枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验
杨仕春2008113130
化学与生命科学学院
摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。
关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活
淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。
实验材料和方法
一、实验材料：
（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）
（二）培养基：
1、种子培养液
葡萄糖1%
Tryptone(胰蛋白胨)：1%,
Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%,
NaCl(氯化钠)：1%
调pH7.2
若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。
2、产淀粉酶发酵培养液
玉米粉 2 .0 %
黄豆饼粉1 .5%
CaCl 2 0 .02 %
MgSO4 0 .02%
NaCl 0 .25%
K2HPO4 0 .2%
柠檬酸钠0 .2%
硫酸铵0 .075%
Na2HPO4 0 .2 %
调节pH 值7 .0
（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）
（四）实验仪器
离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管
二、实验
1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。
2、种子斜面及种子液准备
–A. 挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。
–B. 将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（100KPa 20min ）。
–C. 在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培养液中（每支斜面接两瓶），37℃120r／min振荡培养16h作种子液。（6瓶/组）
3、发酵培养
–按15-20％的接种量接种于装有50mL已灭菌菌发酵培养基的250ml三角瓶中。37℃培养48h。
–在无菌操作条件下，每4h取样2mL，测定酶活。
40-48h酶活降低后结束实验。
三、α淀粉酶活性测定
（1）上清酶液：发酵液0.8ml 5000rpm/5min，吸取上清0.5ml备用。
（2）吸取0.1mL标准糊精溶液，转入装有0.3mL标准碘液的瓷板空穴中，以此作为比色的标准。
（3）在比色管中加入2％可溶性淀粉液20mL，加磷酸缓冲液5mL，在60℃水浴中平衡约5min，加入0.5mL上清酶液，立即计时，并充分混匀。
（4）定时（~15s）取出0.1mL反应液于预先盛有0.3ml比色标准碘液的比色瓷板孔内，当颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准孔色相同时，即为反应终点，记录时间t
四、计算酶活
计算淀粉酶活力
酶活力(U/mL) =(60/t×20×2%×n)÷0.5
?式中t为反应时间（分），
?n为酶液稀释倍数，
?0.5是使用的酶液量（mL），
?20是可溶性淀粉溶液体积ml
五、溶液配制
碘原液：
– 1.1克碘化钾加少量水溶解，加入碘0.55克，溶解后定容至25ml，贮于棕色瓶中；
0.02M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0）
–称取45.23g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、8.07g柠檬酸，用水溶解并定容至1000mL，配好后用pH计校正其pH至6.0。
比色用标准碘液：
–取碘原液2ml，加碘化钾20g，蒸馏水定容至500ml贮于棕色瓶中；2%可溶淀粉：
–称取可溶淀粉2克加少量水调成糊状，在搅拌下缓缓加入约70mL 沸水中，然后用水分次冲洗残余淀粉后加入沸水，继续加热煮沸至
透明（约20min），冷却后加水定容至100ml。（当天配制）。
标准糊精溶液
–称取分析纯糊精0.06克加少量水调匀，倾入80-90ml沸水中，冷却后加水定容到100ml
结果
α-淀粉酶产生的时间
在上述培养条件下，12小时之前蛋白酶活力较低，36小时达到高峰，继续培养至60小
时，酶活逐渐下降，结果见表1。
表α-淀粉酶活力与培养时间的关系
.
