一些化学预防剂抑制癌发生的一个重要机制就是抑制细胞增殖;另一方面,细胞凋亡过程的失调也是癌发生的另一原因。研究细胞凋亡与癌发生的关系,进而诱导细胞凋亡对癌的预防具有重要的意义。 参考文献 1 Davis JN et al.Nutr Cancer,1998,32:123 131. 2 Li M et al.Cancer Epidemiol Biom Prev,2000,9(6):545 550. 3 方福德等.分子生物学前沿技术.北京医科大学、中国协 和医科大学联合出版社,1998,76 174. 4 贾旭东.细胞增殖和细胞凋亡和癌的发生和预防.国外 医学卫生学分册,2001,28(2):65 68. (B H) 17 2003年第38卷第5期 生 物 学 通 报
细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V 进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。