α-淀粉酶的活力随细胞的生长而增强，进入对数期后，酶活显著提高。
培养至36小时，随着芽抱、晶体的脱落亦即随着菌体的自溶，酶活达
到高峰。
参考文献
1.唐丽江，王振华，王迪.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri.Sci.2009,37(12):53
62-5363,5371
2. 陶文沂, 桧山圭一郎, 浜田信威, 竹西繁行, 冈田茂孝. 枯草芽孢杆菌糖化型α-淀粉酶的研究(Ⅰ)——糖化型淀粉酶的发酵生产条件及纯化[J]. 食品与生物技术学报, 1984, (02)
“生物制药技术实训”课程研究报告 项目一：产淀粉酶枯草芽孢杆菌 一实验原理 枯草芽孢杆菌的多数中都能产生大量的淀粉酶，较易得到分离。由于芽孢具有较强的抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中使芽孢杆菌得到很好的富集。利用该菌产淀粉酶的特性，选择以淀粉为碳源的分离培养基，菌体分泌的淀粉酶会使菌落周围的淀粉水解，滴加碘液即可在菌落周围出现清晰的透明圈。根据透明圈的直径（C）与菌落直径（H）之比（C/H）可初步鉴定酶活力的高低，即比值越大酶活力越高，进而筛选出优良的生产用菌。 二材料 灭过菌的种子培养基无菌生理盐水（杀了菌的生理盐水，盐浓度0.9％）培养基配方：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，水1L，淀粉，1. 8%的琼脂PH7.2-7.4，121℃灭菌20min（各量取其三分之一）。 三操作步骤 1.包平板 2.配生理盐水 3.根据培养基配方配置培养基，并取出45ml用于液体培养基，其余作为固体培养基 4.取1，2，3中配成的平板，生理盐水，大型三角瓶在121℃中灭菌20min
5．称取土壤10g与 90mL无菌水中，振荡20分，使土壤中菌体或孢子均匀分散，取其悬浮液于80℃下保持10min,以杀死非芽孢的菌体。取5ml悬浮液接入到装有45 ml种子培养基的三角瓶内，（于37℃、200 r/min摇床中）培养20 h 6.灭完菌后倒平板，自然冷却凝固后放入恒温培养箱中静致一夜，观察其是否染菌 7.将用于做梯度试验的试管8个，每个加9ml蒸馏水，移液管8个，塞棉花拿去灭菌121℃，20min 8. 取培养后的菌液，用无菌生理盐水适当稀释，取一定量涂布于平板，做梯度试验分别标记为100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10。 9.将标记的的试管，移取1ml与培养基中涂布并进行标记，于37℃，培养20h 10.将灭菌好的平板拿出，进行无菌划线，在培养基中观察到10-8，10-9，10-10，有单一菌落，而10-6，10-7并不明显，．对10-8，10-9，10-10的培养基中的菌落加碘液进行观察，发现有透明圈。
蛋白酶产生菌的筛选 组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌
二、实验内容 蛋白酶产生菌的分离 三、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL 无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇 床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液 管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂 瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。 五、操作步骤
（一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试 管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉 膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明 的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 （三）筛选 1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。
枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验 化学与生命科学学院 摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。 关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活 淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。 实验材料和方法 一、实验材料： （一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658） （二）培养基： 1、种子培养液 葡萄糖 1% Tryptone(胰蛋白胨)：1%, Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%, NaCl(氯化钠)：1% 调pH7.2 若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。 2、产淀粉酶发酵培养液 玉米粉 2 .0 % 黄豆饼粉1 .5% CaCl 2 0 .02 % MgSO4 0 .02% NaCl 0 .25% K2HPO4 0 .2% 柠檬酸钠0 .2% 硫酸铵0 .075% Na2HPO4 0 .2 % 调节pH 值7 .0
浅谈枯草芽孢杆菌 1. 抗生作用 抗生作用是指拈抗微生物通过产生代谢产物在低浓度下就能够对病原微生物的生长和代谢产生抑制作用，从而来影响病原微生物的生存和活动。近半个世纪以来，人们从枯草芽孢杆菌不同菌株的代谢产物中分离纯化了多种有效的抗菌物质。 2 溶菌作用 枯草芽孢杆菌的溶菌作用主要表现在是通过吸附在病原菌的菌丝上，并随着菌丝生长而生长，而后产生溶菌物质造成原生质泄露使得菌丝体断裂；或者是产生抗菌物质通过溶解病原菌孢子的细胞壁或细胞膜，致使细胞壁穿孔、畸形等现象从而抑制孢子萌发。 3 诱导植物产生抗性及促进植物生长 诱导植物产生抗性作用是指枯草芽孢杆菌不但能够抑制植
物病原菌，而且还能够诱发植物自身抗病机制从而增强植物的抗病性能的作用。什么是PGPR国际上把土壤中能促进植物生长的根际自生细菌通称为植物促生根圈细菌(Plant growth promoting rhizobaceria)，简称为PGPR。 其中以枯草芽孢杆菌的抗逆性最强、功能最多、适应性最广、效果最稳定。枯草芽孢杆菌能够产生类似细胞分裂素、植物生长激素的物质，促进植物的生长使植物抵抗病原菌的侵害。 4保护环境。 枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料。当作用于作物或土壤时，能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料效应。目前，微生物肥料在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用。提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出了不可替代的作用。
5 枯草芽孢杆菌对土壤中的菲与苯并芘的吸附及生物降解功能 土壤与其相连的水环境称为土壤-水环境系统，其中存在着大量的土壤固有微生物，并在表面存在生物膜，因为生物膜形成了隔离层，有机污染物在接触到支撑生物膜的固体基底之前，必须首先到达并且穿过这个隔离层，这样就强烈地改变矿物颗粒或基底的吸附行为，对吸附作用有重要的影响，近年的研究表明，由于受污染影响，导致土壤中含有多环芳烃（PAHs），沉积物中PAHs主要为原油污染以及工业或民用煤不完全燃烧所致，枯草芽孢杆菌对菲与苯并芘的吸附及生物降解研究，研究表明以枯草芽孢杆菌为接种微生物，对菲与苯并芘都可进行吸附或生物降解，48h液相PAHs浓度达到平衡时，微生物对菲消除了98％，对苯并芘消除85％；接种的样品48h吸附等温线均呈线形，能较好地符合线性方程；在接种微生物情况下，沉积物与土壤对菲和苯并芘吸附特征均发生较大变化，对菲的吸附量增大约35倍，而对苯并芘的吸附量却降低了2／3左右；未接种微生物的土壤和沉积物对菲解吸率为20％，接种的样品组为2.9％，而对苯并芘的解吸结果与菲相反，未接种
枯草芽孢杆菌浓度测定试验方案 一、材料准备 （1）实验仪器 培养皿、烧杯、天平、玻璃棒、移液枪（5ml 1ml 200ul）、枪头（黄、蓝）、电子天平、250ml锥形瓶、15ml试管、涂布棒、酒精灯、记号笔、封口膜、灭菌锅、漩涡震荡仪 （2）实验试剂 NA培养基： 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水、盐酸、氢氧化钠、无菌水 枯草芽孢杆菌（不同浓度梯度）：101、102、103、104、105 （3）培养基配方 牛肉膏（3g）、蛋白胨（5g）、琼脂（20g）、水（1000ml）、无菌水（100ml）、盐酸、氢氧化钠（调节PH7.0-7.2），121°C下灭菌30 min。 二、实验步骤 （1）制备菌液 称取1.0g枯草芽孢杆菌转移至灭菌试管中，用移液枪分别移取9ml无菌水至试管，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为①； 用移液枪从①中移取1ml混匀菌液至一新试管，用移液枪分别移取9ml 无菌水，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为②；同理，分别进行稀释，得到③-⑧; （2）进行涂板 向每个培养皿中倒入约12ml50℃左右的灭菌的NA培养基，排除气泡；
待培养基凝固后，用移液枪分别从①-⑧中吸取200ul菌液，加至已灭菌的培养皿中，用涂布棒进行均匀涂抹，并标记； 每个样品做两个处理，每个稀释度重复3次； 将密封后的培养皿倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h，观察记录实验结果。 （3）菌落计数 以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数： 当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数； 若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数； 若三个稀释度的平均菌落数大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数； 若三个稀释度的平均菌落数小于300个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。5.6若三个稀释度的平均菌落数不在30个-300个之间，则以最接近300个或30个的平均菌落数乘以稀释倍数。 （4）结果统计与计算 有效活菌总数按式（1）计算； A=B×C /D (1)
响应面法优化枯草芽孢杆菌产蛋白酶的 发酵条件 张 智，朱宏亮，钮宏禹，罗欢华 （东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 １５００４０） 摘 要：在单因素试验的基础上，应用响应面分析法对影响枯草芽孢杆菌产蛋白酶的因素进行分析，得到了最佳发酵条件为温度４０℃、ｐＨ８．０４、接种量８．３％、发酵时间５６ｈ，此条件下的蛋白酶酶活为２４７．８ Ｕ／ｍｌ，比单因素试验的最高酶活２２８．３Ｕ／ｍｌ提高了８．５４％。关键词：枯草芽孢杆菌；蛋白酶；响应面 Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ，ＺＨＵ Ｈｏｎｇ－ｌｉａｎｇ，ＮＩＵ Ｈｏｎｇ－ｙｕ，ＬＵＯ Ｈｕａｎ－ｈｕａ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００４０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：４０ ℃， ｐＨ ８．０４ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ８．３％， Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｕｐ ｔｏ ２４７．８ Ｕ／ｍｌ ａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５６ ｈｏｕｒｓ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ８．５４％ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｏｎｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｗｈｉｃｈ ｉｓｏｎｌｙ ２２８．３ Ｕ／ｍｌ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｐｒｏｔｅａｓｅ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ 中图分类号：Ｑ８１５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）１２－０４００－０５ 收稿日期：２００７－１０－１８ 作者简介：张智（１９６４－）女，研究员，硕士，研究方向为食品发酵与食品微生物。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｌｗｚ０７＠１６３．ｃｏｍ 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）是一种安全的蛋白酶 生产菌［１］，它可产生大量的胞外蛋白酶，在工业生产中应用广泛。主要应用有以下五个方面：（１）在食品工业中应用：如奶酪生产、焙烤食品、大豆、玉米的深加工［２－３］ 、水解产物的脱苦以及阿斯巴甜的合成等。（２）在制革行业中应用：如脱毛、脱皮等。（３）洗涤剂行业［４－５］，衣服的主要污染是汗液、血迹、食迹等。在汗液中除脂肪外，干物质的１／３是蛋白质。织物上的蛋白质，特别是陈化以后很难洗除，加入蛋白酶可大大的提高洗涤效果，延长织物的寿命，目前全世界洗涤剂用酶的消费量已达到１００００多吨。现已将蛋白酶加入牙膏、牙粉、漱口水中有助于去除牙垢。（４）医药行业，可作为消化、消炎、化痰止咳等药物以及治疗跌打伤、水肿血肿、消除坏死组织等。（５）除了应用于工业及医药行业外，还可以应用于基础研究中，蛋白酶的选择性肽键裂解可用于阐明结构功能关系、肽链合成以及蛋白质测序［６］等。现在蛋白酶的生产日趋火热。 响应面分析法［８］（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ＲＳＭ）是一种优化工艺条件的有效方法，可用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对指标（响应值）的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系，已被广泛地用于同时存在多因素影响的实验优化上。为了得到最佳产酶条件，本实验采用响应面分析法对影响菌种产酶的几个条件做了优化。１材料与方法１．１ 菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）本实验室保存，是经过选育筛选出来的产蛋白酶性能稳定的菌株。１．２ 培养基 斜面培养基：葡萄糖０．５％、酵母膏１％、蛋白胨０．５％、氯化钠０．２％、琼脂２％、自然ｐＨ值。
枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的研究 XXX （XXX农业与生物技术学院，XX XX，XXX） 摘要：通过单因子实验对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的培养基条件进行优化，采用此优化培养基对发酵菌株进行单因素试验，结果表明在其他条件均不变 且以牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、（NH 4） 2 SO 4 、KNO 3 作为枯草芽孢杆菌发酵产碱 性蛋白酶培养基的唯一氮源时，最佳的氮源为蛋白胨，在此条件下碱性蛋白酶活力可达209.7U/ml。 关键字:枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶发酵 引言：碱性蛋白酶是指pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9-11，属于肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，除可催化蛋白质水解为氨基酸外，在有机溶剂中还可催化多肽的合成，是一类非常重要的工业用酶, 其产量约占整个世界酶制剂产量的30 %, 广泛存在于动、植物及微生物体中,在食品、医药、化工等工业有着广泛用途[1]。由于微生物碱性蛋白酶与来自动、植物的相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量较高、选育简单快速, 易于实现工业化生产等特点, 因此, 微生物碱性蛋白酶已成为研究的热点[2]。碱性蛋白酶等工业化酶制剂主要是通过复杂而成本较高的微生物培养基制备的, 其培养基成本约占工业化成本的30 %-40 %；另外, 碱性蛋白酶具有潜在的工业化应用前景, 因此经价格低廉的培养基选育较高产量的菌株以降低产酶成本显得尤为重要[3]。目前,国产碱性蛋白酶主要在酶活、成本和酶学性质等方面还不能满足工业发展要求, 大规模工业用碱性蛋白酶主要依赖进口[4]，本实验主要通过单因子试验优化枯草芽孢杆菌发酵培养基，以进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。 1材料和方法 1.1 试剂与器材 碱性蛋白酶菌种；Na 2CO 3 (0.4mol/L)；干酪素（10g/L）；三氯乙酸(0.4mol/L)； 福林试剂；100ul/ml酪氨酸标准液；胰蛋白胨；酵母浸粉；葡萄糖；糊精；CaCl 2 ； K 2HPO 4 ；牛肉膏；柠檬酸钠；（NH 4 ） 2 SO 4 ；KNO 3 恒温水浴锅，分光光度计；试管若干；移液管；吸耳球；洗瓶；漏斗；离心 机；高压灭菌锅；5L发酵罐体系；pH计；恒温摇床。 1.2 操作方法 1.2.1 福林法制作标准曲线 取11支试管，按表1所示标号加入试剂（除0号做空白对照，其余每只重复一次计算时取平均值），混匀，再加入1ml福林试剂摇匀，水浴20min，以不含酪氨酸的0号管作为空白，于分光光度计下测A680的值。以A680的值为横坐标，酪氨酸浓度为纵坐标作图如图1。
１０ 科技创新导报 Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ ２０１０ ＮＯ．２９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ 研 究 报 告 科技创新导报α－淀粉酶是在淀粉加工、食品工业、医药工业、发酵工业及酿造、制糖和纺织工业上应用广泛的酶种，也是目前国内外应用最广、产量最大的酶种之一。α－淀粉酶一般可由微生物发酵产生，也可由植物和动物提取。 目前，工业生产上都以微生物发酵法为主进行大规模生产α－淀粉酶。我国从１９６５年开始应用枯草芽孢杆菌（Ｂｃａｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＦ－７６５８生产α－淀粉酶，当时仅无锡酶制厂独家生产，年产量为１０．２２吨。现在国内生产酶制剂的厂家己发展到上千个，其中约有４０％～５０％的工厂生产α－淀粉酶。总产量上万吨。 近年来，国外生产耐热α－淀粉酶发展较快，己从嗜热真菌、高温放线菌、特别是从嗜热细菌（嗜热脂肪芽孢杆菌Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｔ和地衣芽孢杆菌Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｕｓ等）中分离得到了耐高温的α－淀粉酶菌种。但就国内而言，虽己开展了耐高温α－淀粉酶的研究工作，目前仍以枯草杆菌菌株生产α－淀粉酶为主。 本文就枯草杆菌在淀粉培养基上产 α－淀粉酶做一下研究，其对在以玉米（淀粉含量为７０％～７５％）或大米（淀粉含量为８０％～８５％）主要原料的发酵酿酒过程，具有实际的指导意义。 １ 材料和方法 １．１实验材料 １．１．１菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）为实验室保藏菌种。 １．１．２种子培养基 马铃薯固体（及液体）培养基（简称ＰＤＡ，马铃薯２００ｇ、蔗糖２０ｇ、琼脂１５ｇ、水１０００ｍｌ、ＰＨ自然，马铃薯去皮，切成块煮沸３０ｍｉｎ，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至１０００ｍｌ。１２１℃灭菌３０ｍｉｎ） １．１．３发酵培养基 淀粉液体培养基（可溶性淀粉、蒸馏水、ｐＨ自然。１２１℃灭菌３０ｍｉｎ） １．２实验方法 １．２．１菌种激活 枯草芽孢杆菌在马铃薯固体培养基（简称ＰＤＡ）上３７℃培养１２ｈ后使用 １．２．２液体种子的制备 １００ｍＬ三角瓶装５０ｍＬ马铃薯液体培养基（起始ＰＨ为自然ＰＨ），灭菌后接激活菌种悬液１．５ｍＬ，培养３６ｈ。 １．２．３发酵培养 在各淀粉液态培养基中加１．５ｍＬ液体种子，用电热恒温振荡培养箱培养枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。 １．２．４分析方法 酶活力测定，根据国家标准局发布的方法进行①。即１ｍＬ酶液于６０℃，ＰＨ４．８条件下，１小时液化１ｇ可溶性淀粉为１个活力单位。［①国家标准局颁布，ＧＢ８２７５－８７，１９８８－０２－０１实施］ ２ 实验结果与讨论 （１）培养温度对菌体生长和产酶的影响在不同温度下用电热恒温振荡培养箱（天津产ＳＨ６０００Ａ型）在２３℃至４４℃范围内培养枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ），３６ｈ后测定α－淀粉酶活力。结果示于表１。菌体生长和产酶的最适温度均在３７℃。温度高于４４℃菌体生长和酶活力迅速下降。 （２）培养基对菌体生长和产酶的影响，同在最适温度３７℃下，相同的接种量、相同的种龄的枯草杆菌，比较不同比例的淀粉液体培养基产α－淀粉酶，结果见表２测定产α－淀粉酶的最适培养基为：淀粉∶水＝７５∶１００。 （３）培养时间对产酶的影响，在最适温度３７℃下，相同的接种量，淀粉与水的比例为：７５∶１００时１（最适产α－淀粉酶的淀粉液体培养基），测定枯草杆菌产α－淀粉酶最适培养时间为３６ｈ。 ３ 结论 α－淀粉酶是产量在，用途广的酶制剂 品种之一，我国目前枯草杆菌α－淀粉酶是主要品种之一，在行业应用具有重要价值。本实验采用枯草杆菌在淀粉液态培养基上产α－淀粉酶，其研究结果对以玉米或大米为主要原料的发酵造酒具有指导意义。１）在２３℃至４４℃范围内，振荡培养，起始ＰＨ为自然ＰＨ，产α－淀粉酶最适培养条件：培养温度３７℃。２）在温度３７℃下，用淀粉液体培养基发酵，当淀粉与水的比例为７５∶１００时，产α－淀粉酶酶活力最高。３）在最适温度３７℃，淀粉与水的比例为７５∶１００（即产酶最高的淀粉液体培养基）时，最佳培养时间为１２ｈ，此时α－淀粉酶活力最高。 参考文献 ［１］沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验． 北京：高等教育出版社，２０００．［２］臧明玺，姜延程，李廷生．发酵助剂提高 枯草杆菌α－淀粉酶的活性研究．郑州粮食学院学报，１９９７． ［３］钟穗生等．枯草杆菌α－淀粉酶的活性 研究．太原工业大学学报，１９９７． 枯草杆菌生产α－淀粉酶的研究 哈申吐力古尔 （内蒙古通辽职业学院 通辽 ０２８０４５） 摘 要：以枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＦ７６５８）为实验菌株，以淀粉为主要原料，采用液态培养基摇瓶发酵，生产α－淀粉酶。结果表明：①在２３℃至４４℃内，培养基起始ＰＨ为自然ＰＨ，产酶最适培养温度为：３７℃②枯草杆菌在淀粉液态培养基中３７℃，振荡培养，其产酶最适淀粉水组成为：淀粉∶水＝７５∶１００；③在最适温度３７℃下，淀粉∶水＝７５∶１００时，最适培养时间为３６ｈ。关键词：α－淀粉酶 枯草杆菌 淀粉液体培养基中图分类号：Ｒ３１３文献标识 码：Ａ 文章编号：１６７４－０９８Ｘ（２０１０）１０（ｂ）－００１０－０１ 表１ 不同温度下所测糖度值 表２ 不同培养基对枯草杆菌产α－淀粉酶的影响
微生物技术综合实验 年级：13级生物工程（专升本）班级：2013011201 学号：1301014026 姓名：徐红贞 指导老师：刘凤霞教授 日期：二零一三十月五号
目录 1实验目的及原理 (1) 1.1实验目的 (1) 1.2实验原理 (1) 2实验材料 (1) 2.1实验仪器 (1) 2.2实验试剂 (1) 2.3培养基 (2) 2.3.1 生长培养基 (2) 2.3.2鉴定培养基 (2) 2.3.3摇瓶培养基 (2) 3试验方法 (2) 3.1仪器的准备 (2) 3.2培养基的配置 (2) 3.3初步筛选及鉴定 (2) 3.3.1采集土样 (3) 3.3.2富集培养 (3) 3.3.3稀释分离、纯化 (3) 3.3.4初筛 (3) 3.4复筛及鉴定 (4) 3.4.1革兰染色 (4) 3.5酶活力的测定 (4) 3.5.1摇瓶培养 (4) 3.5.2酶液稀释 (4) 3.5.3酶液测定 (4) 4结果分析 (5) 4.1平板涂布分离 (5) 4.2平板划线分离 (5) 4.3初筛 (5) 4.4复筛 (5) 4.5摇瓶培养 (6) 4.6酶活力测定 (6) 5参考资料 (7) 6附录 (8)
微生物上游技术综合实验 枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定 1.实验目的及原理 1.1实验目的 （1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。 （2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。 （3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。 （4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。 （5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 1.2实验原理 选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断培养物中是否有产淀粉酶微生物及产淀粉酶的能力。 2. 实验材料 2.1实验仪器 无菌玻璃涂棒无菌移液管接种环无菌培养皿土样电子天平三角瓶烧杯试管酒精灯擦镜纸载玻片吸水纸恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅玻璃珠显微镜无菌铲胶头滴管记号笔试管架棉塞牛皮纸报纸细绳无菌纸袋电炉搪瓷缸分光光度计恒温水浴锅白瓷皿等。 2.2 实验试剂 ○1碘液储备液：称取22.0g碘化钾溶于约300mL水中，加入11.0g碘，搅拌溶液，移入500mL容量瓶，用水定容，贮于棕色瓶中备用（每月配制一次）。 ○2碘液使用液：称取20.0g碘化钾，溶于约300mL水中，移入500mL容量瓶中，
分离产蛋白酶的芽孢杆菌菌株的分离方案 一．取样环境及原因 选择一块污染较少且植被丰富，腐殖质较厚的地块，取表层一下5—10cm处的土样，这样可以保证土壤中有多种类和多数量的高活性的微生物，并且可以避免污染物对菌种的影响。 二．筛选流程 1)将采集的土壤样品用无菌水制备1:10的土壤悬液。 2)取1:10土壤悬液5mL，注入已灭菌的试管中，将试管放入75—80℃水浴中 热处理10min，以杀死非芽孢细菌及其他微生物。 3)取热处理过的悬液100—200μL，涂布接种到牛肉膏白胨培养基平板，将平板倒置， 于30—32℃培养24—48小时。 4)对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片， 做芽孢染色，选出芽孢杆菌菌落。 5)从芽孢杆菌菌落处分别挑取少许菌苔，接种到含酪蛋白的斜面培养基上，再点接于含酪 蛋白的平板，30—32℃培养24—48h，测定平板上菌落苔直径和水解圈的直径。 6)筛选出水解圈于菌落直径比值大的菌落进行发酵培养，取发酵液进行酶活力测定。再取 发酵液酶活力大的菌落进行接种培养。 三．筛选模型的选择及原因 芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌，并且广泛存在于土壤中，且其性质稳定，可较容易与其它细菌分离，繁殖速度快，体积较大，在培养时可抑制有害菌生长。而且对人体无害，可代谢生产多种酶和有机酸。 四．如何检验筛选所得的菌株是所需的目的菌种 芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，可用革兰氏染色法初步判定，且其在酪蛋白平板上会产生水解圈，并且其菌种有体积较大，表面干燥、粗糙、不透明等特征，较易和其它菌种分辨。还可以利用显微镜观察比较其形态特征来判定是否为芽孢杆菌。
产淀粉酶芽孢杆菌的分离、纯化并发酵测定淀粉酶活力杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法 注明：蓝色字体是已修改的 一、实验目的 1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法； 2、掌握测定酶活力的方法； 3、培养自行设计、实施实验的能力。 二、实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。 2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢杆菌。 4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。 三、实验材料 1、土壤样品 湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。 2、培养基 淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml 种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml
发酵培养基：玉米粉 2% ，黄豆饼粉1.5 %， CaCl20.02% ， MgSO40.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬酸钠0.5 % ，硫酸 氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养 条件为：温度37℃，装液100ml/250ml，配制200 ml 3、试剂 草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液 4、玻璃器皿 锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管（1mL） 10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、载玻片若干，5、其他仪器及设备： 天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生化培 养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微镜，接种 环等 四、实验步骤 1、样本采集 ①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。 ②取12.5g土壤加入250ml烧杯中，再加入112ml去离子水制成土壤混悬液，加入一小层玻璃珠。在锥形瓶中加入2g的可溶性淀粉，蛋白胨0.625g，NaCL0.625g,调节PH值为7.0—7.2。在37℃摇床培养箱中培养两天，使菌体富集且产生大量芽孢。 在85℃-90℃水浴锅中加热10分钟，杀灭菌体，使芽孢得到富集。 3、初筛 将富集得到的菌体液静置5分钟，然后进行浓度梯度稀释到10-6，分别在10-1 、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度下各取1mL均匀涂布在淀粉培养基上，培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。取出培养好的平皿在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即该菌株能产生淀粉酶。 4、划线分离 从初筛所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行划线分离。将于种子培养基上划线后，再将培养皿放入37℃培养箱中培养24小时。 5、镜检 挑取一个较好的单个菌落，通过革兰氏染色制片观察，判别所选菌
实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离 一、教学目标及基本要求 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术 4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、实验原理 枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。 1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。 由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。 2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。 利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 3. 枯草芽胞杆菌的形态特征 枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。 4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性 枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。 三、实验材料 1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样， 并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取） 2. 培养基 ①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
山东大学实验报告2012年 12 月 4日 姓名系年级 2011级生科2班组别四 科目微生物学实验题目微生物的生理生化反应 微生物的生理生化反应 一、【实验目的】 1. 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5. 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、【实验仪器与试剂】 菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄 糖蛋白胨水培养基； 试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、 仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管 三、【实验原理】 1.在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种 微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。 2.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质 分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 3.油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说 明此中菌可产生分解油脂的酶。 4.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数 细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气. 例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 5.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并 非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测
北方民族大学学生实验论文论文题目:产蛋白酶芽孢杆菌的分离、纯化与选育 院(部)名称:生物科学与工程学院 学生姓名:杨嘉怡 专业:生物工程学号:20103371班级:102班 指导教师姓名:刘雅琴 实验小组成员:高瞻，邢艳东，刘帅，阳波 组别:第五组 实验成绩: 北方民族大学教务处制
产蛋白酶芽孢杆菌的分离、纯化与选育 摘要 酶（英语：Enzyme，又称酵素），指具有生物催化功能的高分子物质。几乎所有的细胞活动进程都需要酶的参与，以提高效率。酶作为催化剂，本身在反应过程中不被消耗，也不影响反应的化学平衡。酶具有高度的专一性，只催化特定的反应或产生特定的构型。酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。目前已知的可以被酶催化的反应有约4000种。在生物体内，酶发挥着非常广泛的功能。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。目前，能由工业生产的50多种酶制剂包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶等，这些酶大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离产酶微生物的方法，菌种的纯化技术及其高产菌的选育技术。 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 生物的遗传信息的改变是通过基因突变、基因重组和基因转移来进行的。基因突变，又称点突变（point mutation），包括自发突变和诱发突变，前者是未经人为施加诱变剂处理而发生的突变，后者是经人为施加诱变剂处理而获得的突变。两种突变都是由于一个或几个碱基的增加、缺失或置换而引起的，因此本质相同，不同的只是诱发突变的频率比自发突变的频率要高得多。这一部分的实验是以紫外线和亚硝基胍为例介绍了物理因素和化学因素对微生物的诱变作用。本实验中，将筛选出的蛋白酶的产生菌株作为出发菌株通过紫外线对微生物诱变作用，对菌株进行选育工作。 关键字：芽孢杆菌，分离，突变，筛选
山东大学实验报告2017年12月4日 ___________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物鉴定常用的生理生化试验姓名：丁志康 一、目的要求 1.证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的 酶系统。 2.掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5.了解IMViC反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、基本原理 1、生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶只要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实；淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不在产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变成深红色，说明胞外存在着脂肪酶。 2、糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳糖、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳的等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨，指示剂（溴甲酚紫），倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 3、IMViC反应是吲哚试验、甲基红试验、伏-普试验和柠檬酸试验4个试验的首字母缩写。这四个实验主要是用来快速鉴别大肠杆菌和产气杆菌，多用于水的细菌检查。 （1）吲哚试验：某些细菌有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸形成吲哚（靛基质），吲哚能与对二甲基氨基苯甲醛作用生成玫瑰吲哚而呈红色。 （2）甲基红试验：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解成为甲酸、乙酸、琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂可呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在5.4以上，加入甲基红指示剂呈橘黄色。本试验常与V-P试验一起使用，因为前者呈阳性的细菌，后者通常为阴性。 （3）伏-普（二乙酰）试验：某些细菌能发生如下转换：葡萄糖→丙酮酸（脱羧）→乙酰甲基甲醇→2，3—丁烯二醇，在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用产生粉